DE3822406A1 - Verfahren zur herstellung von nucleinsaeurederivaten und verfahren zur herstellung von diese enthaltenden medizinischen zusammensetzungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäurederivaten und ein Verfahren zur Herstellung von diese Derivate enthaltenden medizinischen Zusammensetzungen.

Nucleinsäuren bestehen aus Purinringen oder Pyrimidinringen und an diese Ringe gebundener Ribose oder dergleichen Zuckern, wobei diese konstitutionellen Elemente miteinander oder über eine Phosphatbrücke unter Bildung einer Kettenstruktur verbunden sind.

Unter den Nucleinsäuren ist RNA (Ribonucleotidpolymer) eine makromolekulare Verbindung mit Kettenstruktur mit Ribose als Zucker, wobei die Zuckergruppen miteinander über eine Phosphatbrücke durch die Diesterbindung verbunden sind. Bei den doppelsträngigen Nucleinsäuren sind die Purinring- oder Pyrimidinringgruppen der die Nucleinsäure bildenden Basen (beispielsweise Inosin, Adenosin, Cytidin, Uridin usw.) durch eine sogenannte komplementäre Wasserstoffbrückenbindung verbunden, wobei eine sterische Doppelhelixstruktur erhalten wird. Da von Nucleinsäuren mit doppelsträngiger Struktur erwartet wird, daß sie nützliche physiologische Funktionen haben, sind diese Nucleinsäuren bisher zahlreichen Untersuchungen unterzogen worden (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, usw.).

Unter den Nucleinsäuren dieser Art gibt es als eine synthetische doppelsträngige RNA Polyinosinsäure/Polycytidylsäure-Derivat, das nachstehend als "Poly-I/Poly-C"-Derivat bezeichnet wird; die Polyinosinsäure, die eine Bestandteilgruppe dieses Derivats ist, wird als "Poly-I" und die Polycytidylsäue als "Poly-C" bezeichnet.

In neuerer Zeit sind zahlreiche natürliche und synthetische doppelsträngige RNAs mit interferoninduzierender Fähigkeit bekanntgeworden (Field et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U. S., 58, 1004, 1967; Field et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U. S., 58, 2102, 1967; Field et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U. S., 61, 340, 1968; Tytell et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U. S., 58, 1719, 1967; Field et al., J. Gen. Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al., Methods in Enzymology, 78, 291, 1981).

Typische Beispiele für diese synthetischen Nucleinsäurederivate sind nachstehend angeführt.

Synthetische Nucleinsäurederivate für Interferon-Inducer

• (I) Homopolymer/Homopolymer-Komplexe (doppelsträngige Nucleinsäurepolymere mit Poly-I/Poly-C als Elternstruktur:
  • (1) Basenmodifizierte Derivate:
    Polyinosinsäure/Poly(5-bromcytidylsäure);
    Polyinosinsäure/Poly(2-thiocytidylsäure);
    Poly(7-deazainosinsäure)/Polycytidylsäure);
    Poly(7-deazainosinsäure)/Poly(5-bromcytidylsäure);
  • (2) Zuckermodifizierte Derivate:
    Poly(2′-azidoinosinsäure)/Polycytidylsäure.
  • (3) Phosphorsäuremodifizierte Derivate:
    Polyinosinsäure/Poly(cytidin-5′-thiophosphorsäure).
• (II) Intern modifizierte Copolymere:
  Poly(adenylsäure-uridylsäure).
• (III) Homopolymer/Copolymer-Komplexe:
  Polyinosinsäure/Poly(cytidylsäure,uridylsäure);
  Polyinosinsäure/Poly(cytidylsäure,4-thiouridylsäure).
• (IV) Synthetische Säure/Polykation-Komplexe:
  Polyinosinsäure/Polycytidylsäure/Poly-L-lysin (nachstehend bezeichnet als "Poly-ICLC").
• (V) Andere:
  Polyinosinsäure/Poly(1-vinylcytidylsäure).

Wie erwähnt, ist in neuerer Zeit über verschiedene Arten von doppelsträngigen RNAs berichtet worden, insbesondere über Poly-I/Poly-C als Elternkörper enthaltende Derivate. Bezüglich der Beziehung zwischen der Struktur der Derivate und ihren Funktionen gibt es für eine Reihe von Nucleinsäurederivaten einschließlich der genannten eine gesicherte Theorie (De Clercq et al., Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).

Auf der Grundlage des vorstehend erläuterten Standes der Technik wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß, wenn Poly-I/Poly-C und verschiedene die Poly-I/Poly-C-Gruppe als Elternkörper enthaltende Derivate davon kalibriert werden, so daß die insgesamte Molekülgrößenverteilung der Derivate, ausgedrückt durch ihre Sedimentationskonstante, innerhalb eines Bereiches von 4S bis 13S liegt (oder, ausgedrückt durch die Basenanzahl der Derivate, 50 bis 10 000 oder in dieser Größenordnung beträgt), können die so kalibrierten Derivate eine beachtlich niedrigere Toxizität aufweisen und auch die nachstehend erläuterten physiologischen Eigenschaften haben. Als Folge davon wurden Patentanmeldungen in Japan eingereicht (japanische Patentanmeldung No. 62-1 67 433 und eine weitere Patentanmeldung mit der Priorität dieser Anmeldung No. 62-1 67 433).

Neben den vorstehend erläuterten Untersuchungen wurde erfindungsgemäß nach verschiedenen Mitteln geforscht mit dem Ziel, diese Produkte effektiv herstellen zu können. Insbesondere wurde verschiedentlich nach Methoden, Nucleinsäurederivate mit einer Molekülgrößenverteilung von 50 bis 10 000 oder in dieser Größenordnung, als Anzahl ihrer Basen, zu kalibrieren und doppelsträngige Nucleinsäurepolymere aus zwei Arten von einsträngigen Nucleinsäurepolymeren auszubilden, gesucht. Was die ersteren Methoden betrifft, so wird der Vorgang der Begrenzung der Molekülgrößenverteilung der Nucleinsäurederivate auf einen vorbestimmten Bereich nachstehend als "Kalibrieren" (sizing) bezeichnet. Da das Kalibrieren bei dem Verfahren nach der Erfindung von einer Umwandlung in niedermolekulare Substanzen begleitet ist, bedeutet das Kalibrieren eine "Ketten-Verkürzung". Diese letztere Maßnahme wird nachstehend als "Erhitzen" (annealing) bezeichnet.

Das Basenpaar (nachstehend abgekürzt "BP"), das im allgemeinen als die Einheit zum Repräsentieren der Molekülgröße der Nucleinsäuren benutzt wird, kann zum Repräsentieren der Molekülgröße der Nucleinsäuren anhand der Anzahl der die Nucleinsäure bildenden Basen verwendet werden. (Beispielsweise bedeutet 10 BP, daß das doppelsträngige Polymer aus 10 Basenpaaren besteht.) In der vorliegenden Beschreibung wird neben den Nucleinsäurepolymeren auch auf andere Nucleinsäurepolymere als die doppelsträngigen Bezug genommen, und deshalb wird hier der Ausdruck "Basenanzahl (Anzahl der Basen)" anstelle von "BP" zum Repräsentieren der Molekülgröße der Nucleinsäuren verwendet. (Beispielsweise bedeutet ein Nucleinsäurepolymer mit einer "Baseanzahl von 10", daß das Polymer 10 Basen enthält.)

Wenn die Molekülgröße der Nucleinsäure bestimmt oder identifiziert werden soll, wird im allgemeinen in breitem Rahmen die sogenannte Sedimentationskonstante (S-Wert) verwendet. Die Erfindung konnten die vorstehend erwähnte Basenzahl der Nucleinsäure mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule oder der Elektrophorse (die nachstehend noch im einzelnen erläutert sind) ermitteln, wobei doppelsträngige DNAs (M13phage-DEN-Fragmente) mit bekannten Molekülgrößen als Anzeiger verwendet werden und die Basenzahl der zu bestimmenden Nucleinsäure auf der Basis der Anzahl des Vergleichs berechnet wird.

Bislang ist die Sedimentationskonstante (S-Wert) verbreitet für die Repräsentation des Molekulargewichts von makromolekularen Nucleinsäuresubstanzen verwendet worden. Makromolekulare Nucleinsäuresubstanzen, die im Handel sind, werden mit Hilfe ihrer S-Werte repräsentiert. Wegen des Fortschritts der Experimentaltechniken in den letzten Jahren wurde jedoch eine Methode zur genaueren Bestimmung des Molekulargewichts von makromolekularen Substanzen durch Anwendung der Gelelektrophorese, der Gelfiltrationschromatographie, der Ionenaustauschchromatographie od. dgl. bereitgestellt, so daß die Bestimmung der Kettenlänge der makromolekularen Nucleinsäuresubstanzen möglich geworden ist. Bei der vorliegenden Situation würde die Beziehung zwischen der Repräsentation des S-Wertes und der Repräsentation der Kettenlänge problematisch werden. Da insbesondere die jeweiligen Nucleinsäuremoleküle im Falle der Repräsentation durch den S-Wert ihre Eigenwerte haben, gibt es nicht immer irgendwelche Probleme in dem Punkt, ob die Repräsentation durch den S-Wert und die Repräsentation durch die Kettenlänge als Mittel zum Repräsentieren des Molekulargewichts der Nucleinsäuren einander genau entsprechen können oder nicht.

Dementsprechend wird in Übereinstimmung mit dem konventionellen Weg auf dem Gebiet der Nucleinsäurechemie für die Angabe des Molekulargewichts der erfindungsgemäßen Nucleinsäurepolymeren die Repräsentation durch den S-Wert gleichfalls in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet. Da jedoch der "S-Wert" durch eine Methode erhalten wird, bei der das Molekulargewicht von makromolekularen Nucleinsäuresubstanzen in Form der Molekülmasse als Ganzes (oder in der Form des Molekülzustandes der Substanz) gemessen wird, wird die Repräsentation auf der Basis der Messung der Kettenlänge der Substanz (die die "Basenzahl" ist, wie vorstehend erwähnt) ebenfalls hier neben dem genannten "S-Wert" genannt. Dies geschieht vor allem deshalb, weil die Begrenzung der Molekulargewichtsverteilung bei der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung genauer definiert werden muß.

In Übereinstimmung mit konventionellen Methoden zum Kalibrieren von Poly-I/Poly-C und verschiedenen Derivaten davon mit dem Poly-I/Poly-C als Elternkörper zur Gewinnung von kalibrierten doppelkettigen Nucleinsäurepolymeren werden bereits existierende doppelkettige Nucleinsäurepolymere zu niedermolekularen Verbindungen zersetzt, oder alternativ werden einsträngige Nucleinsäuren vor dem Erhitzen zu niedermolekularen Verbindungen hydrolysiert. Die konventionellen Methoden sind jedoch zum Erzeugen des beabsichtigten Produkts in großtechnischem Maßstab unzureichend, weil das Kalibrieren eine lange Zeit erfordert und das Verfahren nicht schnell durchgeführt werden kann. Außerdem sind die konventionellen Methoden hinsichtlich der Produktausbeute nicht immer zufriedenstellend.

Wenn auf der anderen Seite einsträngige Nucleinsäurepolymere nach dem Kalibrieren sulfuriert werden müssen, geschieht dies mit Schwefelwasserstoff, der dann bei den herkömmlichen Methoden aus dem Lösungsmittel verdampft wird. Das Pyridin wird nämlich aus der Reaktionslösung nach der Sulfurierung beispielsweise mit einer Vakuumpumpe verdampft, so daß der Schwefelwasserstoff gemeinsam mit dem Pyridin durch Verdampfung aus der Reaktionslösung entfernt werden kann. Bei diesem Verfahren entweicht der Schwefelwasserstoff jedoch in die Luft, so daß die Anwendung dieses Verfahrens im großtechnischen Maßstab aus Umweltschutzgründen nachteilig ist. Außerdem wird bei diesem Verfahren die nach dem Verdampfen des Pyridins abgetrennte wäßrige Schicht zur Dialyse gegen fließendes Wasser in ein Dialyserohr gegeben, um so das Zielprodukt zu erhalten. Das Verfahren erfordert jedoch mindestens 3 Tage für den vollständigen Vorgang, und die Produktausbeute liegt in der Größenordnung von höchstens 80%. Somit hat die konventionelle Methode hinsichtlich der Produktausbeute, der Herstellungskosten und der Arbeitszeit zahlreiche technische Nachteile.

Von der Kalibriertechnik kann ebenfalls nicht gesagt werden, daß sie bei den Verfahren des Standes der Technik ohne Schwierigkeiten wäre.

Auf diesem technischen Gebiet ist es allgemein üblich, daß ein Nucleinsäurepolymer in Gegenwart von Formaldehyd erhitzt wird, um es in niedermolekulare Verbindungen zu hydrolysieren. Bei dieser konventionellen Methode werden durch genaue Steuerung der Reaktionszeit und der Reaktionstemperatur Produkte mit der gewünschten Kettenlänge erhalten, und dann wird die Reaktionslösung der Dialyse unterzogen, um etwelche zu stark zersetzte Verbindungungen mit übermäßig kleiner Molekülgröße zu entfernen. Bei dem herkömmlichen Verfahren werden jedoch entsprechend den Eigenschaften der verwendeten Nucleinsäurepolymeren durch das Kalibrieren Verbindungen mit völlig unterschiedlicher Molekulargewichtsverteilung erhalten, selbst wenn die Reaktionsbedingungen konstant gehalten werden. Deshalb ermangelt es diesem Verfahren an Reproduzierbarkeit. Der Grund hierfür ist darin zu sehen, daß, da die Ausgangsstoffe für die Verwendung bei dem Verfahren durch eine Enzymreaktion erhalten werden, die Größe der Ausgangsstoffe nicht konstant definiert werden kann. Außerdem ist es durch die bei der Methode angwendete Dialyse im Prinzip unmöglich, Nucleinsäurepolymere mit größerer Kettenlänge als die gebildeten Produkte zu entfernen. Unter diesen Umständen sind grundlegende Maßnahmen zum Ausschalten der vorstehend erläuterten Probleme des Standes der Technik wünschenswert.

Deshalb wurden erfindungsgemäß zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um die folgenden Aufgaben zu lösen:

• (1) Kalibrierte doppelsträngige Nucleinsäurepolymere werden durch ein rasch ablaufendes Verfahren erhalten.
• (2) Die Produktausbeute ist hoch.
• (3) Selbst wenn das Verfahren in großtechnischem Maßstab durchgeführt wird, treten keine Umweltbelastungen oder andere Schwierigkeiten auf.
• (4) Eine ganze Reihe von Arbeitsgängen des Verfahrens läuft ausreichend quantitativ ab und ist reproduzierbar.

Als Folge dieser Untersuchungen gelangte man zu der vorliegenden Erfindung, die folgendes bewirkt:

(1) ein Verfahren zum Erzeugen von doppelsträngigen Nucleinsäurederivaten mit RNA als Elternkörper, wobei die gesamte Molekülgrößenverteilung innerhalb eines Bereiches von 4S bis 13S, ausgedrückt durch ihre Sedimentationskonstante, liegt, wobei die Nucleinsäurepolymeren vor dem Erhitzen kalibriert werden, und
(2) ein Verfahren zum Erzeugen von doppelkettigen Nucleinsäurederivaten mit RNA als Elternkörper, wobei die Moleküle für die maximale Verteilung der insgesamten Molekülgrößenverteilung der Derivate eine Basenzahl innerhalb eines Bereiches von 50 bis 10 000 haben, wobei die Nucleinsäurepolymeren vor dem Erhitzen kalibriert werden.

Genauer gesagt liegt der Kernpunkt der vorliegenden Erfindung in den folgenden Merkmalen:

(1) Einkettige Nucleinsäurepolymere werden vor dem Erhitzen kalibriert.
(2) Für das Kalibrieren in Stufe (1) wird anstelle der herkömmlichen Elektrophorese die HPLC (Gelfiltrations-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) angewendet, so daß die Fluktuation der Molekülgrößenverteilung leicht überprüft werden kann, so daß Produkte mit dem beabsichtigten Molekülgrößenverteilungsbereich von 4S bis 13S (ausgedrückt als die Sedimentationskonstante) (oder von 50 bis 10 000 oder in dieser Größenordnung als die Basenzahl) rasch erhalten werden können. Das schnelle und genaue Verfahren der Selektion der Produkte mit der gewünschten Kettenlänge stellt die vorliegende Erfindung dar.
(3) Nach dem Kalibrieren kann zum Isolieren des Produktes ein niederer Alkohol der Reaktionslösung zugesetzt werden (bei den herkömmlichen Methoden werden die Produkte durch Dialyse erhalten). Die vorliegende Erfindung enthält eine außerordentlich einfache Isolationsstufe, wodurch die Produktausbeute erhöht wird.
(4) Nach dem Kalibrieren werden, wenn die kalibrierten einkettigen Nucleinsäurepolymeren sulfuriert werden müssen, die Polymeren zunächst mit Schwefelwasserstoff sulfuriert, und dann, nachdem ein Arylalkohol zu der sulfurierten Reaktionslösung zugesetzt worden ist, wird die erhaltene Lösung zentrifugiert, um den Schwefelwasserstoff zu entfernen (bei den konventionellen Verfahren wird der Schwefelwasserstoff direkt aus dem Lösungsmittel verdampft). Somit ist bei der vorliegenden Erfindung die Schwefelwasserstoffentfernung höchst einfach, was ebenfalls zu einer Erhöhung der Ausbeute führt.
(5) Als Verfahren zum Steuern und Begrenzen der Molekulargewichtsverteilung der kalibrierten einsträngigen Nucleinsäurepolymeren wird ein Ionenaustauschharz angewendet (dieser Vorgang wird nachstehend als "Größenbegrenzung" bezeichnet).

Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.

"Erhitzen" (annealing) ist eine Stufe, bei der komplementäre einsträngige Nucleinsäurepolymere zu einem doppelsträngigen Polymer verbunden werden, und dies ist ein Vorgang, der selbstverständlich leicht durchgeführt werden kann. Wenn nach dem Erhitzen kalibriert wird, könnte der Sulfurierungsgrad fälschlich fluktuieren, so daß es schwierig würde, das Produkt in quantitativer Ausbeute zu erhalten. Folglich wurde erfindungsgemäß versucht, das Kalibrieren vor dem Erhitzen durchzuführen, und als Ergebnis wurde ein äußerst vorteilhaftes Resultat erhalten. Der vorstehend erläuterte Aspekt (1) steht in enger Beziehung zu dem Aspekt (2). Gemäß den herkömmlichen Maßnahmen zur Bestimmung des Molekulargewichts durch Elektrophorese wird für Verschiebung, Einfärbung und andere Stufen mindestens eine ganze Nacht benötigt, und deshalb ist ein rasches Verfahren schwierig. Erfindungsgemäß wird im Gegensatz dazu die HPLC-Gelfiltration für die Bestimmung des Molekulargewichts der Nucleinsäurederivate angewendet, wodurch die Reaktionszeit vor der Eluierung der Derivate mit der beabsichtigten Molekülgrößenverteilung (d. h. mit einer solchen innerhalb eines Bereiches von 4S bis 13S, ausgedrückt durch die Sedimentationskonstante, oder von 50 bis 10 000 oder in dieser Größenordnung, ausgedrückt durch die Basenzahl) bemerkenswert verkürzt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Reaktion nach dem Nachweis der Beendigung der Kalibrierungsreaktion gestoppt, und dann wird ein niederer Alkohol zugesetzt, um die Reaktionslösung weiter zu behandeln. Unter den niederen Alkoholen ist Ethanol besonders zu bevorzugen.

Im Falle der erfindungsgemäßen Ethanolfällung beträgt beispielsweise die Ausbeute an L-Poly-C (kalibriertes Poly-C; der Buchstabe "L" bedeutet nachfolgend "kalibriert" aus Poly-C 93% und die Ausbeute an L-Poly-I aus Poly-I 78%. Dies zeigt, daß die Ausbeute an kalibrierten Produkten hoch ist.

Im Gegensatz dazu ist bei dem herkömmlichen Verfahren eine zum Zwecke der Dialyse in ein Dialyserohr einzugebende Reaktionslösung erforderlich. In diesem Fall werden nur Mengen in der Größenordnung von 60% erhalten, und die Ausbeute an L-Poly-I aus Poly-I kann nur zu etwa 40% erwartet werden. Außerdem beträgt die für eine Dialyse erforderliche Zeit etwa drei Tage.

Wenn jedoch, wie im Falle der vorliegenden Erfindung, für das Ethanolfällungsverfahren zu einer Reaktionslösung die, bezogen auf die Reaktionslösung, zweifache Menge an Ethanol zugesetzt, zum Ausfällen des gewünschten Produktes gerührt und dann der erhaltene Niederschlag abzentrifugiert, gewaschen und getrocknet wird, kann der Prozeß innerhalb einer Stunde vollzogen werden.

Der vorstehend genannte Aspekt (3) ist das wichtigste Merkmal für den Erfindungsgegenstand.

Die Substitution der Stickstoffatome in der Nucleinsäuregruppe eines kalibrierten einsträngigen Nucleinsäurepolymeren durch Schwefelatome (beispielsweise Substituieren der Aminogruppe in dem Cytidinrest des Poly-C durch eine Mercaptogruppe in einem bestimmten Ausmaß) zum Umwandeln dieser Nucleinsäuregruppe in eine andere Nucleinsäure (diese Reaktion wird hier als "Sulfurierung" bezeichnet) wird oftmals bei der Synthese von Copolymeren angewandt. Ein weiteres charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, zum Isolieren der sulfurierten Copolymeren einen Arylalkohol zu den kalibrierten einkettigen Nucleinsäurepolymeren zuzusetzen. Dies ist der vorstehend erläuterte Aspekt (4).

Als Arylalkohol kann für diesen Zweck beispielsweise Phenol verwendet werden.

Beispielsweise wird zunächst zu der Pyridin, Wasser und Schwefelwasserstoffgas im Gemisch enthaltenden Reaktionslösung die halbe Menge Phenol zugesetzt, gerührt und zentrifugiert, wodurch sich die wäßrige Schicht scharf von der Phenolschicht absetzt und das Färbemittel in der Reaktionslösung ebenso wie als Nebenprodukt entstandener Schwefel u. dgl. in die Phenolschicht überführt werden. Danach wird die wäßrige Schicht isoliert und das Zielprodukt durch Behandlung mit einer wäßrigen Salzlösung und einem Alkohol ausgefällt. Der so erhaltene Niederschlag wird dann abzentrifugiert und schließlich mit einem Alkohol gewaschen, um das reine Produkt zu erhalten.

Bei diesem Verfahren wird nahezu der gesamte Schwefelwasserstoff in Form von Schwefelwasserstofflösung in die überstehende Lösung übergeführt, so daß er leicht aus dem Reaktionsprodukt entfernt werden kann.

Beispielsweise kann das Verfahren nach der Erfindung bei Verwendung von Phenol innerhalb von einer Stunde beendet werden, wobei die Ausbeute nahezu 100% beträgt. Außerdem kann das Produkt quantitativ isoliert werden.

Die vorstehend erläuterten charakteristischen Aspekte (2) bis (4) gemäß der Erfindung sind wichtig für das Kalibrieren vor dem Erhitzen. Sie sind nämlich außerordentlich wesentlich dafür, daß das Kalibrieren vor dem Erhitzen wirkungsvoll durchgeführt werden kann.

Der vorstehende Aspekt (5) ist ein weiteres charakteristisches Merkmal für die vorliegende Erfindung, wobei eine Stufe der Größenbestimmung zwischen dem Kalibrieren und dem Erhitzen durchgeführt wird. Dies wird nachstehend erläutert.

Bei dieser Stufe wird ein Ionenaustauscherharz benötigt. Als ein Beispiel für die Anwendung eines Ionenaustauscherharzes auf makromolekulare Nucleinsäuren werden die DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, benzoylierte DEAE-Cellulose od. dgl. auf t-RNA genannt (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 200, 1963; Biochem., 6, 3043, 1967). Bei diesem Beispiel wird das Ionenaustauscherharz jedoch nur zur Reinigung der niedermolekularen Nucleinsäuren mit einer Basenzahl in der Größenordnung von 80 benutzt.

Erfindungsgemäß wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, ob die innewohnenden Eigenschaften der Chargenabsorbierfähigkeit der Ionenaustauscherharze auf die Reinigung von makromolekularen Nucleinsäurepolymeren auf der Basis des Index der Basenzahl der der Polymeren anwendbar wäre, und das Ergebnis dieser Forschungen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Da die erfindungsgemäß erhaltenen Endprodukte außerordentlich nützliche Arzneimittel sind, ist anzunehmen, daß die Größendefinition, die durch Verwendung eines Ionenaustauscherharzes durchgeführt wird (was nachstehend als "Ionenaustauschverfahren" bezeichnet ist), ein ganz besonders ausgezeichnetes Merkmal bei dem Verfahren der Erfindung darstellt.

Bei dem Ionenaustauschverfahren gemäß der Erfindung kann ein Ionenaustauscherharz in einen ein damit zu behandelndes Nucleinsäurepolymer enthaltenden Behälter gegeben werden, um das Ziel zu erreichen (satzweises Verfahren), während im allgemeinen die Säulenchromatographie für die Fraktionierung angewendet wird (Säulenverfahren). Genauer gesagt, wird ein Ionenaustauscherharz in eine Säule gefüllt und eine Lösung eines Nucleinsäurepolymeren in die Säule eingegeben, so daß das Polymer von dem Ionenaustauscherharz auf einmal adsorbiert wird. Danach wird ein Eluiermittel, wie Salz-Trispuffer od. dgl., linear oder stufenweise bei unterschiedlicher Salzkonzentration durch die Säule geschickt, um so eine konstante Eluatmenge zu erhalten. Die Basenzahl des Nucleinsäurepolymeren, das in jeder Fraktion enthalten ist, wie sie eluiert wird, wird durch dieselbe HPLC-Gelfiltration wie vorstehend erläutert unter Verwendung eines Anzeigers als Index bestimmt, und entsprechend können die das beabsichtigte Endprodukt enthaltenden Fraktionen gesammelt werden.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe durch das vorstehende Ionenaustauschverfahren sind die Art des in die Säule einzufüllenden Ionenaustauscherharzes ebenso wie die Art des zum Eluieren verwendeten Eluiermittels außerordentlich wichtige Faktoren.

Als beispielsweise Poly-I in Tris-HCl-Puffer gelöst und an QAE (quaternäres Aminoethyl), wie es für die Größendefinition von Poly-I verwendet wird, zum Ionenaustausch adsorbiert wurde, konnte das Zielprodukt nicht erhalten werden, selbst als die Salzkonzentration in dem Eluiermittel extrem hoch angesetzt wurde. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Poly-I selbst unlöslich gemacht worden ist, weil die Salzkonzentration in dem Eluiermittel höher gemacht worden war als die eines angemessenen Eluiermittels für Poly-I auf dem QAE-Harz. Dies wird aus der Tatsache ersichtlich, daß die Inosinsäure, die die konstitutionelle Einheit von Poly-I ist, strukturell stärker hydrophob ist. In diesem Fall kann die Salzkonzentration in einem angemessenen Eluiermittel für Poly-I im Vergleich mit dem Fall von Poly-C bestimmt werden.

Bei einem weiteren erfindungsgemäß durchgeführten Versuch wurde beobachtet, daß eine Lösung von Poly-I in einem Puffer mit einer angemessenen Eluiermittelsalzkonzentration für Poly-I in einem QAE-Harz weiß und wolkig wurde und einen Niederschlag bildete. Folglich sollte bei einem Ionenaustauschverfahren gemäß der Erfindung gesagt werden, daß die Auswahl der Art des verwendeten Ionenaustauschharzes ebenso wie die Auswahl der Eluiermittelsalzkonzentration extrem wichtige Faktoren sind.

Beispielsweise ergab DEAE-Harz im Falle von Poly-I ein extrem gutes Ergebnis. Im Fall von Poly-C wurde gefunden, daß sowohl QAE- Harz als auch DEAE-Harz günstige Ergebnisse zeitigen können. Für die Eluierung kann entweder der lineare Salzanstieg oder der stufenweise Salzanstieg angewendet werden, wodurch die Polymeren in der Reihenfolge der Kettenlänge der Polymeren fraktioniert und eluiert werden können.

Wenn beispielsweise Poly-C (38 mg, S₂₀, 8,6) an DEAE-Toyopearl 650 C (⌀ 10×130 mm) adsorbiert und dann durch Linearanstiegeluierung unter Verwendung der folgenden Eluiermittel (A) und (B) jeweils in einer Menge von 100 ml eluiert wird,

(A)= 0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B)= 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

wobei der lineare Gradient für (B) 0 bis 100% beträgt und die Eluierungsbedingungen wie folgt sind:

Lineare Fließgeschwindigkeit: 1,32 cm/min
Eluierungsgeschwindigkeit: 175 Tropfen/Fraktion

werden als Ergebnis die folgenden Fraktionen mit jeweils der angegebenen Kettenlänge in der angegebenen Reihenfolge eluiert:

Außerdem wurde dieselbe Probe durch stufenweisen Anstieg eluiert, wobei zuerst eine Fraktion mit einer geringeren Basenzahl als 500 BP mit 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 50 ml) und dann eine Fraktion von 500 bis 1500 BP mit 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 50 ml) eluiert wurde.

Auf die gleiche Weise wurde Poly-I (7,8 mg, S₂₀, 7,3) durch linear ansteigende Eluierung unter denselben Bedingungen wie vorstehend eluiert. Als Ergebnis wurden die folgenden Fraktionen in der angegebenen Reihenfolge eluiert:

Außerdem wurde dieselbe Probe durch stufenweise ansteigende Eluierung eluiert, wodurch zuerst eine Fraktion mit einer Basenzahl von weniger als 300 BP mit 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 50 ml) und dann eine Fraktion von 300 BP bis 600 BP mit 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 50 ml) eluiert wurde.

Wie vorstehend erläutert, konnten durch geeignete Auswahl der Salzkonzentration bei der Eluierung sogar makromolekulare Nucleinsäuren durch das Verfahren nach der Erfindung in kettenlängedefinierte Nucleinsäurefraktionen fraktioniert werden (Größendefinition).

Wie durch die beiden vorstehend erläuterten Beispiele dargestellt, können Fraktionen (Hauptbestandteile) mit einer geeigneten Kettenlängenverteilung, die als pharmazeutische Mittel geeignet sind, aus einem unterschiedliche makromolekulare Nucleinsäuren enthaltenden Gemisch mit unterschiedlichen Kettenlängenverteilungen frei fraktioniert werden, und die Fraktionierung kann in großtechnischem Maßstab durchgeführt werden. Das charakteristische Merkmal bei der Fraktionierung ist der wichtigste Aspekt bei dem Ionenaustauschverfahren gemäß der Erfindung.

Wenn eine pharmazeutische Zubereitung in Form einer Injektionslösung hergestellt wird, ist es bekannt, daß die Entfernung von Pyrogenen aus der Injektion unvermeidlich ist. Das Pyrogen besteht bekanntlich aus Lipopolysacchariden, die nicht in medizinischen Zusammensetzungen vorhanden sein dürfen. Wenn die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung durch Injektion an den Menschen verabreicht werden, die die Entfernung sämtlicher Pyrogene Grundbedingung.

Erfreulicherweise wurde gefunden, daß die Anwendung des vorstehend erläuterten Ionenaustauschverfahrens auf die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung auch für die Entfernung von Pyrogenen aus den Derivaten sorgt.

Folglich wurden weitere Untersuchungen angestellt, um das vorstehend genannte günstige Phänomen genauer zu erforschen, und es zeigte sich, daß Pyrogene aus beliebigen und allen einsträngigen Nucleinsäurederivaten ungeachtet ihrer Kettenlänge durch das Ionenaustauschverfahren gemäß der Erfindung entfernt werden können. Dies ist noch ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung.

Dementsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung weiterhin eine Ausführungsform der Behandlung der erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate mit einem Ionenaustauschharz, um die Pyrogene aus ihnen zu entfernen, zur Herstellung einer das Derivat enthaltenden Injektion.

Die durch einen Limulus-Test der quantitativen Bestimmung der Menge an Endotoxin in verschiedenen einkettigen RNAs (handelsübliches Poly-C und kettenverkürzte Derivate davon) erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

In dieser Tabelle bedeutet EE (Endotoxin-Einheit) eine Einheit bei einem Kaninchen-Fiebertest mit USP-Bezugsstandard-Endotoxin (E. coli 0113). (1) zeigt den Blindversuch mit destilliertem Wasser; (2) zeigt Poly-C (handelsübliches Produkt 1); (3) zeigt Poly-C) handelsübliches Produkt 2); und (4) zeigt das gemäß dem folgenden Beispiel (5-4) erhaltene Produkt.

Aus den Ergebnissen der vorstehenden Tabelle wird der pyrogen- entfernende Effekt durch Ionenaustausch offensichtlich.

Die physiologische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate ist für Arzneimittel außerordentlich nützlich. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate haben eine starke carcinostatische Wirksamkeit, wie nachstehend im einzelnen noch erläutert wird. Diese Aktivität ist nur eine von verschiedenen physiologischen Wirksamkeiten der erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate.

Als andere physiologische Wirksamkeiten von Poly-I/Poly-C als Elternkörper enthaltenden erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivaten können weiterhin genannt werden die TNF produzierende Fähigkeit, die Interferon produzierende Fähigkeit, die Interleukin-2 produzierende Fähigkeit, die Makrophagen aktivierende Fähigkeit, die NK-Zellen aktivierende Fähigkeit, die Aktivität zum Inhibieren der Wucherungen von Tumorzellen, die Aktivität zum Inhibieren der Wucherungen von Tumorzellen, die Aktivität zum Inhibieren der Wucherungen von Tumorzellen bei menschliche Tumorzellen tragenden nackten Mäusen, die Aktivität der Inhibierung von Metastasen von Tumorzellen in der Lunge usw.

Die Nucleinsäurederivate gemäß der Erfindung besitzen eine extrem höhere Sicherheit als konventionelles Poly-I/Poly-C und dergleichen Interferon-Inducer. Folglich sind die erfindungsgemäßen Verbindungen brauchbare Antivirusmittel, Antitumormittel usw.

Die physiologischen Wirksamkeiten der erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate, wie vorstehend erläutert, sind in den vorstehend erwähnten Patentanmeldungen (japanische Patentanmeldung 62-167433 und einer weiteren Patentanmeldung mit der Priorität dieser Anmeldung 62-167433) im einzelnen erläutert.

Das folgende Beispiel erläutert das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäurederivate im einzelnen, bedeutet jedoch keinerlei Einschränkung des Erfindungsbereiches.

Beispiel (1) Herstellung und Reinigung von L-Poly-I (kalibriertes Poly-I):

200 ml destilliertes Wasser, 250 ml Formamid und 500 ml einer 5 M NaCl-Lösung wurden zu 10 g handelsüblichem Poly-I zugesetzt und bei 80°C etwa vier Stunden lang erhitzt.

Die Reaktionslösung wurde der Gelfiltration durch HPLC unter Verwendung einer TSK-Gel G-DNA-Säule (7,88 mm ID×300 mm) unterzogen (Eluiermittel: 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5; 0,3 M NaCl-Lösung, 2 mM EDTA; Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min), worauf die Umsetzung zu dem Zeitpunkt gestoppt wurde, an dem eine Fraktion mit einer maximalen Spitze für eine Verweilzeit von 21,86 ± 0,2 min erhalten wurde.

Die Reaktionslösung wurde mit der zweifachen Menge Ethanol versetzt und der erhaltene gebildete Niederschlag abzentrifugiert (3000/min, 4°C). Er wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 10,2 g L-Poly-I erhalten wurden.

Das Wasser und die Lösungen, die bei diesem Verfahren verwendet wurden, waren sämtlich sterilisiert. Dasselbe gilt für das folgende.

(2) Herstellung und Reinigung von L-Poly-C (kalibriertes Poly-C):

200 ml destilliertes Wasser, 250 ml Formamid und 50 ml einer 5 M NaCl-Lösung wurden zu 10 g Poly-C zugegeben und etwa 4 Stunden lang bei 80°C erhitzt. Aufgrund derselben HPLC-Gelfiltration, wie sie vorstehend beschrieben ist, wurde der Endpunkt der Reaktion ermittelt (Verweilzeit: 21,33 ± 0,2 min).

Die Reaktionslösung wurde mit der zweifachen Menge Ethanol versetzt und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert (3000/min, 4°C). Dieser wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, wobei 9,5 g L-Poly-C erhalten wurden.

(3) Sulfurierung von L-Poly-C:

8,0 g des in der vorstehenden Stufe (2) erhaltenen L-Poly-C wurden in 240 ml Wasser gelöst und in eine 500-ml-Stahlbombe gegeben. Eine 12 g/120 ml Schwefelwasserstoff enthaltende Pyridinlösung wurde unter Eiskühlung zugesetzt. Nach dem dichten Verschließen wurde die Bombe etwa 10 Stunden lang auf 50°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde TE-gesättigtes Phenol (200 ml) zugesetzt, gerührt und zentrifugiert (3000/mi, 15°C, 5 Minuten). Eine 1/10 Menge einer 5 M NaCl-Lösung und die zweifache Menge Ethanol wurden der wäßrigen Schicht, die sich abgesetzt hatte, zugesetzt, wodurch sich in dieser ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert (3000/min, 4°C, 10 Minuten), mit 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 8,0 g L-Poly (C₂₀, S⁴ U) erhalten wurden (nämlich kalibriertes Poly-C-Derivat, bei dem die Cytidylsäuren durch 4-Thiouridylsäure in einer Menge von einer 4-Thiouridylsäure auf 20 Cytidylsäuren substituiert waren).

Das vorstehend erwähnte TE bedeutet 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der EDTA in einer Menge von 1 mM enthielt.

(4) Ausführungsform des Erhitzens (annealing):

6,00 g des in der vorstehenden Stufe (3) erhaltenen L-Poly (C₂₀, S⁴ U) und 6,44 g des in der vorstehenden Stufe (1) erhaltenen Poly-I wurden in 300 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)/50 mM NaCl- Lösung gelöst und darin vermischt. Die erhaltene Lösung wurde auf einem Wasserbad bis auf 70°C erhitzt und 10 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. Danach ließ man das Ganze so, wie es war, über Nacht abkühlen. Nach Phenolbehandlung und Ethanolfällung wurde Wasser (etwa 200 ml) zu dem gebildeten Niederschlag zugesetzt, um diesen zu lösen. Dann wurde die erhaltene Lösung gegen Wasser bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wurde bis zur Trockne eingeengt, wobei 12,4 g der erhitzten Verbindung erhalten wurden.

(5) Größendefinition durch Ionenaustauschverfahren:

Das Ionenaustauschverfahren wurde durch stufenweise oder linear ansteigende Eluierung durchgeführt. In beiden Fällen waren Ausbeute und Kettenlänge der Produkte nahezu gleich, vorausgesetzt, daß die Eluierungsbedingungen geeignet ausgewählt waren. Für die stufenweise Eluierung von L-Poly-C und L-Poly (C, S⁴ U) wurden 0,15 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) verwendet, während für die kontinuierliche Verfahrensweise 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) verwendet wurden.

Für die stufenweise Eluierung von L-Poly-I kann das nachfolgende Beispiel (5-1) befolgt werden.

Für die linear ansteigende Eluierung von L-Poly-I wurden die folgenden (A) und (B) verwendet, und die Eluierung wurde unter der ansteigenden Bedingung der Lösung (B) von 0 bis 100% durchgeführt.

(A)= 0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B)= 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

Für die linear ansteigende Eluierung von L-Poly-C und L-Poly- (C, S⁴ U) kann Beispiel (5-2) und (5-4) befolgt werden.

(5-1) Größendefinition von L-Poly-I:

210 mg des in der vorstehenden Stufe (1) erhaltenen L-Poly-I wurden in 5 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und an DEAE- Toyopearl® 650 C (⌀ 10 mm×130 mm) adsorbiert. Dann wurde dieses stufenweise bei einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,30 cm/ min eluiert, wobei als Eluiermittel 0,03 NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 50 ml) und 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0, 80 ml) verwendet wurden. Die mit 0,5 M NaCl eluierte Fraktion wurde gesammelt und ihre Verweilzeit durch dieselbe HPLC-Gelfiltration gemessen, wie sie vorstehend in Stufe (1) erläutert ist. Sie betrug 21,90 ± 0,2 min.

Das beabsichtigte Endprodukt L-Poly-I (größendefiniert) mit einer Basenzahl von 100 bis 1000 wurde in hoher Ausbeute erhalten. Die Ausbeute nach Umkristallisieren betrug 91%.

(5-2) Größendefinition von L-Poly-C:

610 mg des in der vorstehenden Stufe (2) erhaltenen L-Poly-C wurden in 10 ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und an QAE-Toyopearl® 550 C (⌀ 10 mm×130 mm) adsorbiert. Dann wurde dieses durch linear ansteigende Eluierung bei einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,30 cm/min eluiert, worauf die folgenden (A) und (B) jeweils in einer Menge von 100 ml verwendet wurden und die Eluierung unter ansteigender Bedingung der Lösung (B) von 0 bis 100% durchgeführt wurde.

(A)= 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B)= 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

Die bei der Hauptspitze eluierte Fraktion wurde gesammelt und ihre Verweilzeit durch HPLC-Gelfiltration gemessen. Sie betrug 21,35 ± 0,2 min. Das beabsichtigte Endprodukt L-Poly-C (größendefiniert) mit einer Basenzahl von 100 bis 1000 wurde in hoher Ausbeute erhalten. Die Ausbeute nach Umkristallisieren betrug 93%.

(5-3) Größendefinition von L-Poly(C₁₂, U):

19 mg Poly(C₁₂, U) (bei dem die Cytidylsäuren durch Uridylsäure in einer Menge von einer Uridylsäure auf 12 Cytidylsäuren substituiert waren) (es hatte eine Verweilzeit von 18,67 min bei derselben HPLC wie bei der vorstehenden Stufe (1)) wurden in 5 ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und an DEAE-Toyopearl® 650 C (⌀ 10 mm×130 mm) adsorbiert. Dieses wurde dann durch linear ansteigende Eluierung bei einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,30 cm/min eluiert, wonach die folgenden (A) und (B) jeweils in einer Menge von 100 ml verwendet und die Eluierung unter der ansteigenden Bedingung der Lösung (B) von 0 bis 100% durchgeführt wurde.

(A)= 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B)= 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

Die bei der Hauptspitze eluierte Fraktion wurde gesammelt und ihre Verweilzeit durch HPLC-Gelfiltration gemessen. Sie betrug 18,97 ± 0,2 min. Das beabsichtigte Endprodukt L-Poly(C₁₂, U) (größendefiniert) mit einer Basenzahl von 100 bis 1000 wurde in hoher Ausbeute erhalten. Die Ausbeute nach Umkristallisieren betrug 87%.

(5-4) Größendefinition von L-Poly(C₂₀, S⁴ U):

600 mg des in der vorstehenden Stufe (3) erhaltenen L-Poly(C₂₀, S⁴ U) wurden in 10 ml Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) gelöst und an QAE- Toyopearl® 550 C (⌀ 10 mm×130 mm) adsorbiert. Dieses wurde dann durch linear ansteigende Eluierung bei einer linearen Fließgeschwindigkeit von 1,30 cm/min eluiert, wonach die folgenden (A) und (B) jeweils in einer Menge von 100 ml verwendet und die Eluierung unter ansteigender Bedingung der Lösung (B) von 0 bis 100% durchgeführt wurde.

(A)= 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B)= 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

Die Verweilzeit wurde auf dieselbe Weise wie bei der vorstehenden Stufe (5-2) durch HPLC-Gelfiltration gemessen. Sie betrug 21,35 ± 0,2 min.

Das beabsichtigte Endprodukt L-Poly(C₂₀, S⁴ U) (größendefiniert) mit einer Basenzahl von 100 bis 1000 wurde in hoher Ausbeute erhalten. Die Ausbeute nach Umkristallisieren betrug 90%.

(6) Erhitzen (annealing): (6-1) L-Poly-I und L-Poly-C:

3,0 g des größendefinierten L-Poly-C (erhalten in der vorstehenden Stufe (5-2)) und 3,2 g des größendefinierten L-Poly-I (erhalten in der vorstehenden Stufe (5-1)) wurden separat in 150 ml 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,5)/50 mM NaCl gelöst und die Lösungen vereinigt und vermischt. Die erhaltene Lösung wurde in einem Wasserbad bis auf 70°C erhitzt und bei dieser Temperatur 10 Minuten lang gehalten. Danach ließ man das Ganze über Nacht stehen und abkühlen. Nach Phenolbehandlung und Ethanolfällung wurde Wasser (etwa 400 ml) zu dem so gebildeten Niederschlag zugesetzt, um diesen zu lösen. Dann wurde die erhaltene Lösung bei 4°C gegen Wasser dialysiert.

Das Dialysat wurde bis zur Trockne eingeengt, wobei 6,2 g der Zielverbindung erhalten wurden.

(6-2) L-Poly-I und L-Poly(C₂₀, S⁴ U):

1,46 g des in der vorstehenden Stufe (5-4) erhaltenen größendefinierten L-Poly(C₂₀, S⁴ U) und 1,57 g des in der vorstehenden Stufe (5-1) erhaltenen L-Poly-I wurden auf die vorstehend unter (6-1) beschriebene Weise behandelt, wobei in jedem Fall 3,0 g der jeweiligen Zielverbindung erhalten wurden.

An der im Detail beschriebenen und erläuterten Erfindung können für den Fachmann naheliegende zahlreiche Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden, ohne daß der Bereich der Erfindung verlassen wird.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung doppelsträngiger Nucleinsäurederivate mit RNA als Elternkörper, deren insgesamte Molekülgrößenverteilung, ausgedrückt als ihre Sedimentationskonstante, innerhalb des Bereiches von 4S bis 13S liegt, wobei die Nucleinsäurepolymeren kalibriert und dann erhitzt werden.

2. Verfahren zur Herstellung doppelsträngiger Nucleinsäurederivate mit RNA als Elternkörper, bei denen die Moleküle für die maximale Verteilung der insgesamt Molekülgrößenverteilung der Derivate eine Basenzahl innerhalb eines Bereiches von 50 bis 10 000 aufweisen, wobei die Nucleinsäurepolymeren kalibriert und dann erhitzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der das kalibrierte Nucleinsäurepolymer enthaltenden Reaktionslösung vor dem Erhitzen ein niederer Alkohol zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der niedere Alkohol Ethanol ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuregruppen in den kalibrierten einsträngigen Nucleinsäurepolymeren in Gegenwart eines Arylalkohols vor dem Erhitzen sulfuriert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Arylalkohol Phenol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die einsträngigen Nucleinsäurepolymeren vor dem Erhitzen mit einem Ionenaustauschharz behandelt werden, um die Polymeren mit einer Molekülgrößenverteilung zu sammeln, die innerhalb des für die Größendefinition der kalibrierten Polymeren vorbestimmten Bereiches liegt.

8. Verfahren zur Herstellung einer Injektionslösung, die im wesentlichen Nucleinsäurederivate enthält, dadurch gekennzeichnet, daß gegebenenfalls in den Derivaten vorhandene Pyrogene durch Verwendung eines Ionenaustauschharzes entfernt werden.