WO1993024512A1 - Nucleic acid homologue - Google Patents
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Definitions
- the present invention relates to nucleic acid homologs having a so-called antisense function. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid homolog that specifically binds to a nucleic acid of DNA or RNA to form a complex, thereby selectively inactivating, activating, or controlling their genetic information.
- the gene is a double-stranded DNA consisting of a complementary base sequence, and a significant coding sequence (sense sequence) is coded on one of the strands. Oligonucleotides complementary to this sequence can specifically bind to the sense sequence, thereby blocking gene function in a manner that covers the desired region of interest. . Compounds having such a function are called antisense molecules.
- Antisense molecules act not only on such DNA binding but also on RNA, and can selectively inhibit the process of protein translation from messenger RNA (Harold M.
- antisense molecules can be used to elucidate and control biological functions, and to date, the following types of nucleic acids Homologs have been synthesized (Murakami et al., Synthetic Organic Chemistry, Vol. 48, No. 3, P1BO-193 (1990)).
- ⁇ represents a nucleobase
- R and R ′′ represent hydrogen, alkyl, or other substituents.
- R 2 represents hydrogen, an inorganic acid residue, organic acid residue, an alkyl or Ashiru.
- nucleic acid homologs have been synthesized, including the above compounds.
- the inventors of the present invention have conducted studies for the purpose of finding a novel and useful synthetic antisense molecule that solves the above problems.
- ⁇ indicates an integer on 1 ⁇ , provided that when ⁇ is on 2 J3 ⁇ 4, B 2 and B 3 are not limited to the same base.
- the present inventors have found that a nucleic acid homolog to be solved has solved the above-mentioned problems and has properties as an excellent antisense molecule, and has finally completed the present invention.
- the antisense molecule of the present invention has extremely excellent properties under the conditions described in (a) above, as compared with the conventional antisense molecule.
- the nucleic acid homologues of the present invention have extremely good solubility in water and the like, in particular, as compared with conventional antisense molecules (for example, potassium-oligonucleotide derivative (compound I)). Therefore, the nucleic acid homologue of the present invention has a high binding ratio to highly water-soluble DNA or RNA. Therefore, high utility in the medical field can be expected.
- conventional antisense molecules for example, potassium-oligonucleotide derivative (compound I)
- Structural features of the nucleic acid homologs of the present invention are characterized by In the case there is an alternating presence of a calcium or thiocarbamate group and a phosphoric or thiophosphate group.
- the solubility of the nucleic acid homolog of the present invention is considered to be due to this structural feature.
- the gist of the present invention resides in the structural features of the nucleic acid homolog of the present invention described above.
- Antisense molecules generally have higher activity and selectivity as the number of bases increases. However, conversely, the greater the number of bases, the stronger the toxicity.
- N relating to the nucleic acid homolog of the present invention is 1 or more, but in consideration of the balance between activity and toxicity, 1 to 20 is preferable, and 3 to 10 is more preferable.
- nucleotide sequence of the nucleic acid homolog of the present invention that is, the type of bases of BB 2 , B 3 , differs depending on the nucleotide sequence of DNA or RNA to be inactivated, activated or controlled.
- the double-stranded nucleic acid derivative shows a characteristic C-type compared to many double-stranded nucleic acid derivatives having a B-type I have.
- the reason for this is not clear, but the structural transition from type B to type C occurs only when natural DNA with random nucleotide sequence is placed under special conditions (such as high salt concentration or low humidity). Therefore, it is inferred that they form a three-dimensional structure under similar conditions.
- the nucleic acid homologue of the present invention has a pharmacological action such as a P protein synthesis inhibitory action in HelaS3-MDR1 cells, and is therefore extremely useful as, for example, an anticancer agent.
- the compound of the general formula [I] gives an optically pure active substance when Y is either S or 0.
- the compound has two optical isomers (diastereomers) for each thiophosphoric acid bond, and any compound is included in the present invention. is there.
- the nucleic acid homologs of the invention have been found to be less toxic.
- the nucleic acid homolog of the present invention When used as a medicament, the compound of the present invention is administered as it is or in a pharmaceutically acceptable nontoxic and inert carrier.
- the carrier one or more liquid, solid, or semi-solid diluents, fillers, and other prescription auxiliaries are used.
- the pharmaceutical compositions are preferably administered in dosage unit forms.
- the nucleic acid homologs of the present invention can be administered orally, intraosseously, topically, or rectally. Needless to say, the composition is administered in a dosage form suitable for these administration methods, for example, various oral preparations, injections, inhalants, eye drops, softeners, suppositories, and the like. In particular, intra-tissue administration and local administration are preferred. (Synthesis method)
- B ′, B 2 and B 3 are the same or different and are hypoxanthine, thymine, peracyl, N-benzoyladenine having a protected base, and N-di having a base protected. It represents sobutyrylguanine or N-benzoylcytosine whose base moiety is protected.
- X 0 represents S or 0.
- n represents an integer of 0 or more. However, when n is 2 or more, B 3 and B 3 are not determined by the same base.
- Step 3 When _ obtained in Step 1 and _ obtained in Step 2 are mixed in a dimethylformamide or pyridine solution at room temperature, the mixture is quantitatively condensed to obtain dimer _ ⁇ .
- 5'-D-Dimethoxytrityl thymidine_1 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3.95 g is dissolved in 36 ml of pyridine, and 1, ⁇ -thiocarbyldimidazole is dissolved.
- Solution A 50 mM TBAA (PH 7) buffer 100 ml
- Solution B 40% cetonitrile / 50 mM TEAA (pH 7) buffer 100 ml ⁇ 3 ⁇ 4'0 ⁇ 100 .
- Only the fractions that develop the color of the DMTr group (the color becomes orange due to the acid added) are collected, the solvent is distilled off under reduced pressure, treated with 80% acetic acid (5 ml), and treated at room temperature for 15 minutes. After standing, confirm that the DMTr group has been removed by TLC check, and then distill off the solvent under reduced pressure. Separate and extract with ethyl acetate-water, and separate the aqueous layer.
- C bz represents N-pentylcytosine.
- the resin was then deprotected with a 0.3 M aqueous solution of dioxane (CB Reese et al. Tetrahedron Lett., 2727 (1978)) in dioxane at room temperature for 24 hours at room temperature. After washing with, the washing solution was concentrated to dryness, 5.0 ml of concentrated ammonia water ZDMF (1/1) was added, and the solution was deprotected again at room temperature for 24 hours.
- dioxane CB Reese et al. Tetrahedron Lett., 2727 (1978)
- Fig. 2 shows the HPLC chromatogram of this target compound.
- a solution 100 mM TBAA (pH 7) buffer 100 ml
- B solution 35% acetonitrile Z50 mM TBAA (pH 7) buffer 100 ml
- Elution was performed with a gradient of 0 ⁇ 100. Only the fractions that develop the color of the DMTr group (it becomes orange due to acetic acid) are collected, the solvent is distilled off under reduced pressure, treated with 80% acetic acid (5 ml), and left at room temperature for 30 minutes. After checking that the DMTr group had been removed by a check, the solvent was distilled off under reduced pressure.
- test was carried out under the conditions of 50 mM trinitrile TBAA (PH 7.0), B3 ⁇ 4: 0 ⁇ 50 (15 minutes), gradient, and flow rate of 1 mlZ.
- the solubility in water was 5 tnM or more.
- HeLaS3-MDRl cells are seeded on a 6-well plate at a density of 6 ⁇ 10 5 cells / well, and after 24 hours and 48 hours, the test substance is lipofuctin (BRL, registered trademark) (3 jug). / ml final concentration) and added to the cells. After 72 hours, the cells were lysed with a detergent (Triton X-100 NP40), and radioimmunoassay was performed using a monoclonal antibody C219 against human P protein (manufactured by Centco Ryo). The amount of the synthesized P protein was measured by radioactivity using an image analyzer (BAS2000). table 1
- Antisense nucleic acid consisting of only phosphothioate in "": the same sequence (references Stec. W. J. et al., J. Am. Chem. Soc.
- As the control a natural DNA oligomer having the same sequence was used.
- Each sample was prepared at a concentration of 25 / xM in 30 mM acetate buffer ( ⁇ 4.6), 50 mM sodium chloride, and Im-zinc chloride solution.
- the present invention substance "to form a complex of (Example 2 materials) and complementary thereto native Doki Shi Li Boo Li Gonuku Reochi de (3 'AGAAACTCGAAC 5'), ' a ⁇ by that shown in FIG. 9 Melting curves were obtained. This melting curve was measured under the conditions of a sample concentration of 65 ⁇ , 0.15% sodium chloride, 10M sodium phosphate (PH 7.0), and a heating rate of 0.5 minutes.
- the substance of the present invention strongly formed a complex (Tm 40.9 t).
- the compound When the right-handed circularly polarized light and the left-handed circularly polarized light have different molar absorption coefficients in the absorption band of the compound, the compound is said to exhibit circular dichroism (referred to as “CD”). Determine the three-dimensional structure and conformation, especially for nucleic acids
- Natural DNA is known to take Form B under physiological conditions from the results of CD measurement (VI Ivanov et al., Biopolymer 12, 89-100 (1973)) ⁇
- the CD curve (FIG. 10) of the complex of the substance of the present invention and the complementary deoxyribonucleotide is shown in the figure for a conjugate having the same sequence instead of the substance of the present invention.
- the case using natural DNA (Fig. 11) is also shown.
- This CD curve was measured under the conditions of a sample concentration of 65%, 0.15M sodium chloride, 10mM sodium phosphate (PH 7.0), and a temperature lOt.
- FIG. 1 shows a ⁇ -matogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 1.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
- FIG. 2 shows a high-speed liquid chromatography (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention obtained in Example 2.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the vertical axis represents time (minutes).
- FIG. 3 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 3.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the vertical axis represents time (minutes).
- FIG. 4 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 4.
- the vertical axis represents absorbance (260 ntn), and the vertical axis represents time (minutes).
- FIG. 5 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the natural DNA oligomer before addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents hours M (minutes).
- Figure 6 shows the natural DNA polymerase after addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2.
- Figure 1 shows a high-performance liquid chromatographic (HPLC) chromatogram. The vertical axis represents absorbance (260nro), and the horizontal axis represents time (minutes).
- FIG. 7 shows a high-speed liquid chromatographic (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention before addition of the enzyme, which was tested in Test Example 2.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
- FIG. 8 shows a high-performance liquid chromatographic (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention after addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2.
- the vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
- FIG. 9 shows the melting curve measured in Test Example 3.
- the vertical axis represents relative absorbance, and the horizontal axis represents temperature.
- FIG. 10 shows a CD curve of a complex of the substance of the present invention and a complementary dextrin liponucleotide measured in Test Example 3.
- the vertical axis represents the molecular ellipticity, and the horizontal axis represents the wavelength.
- FIG. 11 shows the CD curve of the natural DNA duplex measured in Test Example 3.
- the vertical axis represents the molecular ellipticity, and the horizontal axis represents the wavelength.
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Abstract
An object of the invention is to provide a novel antisense molecule utilizable as a medicine which suppresses infection with herpesvirus, influenza virus, human immunodeficiency virus or the like and the action of cancer genes. The nucleic acid homologue of the invention is one represented by general formula (I), wherein X and Y may be the same or different from each other and each represents S or O; B?1, B2, B3 and B4¿ may be the same or different from one another and each represents adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine or uracil; and n represents an integer of 1 or above, provided that B?2 and B3¿ need not necessarily be one and the same base when n is 2 or above.
Description
1 1
明 細 書 二 Book 2
核 酸 同 族 体 技 術 分 野 Nuclear acid homolog technology
本発明は、 いわゆるアンチセンスの機能を持つ核酸同族体に関す る。 更に詳しく は、 D N A又は R N Aの核酸に特異的に結合し、 複 合体を形成することにより、 それらの遺伝情報を選択的に不活性化、 活性化又は制御する核酸同族体に関する。 The present invention relates to nucleic acid homologs having a so-called antisense function. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid homolog that specifically binds to a nucleic acid of DNA or RNA to form a complex, thereby selectively inactivating, activating, or controlling their genetic information.
背 景 技 術 Background technology
遺伝子は、 相補的な塩基配列からなる二本鎖 D N Aであり、 一方 の鎖上に意味を持つ暗号配列 (センス配列) がコー ドされている。 この配列に相補的なォ リ ゴヌク レオチ ドは、 セ ンス配列に特異的に 結合することができ、 これによつて、 目的とする一定領域に蓋をす る形で遺伝子機能を塞ぐことができる。 このような機能を持った化 合物をアンチセンス分子という。 The gene is a double-stranded DNA consisting of a complementary base sequence, and a significant coding sequence (sense sequence) is coded on one of the strands. Oligonucleotides complementary to this sequence can specifically bind to the sense sequence, thereby blocking gene function in a manner that covers the desired region of interest. . Compounds having such a function are called antisense molecules.
アンチセンス分子は、 このような D N Aに対する結合だけでなく、 R N Aに対しても作用し、 メ ッセンジャー R N Aから蛋白質が翻訳 される過程を選択的に阻害することができる (Harold M. Antisense molecules act not only on such DNA binding but also on RNA, and can selectively inhibit the process of protein translation from messenger RNA (Harold M.
Weintrau h. , Scientific American, January 1990, p34 ~40) 0 以上の原理に基づき、 了ンチセンス分子は、 生体機能の解明や制 御に役立てることができることから、 今日まで以下のようなタイ プ の核酸同族体が合成されている (村上ら、 有機合成化学、 第 48巻第 3号、 P1BO〜 193 (1990))。 Weintrau h., Scientific American, January 1990, p. 34-40) Based on zero or more principles, antisense molecules can be used to elucidate and control biological functions, and to date, the following types of nucleic acids Homologs have been synthesized (Murakami et al., Synthetic Organic Chemistry, Vol. 48, No. 3, P1BO-193 (1990)).
(1)D N A型オ リ ゴヌク レオチ ド誘導体 (化合物①)
2 (1) DNA type oligonucleotide derivative (Compound II) Two
(2) R N A型オリゴヌク レオチド誘導体 (化合物②) (2) RNA type oligonucleotide derivative (Compound II)
(3)リ ン酸ト リエステル型ォリゴヌク レオチド誘導体 (化合物③) (3) phosphoric acid ester type oligonucleotide derivative (compound ③)
(4)メチルホスホネー ト型オリゴヌク レオチ ド誘導体 (化合物④)(4) Methylphosphonate-type oligonucleotide derivative (Compound II)
(5)ホスホロアミデー ト型オリゴヌク レオチ ド誘導体 (化合物⑤)(5) Phosphoramidate-type oligonucleotide derivative (Compound II)
(6)ホスホロチォエー ト型オリゴヌクレオチ ド誘導体 (化合物⑥)(6) Phosphorothioate-type oligonucleotide derivative (Compound I)
(7)ホスホロジチォエー ト型オリゴヌ ク レオチ ド誘導体 (化合物⑦)(7) Phosphorodithioate-type oligonucleotide derivative (Compound II)
(8)力ルバメー ト型オリゴヌクレオチ ド誘導体 (化合物⑧) (8) Capillate-type oligonucleotide derivative (Compound I)
上記化合物の構造上の特徴を次に示す。 いずれも天然の核酸構造 (化合物①) を改造することで、 生体内で機能するアンチセンス分 子の合成を目指している。 一 0
The structural characteristics of the above compound are shown below. Both aim to synthesize antisense molecules that function in vivo by modifying the natural nucleic acid structure (Compound II). One 0
(式中 Βは、 核酸塩基を示し、 R 、 R" は、 水素、 アルキル又はそ の他の置換基を示す。 ) (Wherein, を represents a nucleobase, and R and R ″ represent hydrogen, alkyl, or other substituents.)
本発明者らは鋭意検討の結果、 以下の核酸同族体が上記に比べて 優れた効果を有することを見出し、 特許出願した (特願平 2 — 1452 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the following nucleic acid homologues have more excellent effects than those described above, and have filed a patent application (Japanese Patent Application No. 2 — 1452).
16号) 。 No. 16).
(9)チォカルバメー ト型オリゴヌク レオチ ド誘導体 (化合物⑨)
(9) Thiocarbamate-type oligonucleotide derivative (Compound II)
5 Five
(式中 Bは、 核酸塩基を示し、 I?1、 R2は、 水素、 無機酸残基、 有機 酸残基、 アルキル又はァシルを示す。 ) (Wherein B represents a nucleic acid base, I? 1, R 2 represents hydrogen, an inorganic acid residue, organic acid residue, an alkyl or Ashiru.)
上記の化合物を含め他にも多くの核酸同族体が合成されているが Many other nucleic acid homologs have been synthesized, including the above compounds.
(例えば、 米国特許第 5, 034, 506 号記載の核酸同族体など) 、 必ず しも満足すべき効果は得られていず、 下記の条件を充分に備えた実 用性の高いアンチセンス分子の開発には至っていない。 (For example, nucleic acid homologs described in US Pat. No. 5,034,506). However, a satisfactory effect has not always been obtained, and a highly practical antisense molecule satisfying the following conditions has been obtained. It has not been developed.
(a) D N A及び R N Aへの結合安定性 (複合体形成能) (a) Stability of binding to DNA and RNA (complex forming ability)
(b)核酸分解酵素に対する抵抗性 (b) Resistance to nucleolytic enzymes
(c)酸、 アルカ リ、 温度、 湿度に対する物理化学的安定性 (c) Physicochemical stability to acids, alkalis, temperature and humidity
(d)細胞膜透過性 (d) Cell membrane permeability
(e)核酸遣伝子に対する安全性 (e) Nucleic acid safety
ぱ)合成の簡便性と低コス ト化 ぱ) Convenience of synthesis and low cost
(g)水又は緩衝液に対する溶解性。 (g) Solubility in water or buffer.
そこで、 本発明者らは、 上記諸問題を解決する新規有用な合成ァ ンチセンス分子を見出すことを目的として検討を行うことにした。 Therefore, the inventors of the present invention have conducted studies for the purpose of finding a novel and useful synthetic antisense molecule that solves the above problems.
発 明 の 開 示 Disclosure of the invention
本発明者らは、 鋭意検討を行った結果、 次 w—般式 〔 I〕
The present inventors have conducted intensive studies and found that the following general formula [I]
(式中、 X、 Yは、 同一又は異なって、 S又は 0を表す。 Β ]、 Β3、 Β 3、 は、 同一又は異なって、 了デニン、 グ了ニン、 ヒポキサンチ ン、 シ ト シン、 チ ミ ン又はゥ ラ シルを示す。 ηは、 1 ^上の整数を 示す。 ただし、 ηが 2 J¾上の場合には、 B 2及び B 3は、 同一の塩基に 限定されない。 ) で表される核酸同族体が、 上記課題を解決し優れ たア ンチセ ンス分子と しての性質を有することを見出し、 ようやく 本発明を完成するに至った。 (Wherein, X, Y are the same or different and each represents S or 0. Β], Β 3, Β 3, are the same or different, Ryo adenine, GuRyo Nin, Hipokisanchi down, collected by Singh, Η indicates an integer on 1 ^, provided that when η is on 2 J¾, B 2 and B 3 are not limited to the same base. The present inventors have found that a nucleic acid homolog to be solved has solved the above-mentioned problems and has properties as an excellent antisense molecule, and has finally completed the present invention.
本発明のア ンチセ ンス分子は、 従来のア ンチセ ンス分子と比較し, 前述の (a)から の条件において、 極めて優れた特性を有する。 The antisense molecule of the present invention has extremely excellent properties under the conditions described in (a) above, as compared with the conventional antisense molecule.
本発明核酸同族体は、 特に従来の了 ンチセ ンス分子 (例えば、 力 ルバメ ー ト型オ リ ゴヌク レオチ ド誘導体 (化合物⑧) ) に比べて、 その水等に対する溶解性が極めて良い。 従って、 本発明核酸同族体 は、 水溶性の高い D N A又は R N Aと結合する割合が高く なるので. 医療分野において高い有用性を期待することができる。 The nucleic acid homologues of the present invention have extremely good solubility in water and the like, in particular, as compared with conventional antisense molecules (for example, potassium-oligonucleotide derivative (compound I)). Therefore, the nucleic acid homologue of the present invention has a high binding ratio to highly water-soluble DNA or RNA. Therefore, high utility in the medical field can be expected.
本発明核酸同族体の構造上の特徴は、 ヌク レオシ ドを接続する骨
格の中に、 力ルバメ ー ト又はチォカルバメ ー ト基と リ ン酸基又はチ ォ リ ン酸基とが、 交互に存在するところにある。 本発明核酸同族体 の髙ぃ溶解性は、 この構造上の特徴に起因するものと考えられる。 本発明の要旨は、 上記した本発明核酸同族体の構造上の特徴に存 する。 Structural features of the nucleic acid homologs of the present invention are characterized by In the case there is an alternating presence of a calcium or thiocarbamate group and a phosphoric or thiophosphate group. The solubility of the nucleic acid homolog of the present invention is considered to be due to this structural feature. The gist of the present invention resides in the structural features of the nucleic acid homolog of the present invention described above.
アンチセンス分子は、 一般に塩基の数が多く なる程、 活性及び選 択性が髙く なる。 しかし、 逆に塩基の数が多く なればなる程、 毒性 が強く なつていく。 本発明核酸同族体に係る nは、 1以上であるが、 活性及び毒性のバラ ンスを考慮すると、 1〜20が好ま しく、 3〜10 が更に好ま しい。 Antisense molecules generally have higher activity and selectivity as the number of bases increases. However, conversely, the greater the number of bases, the stronger the toxicity. N relating to the nucleic acid homolog of the present invention is 1 or more, but in consideration of the balance between activity and toxicity, 1 to 20 is preferable, and 3 to 10 is more preferable.
本発明核酸同族体の塩基配列、 即ち、 B B2、 B3、 の塩基の種 類は、 不活性化、 活性化又は制御される D N A又は R N Aの塩基配 列によって異なる。 The nucleotide sequence of the nucleic acid homolog of the present invention, that is, the type of bases of BB 2 , B 3 , differs depending on the nucleotide sequence of DNA or RNA to be inactivated, activated or controlled.
本発明核酸同族体は、 その二重鎖らせん構造を円二色性(Circular Dichroism)によって解析すると、 多く の二重鎖核酸誘導体が B型を とるのに比べ、 特徴的な C型を示している。 この理由は判然とはし ないが、 ラ ンダムな塩基配列をもつ天然の D N Aが特殊な条件下.( 高塩濃度又は低湿度等) に置かれたときにのみ B型から C型に構造 転移することから、 これらに似た条件下におかれた立体構造を形成 しているものと推察される。 When the double-stranded helical structure of the nucleic acid homologue of the present invention is analyzed by circular dichroism (Circular Dichroism), the double-stranded nucleic acid derivative shows a characteristic C-type compared to many double-stranded nucleic acid derivatives having a B-type I have. The reason for this is not clear, but the structural transition from type B to type C occurs only when natural DNA with random nucleotide sequence is placed under special conditions (such as high salt concentration or low humidity). Therefore, it is inferred that they form a three-dimensional structure under similar conditions.
後述するように、 本発明核酸同族体は、 HelaS3- MDR1 細胞におけ る P 蛋白質の合成抑制作用等の薬理作用を有するので、 例えば抗癌 剤等として極めて有用である。 As described later, the nucleic acid homologue of the present invention has a pharmacological action such as a P protein synthesis inhibitory action in HelaS3-MDR1 cells, and is therefore extremely useful as, for example, an anticancer agent.
本発明に係る核酸同族体の用途と しては、 本究明祓酸同族休が遣
° 93 2 512 謂画 0684 As a use of the nucleic acid homolog according to the present invention, ° 93 2 512 So-called image 0684
8 8
伝子情報を不活性化することから、 生体に侵入した異物、 例えば、 ヘルぺスウィルス、 イ ンフルエンザウイルス、 ヒ ト免疫不全症ウイ ルス (H I V、 エイズウイルス等) 等の感染や癌遺伝子の働きを抑 える医薬としての利用が可能である。 また、 積極的に動物や植物の 遣伝子を制御して、 品種改良等の技術に IS用され得る。 更に、 遺伝 子機能の解析や、 遗伝性疾患、 紬菌及びウィルスの感染チ X ッ ク等 の D N Aプローブとしての可能性をも有しており、 また上記記載以 外にも多くの有用性が考えられる。 Since it inactivates gene information, it can infect foreign substances that have entered the living body, such as herpes virus, influenza virus, and human immunodeficiency virus (HIV, AIDS virus, etc.), and the function of oncogenes. It can be used as a medicine to suppress the disease. In addition, it can be used for IS for breeding and other technologies by actively controlling the gene transfer of animals and plants. In addition, it has the potential to be used as a DNA probe for analysis of gene function and for infections of infectious diseases, pneumococci, and viruses. Can be considered.
一般式 〔 I 〕 の化合物は、 Xが 0の場合、 Yが S又は 0のいずれ のときにも光学的純粋な活性体を与える。 一方、 Xが Sの場合、 Y が S又は 0のいずれのときにもチオリ ン酸結合ごとに 2個の光学的 異性体 (ジァステレオマー) を有するが、 いずれの化合物も本発明 に含まれるものである。 When X is 0, the compound of the general formula [I] gives an optically pure active substance when Y is either S or 0. On the other hand, when X is S, when Y is S or 0, the compound has two optical isomers (diastereomers) for each thiophosphoric acid bond, and any compound is included in the present invention. is there.
本発明核酸同族体は、 毒性が少ないことが判っている。 The nucleic acid homologs of the invention have been found to be less toxic.
本発明核酸同族体を医薬として用いる場合、 本発明の化合物をそ のまま、 又は医薬的に許容される無毒性かつ不活性の担体中に包含 させて投与する。 When the nucleic acid homolog of the present invention is used as a medicament, the compound of the present invention is administered as it is or in a pharmaceutically acceptable nontoxic and inert carrier.
担体としては、 液状、 固形、 又は半固形の希釈剤、 充埴剤、 及び その他の処方用の助剤が一種以上用いられる。 医薬組成物は、 投与 単位形態で投与することが望ましい。 本発明核酸同族体は、 経口投 与、 組織内投与、 局所投与又は経直腸的に投与することができる。 これらの投与方法に適した剤型、 例えば、 各種の経口剤、 注射剤、 吸入剤、 点眼剤、 軟育剤、 坐剤等、 で投与されるのはもちろんであ る。 特に、 組織内投与、 局所投与が好ましい。
(合成方法) As the carrier, one or more liquid, solid, or semi-solid diluents, fillers, and other prescription auxiliaries are used. The pharmaceutical compositions are preferably administered in dosage unit forms. The nucleic acid homologs of the present invention can be administered orally, intraosseously, topically, or rectally. Needless to say, the composition is administered in a dosage form suitable for these administration methods, for example, various oral preparations, injections, inhalants, eye drops, softeners, suppositories, and the like. In particular, intra-tissue administration and local administration are preferred. (Synthesis method)
次に、 本発明核酸同族体の一般的な合成方法を記述する。 Next, a general method for synthesizing the nucleic acid homolog of the present invention will be described.
*ス *ϊリエスチル 法 による 固相合成 * S solid phase synthesis by periestil method
式中、 B'、 B2、 B3、 は、 同一又は異なって、 ヒポキサンチン、 チ ミ ン、 ゥラ シル、 塩基部分が保護された N-ベンゾィ ルァデニン、 塩基部分が保護された N-ィ ソブチ リルグァニン、 又は塩基部分が保 護された N-ペンゾィルシ ト シンを示す。 X0は、 S又は 0を示す。 n は、 0以上の整数を示す。 ただし、 nが 2以上の場合には、 B3及び B3は、 同一の基に跟定されない。 In the formula, B ′, B 2 and B 3 are the same or different and are hypoxanthine, thymine, peracyl, N-benzoyladenine having a protected base, and N-di having a base protected. It represents sobutyrylguanine or N-benzoylcytosine whose base moiety is protected. X 0 represents S or 0. n represents an integer of 0 or more. However, when n is 2 or more, B 3 and B 3 are not determined by the same base.
操作 1 市販のヌ ク レオ シ ド又は塩基部分が保護されたヌ ク レオ シ ドの 5'- ジメ トキシ ト リチル誘導体 1を、 ビリ ジン溶液中で、 1, Γ
93/24512 請画 Procedure 1 Commercially available 5'-dimethoxytrityl derivative 1 of a nucleoside or a nucleotide protected in the base moiety was converted to 1, 93/24512 contract
11 11
チォカルボ二ルジィ ミ ダゾール (H. Staab et al. , Ann, 657, 98-103 (1962))と処理し、 50tで加温するか、 又は 1,1'- カルボ二 ルジィ ミ ダゾール (J. M. Coull et al.. Tetrahedron Lett. , 28, 745- 748 (1987〉)と処理し、 室温で 4時間反応するとィ ミ ダゾリルチ ォカルボニル誘導体又はィ ミ ダゾリ ルカルポニル誘導体 _ ^を得る。 操作 2 5'- 了ジ ド -5'-デォキシヌク レオシド又は塩基部分が保護 されたヌク レオシ ド誘導体 3 (T. Hata et al. , Chem. Lett. , 977-Treat with thiocarbonimidazole (H. Staab et al., Ann, 657, 98-103 (1962)) and heat at 50 t or 1,1'-carbonimidimidazole (JM Coull et 28, 745-748 (1987)), and reacted at room temperature for 4 hours to obtain an imidazolyl carbonyl derivative or imidazolyl carbonyl derivative __ ^. -5'-Deoxynucleoside or nucleoside derivative 3 whose base moiety is protected (T. Hata et al., Chem. Lett., 977-
980 (1975)) を、 10%パラ ジウム炭素メ タ ノ ール中、 室温で接触還 元すると、 容易にア ミ ノ体 jを得る。 これは通常精製せずに次の縮 合反応に用いることができる。 When 980 (1975)) is catalytically reduced at room temperature in 10% palladium carbon methanol, the amino body j is easily obtained. This can be used for the next condensation reaction without purification.
操作 3 操作 1で得た と操作 2で得た _ をジメチルホル厶ァ ミ ド 又はピリ ジン溶液中、 室温で混合すると定量的に縮合してダイ マ一 _ ^を得る。 Step 3 When _ obtained in Step 1 and _ obtained in Step 2 are mixed in a dimethylformamide or pyridine solution at room temperature, the mixture is quantitatively condensed to obtain dimer _ ^.
操作 4 固相法のうち、 いわゆる ト リ エステル法(H. Ito et al., Nucleic Acids Res. , 10, 1755-1769 (1982) )を利用するため、 ダイ マ ー 5 (X0=S)をリ ン酸化剤 ( C. Broka et al. , ucleic Acids Res., 8, 5461-5472 (1980〉)により、 ホスホジエステル化する P この結果得られたダイマーブ D ッ ク_ ^は、 直接固相反応に用いるこ とができる。 支持体として 1 %ポ リ スチレンを使用して、 ダイマ一 ブロ ッ ク 6の縮合を操り返し、 最後のステッブにモノ マーブロ ッ ク ( デォキシヌ ク レオチ ド 2- ク ロ 口 フ ヱニルジェステル、 シグマ社 製) を縮合させることにより、 ュのタイ ブのアンチセンス分子を合 成することができる。 Procedure 4 In order to use the so-called triester method (H. Ito et al., Nucleic Acids Res., 10, 1755-1769 (1982)) of the solid phase method, dimer 5 (X 0 = S) re phosphorylation agent (C. Broka et al., ucleic Acids Res., 8, by 5461-5472 (1980>), P phosphodiester of the resulting Daimabu D click _ ^ directly solid phase Using 1% polystyrene as a support, the condensation of dimer block 6 is repeated, and the last step is a monomer block (deoxynucleotide 2-chloro). By condensing lipopolyester (manufactured by Sigma Co., Ltd.), a novel antisense molecule can be synthesized.
搔作 5 固相法のうち、 いわゆる了ミ ダイ ト (Amidite)法のための
ダイ マーブ n ッ ク _Jは、 jを文献 ( oester et al. , Nucleic Acids Res. , 12, 4539-4557 (1984)) の方法で処理して得られる。 この 8を用い、 D N A合成機( 例えば、 AB 土製) を利用すると、 9のタイ プの了 ンチセ ンス分子を容易に調製することができる。 Operation 5 Among the solid-phase methods, the so-called Amidite method Die marb n_J can be obtained by treating j by the method described in the literature (oester et al., Nucleic Acids Res., 12, 4539-4557 (1984)). By using this 8 and using a DNA synthesizer (for example, AB clay), 9 types of intense molecules can be easily prepared.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下に実施例、 参考例、 試験例及び比較例により、 本発明を更に 詳しく説明するが、 本発明は、 これらに限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Reference Examples, Test Examples, and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例 1 —般式 〔 I 〕 において X = S、 Y = S、 τι = 6、 5'CTTCExample 1 - In general formula [I] X = S, Y = S, τι = 6, 5 'CTTC
TTTGAGCTTG3'である本発明物質 jの合成 Synthesis of substance j of the present invention which is TTTGAGCTTG 3 '
ダイ マーブロ ッ ク (Dimer block ) である _ (X°=S 、 Bl = T 、 B2 = T ) 3個、 8 (X°=S 、 B' = G 、 Ba=C ) 1個、 _ (X°=S 、 Bl = G 、 Ba = A ) 1個、 及び j (X°=S 、 Bl = C 、 Ba = T ) 個を用 意しこれらをアミ ダイ ト法により縮合して合成した。 T はチ ミ ン、 G はグァニン、 C はシ ト シ ン、 A は了デニンを、 それぞれ表す。 1. 下記ダイマーブロ ッ ク 8_ (X°=S 、 B] = T 、 B2 = T ) 〔以下 ( 8TT ) と略す〕 の合成 A die Maburo click (Dimer block) _ (X ° = S, B l = T, B 2 = T) 3 pieces, 8 (X ° = S, B '= G, B a = C) 1 piece, _ (X ° = S, Bl = G, Ba = A) and j (X ° = S, Bl = C, Ba = T) are prepared, and these are prepared by the amidite method. It was synthesized by condensation. T is thymine, G is guanine, C is cytosine, and A is rydenine. 1. The following Daimaburo click 8_ Synthesis of (X ° = S, B] = T, B 2 = T) [hereinafter (8TT) abbreviated]
^の合成 ^ Synthesis
5' -D- ジメ トキシ ト リ チルチ ミ ジン _1 (和光純薬社製) 3.95gを ピリ ジン 36 mlに溶解し、 1, Γ - チォカルボ二ルジィ ミ ダゾ一ル 5'-D-Dimethoxytrityl thymidine_1 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3.95 g is dissolved in 36 ml of pyridine, and 1, Γ-thiocarbyldimidazole is dissolved.
3.23 gを加え、 :、 5時間加温した。 加温後、 濃縮乾固し、 そ の残渣をシ リ カゲルカ ラムク ロマ ト (シ リ カゲル 170 g、 メ タ ノ ー ル /ジク ロロメ タ ン) で精製し、 1 (X°=S 、 B' = T ) を 4.16g ( 収率 88%) 得た。 MS(PAB) : 655 (MH +) 3.23 g was added, and the mixture was heated for 5 hours. After heating, the mixture was concentrated to dryness, and the residue was purified with silica gel chromatography (silica gel 170 g, methanol / dichloromethane), and 1 (X ° = S, B ' = T) was obtained in 4.16 g (88% yield). MS (PAB): 655 (MH +)
② J [の合成 ② Synthesis of J [
5' - 了シ ド -5' -デォキシチ ミ ジン 3 (T. Hata et al.. Chem. 5'-Ryside-5'-Doxythymidine 3 (T. Hata et al. Chem.
Lett.. 977-980 (1975)) 2.2 gのメ タ ノ ール 220ml溶液に、 10%パ ラ ジウ ム炭素 0.66 gを加え、 室温で 3時 M接触還元した。 反応後、 セライ トを通して攄過し、 濾液を濃縮乾面すると、 j (B8 = T ) を 1.67 g (収率 84%) 得た。 Lett .. 977-980 (1975)) To 2.2 g of a 220 ml solution of methanol was added 0.66 g of 10% palladium carbon, and the mixture was catalytically reduced by M at room temperature for 3 hours. After the reaction,攄過through Celite DOO, The filtrate was concentrated and dried surface to give j (B 8 = T) and 1.67 g (84% yield).
③ の合成 Synthesis of ③
①で得た 2 1.31 gの DMP 30ml溶液に、 ②で得た _J 0.58 gを加 え、 室温で 2時間処理した。 反応後、 真空ポンプで濃縮乾固し、 シ リ カゲルカ ラムク ロマ ト (シ リ カゲル 70 g、 メ タ ノ ール/ジク ロ ロメ タ ン) で精製し、 j (X°=S 、 B^T 、 Ba = T ) 1.69 gを白 色固体で得た。 MS(FAB) : 828 ( H + ) 0.53 g of _J obtained in ② was added to a 30 ml solution of 21.31 g of DMP obtained in ① and treated at room temperature for 2 hours. After the reaction, concentrate with a vacuum pump to dryness, purify with silica gel chromatography (silica gel 70 g, methanol / dichloromethane), j (X ° = S, B ^ T , B a = T) 1.69 g were obtained as a white solid. MS (FAB): 828 (H + )
®_Jの合成 ®_J synthesis
③で得た 5 0.5 gを使用直前にビリ ジン共沸、 トルエン共沸及び THF共沸し、 反応系を窒素ガスで置換後、 最後に無水 THP 5.0mlに 溶解した。 これに Ν, Ν-ジィ ソプ ビルェチル了 ミ ン 0.42 ml及び 2- シ了ノ エチル N, N-ジイ ソプロ ピルク ロ 1 αホスホ了 ミ ダイ ト (アル
ド リ ツチ社製) 0.27 mlを加え、 室温で 2時間攪拌した。 ¾液を濃 縮乾固した。 残渣を酢酸ェチル (窒素ガスで飽和したもの) 及び飽 和重曹水 (窒素ガスで飽和したもの) で分配し、 有機層を芒硝で乾 燥後、 再度濃縮乾固した。 この残渣を n-へキサン (窒素ガスで飽和 したもの) で粉末化すると、 _ (XD=S 、 B* = T 、 Β2 = Τ ) 0.54 gを白色固体で得た。 この _Jは直接、 DNA合成機 (了プライ ドバイ ォシステムズ社 (以下 ΓΑΒΙ 社」 ともいう〉 製) のためのダイ マー ブロ ッ クに使用した。 Immediately before use, 50.5 g obtained in ③ was azeotropically azeotroped with pyridine, azeotropic with toluene, and azeotroped with THF. The reaction system was replaced with nitrogen gas and finally dissolved in 5.0 ml of anhydrous THP. Add 0.42 ml of Ν, Ν-diisovir virethyl, and 2-cyanoethyl N, N-diisopropyl chloro 1 α-phospho amide (Al 0.27 ml was added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. ¾ The solution was concentrated to dryness. The residue was partitioned between ethyl acetate (saturated with nitrogen gas) and saturated aqueous sodium bicarbonate (saturated with nitrogen gas), and the organic layer was dried over sodium sulfate and concentrated to dryness again. When triturated with hexane the residue to n- (those saturated with nitrogen gas), _ (X D = S , B * = T, Β 2 = Τ) was obtained 0.54 g white solid. This _J was used directly in a dimer block for a DNA synthesizer (manufactured by Ryo Pride Systems, Inc. (hereinafter also referred to as ΓΑΒΙ)).
2. 他のダイマーブロ ック _Jの合成 2. Synthesis of other dimer blocks _J
1. と同様の方法により自劻面相合成機 ( ABI社製) に必要なダ イマ一ブロ ッ ク j ( »=s 、 B' = G 、 B2=C ) 〔以下 (8GC ) 〕 、In the same manner as in 1., the dim block j (»= s, B '= G, B 2 = C) required for the automatic surface phase synthesizer (manufactured by ABI) [hereafter (8GC)],
J (X°=S 、 B^G 、 Ba = A ) 〔以下 (8GA ) 〕 、 及び j (X°=S 、 B' = C 、 Ba = T ) 〔以下 (8CT ) 〕 を合成した。 J (X ° = S, B ^ G, B a = A) [hereinafter (8GA)], and j were synthesized (, X ° = S B ' = C, B a = T) [hereinafter (8CT)] the .
3. 9 (X° = S 、 n= 6、 5' CTTCTTTGAGCTTG3' ) の合成 Synthesis of 3.9 (X ° = S, n = 6, 5 'CTTCTTTGAGCTTG 3 ')
(8TT ) 537mgを 5.21 mlの無水ァセ トニ ト リ ルに、 (8GC ) 192mgを 1.60 mlの無水ァセ トニ ト リ ルに、 (8GA ) 287mgを 2.30 mlの無水ァセ トニ ト リ ルに、 (8CT ) 190mgを 1.70 mlの無水ァセ トニ ト リ ルに、 N6- ベンゾィ ル- 3' -0-L2- シァノ エ トキシ -(N, N-ジ イ ソプ D ピルア ミ ノ) ホスフィ ン] -5' -0- (4.4' - ジメ トキシ ト リ チ ル) -2'- デォキシチ ミ ジン(ABI社製) 500 rogを 6.00 nilの無水ァセ トニ ト リ ルに、 それぞれ溶解した。 これを DNA 自動合成機 ( ABI社 製) で市販プログラムに従って合成したが、 ^下の点では独自の方 法をとつた。 (8TT) 537 mg to 5.21 ml anhydrous acetonitrile, (8GC) 192 mg to 1.60 ml anhydrous acetonitrile, (8GA) 287 mg to 2.30 ml anhydrous acetonitrile , (8CT) 190 mg in 1.70 ml of anhydrous acetonitrile, N 6 -benzoyl-3'-0-L2-cyanoethoxy- (N, N-diisop-D-piramino) phosphine ] -5'-0- (4.4'-dimethoxytrityl) -2'-deoxythymidine (manufactured by ABI) 500 rog was dissolved in 6.00 nil anhydrous acetonitrile. This was synthesized using an automatic DNA synthesizer (manufactured by ABI) according to a commercially available program, but the proprietary method was used for the following points.
① DMTr (ジメ トキシ ト リ チル) 基の除去に 3%ト リ ク ロ 口酢酸/ジ
ク ロ σメ タ ンの代わりに 10%ギ酸/ジク ロ ロメ タ ンを用い、 反応時 間を 90秒、 60秒、 30秒の 3回に分けた。 ②ョード酸化の代わりに TBTD (テ ト ラェチルチウ ラムジスルフ ィ ド) 試薬を使用した (反応 時間 900秒) 。 ③縮合時 Κを 600秒とした。 (1) 3% tri-acetic acid / diacetic acid for removal of DMTr (dimethoxytrityl) group The reaction time was divided into 90, 60, and 30 seconds using 10% formic acid / dichloromethane in place of the cro-sigma methane. (2) A TBTD (tetraethyl thiuram disulfide) reagent was used in place of oxidization (reaction time: 900 seconds). ③ During condensation 縮合 was set to 600 seconds.
反応はグ了ニン SNAF/CPGカ ラム ( 1 Λ«Μ) (ABI社製) を 2本用いて 行った。 反応終了後、 樹脂をカラムから取り出し、 DMF- 濃了ンモ ニァ水 =1:1 の溶液 5ϋ にて室温で 2 日処理し、 樹脂からの切出し と脱保護を行った。 The reaction was carried out using two Gurunin SNAF / CPG columns (1Λ «Μ) (manufactured by ABI). After completion of the reaction, the resin was taken out of the column, treated with 5ϋ of a solution of DMF-concentrated ammonia water = 1: 1 at room temperature for 2 days at room temperature, and cut out from the resin and deprotected.
溶媒を留去後、 50mM ΤΒΑΑ (酢酸ト リ ェチルアンモニゥム) (pH 7)緩衝液 5mlに溶解し、 ウ ォーターズプレップ RP - 18(55 〜105 u m) 125 A逆相クロマ トグラフィ ーにて分取精製を行った (0 = 10 mm X 100mm力 ラム) 。 After evaporating the solvent, dissolve in 5 ml of 50 mM triethylammonium acetate (pH 7) buffer, and apply to Waters Prep RP-18 (55 to 105 um) 125 A reverse phase chromatography. Preparative purification (0 = 10 mm x 100 mm force ram).
A 液 = 50mM TBAA(PH 7) 緩衝液 100ml、 B 液 = 40%了セ トニ ト リ ル/ 50mM TEAA(pH 7) 緩衝液 100ml Β¾'·0→100 のグラ ジェン ト に より溶出で行った。 DMTr基の発色 (酌酸によりオレンジ色となる) がするフラ ク ショ ンのみを分取し、 溶媒を'减圧留去し、 80%酢酸 ( 5 ml) で処理し、 室温にて 15分放置後、 TLCチユ ッ クにて、 DMTr基 の除去されたことを確認後、 溶媒を減圧留去する。 酢酸ェチルー水 にて分液抽出し、 水層を分取する。 溶媒を減圧留去後、 再度上記逆 相カ ラムにて精製すると、 目的物が 20.6 0. D. (260nmで測定) 得ら れた。 この目的物の高速液体ク ロマ トグラフィ ー(HPLC)のク ロマ ト ク ラムを図 1に示す。 HPLCによる分析は、 Lichrospher 100 RP - 18 (5jura 、 4 mml. D. x 125mm) カ ラム、 A 液 = 5%ァセ トニ ト リ ル Z50 mM TEAA(PH 7.0) 、 B 液 = 80% 了セ トニ ト リ ル ^OmM TEAA(pH 7.0
) 、 B¾: 0→B0 (15分) グラジェン ト、 流速 1 rolZ分の条件下で行 つた。 また、 水に対する溶解度は 0.5raMJil上であった。 Solution A = 50 mM TBAA (PH 7) buffer 100 ml, Solution B = 40% cetonitrile / 50 mM TEAA (pH 7) buffer 100 ml Β¾'0 → 100 . Only the fractions that develop the color of the DMTr group (the color becomes orange due to the acid added) are collected, the solvent is distilled off under reduced pressure, treated with 80% acetic acid (5 ml), and treated at room temperature for 15 minutes. After standing, confirm that the DMTr group has been removed by TLC check, and then distill off the solvent under reduced pressure. Separate and extract with ethyl acetate-water, and separate the aqueous layer. After evaporating the solvent under reduced pressure, the residue was purified again by the above-mentioned reversed-phase column to obtain 20.6.D. (measured at 260 nm). Fig. 1 shows the chromatogram of this target product by high-performance liquid chromatography (HPLC). Analysis by HPLC was performed on a Lichrospher 100 RP-18 (5 jura, 4 mml.D. x 125 mm) column, solution A = 5% acetate nitrile Z50 mM TEAA (PH 7.0), solution B = 80% Tonitrile ^ OmM TEAA (pH 7.0 ), B¾: 0 → B0 (15 minutes) Gradient, flow rate 1 rolZ minutes. The solubility in water was above 0.5raMJil.
実施例 2 —般式 〔 I〕 において X = 0、 Y= S、 n = 5、 5'TCTT TGAGCTTG3'である本発明物質 J [の合成 Example 2 - general formula [I] in X = 0, Y = S, n = 5, 5 'TCTT TGAGCTTG 3' in which the present invention material J [Synthesis of
ダイマ一ブロ ッ ク (B' = T 、 B2 = T ) 2 個、 _i (Bl = G 、 B2 = C ) 1個、 _ (B' = G 、 B2 = A ) 1個、 及び (BJ = C 、 B = T ) 1個を用意しこれらをホスホ ト リ エステル法により縮合して合成し た 0 Dimer one block (B '= T, B 2 = T) 2 amino, _i (B l = G, B 2 = C) 1 piece, _ (B' = G, B 2 = A) 1 piece, and (B J = C, B = T) were prepared and synthesized by condensing them by the phosphotriester method.
1. 下記ダイマーブロ ッ ク j (Bl = C bz、 Ba = T ) 〔以下 (6TT ) と略す〕 の合成 1. The following Daimaburo click j Synthesis of (B l = C bz, B a = T) [hereinafter (6TT) abbreviated]
C bzは Nに ペンゾィ ルシ ト シンを表す。 C bz represents N-pentylcytosine.
① の合成 ① Synthesis
N6- ベンゾィ ル- 5' -0- ジメ トキシ ト リ チル -2' -デォキシシチジ ン_11.90 g (和光純薬社製) をピリ ジン 15 mlに溶解し、 1, Γ - チォカルボ二ルジィ ミ ダゾール 1.34 gを加え、 40でで 5時 ¾加温 した。 実施例 1の①と同様に処理し、 目的物である _ (X°=S 、 B1 =C a) を 1.92 g得た。 収率 86%。 MS(PAB) :745 (MH + )N 6 -Benzoyl-5'-0-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine_11.90 g (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1.34 g was added, and the mixture was heated at 40 for 5 hours. The same treatment as in ① of Example 1 was carried out to obtain 1.92 g of _ (X ° = S, B 1 = C a ) which was the target substance. 86% yield. MS (PAB): 745 (MH +)
② 5の合成
①で得た 0.89 gの DMP 16 ml 溶液に j (B3 = T) 0.40 gを加 え、 室温で 2時閒処理した。 反応後、 実施例 1 の③と同様に処理し, シ リカゲルク ロマ ト (シ リ力ゲル 40g ) で精製し、 目的物である② Synthesis of 5 0.40 g of j (B 3 = T) was added to 0.89 g of the DMP 16 ml solution obtained in ①, and the mixture was treated at room temperature for 2 hours. After the reaction, the mixture is treated in the same manner as in 3 of Example 1, and purified by silica gel chromatography (silica gel 40 g).
(X°==S 、 B1 = C b Ba = T ) を白色面体で取得した (定量的) 。 (X ° == S, B 1 = C b B a = T) was obtained in white facepiece (quantitative).
S(FAB): 918(ΜΗ + ) S (FAB): 918 (ΜΗ +)
®_Iの合成 ®_I synthesis
②で得た 0.46 に リ ン酸化試薬 0.28M (C. Broka et al. , Nucleic Acids Res.,_8_, 5461-5472 (1980)) 2.70mlを加え、 室温 で 50分間攪拌した。 反応後、 50%ビリ ジン水 0.9mlを加え、 ジク 口 πメ タ ンと 0.5M 炭酸水素 ト リ エチルアンモニゥ ム水溶液で分配し, 有機層を濃縮乾固した。 この残揸をジク ロ πメ タ ン 5.0mlに溶解し、 n一へキサン ( 0.1% ト リ ェチル了 ミ ン) 45 ralで粉末化すると定量 的に j (B^C b B2 = T ) を得た。 2.70 ml of a phosphorylation reagent 0.28M (C. Broka et al., Nucleic Acids Res., _8_, 5461-5472 (1980)) was added to 0.46 obtained in ②, and the mixture was stirred at room temperature for 50 minutes. After the reaction, 0.9 ml of 50% pyridine solution was added, and the mixture was partitioned between π-methan pentamethine and a 0.5 M aqueous solution of triethylammonium bicarbonate, and the organic layer was concentrated to dryness. This residue is dissolved in 5.0 ml of dichloromethane and powdered with 45 ml of n- hexane (0.1% triethylamine). Quantitatively, j (B ^ C b B 2 = T) I got
2. 他のダイマ一ブロ ッ ク 6の合成 2. Synthesis of other dimer block 6
1. と同様の方法により J [のマニュアルによるホスホ ト リ エステ ル固相合成に必要なダイマーブ α ッ ク j (B^ = T 、 B2 = T ) 〔^下 C6TT ) , _6 (BJ = G ib 、 Ba = C bz) 〔以下 (6GC 》 〕 、 _J ( B' = G ib 、 B2=A bz) 〔以下 (A ) 〕 を合成した。 G ib は N-ィ ソブチ リ ルグ了ニンを、 A bzは N6- ペンゾィ ルアデニンを表す。 In the same manner as in 1., the dimer α j j (B ^ = T, B 2 = T) [^ lower C6TT), _6 (B J = G ib , B a = C bz ) [the following (6GC >>)] and _J (B '= G ib , B 2 = A bz ) [the following (A)] were synthesized, where G ib was N-isobutyril the Nin, a bz is N 6 - represents a Penzoi Ruadenin.
3. J [の合成 3. Synthesis of J [
マニュアルによるホスホ ト リ エステル固相合成の手順は、 文献 ( H. Ito et al. , ucleic Acids Res. , 10 , 1755-1769 (1982)) に 準じて行った。 The manual procedure for phosphotriester solid phase synthesis was performed according to the literature (H. Ito et al., Ucleic Acids Res., 10, 1755-1769 (1982)).
①榭脂 d(DMTr)G ib- ポ リ スチレン (和光純薬社製) 25mgをジクロ
ロ メ タ ン一メ タ ノ ール溶液 (7/3)で洗浄した。 ① 榭 d (DMTr) G ib- polystyrene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 25 mg The plate was washed with a solution of methanol and methanol (7/3).
②その樹脂を、 2. ジク口 πメタ ン一メタノ ール溶液で発色が 消えるまで短時 Mですばやく脱ト リチル化した。 (2) The resin was quickly detritylized with M for a short period of time until the color disappeared with a solution of 2.pi.-methanol in methanol.
③その榭脂を、 ビリ ジンで置換し、 共沸乾固し、 無水にする。 これ にダイマ一プロ ッ クのピリ ジ ン溶液を加え、 共沸乾固後、 MSNTと反 応用ビリ ジン 150〃 1 を加え、 室温で 40分間放置した後、 ピリ ジン で洗淨し 7 。 ③ Replace the fat with viridine, azeotropically dry to make it anhydrous. To this was added a dimer block pyridin solution, and after azeotropic drying, MSNT and anti-applied viridine 150〃1 were added. The mixture was allowed to stand at room temperature for 40 minutes, and then washed with pyridine.
④その樹脂に、 0.1 ジメチルァ ミ ノ ビリ ジンノビリ ジンの溶液 溶液 A solution of 0.1 dimethylamino viridine viridine in the resin
1.8mlと無水齚酸 0.2mlを加える。 室温で 2分問放置後、 ビリ ジン で洗淨し/"。 Add 1.8ml and 0.2ml anhydrous anhydride. After leaving for 2 minutes at room temperature, wash with viridine / ".
以上の操作を 5回操り返し、 最後に 5'-0-ジメ トキシ ト リチルチ ミ ジン一 3,-(2-ク D ロ フ ヱニル) ホスフ ヱ ー ト (シグマ社製) 20mg をダイマ ーブロ ッ クの代わりに加え、 ③までの処理をして縮合反応 を終えた。 Repeat the above operation 5 times, and finally dimer block 20 mg of 5'-0-Dimethoxytritylthymidine-1,3- (2-chlorophenyl) phosphate (Sigma). In addition to the above, the process up to ③ was completed to complete the condensation reaction.
平均収率 88%。 Average yield 88%.
その後樹脂を 0.3M のテ ト ラ メ チルダァニジン一 ピ リ ジン了ル ド キ シム(C. B. Reese et al. Tetrahedron Lett. , 2727 (1978)) ジ ォキサ ン水溶液で室温 24時間脱保護し、 ピリ ジン水で洗浄後、 洗液 を濃縮乾固し、 濃ア ンモニア水 ZDMF(1/1) 5.0mlを加え、 室温 24時 間で再度脱保護した。 The resin was then deprotected with a 0.3 M aqueous solution of dioxane (CB Reese et al. Tetrahedron Lett., 2727 (1978)) in dioxane at room temperature for 24 hours at room temperature. After washing with, the washing solution was concentrated to dryness, 5.0 ml of concentrated ammonia water ZDMF (1/1) was added, and the solution was deprotected again at room temperature for 24 hours.
反応液は、 逆相(Preparative C.e 125A 55-105 »ΙΏ ウ ォ ーター ズ社製) のオープンク ロマ トを行い、 純粋な目的物を 50 O.D. 得た。 この目的物の HPLCのク口マ トグラムを図 2に示した。 HPLCによる分 析は、 Lichrospher 100 RP-18 (5 im 、 4難 I. D. x 125mm) カ ラ ム、
A 液 =5%了セ ト ニ ト リ ル《 50mM TEAA(PH 7.0〉 、 B 液 = 80% ァセ ト 二 ト リ ル Z50mM ΤΒΑΑίρΗ 7.0) 、 Β¾: 0—50 (15分) グラジェン ト , 流速 1 ralZ分の条件下で行った。 また、 水に対する溶解度は、 1.0 mM以上であった。 The reaction solution is subjected to open click Roma preparative reversed phase (Preparative C. e 125A 55-105 manufactured »IO U O Ta Inc.) to afford the pure desired product 50 OD. Fig. 2 shows the HPLC chromatogram of this target compound. HPLC analysis was performed on a Lichrospher 100 RP-18 (5 im, 4 difficult ID x 125 mm) column, Solution A = 5% cetonitrile << 50mM TEAA (PH 7.0), Solution B = 80% acetonitrile Z50mM ΤΒΑΑίρΗ 7.0), Β¾: 0-50 (15 minutes) Gradient, flow rate The test was performed under the condition of 1 ralZ. The solubility in water was 1.0 mM or more.
実施例 3 —般式 〔 I 〕 において X - 0、 Y= 0、 η = 7、 S'TGCT TCTTTGAGCTTG3'である本発明物質 jの合成 Example 3 - general formula in [I] X - 0, Y = 0, η = 7, S Synthesis of 'TGCT TCTTTGAGCTTG 3' in which the present invention substances j
ダイマーブロ ッ ク (Dimer block ) である j (X°=0 、 B' = T 、 Ba = T ) 3個、 j (X°=0 、 Bl = G 、 B2=C ) 2個、 j (X°=0 、 B' = G 、 B2 = A ) 1個、 及び j (X°=D 、 Bl = C 、 B = T ) 個を用 意し、 これらをア ミ ダイ ト法により縮合して合成した。 T はチ ミ ン. G はグァニン、 C はシ ト シ ン、 A はアデニンを、 それぞれ表す。 J (X ° = 0, B '= T, B a = T) 3 j, X (X ° = 0, B l = G, B 2 = C) 2 j (X ° = 0, B ' = G, B 2 = a) 1 piece, and j (X ° = D, B l = C, B = T) number to use Thanked by these a Mi Daito method It was synthesized by condensation. T is thymine; G is guanine; C is cytosine; and A is adenine.
1. 下記ダイマーブロ ック J (X°=Q 、 B^T 、 B3 = T ) 〔以下 ( B'TT) と略す〕 の合成 1. Synthesis of the following Daimaburo click J (X ° = Q, B ^ T, B 3 = T) [hereinafter (B'TT) abbreviated]
5' -0- ジメ トキシ ト リチルチ ミ ジン _1 (和光純薬社製) 0.65gを ピ リ ジ ン 5 mlに溶解し、 1, Γ - カ ルボニルジイ ミ ダゾ一ル 0.23 g を加え、 室温下、 4時間反応した。 溶媒を減圧下留去後、 残渣をジ クロロメ タ ン一 5%リ ン酸二水素ナ ト リ ウム溶液で分液し、 ジク ロロ
メ タ ン液を水洗、 芒硝で乾燥後、 濃縮乾固して (X°= 0 、 B' = T ) を 0.70g (収率 91%) 得た。 0.65 g of 5'-0-dimethoxytritylthymidine_1 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in 5 ml of pyridin, and 0.23 g of 1, Γ-carbonyldiimidazole is added. Reacted for 4 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, the residue was partitioned with a 5 % solution of dichloromethane in sodium dihydrogen phosphate to give dichloromethane. The methane solution was washed with water, dried over sodium sulfate, and concentrated to dryness to obtain 0.70 g (91% yield) of (X ° = 0, B ′ = T).
② jの合成 ② Synthesis of j
5' - 了シ ド -5' -デォキシチ ミ ジン 3 (T. Hata et al. , Chem. 5'-Ryside-5'-Doxythymidine 3 (T. Hata et al., Chem.
Lett. , 977-980 (1975)) 2.2 gのメ タ ノ ール 220ml溶液に、 10%パ ラ ジウム炭素 0.66 gを加え、 室温で 3時閒接触還元した。 反応後、 セライ トを通して濾過し、 滤液を濃縮乾面すると、 」 (Ba = T ) を 1.67 g (収率 84%) 得た。 Lett., 977-980 (1975)) To 2.2 g of a 220 ml solution of methanol was added 0.66 g of 10% palladium carbon, and the mixture was subjected to catalytic reduction at room temperature for 3 hours. After the reaction was filtered through Celite the windows, and the concentrated dry surface滤液, "the (B a = T) to give 1.67 g (84% yield).
③ jの合成 ③ Synthesis of j
①で得た 0.70 gの DMF 8 ml溶液に、 ②で得た _J 0.35 gを加 え、 室温で 20時間反応した。 反応後、 真空ポンプで濃縮乾固し、 シ リ カゲルカ ラムク ロマ ト (シ リ カゲル 40 g、 メ タ ノ ール/ジク ロ 口メ タ ン) で精製し、 j (X°=D 、 B' = T 、 B3 = T ) 0.39 gを白 色面体で得た (収率 40%) 。 MS(PAB) : 812(MH + ) 0.35 g of _J obtained in ② was added to a solution of 0.70 g of DMF in 8 ml obtained in ① and reacted at room temperature for 20 hours. After the reaction, the solution is concentrated to dryness using a vacuum pump and purified using silica gel chromatography (silica gel 40 g, methanol / dichloromethane). J (X ° = D, B ' = T, B 3 = T) and 0.39 g was obtained in white color facepiece (40% yield). MS (PAB): 812 (MH + )
④ jの合成 ④ j synthesis
③で得た j 0.36 gを使用直前にビリ ジン共沸、 トルェン共沸及 び THP共沸し、 反応系を窒素ガスで置換後、 最後に無水 THF 4 mlに 溶解した。 これに N, N-ジイ ソプロ ピルェチル了 ミ ン 0.31 ml及び 2- シァノ エチル N, N-ジイ ソプロ ビルク π ホスホア ミ ダイ ト (了ル ド リ ツチ社製) 0.20 mlを加え、 室温で i時 K反応した。 濾液を濃 縮乾面後、 残渣を酢酸ェチル (窒素ガスで飽和したもの) 及び飽和 重曹水 (窒素ガスで飽和したもの) で分配し、 有機層を芒硝で乾燥 後、 再度濃縮乾固した。 この残渣を π-へキサン (窒素ガスで飽和し たもの) で粉末化すると、 8 (X°=0 、 B' = T 、 B2 = T ) 0.40s (
収率 90%) を白色固体で得た。 この jは直接、 DNA合成機 (ァブラ ィ ドバイオシステムズ社 (以下 「ABI 社」 ともいう) 製〉 のための ダイマーブ ッ クに使用した。 Immediately before use, 0.36 g of j obtained in ③ was azeotropically azeotroped with pyridine, azeotropic with toluene, and azeotroped with THP. The reaction system was replaced with nitrogen gas, and finally dissolved in 4 ml of anhydrous THF. To this was added 0.31 ml of N, N-diisopropyrethyl and 0.20 ml of 2-cyanoethyl N, N-diisoprovirk π-phosphoamidite (manufactured by Rydritz), and the mixture was added at room temperature. Reacted. After the filtrate was concentrated and dried, the residue was partitioned between ethyl acetate (saturated with nitrogen gas) and saturated aqueous sodium bicarbonate (saturated with nitrogen gas), and the organic layer was dried over sodium sulfate and concentrated again to dryness. When triturated with hexane the residue into .pi. (those saturated with nitrogen gas), 8 (X ° = 0 , B '= T, B 2 = T) 0.40s ( (90% yield) as a white solid. This j was used directly in a dimer book for a DNA synthesizer (manufactured by ABB) (hereinafter also referred to as “ABI”).
2. 他のダイマーブロ ック 8の合成 2. Synthesis of other dimer blocks 8
1. と同様の方法により自動固相合成機 ( ΑΒΙ社製) により必要 なダイマーブ ηッ ク 8 (X°=0 、 B^G 、 Ba=C ) 〔以下 (8'GC) 〕 、 J (X° = 0 、 Bl = G 、 Ba = A ) 〔以下 (8'GA) 〕 、 及び j (X° =D 、 B' = C 、 B2 = T ) 〔以下 (8'CT) 〕 を合成した。 1. automated solid phase synthesizer Daimabu required by (Arufabetaiota Co.) eta click 8 by the same method as (X ° = 0, B ^ G, B a = C) [hereinafter (8'GC)], J (X ° = 0, B l = G, B a = A) [hereinafter (8'GA)], and j (X ° = D, B '= C, B 2 = T) [hereinafter (8'CT) ] Was synthesized.
3. 9 (X°=Q 、 n = 7 5' TGCTTCTTTGAGCTTG3' ) の合成 3. 9 (X ° = Q, n = 7 5 'TGCTTCTTTGAGCTTG 3') Synthesis of
(8,TT) 400mgを 7.96 mlの無水ァセ トニ ト リ ルに、 (8'GC) (8, TT) 400 mg to 7.96 ml of anhydrous acetonitrile, (8'GC)
313tngを 5.23 mlの無水ァセ トニ ト リルに、 (8' GA) 180ragを 2.95 mlの無水了セ トニ ト リ ルに、 (8'CT) 213mgを 3.87 mlの無水了セ トニ ト リ ルに、 3, -0- [2 -シ了ノ エ トキシ - ( N-ジイ ソプ D ビルア ミ ン) ホスフィ ン] -5' -(]-(4· 4'- ジメ トキシ ト リ チル) チ ミ ジン(ABI 社製) 500 tngを 6.00 nilの無水ァセ トニ ト リ ルに、 それぞれ溶解し た。 これを DNA 自動合成機 ( ABI社製) で市販プログラムに従って 合成したが、 以下の点では独自の方法をとつた。 313 tng to 5.23 ml of anhydrous acetonitrile, (8 'GA) 180 rag to 2.95 ml of anhydrous acetonitrile, and (8'CT) 213 mg to 3.87 ml of anhydrous acetonitrile , 3, -0- [2-Synoethoxy- (N-diisop-D-bilamine) phosphine] -5 '-(]-(4.4'-Dimethoxytrityl) thymidine (ABI) 500 tng were dissolved in 6.00 nil anhydrous acetonitrile, respectively, and synthesized using an automatic DNA synthesizer (ABI) according to a commercial program. The method was taken.
① DMTr (ジメ トキシ ト リチル) 基の除去に 2%ト リ ク ロ口酌酸/ジ クロロメ タ ンの代わりに 10%ギ酸/ジク ロロメ タ ンを用い、 反応時 間を 90秒、 60秒、 30秒の 3回に分けた。 ②縮合時 ¾を 600秒、 600 秒の 2回に分けた。 (1) Use 10% formic acid / dichloromethane instead of 2% trichloroacetic acid / dichloromethane to remove the DMTr (dimethoxytrityl) group, and reduce the reaction time to 90 seconds, 60 seconds, Divided into 3 times of 30 seconds. ② During condensation ¾ was divided into 600 seconds and 600 seconds.
反応はグ了ニン SNAP/CPGカ ラム ( 1 (ABI社製) を 3本用いて 行った。 反応 了後、 榭脂をカ ラムから取り出し、 DMF- 濃アンモ ニァ水 =1:1 の溶液 lOtnlにて室温で 3 日処理し、 榭脂からの切出し
と脱保護を行った。 The reaction was carried out using three columns of GUNIN SNAP / CPG columns (1 (manufactured by ABI). After the reaction was completed, the resin was removed from the column, and a DMF-concentrated aqueous ammonia = 1: 1 solution lOtnl For 3 days at room temperature and cut out from resin And deprotection.
溶媒を留去後、 50mM TBAA (齚酸ト リ ェチルアンモニゥム) (pH 7)緩衝液 5ΓΠΠこ溶解し、 ウ ォ ーターズプレップ RP-1 55 〜: 105 m) After distilling off the solvent, 50 mM TBAA (triethylammonium phosphate) (pH 7) buffer solution was dissolved in 5 parts, and Waters Prep RP-1 55 ~: 105 m)
125 A逆相ク ロマ トグラフィ ーにて分取精製を行った (0 = 10關 X 100mm力 ラム) 。 Preparative purification was performed by 125 A reverse phase chromatography (0 = 10 × 100 mm column).
A 液 = 50mM TBAA(pH 7) 緩衝液 100ml、 B 液 = 35%ァセ トニ ト リ ル Z50mM TBAA(pH 7) 緩衝液 100ml B¾:0→100 のグラ ジェン ト に より溶出で行った。 DMTr基の発色 (酢酸によりオレンジ色となる) がするフラク ショ ンのみを分取し、 溶媒を減圧留去し、 80%酢酸 ( 5 ml) で処理し、 室温にて 30分放置後、 TLCチェ ッ クにて、 DMTr基 の除去されたことを確認後、 溶媒を減圧留去した。 酢酸ェチルー水 にて分液抽出し、 水層を分取すると目的物が 110 O.D. (260nm で測 定) 得られた。 この目的物の高速液体ク σマ トグラフィ ー(HPLC)の クロマ トグラムを図 3に示す。 HPLCによる分析は、 Lichrospher 100 RP-18 (5/ m 、 4 mml. D. 125mm) カ ラム、 A 液 =5%了セ トニ ト リ ル Z50mM TBAA(pH 7.0) 、 B 液 = 80% ァセ トニ ト リ ル 50mM TBAA( PH 7.0) 、 B¾: 0→50 (15分) グラジェン ト、 流速 lmlZ分の条件 下で行った。 また、 水に対する溶解度は 5tnM以上であった。 A solution = 100 mM TBAA (pH 7) buffer 100 ml, B solution = 35% acetonitrile Z50 mM TBAA (pH 7) buffer 100 ml B¾: Elution was performed with a gradient of 0 → 100. Only the fractions that develop the color of the DMTr group (it becomes orange due to acetic acid) are collected, the solvent is distilled off under reduced pressure, treated with 80% acetic acid (5 ml), and left at room temperature for 30 minutes. After checking that the DMTr group had been removed by a check, the solvent was distilled off under reduced pressure. Separation and extraction was performed with ethyl acetate-water, and the aqueous layer was separated to obtain the desired product (110 O.D. (measured at 260 nm)). Fig. 3 shows a chromatogram of the target product by high performance liquid chromatography (HPLC). HPLC analysis was performed on a Lichrospher 100 RP-18 (5 / m, 4 mml. D. 125 mm) column, solution A = 5% cetonitrile Z50 mM TBAA (pH 7.0), solution B = 80% acetate. The test was carried out under the conditions of 50 mM trinitrile TBAA (PH 7.0), B¾: 0 → 50 (15 minutes), gradient, and flow rate of 1 mlZ. The solubility in water was 5 tnM or more.
実施例 4 —般式 〔 I〕 において Χ = 0、 Υ = 0、 η = 5、 5'ΤΤΤΤ TTTTTTTT3'である本発明物質 jの合成 Example 4 - general formula [I] in Χ = 0, Υ = 0, η = 5, 5 Synthesis of 'ΤΤΤΤ TTTTTTTT 3' in which the present invention substances j
ダイマーブロ ック (Χ0=[) 、 Β' = Τ 、 Β2 = Τ ) 及びチ ミ ン SNAP/CPG カ ラム 1本を用い、 実施例 3と同様の方法にて合成及び精製 し、 目的物を 55 0. D. (260nm で測定) 得た。 この目的物の髙速液体 ク ロマ トグラフィ ー(HPLC)のク マ トグラムを図 4に示す。 HPLCに
よる分析は、 し ichrospher 100 RP-18 (5^m 、 4 mml. D. 125mm) カ ラム、 A 液 =5%ァセ トニ ト リル 50roM TBAA(pH 7.0) B 液- 80 % ァセ トニ ト リ ル/ 50tnM TBAA(PH 7.0) 、 %· 0→50 (15分) グラ ジェン ト、 流速 1 ml/分の条件下で行った。 試験例 1 本発明物質 (実施例 1 の物質) の HeLaS3-MDRl 細胞に おける P 蛋白質の合成抑制作用 Using the dimer block (Χ 0 = [), Β '= Τ, Β 2 = Τ) and one thymine SNAP / CPG column, synthesis and purification were performed in the same manner as in Example 3, and the desired product was obtained. 55.D. (measured at 260 nm). Figure 4 shows a high-speed liquid chromatographic (HPLC) chromatogram of this target product. HPLC Analysis was performed using ichrospher 100 RP-18 (5 ^ m, 4 mml. D. 125 mm) column, solution A = 5% acetonitrile 50roM TBAA (pH 7.0) solution B-80% acetonitrile The reaction was performed under the following conditions: Ril / 50tnM TBAA (PH 7.0),% 0 → 50 (15 minutes) gradient, flow rate 1 ml / min. Test Example 1 Inhibitory effect of the substance of the present invention (the substance of Example 1) on the synthesis of P protein in HeLaS3-MDRl cells
HeLaS3-MDRl 細胞を 6穴プレー トに 6 x 105 細胞 Zゥ ェルの密度 で蒔き、 24時間後及び 48時間後に被験物質 をリ ポフ ユ クチン (BRL 社製。 登録商標) (3 ju g/ ml最終濃度) と混合して、 細胞 に添加した。 72時間後に細胞を界面活性剤 ( ト リ ト ン Triton X-100 NP40 ) で溶解し、 ヒ ト P 蛋白質に対するモノ ク ローナル抗体 C219 (セン ト コ了社製) を用いてラジオイ ミ ノ ブレシビテーシヨ ンを行 い、 合成された P 蛋白質の量をイ メージアナライザー (BAS2000)を 用いて放射活性により測定した。 表 1 HeLaS3-MDRl cells are seeded on a 6-well plate at a density of 6 × 10 5 cells / well, and after 24 hours and 48 hours, the test substance is lipofuctin (BRL, registered trademark) (3 jug). / ml final concentration) and added to the cells. After 72 hours, the cells were lysed with a detergent (Triton X-100 NP40), and radioimmunoassay was performed using a monoclonal antibody C219 against human P protein (manufactured by Centco Ryo). The amount of the synthesized P protein was measured by radioactivity using an image analyzer (BAS2000). table 1
n 細胞のみ n cells only
85 に リ ボフヱ クチンを加えたもの 85 plus Libofectin
35 2)にアンチセ ス核酸 9を加えたもの 35 2) plus antisense nucleic acid 9
" "にホスホ チォエー トのみからなるアンチセンス核酸 : 配列は同じ (文献 Stec. W. J. et al. , J. Am. Chem. Soc. Antisense nucleic acid consisting of only phosphothioate in "": the same sequence (references Stec. W. J. et al., J. Am. Chem. Soc.
106, 6077-6079 (1984)) を加えたもの
本発明物質は、 現在ア ンチセ ンス核酸と して有望なものよりも活 性が強かった。 106, 6077-6079 (1984)) The substances of the present invention were more active than those currently promising as antisense nucleic acids.
試験例 2 本発明物質の核酸分解酵素 (Nuclease に対する抵抗 性 Test Example 2 Resistance of the substance of the present invention to nuclease
本発明物質 (X = 0、 Y= S、 n - 3、 S' GATCGATC3' ) を被験物 質と した。 コ ン ト ールとして、 同じ配列を有する天然 DNAォ リ ゴ マーを用いた。 The present invention substances (X = 0, Y = S , n - 3, S 'GATCGATC 3') was used as the test substance. As the control, a natural DNA oligomer having the same sequence was used.
各サ ンプルを 30mM酢酸緩衝液 (ΡΗ 4.6) 、 50mM食塩、 Im 塩化亜 鉛溶液に 25/xM 濃度になるように調製し、 核酸分解薛素 (Nuclease Each sample was prepared at a concentration of 25 / xM in 30 mM acetate buffer (ΡΗ4.6), 50 mM sodium chloride, and Im-zinc chloride solution.
S,) (ベー リ ンガー ' マ ンハイ ム山之内社製) を 10U/ml濃度になる ように加えた。 37tにてイ ンキュベー ト した。 反応液をサ ンプリ ン グし、 HPLCにて分解度をチェッ ク した。 結果を図 5、 図 6、 図 7及 び図 8 に示す。 HPLCによる分析は、 Lichrospher RP-18 ( 4 mml. D. S,) (Boehringer's Mannheim Yamanouchi) was added to a concentration of 10 U / ml. Incubated at 37t. The reaction solution was sampled, and the degree of decomposition was checked by HPLC. The results are shown in Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7 and Fig. 8. Analysis by HPLC was performed using Lichrospher RP-18 (4 mml.
125mm) カ ラ ム、 A 液 =5%ァセ ト ニ ト リ ル ZlOmM TBAA(pH 7.0) 、 B 液 = 80% 了セ ト ニ ト リ ル ZlOmM TBAA(pH 7.0) 、 図 5及び図 6 に おいては B%: 0—30 (15分) グラジェン ト、 図 7及び図 8 において は^: 0—50 (15分) グラジェン ト、 流速 1 ml/分の条件下で行つ た。 コ ン ト ロ ールの DNAが 1分ほどでほぼ原料が消失してしまうの に対して本発明物質は 1時 ¾反応後においてでも、 ほぼ 100%分解 されずに残っていた。 (125mm) Column, solution A = 5% acetonitrile ZlOmM TBAA (pH 7.0), solution B = 80% complete set nitrile ZlOmM TBAA (pH 7.0), see Figures 5 and 6 B%: 0-30 (15 minutes) gradient, and in FIGS. 7 and 8, ^: 0-50 (15 minutes) gradient, and the flow rate was 1 ml / min. While the control DNA almost disappeared in about 1 minute, the substance of the present invention remained almost 100% undegraded even after 1 hour reaction.
試験例 3 物理化学的性質 Test Example 3 Physicochemical properties
1. 融解曲線 (Tm値の測定) 1. Melting curve (measurement of Tm value)
核酸同士が複合体を形成している場合、 温度を上げてゆく とある 温度の前後で急激に吸光度が増大する。 これは核酸のいわゆる淡色
効果(hypochroraicity)の減少によるものであるが、 この前後の吸光 度差の 2分の 1 まで吸光度が增大したときの温度 (以下 「Τπυ とい う) を測定することにより、 核酸との複合体形成能を知ることがで さ な。 When nucleic acids form a complex, the absorbance increases rapidly around a certain temperature as the temperature is increased. This is the so-called light color of nucleic acids This is due to the decrease in effect (hypochroraicity). By measuring the temperature at which the absorbance increased to one half of the absorbance difference before and after this (hereinafter referred to as “ππ”), the complex with the nucleic acid was measured. You can know the forming ability.
本発明物質」 (実施例 2の物質) とこれに相補的な天然のデォキ シ リ ボオ リ ゴヌク レオチ ド (3' AGAAACTCGAAC5') との複合体を形成 させ、 '図 9 に示すよ όな融解曲線を得た。 この融解曲線は、 サンブ ル濃度 65 Μ 、 0.15 塩化ナ ト リ ウム、 lOtnMリ ン酸ナ ト リ ウム (PH 7.0) 、 昇温速度 0.5 分の条件下で測定したものである。 The present invention substance "to form a complex of (Example 2 materials) and complementary thereto native Doki Shi Li Boo Li Gonuku Reochi de (3 'AGAAACTCGAAC 5'), ' a ό by that shown in FIG. 9 Melting curves were obtained. This melting curve was measured under the conditions of a sample concentration of 65Μ, 0.15% sodium chloride, 10M sodium phosphate (PH 7.0), and a heating rate of 0.5 minutes.
図 9から明らかなように、 本発明物質は、 強く複合体を形成して いた (Tm 40.9 t) 。 As is clear from FIG. 9, the substance of the present invention strongly formed a complex (Tm 40.9 t).
2. 複合体の化学構造 (CDの測定) 2. Chemical structure of the complex (measurement of CD)
化合物のもつ吸収帯において、 右円偏光、 左円偏光のモル吸光係 数がそれぞれ異なるとき、 この化合物は円二色性 ( 「CD」 という) を示すという。 特に核酸において、 その立体構造、 立体配座を決定 When the right-handed circularly polarized light and the left-handed circularly polarized light have different molar absorption coefficients in the absorption band of the compound, the compound is said to exhibit circular dichroism (referred to as “CD”). Determine the three-dimensional structure and conformation, especially for nucleic acids
^"る ί日 ¾匚 な O ^ "る ί
天然の DNAは CDの測定結果から、 生理的条件下では B型をとるこ とが知られている (V. I. Ivanov et al. , Biopolymer 12, 89-100 (1973)) ο Natural DNA is known to take Form B under physiological conditions from the results of CD measurement (VI Ivanov et al., Biopolymer 12, 89-100 (1973)) ο
この Β型 DNAは、 特殊な条件下 (高塩 度、 低湿度) に置かれた 場合にのみ、 C型 DNAに転移することが認められている (A. G. W. Lesic et al. , J. Mol. Biol. 143, 49-72 (1980))。 This type I DNA has been shown to transfer to type C DNA only when exposed to special conditions (high salinity, low humidity) (AGW Lesic et al., J. Mol. Biol. 143, 49-72 (1980)).
本発明物質と相補的デォキシ リ ボオ リ ゴヌク レオチ ドとの複合体 の CD曲線 (図 1 0 ) を、 本発明物質の代わりに同じ配列を有する天
然の DNAを用いた場合 (図 1 1 ) を併記して示す。 この CD曲線は、 サンプル'濃度 65 Μ 、 0. 15M 塩化ナ ト リ ウム、 10mMリ ン酸ナ ト リ ゥ ム (PH 7. 0) 、 温度 l O tの条件下で測定したものである。 The CD curve (FIG. 10) of the complex of the substance of the present invention and the complementary deoxyribonucleotide is shown in the figure for a conjugate having the same sequence instead of the substance of the present invention. The case using natural DNA (Fig. 11) is also shown. This CD curve was measured under the conditions of a sample concentration of 65%, 0.15M sodium chloride, 10mM sodium phosphate (PH 7.0), and a temperature lOt.
図 1 0から明らかなように、 本発明物質を用いた場合には、 通常 の生理的条件下では極めて稀な C型 DNAをとることが判った。 同じ 測定条件下において天然の DNAを用いた場合は、 異型的な B型 DHA を示していた。 As is clear from FIG. 10, it was found that when the substance of the present invention was used, C-type DNA was extremely rare under normal physiological conditions. Using natural DNA under the same assay conditions indicated atypical B-type DHA.
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1 は、 実施例 1 で得た本発明物質の髙速液体ク口マ トグラフィ 一 ( HPLC) のク πマ トグラムを表す。 縦軸は吸光度(260nm) を、 横 軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 1 shows a π-matogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 1. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
図 2 は、 実施例 2で得た本発明物質の髙速液体ク 口マ トグラフィ 一 ( HPLC) のク ϋマ トグラムを表す。 縦軸は吸光度(260nm) を、 橫 軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 2 shows a high-speed liquid chromatography (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention obtained in Example 2. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the vertical axis represents time (minutes).
図 3は、 実施例 3で得た本発明物質の髙速液体ク σマ トグラ フィ 一 ( HPLC) のクロマ トグラムを表す。 縦軸は吸光度(260nm) を、 攢 軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 3 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 3. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the vertical axis represents time (minutes).
図 4は、 実施例 4で得た本発明物質の髙速液体ク マ トグラ フィ 一 ( HPLC) のク ロマ トグラムを表す。 縦軸は吸光度(260ntn) を、 橫 軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 4 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the substance of the present invention obtained in Example 4. The vertical axis represents absorbance (260 ntn), and the vertical axis represents time (minutes).
図 5は、 試験例 2でチヱ ック した酵素添加前の天然 DNAォ リ ゴマ 一の髙速液体ク ロマ トグラフィ ー (HPLC) のク ロマ ト グラムを表す。 縦軸は吸光度(260nm) を、 横軸は時 M (分) をそれぞれ表す。 FIG. 5 shows a chromatogram of high-speed liquid chromatography (HPLC) of the natural DNA oligomer before addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents hours M (minutes).
図 6 は、 試験例 2でチェ ック した酵素添加後の天然 DNAォ リ ゴマ
一の高速液体ク ロマ トグラフィ ー (HPLC) のク ϋマ トグラムを表す。 縦軸は吸光度(260nro) を、 横軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 Figure 6 shows the natural DNA polymerase after addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2. Figure 1 shows a high-performance liquid chromatographic (HPLC) chromatogram. The vertical axis represents absorbance (260nro), and the horizontal axis represents time (minutes).
図 7は、 試驗例 2でチ ッ ク した酵素添加前の本発明物質の髙速 液体ク口マ トグラフィ ー (HPLC) のクロマ トグラムを表す。 縦軸は 吸光度(260nm) を、 横軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 7 shows a high-speed liquid chromatographic (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention before addition of the enzyme, which was tested in Test Example 2. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
図 8は、 試験例 2でチ t ック した酵素添加後の本発明物質の髙速 液体ク 口マ トグラフィ ー (HPLC) のクロマ トグラムを表す。 縦軸は 吸光度(260nm) を、 横軸は時間 (分) をそれぞれ表す。 FIG. 8 shows a high-performance liquid chromatographic (HPLC) chromatogram of the substance of the present invention after addition of the enzyme, which was checked in Test Example 2. The vertical axis represents absorbance (260 nm), and the horizontal axis represents time (minutes).
図 9は、 試験例 3で測定した融解曲線を表す。 縦軸は相対吸光度 を、 横軸は温度を表す。 FIG. 9 shows the melting curve measured in Test Example 3. The vertical axis represents relative absorbance, and the horizontal axis represents temperature.
図 1 0は、 試験例 3で測定した本発明物質と相補的デォキシ リ ポ オ リ ゴヌク レオチ ドとの複合体の CD曲線を表す。 縦軸は分子楕円率 を、 横軸は波長を表す。 FIG. 10 shows a CD curve of a complex of the substance of the present invention and a complementary dextrin liponucleotide measured in Test Example 3. The vertical axis represents the molecular ellipticity, and the horizontal axis represents the wavelength.
図 1 1 は、 試験例 3で測定した天然の DNA 二重鎖の CD曲線を表す。 縦軸は分子楕円率を、 横軸は波長を表す。
FIG. 11 shows the CD curve of the natural DNA duplex measured in Test Example 3. The vertical axis represents the molecular ellipticity, and the horizontal axis represents the wavelength.
Claims
1 . 次の一般式 〔 I〕 1. The following general formula [I]
〔 I〕 [I]
(式中、 X、 Yは、 同一又は異なって、 S又は 0を表す。 B B 2、 B3、 B4は、 同一又は異なって、 アデニン、 グァニン、 ヒボキサンチ ン、 シトシン、 チミ ン又はゥラシルを示す。 nは、 1 以上の整数を 示す。 ただし、 nが 2以上の場合には、 B2及び B3は、 同一の塩基に 限定されない。 ) で表される核酸同族体。
(Wherein, X and Y are the same or different and represent S or 0. BB 2 , B 3 and B 4 are the same or different and represent adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine or peracil N represents an integer of 1 or more, provided that when n is 2 or more, B 2 and B 3 are not limited to the same base.
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-
1993
- 1993-05-24 WO PCT/JP1993/000684 patent/WO1993024512A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, Vol. 42, No. 4, p. 703-706, (1977), W.S. MUNGALL et al., "Carbamate Analogues of Oligonucleotides". * |
NUCLEOSIDE & NUCLEOTIDES, Vol. 9, No. 2, p. 259-273, (1990), M.J. DE VOS et al., "Solid Phase Nonisotopic Labeling of Oligodeoxy Nucleotides Using 5'-Protected Aminoalkyl Phosphoramidates". * |
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