DE2451358A1 - Verfahren zur herstellung von modifizierte ribonucleinsaeuremolekuele enthaltenden zusammensetzungen und diese zusammensetzungen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von modifizierte ribonucleinsaeuremolekuele enthaltenden zusammensetzungen und diese zusammensetzungenInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
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Description
Köln, den 28.1o.74 13o9 AvK/IM
The Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland/V.St.A.
Verfahren zur Herstellung von modifizierte Ribonucleinsäuremoleküle
enthaltenden Zusammensetzungen und diese
Zusammensetzungen
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen und therapeutische Zusammensetzungen, die Nucieinsäurekomplexe in modifizierter
Form enthalten und Verfahren zu. ihrer Herstellung. Diese Zusammensetzungen schützen den Organismus gegen den Angriff
von Viren,indem die Zellen des Organismus angeregt werden, ein antivirales Protein zu erzeugen, cas als Interferon
bekannt ist.
Interferon ist ein antivirales Protein, das durch Zellen von Lebewesen als Reaktion auf eine Virusinfektion freigegeben
wird. Es ist seit langem bekannt, daß Ribonucleinsäure (RNS) (ribo nucleic acids- RNA) eine spezifische
Virionkoiuponente ist, die die Freigabe von Interferon in
Zellen von Lebewesen auslöst. Sowohl natürliche als auch synthetische Doppel spiral-RL.'S regen die Interferonproduktion
an. Diese Doppslspiral-RNS-Moleküle können wegen ihrer Toxizität,
die primär mit der Gegenwart der Doppelspiral-RNS-Struk~
tür zusammenhängt, nicht als chemotherapeutische Mittel verwendet
werden. Ej wurde kürzlich gezeigt, daß die erste Stufe
der Interferonauslösung in den Zellen von lebenden Organismen, d.h. die Absorption des Nucleinsäurekomplexes von Polyinosin,'
gebunden an Polycytidylsäure (rl '^C ), rasch vor sich geht,
was darauf hindeutet, daß eine intakte Primärstruktur des auslösenden Komplexes nur für eine kurze Zeit in der Zelle
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BAD ORIGINAL
vorhanden ist. Die vorliegende Erfindung kommt jetzt zu j
der Schlußfolgerung, daß, sobald die Induktion des Interferons ausgelöst ist, die wej .uere Anwesenheit von Doppelspiral-RNS
unnötig ist und zu Sekundäreffekten in der Zelle führt, ohne daß die Größe des antiviralen Widerstandes
steigt. Die Erfindung betrifft daher die Zurverfügung- i stellung von doppelkettigen Nucleinsäurekomplexen, die, j
während sie ihre Fähigkeit des Auslösens der Interferon- , produktion in den Zellen behalten, fähig sind, leicht j
durch Nukleasen in den fellen hydrolysiert zu werden. ϊ
Solche Nucleinsäurekomplexe sind Duplikationen von doppe!-
die
kettigen Virusgenen, die/Interferonproduktion während ·
kettigen Virusgenen, die/Interferonproduktion während ·
-ies Angriffs der Viren fördern, wobei jedoch diese Nucleinsäurekomplexe
so modifiziert sind, daß sie gegenüber den ; Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, leichter in den Zellen ]
abgebaut zu werden, weniger toxisch sind. Verbindungen dieser Art sind in J. Molecular Biology 7o, 568 (1972) beschrieben.
Zusätzlich wurde nun ein neuer Typ von Hypoxanthin-Poly-
nucleotiden aus einer Mischung von Inosin 5'-Diphosphaten ,
und 21-O-Methylinosin 5'-diphosphaten mit M.luteus Poly- :
nucleotid Phosphorylase synthetisiert. Das Verfahren ist '
ähnlich .dem in Biochemistry 1J_, 4931, (1972) beschriebe- '
nen. Dieser Typ von KypoKanthin-Polynucleotiden enthält
5 bis 16 % 2'-0-Methylinosinreste zusammen mit 95 bis i
84 % korrespondierenden Inosinresten und wird als ι
(rlr 2O# 2'-MeI) bezeichnet. Diese Komplexe (rIc_2O' i
2'-MeI) 'rC sind 1oo mal mehr aktiv "Is rl *rC in mensch
n η η η l
liehen Zellen als Interferonerreger. Offenbar hat diese
Modifikation der Hauptkette der Polyinosinat-Gasamtkette ;
(backbone of Polyinosinate strand) einen deutlich gesteigerten Effekt. Daher wird eine geringere Menge an j
5_2o, 2'-MeI)n *rC benötigt als an rl * rC zum
Schutz der menschlichen Zellen gegen Viruserkrankungen.
ORIGINAL
Interferon wird normalerweise durch Zellen von Lebewesen bei Viruserkrankungen produziert, wobei das doppel
ketf-ige spiralförmige Virusgen (double-stranded helical
virus gene) die Produktion dieses a^tiviralen Proteins
durch die Zellen auslöst.
Die Wirkung der doppelkettigen spiralförmigen Gene kann [
durch die 1 : 1-Komplexe von Poiyriboinosinsäuron und
Polyribocytidyliäuren (rl *rC ) nachgeahmt werden. Zwei j
allgemein akzeptierte Bedingungen für die Eignung sol- j eher Komplexe zur Auslösung der Interferonproduktion i
in den Zellen sind: 1) Unversehrtheit der doppelketti- ' gen Komplexe (mit einer T höher als die INkubations- ;
m ι
temperatur) und 2) angemessener Widerstandsfähigkeit j gegenüber Nuclaasen, d.h. gegenüber enzymatischem Aktivität
in den Zellen. Es wurde nun gefunden, daß zusatz- j liehe Bedingungen in Eezug auf Struktur uad Konformation
für den (rl * rC)-Komplex existieren. Insbesondere !
hat die Unterbrechung der rC -Kette (rC -strand) in j den Komplexen durch unpaarige Basen wie Uridin oder j
Guanin weniger Wirkung auf die Fähigkeit des erhaltenen ; Komplexes zur Auslösung der Interferonbildung als die j
Unterbrechung der rIn-Kette. Das bedeutet, daß für die \
Auslösung der Interferonproduktion die-Anforderungen ;
an die Struktur bezüglich Kettenkontinuität und Paarig- ;
ι keit der Basen in der rIn~Kette strenger sind als in
der rC -Kette. Daher sind Modifikationen in der rC -Ketn
η ι
te der (rl'rC)-Komplexe möglich, wobei die Fähigkeit j
dei. Auslösung der Interferon-Bildung behalten und die |
Toxizität signifikant reduziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen zur Verfügung, in denen die Duplikate dieser Doppelkettenspiral'förmigen
Virusgene r/u einem solchen Ausmaß modi- j
fizi-ert sind, daß die Fähigkeit, die Interferonproduktion
"in "den Zellen auszulösen, erhalten bleibt, jedoch die ..
Toxizitäten, die normalerweise mit solchen Verbindungen j
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BAD ORIGINAL
— A —
in Zusammenhang gebracht werden, zu einem Ausmaß redu- :
ziert, was ihre Verwendung als chemotherapeutische Mittel erlaubt. Bei einem ersten Typ der Mofizierung werden
doppelkettige Nucleinsäurekomplexe, die normalerweise die zelluläre Interferonproduktion anregen, strukturell
so modiziert, daß das erhaltene Molekül leicht in den Zellen durch Nucleasen hydrolysiert wird. Die modifizier-,
ten Nucleinficiurekomplexe behalten ihre Fähigkeit, die ί
Produktion von Interferon in den Zellen anzuregen,* sind '
jedoch sehr viel weniger toxisch als die .Mmodifizierten '
doppelkettigen Strukturtn wegen der Fähigkeit der Zellen,
die r.iodifizierten Komplexe kurz nach der Anregung der !
Interferonproduktion zu hydrolysieren.
In einem zweiten Typ von Modifikation wird die Ribosyihauptkette
der Polyinosinsäure in dem Π *rC -Komplex teilweise (zu einem Ausmaß von 5 bis 16 %) durch die
2'-O-Methylribosylreste ersetzt. Die modifizierten Komplexe
(rlc „ , 21MeI) * rC erwiesen sich als 1oo mal aktiver
d~äO η η
als rl *rC als Anreger für die Interferonbilduhg in ;
menschlichen Zellen. I
Die Verringerung der Toxizität bei dem ersten Typ von modifizierten
(rl'rC)-Komplexen wird durch d?e strukturelle
Modifikation dieser Komplexe bewirkt. Eine allge- : meine Modifikation ist die Einführung eines Nucleotids
in die rC -Kette, um die normale paarweise Anordnung |
zwischen den Ketten zu verhindern, wodurch ein "schwacher" Punkt" oder eine chemische Position in der Kette hergestellt
wird, die anfällig gegen Angriffe von Nucleasen in&en Zellen ist. Während die modifizierten Komplexe genügend
strukturelle Integrität behalten, um die Interferonproduktion in den Zellen anzuregen, erlaubt die Anfälligkeit
gegenüber enzymatischer Wirkung eine relativ schnelle Hydrolyse der modifizierten Komplexe in den Zellen.
Nachdem die modifizierten Komplexe in ihrer Funktion als Anreger der Interferonproduktion gedient haben, werden sie
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2451359 j
zerstört. Die Zerstörung dieser Komplexe verhindert negative Auswirkungen, die verursacht würden, wenn die Komplexe
unversehrt in den Zellen verbleiben. Da die fortwährende Gegenwart dieser doppelkettigen spiralförmigen Komplexe
die cviitivirale Widerstandskraft nicht erhöht, wenn einmal
die.Anregung der Interferonbildung in Jen Zellen ausgelöst worden ist, wird nichts durch die Zerstörung der Komplexe
vergoren. Im Gegenteil, die Reduktion der Toxizität gegenüber
den Zellen und gegenüber dem Organismus gestattet die Verwendung dei modifizierten Komplexe als therapeutische
Mittel zum Schutz von Organismen gegen Viruserkrankungen.
Beim zweiten Typ der modifizierten (rl *rC )-Komplexe wird
die rl -Kette durch eine (rlc ,, , 21MeI) -Kette ersetzt,
η ο —/ο η
Dieser neue Komplex (rI5_2 ,21MeI) *rC ist 1oo max wirksamer
als (rl "rC ). Deshalb wird eine sehr viel geringere Menge des modifizierten Komplexes'für den Schutz gegen
Virusangriffe auf die menschlichen Zellen benötigt.
Gegenstand der Erfindung sind Zusammensetzungen auf der
Basis von neuen Komplexen, die durch Anregung der Interferonproduktion in den Zellen Schutz gegen Virusinfektionen
geben, ein Verfahren zur Herstellung dieser Komplexe, d.h. ein Verfahren zur Strukturierung im molekularen Maßstab
von doppelkettigen spiralförmigen Nucleinsäurekomplexen,
die, obwohl sie dazu fähig sind, in den Zellen die Produktion von Interforon anzuregen, gegenüber dem '.
Organismus in therapeutischen Dosen nicht giftig sind, sowie therapeutische Zusammensetzungen, enthaltend (rl *rc )-Kom-'
plexe, die nach Induktion der Interferonproduktion in den lebenden Zellen durch enzymatische Aktivität leicht hydrolysierbar
sind, sowie therapeutische Zusammensetzungen, enthaltend (rlr_2 ' 21MeI) *rC , die viel aktiver sind als ;
(rl "rC ) als Interferonbildner im menschlichen Körper. ;
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Fig 1 ist eine graphische Darstellung eines Elutionsmusters
von einer Sephades G5o-Säule (2,5 cm χ
95 cm) eines Hydrolysats von r(C2 /G) durch
RNase T1; F.-1-6 bedeutet Fraktionen 1-6
95 cm) eines Hydrolysats von r(C2 /G) durch
RNase T1; F.-1-6 bedeutet Fraktionen 1-6
Fig 2 ist eine graphische Darstellung von Schmelzpunktkurven
von rl TC , r (I00,U) TC und r (I01.U) TC
η η Jy 'η η 21 η
in minimale): Eagle's Salzlösung, Nucleptidkonzentration
4 χ 1o"3 .M in I + C;
Fig. 3 ist ein^ graphische Darstellung von Schmelzpunktkurven
von rln'r (C22,U)n,rln·n(C.,3,U)n,rj.nT (C7,U
' rIn.r(C4,U)n und rln'r(c 2o'G^n in miniraaler i
Eagle's Salzlösung, Nucleotidkonzentration 1 χ
1o~4M in I + C;
1o~4M in I + C;
Fig 4 ist eine graphische Darstellung von Schmelzpunktkurven
von (Ip)qITC (Nucleotidkonzentration 1 χ
-4
1o M) und (Ip)12ITCn * Poly-L-Lysin (anfäng- ;
1o M) und (Ip)12ITCn * Poly-L-Lysin (anfäng- ;
liehe Nucleotidkonzentration 2 χ 1o~5M,P/N Verhältnis
= 1) in minimaler Eagle's Salzlösung und
(Ip)16ITCn (Nucleotidkonzentration 1 χ 1o~3M) ; in o,15m NaCl, ο,οΤΜ MgCl0 und ο,οοίΜ Natrium-
(Ip)16ITCn (Nucleotidkonzentration 1 χ 1o~3M) ; in o,15m NaCl, ο,οΤΜ MgCl0 und ο,οοίΜ Natrium-
phosphat (pH 7,4); j
Fig 5 ist eine graphische Darstellung von Schmelzpunktkurven von j
1. rln.r (Cp)48Op, j
2. .--TnT(Cp)35 G>p, j
3. rJnT(Cp)23 Gi.p und |
4. TlnT(Cp)11 G>p
in minimaler Eagle's Salzlösung, Nucleotidkonzentration 1 χ 1o M in I + C;
Fig 6 ist eine graphische Darstellung der Hydrolyse durch Pankrease RNase von
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rVrCn
b). r(I21,U)nTCn
c) rIn-r.(C4,ü)n
und ihren Komplexen mit Poly-L-lysin und PoIy-D-lysin,
wobei der Polynuclootidkomplex allein durch die Linie X-X, sein Komplex mit Poly-L-lysin
durch die Linie A-h (P/N Verhältnis = 2)
und 0-0 (P/N Verhältnis = 1) und sein Komplex mit Pol ν-D-Iy sin durch die Linie-Ar 4 (P/N Verhältnis
= 2) und ©-© (P/N Verhältnis = 1) dargestellt
sind. :
Fig 7 ist eine graphische Darstellung der Hydrolyse durch Pankreas RNasc von rl^.r(Cp) .R G)p / wobei
der Polynucleotidkomplex allein durch die Linie X-X,sein Komplex mit Poly-L-lysin durch
die Linie ©-Φ (P/N Verhältnis = 1 * dargestellt
ist, in minimaler Eagle's Salzlösung, Nucleotidkonzentration
1 χ 1o~ M in I + C, und !
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung der- Hydrolyse
von r(I)n*r(C)n, dargestellt durch die Linie
Λ-A,r(I) dargestellt durch die Linie 0-0 und
r (I)n*r(C2o,G)n, dargestellt durch die Linie
Φ-© mit 5 ug/ml RNase T- und pankreatischer
RNase A bei 37°C in Eagle's Medium.
Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen hängen allgemein
entsprechend ihrer Verwendung in verschiedenen Ausführungsformen von der chemischen Modifikation eines Interferon-induzierenden
Nucleinsäurekomplexes ab, um diesen Komplex weniger toxisch gegenüber Zellen von Lebewesen
zu machen. Die chemisch modifizierten Komplexe behalten
die Fähigkeit der unmodifizierten Komplexe, die Produktion von Interferon durch die Zellen anzuregen, während sie
durch Nucleasen in den Zellen leichter hydrolysierbar gemacht werden als es die unmodifizierten Komplexe ■
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sind. Die gesteigerte Hydrolysefähigkeit der mofizierten
Komplexe macht diese weniger toxisch gegenüber den Zellen,
da die mofizierten Komplexe relativ schnell nach der Anregung der Interferonbildung zerstört werden.
Die doppelkettigen spiralförmigen Nucleinsäurekomplexc der vorliegender Anmeldung können durch nicht richtiges ;
Paaren von Basen (mismatching of bases), wobei eine Änderung der Spirale- ("looping-out" from the helix) an dem j
Punkt oder an den Punkten verursacht werden, an denen ' die 3asen verursacht werden, unpaarig vorzuliegen, durch
Ketten-Unterbrechungsbildung von Oligomer-Polymerkomplexen und durch Anordnung von Kohlenwasserstoffgruppen wie
z.B. einer Methylgruppe, innerhalb der spiralförmigen
modifiziert werden. :
Struktur /Bei der ersten dieser besonderen Modifikationen
. , ■ wei^e Anordnung.
wird die paar/ von Basen m den zwei Ketten des Komplexes unterbrochen, um einen "schwachen" Punkt oder eine chemisch anfällige oder verletzbare Stelle in dem Komplex ' zu schaffen, der oder die dann Angriffen durch Nucleasen in den Zellen ausgesetzt sind. Unpaarige Basen wie z.B. Uridin oder Guanin unterbrechen jede der beiden Ketten eines Nucleinsäurekomplex wie z.B die rC-Kette von Komplexen von Polyriboinosin- und Polyribocytidylsäuren (PoIyrl'rC oder rl "rC , was Polyinosinsäure, gebunden an ; Polycytidylsäure ist) , ohne Beeinträchtigung der Fähig- '.
wird die paar/ von Basen m den zwei Ketten des Komplexes unterbrochen, um einen "schwachen" Punkt oder eine chemisch anfällige oder verletzbare Stelle in dem Komplex ' zu schaffen, der oder die dann Angriffen durch Nucleasen in den Zellen ausgesetzt sind. Unpaarige Basen wie z.B. Uridin oder Guanin unterbrechen jede der beiden Ketten eines Nucleinsäurekomplex wie z.B die rC-Kette von Komplexen von Polyriboinosin- und Polyribocytidylsäuren (PoIyrl'rC oder rl "rC , was Polyinosinsäure, gebunden an ; Polycytidylsäure ist) , ohne Beeinträchtigung der Fähig- '.
keit, die Bildung von Interferon zu induzieren uud dadurch
die antivir'ale Wirkung zu bewahren. Jedoch erlaubt die Unterbrechung der Ketten eine beschleunigte Hydrolyse
des Komplexes und damit eine Reduktion seiner Toxizität, weil die Bildung der schwachen Stellen in der Struktur des
Komplexes diesen der Hydrolyse durch die Nuclease in der : Zelle leichter zugänglich gemacht hat. Auf ähnliche Weise
ergibt das Aufbrechen von Bindungen in den doppelkettigen spiralförmigen Strukturen durch Bildung von Oligomer-Polymerkomplexen
durch Kettenunterbrechung oder durch Anordnung von Kohlenwasserstoffgruppen in der Struktur
Stellen in der Molekularstruktur des Komplexes, die
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einer enzymatischen Hydrolyse leichter zugänglich sind.
Der oben genannte Nucleinsaurekomplex (rl .rC ) hat sich ■ ■
als besonder3 wertvoll als Grundstruktur für die Modifikation
in den Interferonanregernmit niedriger Toxizität :
erwiesen. Die später aufgeführten Daten zeigen,- daß für die Anregung und Auslösung der Interferonproduktion die ;
strukturellen Bedingungen hinsichtlich Kettenkontinuität
i und paarweiser Anordnung der Basen in der rl -Kette i
strenger sind als in der rC -Kette. So haben sicn modifi-i
zierte (rl *rC)-Komplexe, in denen die rC -Kette unterbrochen ist, als besonders geeignet erwiesen. Da gefunden
wurde, daß die Auslösung und Anregung der menschlichen Zellen zur Iiiterferonproduktion durch die Absorption von
(rl *rC ) innerhalb weniger Minuten beendet ist, braucht ' die unversehrte Primärstruktur des Anregerkomplexes nur ■
kurz in der Zelle vorhanden zu sein. Sobald die Anregung ausgelöst ist, xzt die weitere Gegenwart der doppelkettigen
spiralförmigen (rl *rC )-Komplexe nicht nötig und führt zu schädlichen Wirkungen ohne die Widerstandsfähigkeit
gegen Viren zu steigern. Aufgrund dieses kinetischen' Faktors wird die Widerstandsfähigkeit gegen Viren durch
die Modifikation des (rl'rC)-Komplexes in eine leicht
hydrolysierbare Form nicht reduziert. Zwei modifizierte Komplexe von (rl *rC ), von denen gefunden wurde, daß sie
die Interferon-Induktionsfähigkeit des nicht modifizierten Komplexes behalten, aber relativ leicht durch Nucleasen in
der Zelle hyclrolysierbar sind, sind rl " r (C12-13'U^n und
rl "r(c2 _?g»G) , worin U Uridin und G Guanin bedeuter..
Andere Komplexe dieser Struktur umfassen Π *r(C22,U) und
rl *r(C,,U) . Die Bildung und.die charakteristischen Eigenschaften
dieser modifizierten Komplexe werden nachstehend . beschrieben. !
Wenn ein Organismus hohen Dosen - entweder des unmodifi-
) oder des modi; 809819/101 5
zierten(rl 'rC ) oder des modifizierten Komplexes ausge-
setzt wird, ergeben sich toxische Wirkungen durch die
Unfähigkeit des Organismus, diese Substanzen wirksam j innerhalb einer ausreichend kurzen Zeitspanne abzubauen , oder zu beseitigen. Jedoch werden diese normalerweise !
Unfähigkeit des Organismus, diese Substanzen wirksam j innerhalb einer ausreichend kurzen Zeitspanne abzubauen , oder zu beseitigen. Jedoch werden diese normalerweise !
in der Therapie angewandten Dosen mit den modifizierten i
Komplexen unschädlich, weil sie viellleichter enzymatisch
in den Zellen hydrolysiert werden als die unmodifizierten (r7 *rC)-Komplexe. Die Modifikation der Hauptkette
der Nucleinsaurekomplexe kann sogar eine größere ;
i Induktionsfähigkeit für die Bildung von Interferon er- ;
geben, wie es durch dea (rl, .. ~,ml) "C -Komplex bewiesen ;
ist, der eine loofach größere Aktivität als der(rl 'rC )-Komplex
als Anreger der Interferonbildung in menschlichen Zellen aufweist. Die effektiven Dosierungen dieser modifizierten
Komplexe variieren entsprechend der Interferon-Induktionsfähigkeit und der Hydrolysegeschwindigkeit.
Ein Bereich von etwa 1 bis 1oo ug/kg Körpergewicht wurde sicher und wirksam beispielsweise Mäusen verabreicht.
Derartige Konzentrationen des unmodifizierten (rIn*rC )-; Komplexes sind hoch toxisch.
Ein Bereich von etwa 1 bis 1oo ug/kg Körpergewicht wurde sicher und wirksam beispielsweise Mäusen verabreicht.
Derartige Konzentrationen des unmodifizierten (rIn*rC )-; Komplexes sind hoch toxisch.
Die Unterbrechung der Säureketten in diesen Nucleinsäurekomplexen ergeben unvollständige oder modifizierte Komplexe,
die T -Wert2 von wesentlich höher als 37°C haben,
wobei die modifizierten Komplexe gegenüber fauclease durch KomplexAldung mit Polylysin ohne Beeinträchtigung der
Induktionsfähigkeit geschützt sind. Die /addition von j PoIy-L (oder D-)lysin an rl*Oligocytidylatkomplexe ! z.B. rI n'(cP)23 G'P oder an die speziell oben genannten . modifizierten Komplexe macht diese Komplexe gegenüber
enzymatischer Zerstörung resistent, ohne die Antivirus- [ Wirksamkeit zu beeinträchtigen.
wobei die modifizierten Komplexe gegenüber fauclease durch KomplexAldung mit Polylysin ohne Beeinträchtigung der
Induktionsfähigkeit geschützt sind. Die /addition von j PoIy-L (oder D-)lysin an rl*Oligocytidylatkomplexe ! z.B. rI n'(cP)23 G'P oder an die speziell oben genannten . modifizierten Komplexe macht diese Komplexe gegenüber
enzymatischer Zerstörung resistent, ohne die Antivirus- [ Wirksamkeit zu beeinträchtigen.
Die folgenden Methoden, Verfahren und Materialien wurden verwendet, um die Erfindung auszuführen.
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Quellen, Zusammensetzungen und Herstellung der verwendeten Substanzen ι
Enzyme und Nucleosiddiphosphate: Pol^nucleotid Phosphory
läse (Microooccus luteus, gefriergetrocknetes Pulver)
wurde von PL Biochemicals, Inc., Milwaukee, Wise, gekauft.
Bovin Pancrease RNase, RNase T1 und Escherichia
coli Alkalische Phosphatase wurden von Worthington Biochemical Co., Freehold N.J., und IDP (Trinatriumsalz)
und UDP (Trinatriumsalz) wurden von MiIe0 Laboratories,
Elkhart, Ind. erhalten. CDP (Trinatriumsalz), CDP (Trilithiumsalz) und GDP (Dinatriurusalz) wurden von PL
Biochemicals, Inc., Schwarz BioResearch, Inc., Orangeburg
N.Y. und vom Calbiochem, Los Anaeies, Calif, gekauft.
Die Herstellung der 2'-O-Methylinosin-51-diphosphate oder
verwandter 21-O-Alkylnucleotide wurde kürzlich in
einem Artikel in Biochemistry (1972), 11, 4931 mit dem Titel "A Novel Procedure for the Synthesis of 2'-O-Alkyl
Nucleotides" von I. Tazawa et al veröffentlicht.
Polynucleotide: .
rl und rC wurden von Miles Laboratories, Elkart, Ind.,
gekauft. Die maximale molare Extinktionkoeffizienten χ
von 1o.1oo (in o,oo5M Natriumacetat, pH 6,o) und 63oo in o,o1 M Natriumphosphat, pH 7,5) wurden für rl bzw.
rCn verwendet. Jr(I39,U)n, r(I21,U)n, r(C22,ü)n, R(C4,U)n
und r(Co ,G) wurden im Laboratorium durch enzymatische
ώθ ΓΙ
Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten unter Verwendung von Polynucleotidphospnorylase hergestellt. Die
Reaktionsmischung enthidt Nucleosiddiphosphate ( 4omMol), o,15 M-Tris*HCl (pH 8,2), 1o mMol MgCl2, o,4 mMol-EDTA
und M. luteus Polynucleotidphosphorylse (2 mg/ml der Reaktionsmischung). Nach Inkubation bei 37°C während 5
bis 7 Stunden wurden o,1 VoI 5 %iges Natriumdodecylsulfat
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und 1,o VoI 1o%iges Phaol zugegeben und die Reaktionsmischung
5 Minuten geschüttelt. Kristallines Phenol (etwa
1 g/5 ml der Mischung) wurde zu der Mischung gegeben, die
heftig geschüttelt wurde. Die wässrige Schicht wurde
durch Zentrifugation abgetrennt, in einen anderen Behälter übergeführt und einmal mehr mit Phenol behandelt. Die ; endgültige wässrige Schicht wurde gesammelt und nacheinander gegenüber 5o mMcl NaCl/5 mMol EDIA, 5 mttol NaCl/o,5 : mMol EDTA und destilliertes Wasser dialysiert. Nach der
Dialyse war die Polymerlösung frei von Nucleosiddiphosphaten, was durch Papierchromatographie bestimmt wurde.
Die Polynucleotide in wässriger Lösung wurden bei -17°C
gelagert. Die Basenzusammensetzung der Copolymere wurde
durch Hydrolyse des Polymers zu seinen Nucleotidbestandteilen, gefolgt von Umwandlung zu den entsprechenden ' Nucleosiden durch E. coli alkaliphosphate se bestimmt.
Die Nucleoside wurden durch Papierchromatographie getrennt und durch UV-Absorption quantitativ bestimmt. Die Poly- ■ meren wurden mit o,3 M KOH hydrolysiert mit der Ausnahme
von r (C2 ,G) , das durch eine Mischung von pankreatischer
RNase und RNase T- hydrolysiert wurde. Die folgenden
Lösungsmittelsysteme wurden für die Papierchromatographie
verwendet: Isopropanol/Wasser 7 : 3 für Copoly(I,U)'s;
n-Butanol/Formaldehyd/Wasser 77 : Io :13 für Copoly (C,U)'s; Isopropanol/Ammoniak/Wasser, 7:1:2 für r(C2O'G^n'
Es wurde angenommen, daß die molaren Extinktionskoeffizienten von r(I3niü)_ und r(I2,,U) dieselben sind wie die von Π . Ähnlich wurde der rC -Wert für r (C99,U) , r (C1 vü)
1 g/5 ml der Mischung) wurde zu der Mischung gegeben, die
heftig geschüttelt wurde. Die wässrige Schicht wurde
durch Zentrifugation abgetrennt, in einen anderen Behälter übergeführt und einmal mehr mit Phenol behandelt. Die ; endgültige wässrige Schicht wurde gesammelt und nacheinander gegenüber 5o mMcl NaCl/5 mMol EDIA, 5 mttol NaCl/o,5 : mMol EDTA und destilliertes Wasser dialysiert. Nach der
Dialyse war die Polymerlösung frei von Nucleosiddiphosphaten, was durch Papierchromatographie bestimmt wurde.
Die Polynucleotide in wässriger Lösung wurden bei -17°C
gelagert. Die Basenzusammensetzung der Copolymere wurde
durch Hydrolyse des Polymers zu seinen Nucleotidbestandteilen, gefolgt von Umwandlung zu den entsprechenden ' Nucleosiden durch E. coli alkaliphosphate se bestimmt.
Die Nucleoside wurden durch Papierchromatographie getrennt und durch UV-Absorption quantitativ bestimmt. Die Poly- ■ meren wurden mit o,3 M KOH hydrolysiert mit der Ausnahme
von r (C2 ,G) , das durch eine Mischung von pankreatischer
RNase und RNase T- hydrolysiert wurde. Die folgenden
Lösungsmittelsysteme wurden für die Papierchromatographie
verwendet: Isopropanol/Wasser 7 : 3 für Copoly(I,U)'s;
n-Butanol/Formaldehyd/Wasser 77 : Io :13 für Copoly (C,U)'s; Isopropanol/Ammoniak/Wasser, 7:1:2 für r(C2O'G^n'
Es wurde angenommen, daß die molaren Extinktionskoeffizienten von r(I3niü)_ und r(I2,,U) dieselben sind wie die von Π . Ähnlich wurde der rC -Wert für r (C99,U) , r (C1 vü)
XX
XX
Λ» 4L XX ■ *■* XJl
und r(C, ,G) verwendet. Die Extrnktionskoeffizienten von
r (C^U) und r (C4,U) wurden zu 67oo und 6800 (in o,o1 \ m Tris'HCl, pH 7,5) durch Phosphoranalyse bestimmt. ; Tabelle 1 enthält die Herstellung, die Basenzusammensetzung und den Sedimentationskoeffizienten der hergestellten Copolymeren. |
r (C^U) und r (C4,U) wurden zu 67oo und 6800 (in o,o1 \ m Tris'HCl, pH 7,5) durch Phosphoranalyse bestimmt. ; Tabelle 1 enthält die Herstellung, die Basenzusammensetzung und den Sedimentationskoeffizienten der hergestellten Copolymeren. |
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| !Polymer | ,U) ,U) |
Substrat (uMole) in d. enzymati- schen Fraktion |
Ausbeute | Basenzusam- raensetzung d.Copolymere |
Sedimenta- ' tionskoeffi zient , (S2o,w) |
| PoIy(I39 PoIy(I21 |
,U) | IDP (600)+UDP (3o) IDP (600)+UDP (60) |
42 4o |
I:U =39;4:1 I:U =2o,8:1 |
!o,2 7,9 |
| PoIy(C22 | ,U) | CDP (578)+UDP(3o) | 38 | C:U =21,8:1 | 3,8 |
| PoIy(C13 | U) | CDP (578)+UDP (60) | 44 | C:U =12,7:1 | 6,7 |
| PoIy(C7, | U) | CDP (600) +Unp(12o) | 4o | C:U = 7,o:1 | 3,8 |
| PoIy(C4, | ,G) | CDP(5oo) +UDP(2oo) | 38 | C:U = 4,1:1 | 6,8 |
| Poly (C2 | CDP (1000) +GDP (5o) | 47 | C:G = 2o,4:1 | 3,4 | |
x) Die Messungen wurden in minimal Eagle's Salzlösung durchgeführt. Die SeddJmentationskoeffizienten von
PoIy(I) und PoIy(C), die in dieser Studie verwendet wurden, waren 7,3 s bzw. 3,8s.
Die Herstellung von Poly2'-O-methylinosinsäure ist ähnlich
wie in Biochemistry (1972) 11, 4 931 mit dem Titel "A Novel Procedure for the Synthesis of 2'-0-alkyl ;
nucleotides" von I. Tazawa offenbart ist. Jedoch wurde beim vorliegenden Verfahren der Versuch gemacht, ein
Hybrid herzustellen, das beide Reste enthält, d.h. die
sowohl
Reste von/mnosinsäure als auch von 2'-O-methylinosinsäure, wobei beide Reste zusammen in derselben Kette des neuen· Typs von Polynucleotiden synthetisiert worden sind. In diesem Fall wird eine gewisse Proportion beider Substrate in die Mischung gegeben, d.h. gewisse Mengen von Inosin 5'-Diphosphat und gewisse Mengen von 2'-O-methylinosin-51-diphosphat wurden in die Enzymreaktionsmischung gegeben. Die Inkubation oder Bebrütung war der in der vorstehend genannten Literaturstelle sehr ähnlich für die Herstellung von Poly-21-O-methylinosinsäure und wie in dieser Ausführung angegeben ist .für die Synthese von Poly-21-O-inosir·- säure. :
Reste von/mnosinsäure als auch von 2'-O-methylinosinsäure, wobei beide Reste zusammen in derselben Kette des neuen· Typs von Polynucleotiden synthetisiert worden sind. In diesem Fall wird eine gewisse Proportion beider Substrate in die Mischung gegeben, d.h. gewisse Mengen von Inosin 5'-Diphosphat und gewisse Mengen von 2'-O-methylinosin-51-diphosphat wurden in die Enzymreaktionsmischung gegeben. Die Inkubation oder Bebrütung war der in der vorstehend genannten Literaturstelle sehr ähnlich für die Herstellung von Poly-21-O-methylinosinsäure und wie in dieser Ausführung angegeben ist .für die Synthese von Poly-21-O-inosir·- säure. :
Oligoinosinate: ' j
Oligoinosinate wurden durch kontrollierte alkalische Hydrolyse von rl und nachfolgende Behandlung mit HCl und
alkalischer Phosphatase hergestellt. Sie wurden durch , DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie isoliert und charakterisiert.
Die folgenden Extinktionskoeffizienten wurden
für die Oligomeren verwendet: 11 4oo für (Ip)9I, - j
1o 800 für (Ip) rl, 1o 4oo für (Ip)gI und 1o 2oo für
Abbau von r(C2 ,G) rait RNase T-:
Etwa 600 optische Dichteeinheiten (bei 26 8 nm) von
r(C, ,G) wurden mit 35o Einheiten von RNase T1 bei 37°C ,
jährend 3 Stunden in 12,5 ml o,o5 molarem Tris'HCl (pH ,
7,5)/1 mMol EDTA bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die
Mischung gefriergetrocknet, in 1 ml Wasser aufgelöst und
R
auf eine Säule Sephadex G5o (2,5 cm χ 9o cm) aufgebracht. Die Säule wurde mit Wasser eluiert, das Elukionsprofil ist in Fig. 1 gezeigt. 6 Fraktionen wurden willkürlich ausgewählt, wie in cer Fig. 1 gezeigt. Fraktionen5 und 6 hatten ähnliche UV-Spektren wie Cytidin bzw. Guanosin und wurden nicht weiter charakterisiert. Die Fraktionen 1 bis 4 zeigten alle UV-Spektren, die ähnlich denen von j Poly C(>im,v 268 mn in o,o1 M Tris'HCl, pH 7,5) waren. !
auf eine Säule Sephadex G5o (2,5 cm χ 9o cm) aufgebracht. Die Säule wurde mit Wasser eluiert, das Elukionsprofil ist in Fig. 1 gezeigt. 6 Fraktionen wurden willkürlich ausgewählt, wie in cer Fig. 1 gezeigt. Fraktionen5 und 6 hatten ähnliche UV-Spektren wie Cytidin bzw. Guanosin und wurden nicht weiter charakterisiert. Die Fraktionen 1 bis 4 zeigten alle UV-Spektren, die ähnlich denen von j Poly C(>im,v 268 mn in o,o1 M Tris'HCl, pH 7,5) waren. !
IU el X i
Die allgemeine Formel von (Cp) G>p wurde diesen vier Fraktionen
zugeteilt, wobei die Spezifizität und die Menge der verwendeten RNase, T , in Betracht gezogen wurde.
Die Bebrütung dieser Fraktionen mit einer Mischung von ; pankreatischer RNase, RNase T1 und E. coli alkalische j
Phosphatase ergab ausschliesslich Cytidin und Guanosin. ! Die mittlere Kettenlänge dieser Fraktionen wurde aus dem
Cytidin : Guanosin-Verhältnis bestimmt und wird in Tabelle 2 gezeigt. Die folgenden Extinktionskoeffizienten wurden
willkürlich für die Fraktionen 1-4 gewählt unter Berücksichtigung der 2·s von Oligocytidylaten und der Gegenwart
von einem Guanylatrest pro Molekül: Fraktion 1, 6600, Haktion 2 6800, Fraktion 3 7ooo, Fraktion 4 73oo in o,1 M
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Tris'HCl, pH 7,5 bei Raumtemperatur. ' '
Tabelle 2 · j
Mittlere Kettenlänge und Basezusammensetzung der ver- ;
schiedenen Fraktionen von (Cp) G>p,.erhalten durch ,
RNase T1 Hydrolyse von Poly(C,n G) ' i
Fraktion Cytidin Guanosin C : G-Verhält- mittlere :
nis Kettenlänge ;
46,9:1 49,1 !
49,2:1 I
ι i · 14o5 38,4 36,3:1 j
33,5:1 36,1 j
22,5:1 j
23,6:1 24,1 j
! 4 1oo1 86.5 11,6:1 12,4 j
11,3:1
x) Die Experimente wurden doppelt durchgeführt.
Bildung von Poly- und/oder Oligonucleotidkomplexen: \
rl wurde mit rCn, Co-poly (C,U) ' s-, r (C2 ,G) und (Cp)nOp
j. . bei Raumtemperatur in Puffer A gemischt, um die Komplexe ' zu formen. Ähnlich wurde rC mit Co-PoIy(I1U)1S und Oligo
(I)1S gemischt. Da (Ip)2I und (Ip)5I keine Komplexe {
mit rC bei Raumtemperatur bilden, wurden ihre Mischungen mit rC bei etwa 4°C vor den Experimenten gehalten. Alle i
j Mischungen wurden wenigstens 3 Stunden bei der geeigneten ;
Temperatur gehalten, um sicherzugehen, daß die Komplexbildung vor den Experimenten vollendet war. Die Stöchiometrie
des Mischens war immer 1 : 1 hinsichtlich der Inosin- und Cytidin-Reste und die Konzentrationen der Komplexe wurden
in Form von I'CResten ausgedrückt. i
| Cytidin (itiMol) |
Guanosin (mMol) |
| 2212 | 47,2 |
| 1753 | 35,6 |
| 14o5 | 38,4 |
| 1559 | 46,5 |
| 1399 | 62,1 |
| 1312 | 55,7 |
| 1oo1 | 86,5 |
| 979 | 86,6 |
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Bildung von Komplexen zwischen Polylysinen und Poly- und/ oder Oligonucleotxdkomplexen:
Vorgebildete Polynucleotidkomplexe in Puffer A wurden tropfenweise
zu einem gleichen Volumen der Polylysinlösungen im gleichen Medium unter Rühren zugegeben. Polynucleotid-
und Pölylysinkonzentrationen wurden so eingestellt, daß
der gewünschte Wert nach Mischen von gleichen Volumina ; der Lösungen erreicht wurde. Bei einer Konzentration von '.
1 bis 5 χ Io M-Rest Polynucleotid führt die Bildung j
des 1 : 1-Komplexes mit Poly-L-lysin oder Poly-D-lysin bei
Raumtemperatur nicht zu einer bemerkenswerten Menge einer Ausfällung. Dies wurde durch die Abwesenheit einer Trübung
(Erhöhung der Absorption bei 32o nm) und geringen Verlust (weniger als 1o i) an Material nach dem Zentrifugieren
bei 3ooo g während 15 Minuten angezeigt. Jedoch wird eine
solche Lösung immer trübe und beginnt stark bei 32o nm zu absorbieren, und zwar während des Schmelzprozesses,
bei erhöhten Temperaturen und beim Kühlen. Es wurde angenommen, daß der Komplex zwischen einzdkettigen Polynucleotid
und Polylysin sogar weniger löslich ist als der Komplex von Polylysin/r(I)n"r(C)n. j
Für die Herstellung des ternären Komplexes von r(Ip)12I*
rCn'Poly~L-lysin, wurde r(Ip)12I*rCn in 2 m NaCl/o,o1 ;
M-NaP04/o,oo1 MMgCl2 hergestellt und bei 5°C für 1 Stunde
gehalten. Diese Lösung würde zu der gekühlten Poly-L-lysinlösung
im selben Lösungsmittel gegeben. Diese Lösung ' wurde bei 4°C nacheinander dialysiert gggen o,o1 m NaPO,/
o,oo1 M MgCl2 enthaltend 1 m NaCl (4 Stunden), o,5 M j NaCl (4 Stunden), o,25 M NaCl (1o Stunden) und schliesslich
o,15 M NaCl (6 Stunden).
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Komplex
x)
Der Effekt, auf Regionen nicht gepaarter Basen in rl oder rC
η η
auf Interferenz induziert durch den rl *rC Komplex
Interferenz Intracellularer Virusausbeute
Konzentration (d. Mononucleotide)
Schutz,.% Εχρ.Α:ίΧ;
Exp. B
XX )
Exp.
AXX) Exp,
Exp.
,XX)
Interferon (Einh./ml)
Exp.A 'Exp. B'
O
CO
OO
T(I3J1U)nTCn
T(I211U)nTCn
r(I2l.U)n-rCn
r(I„.U),TCn
T(I211U)nTCn
r(I2l.U)n-rCn
r(I„.U),TCn
TlnT(C1U)n
TlnT(Q1U)n
TlnT(Q1U)n
TlnT(C7-U)n
TlnT(CU)n
TlnT(C71U)n
rI„T(C:3,U).
TlnT(CU)n
TlnT(C71U)n
rI„T(C:3,U).
rInT(C2;.U)„
rInT(C2: .Γ)..
TlnT(C22-U)n
rIn-rCn
rIn-rCn
rIn-rCn
None
lxlO"s IxIO-*
IxIO"3 IxIO"5
Ix ΙΟ"4 IxIO"3
ixlO"3 1 \10-5
lxio-··
lxlO"3 IxlO-5
1 χ 10-·»
ixio-5
Ix1O-1
lxio-3
IxIO"5 1 XlO-"
I XlO-3 1 XlO"5 1> 10-*
IxlO-3
10 20 100. 12 61 99 10 30
50
100 100 100 100 100 100 9S 93 100 11
S 50
45 100
35-30 19 21 87 35
92
3-3 XlO8 1-6 XlO3
6-9x10° 3-0 XlO7
1-SxlO*
8-0 XlO1"
3-3 X 10" 3-3 XlO9
7-2 XlO7
7-0 XlO9 1-0 XlO7
_ 5-7XlO9
_ ■ 1-0 XlO7
9-0 χ IJ1 1-3 XlO3
6-0 XlO3 —
3-3x10* —
3-0 XlO1 —
— 1-1 XlO8 3-8 XlO3 —
3-0 XlO3 —
9-0 XlO3 3-3 XlO9
1-2x10» 2-1 XlO8
1-0 XlO8
2-4XlO7
6-6 XlO8
0 0
0 0
18 10
20 10
26 40
<5
<5
x) Alle Belichtungen wurden 6o Min. boi 37°C bei den angegebenen Konzentrationen durchgeführt. Die
Zellen wurden gewaschen ( 2 mal mit minimal Eagle's Medium) und minimal Eagle's Medium (ent- ro
haltend 12 % fötales Kalbsserum) wurde zugegeben. Die Messungen von Interferenz und Inter- -fc**
feron sind im Text beschrieben. ^1
xx) Die Exp. A, B und C wurden zu verschiedenen Zeiten mit verschiedenen Ansätzen von Zellen ^
durchgeführt, die verschiedene Sensivitäten hinsichtlich der Anregung der Interferonbildung ; (jn
und der Viru^ausbeute aufwiesen. Daher wurde für jec'e Gruppe von Experinenten interne Kon- : oo
trollen vorgesehen. · :
Hydrolyse von Nucleinsaurekomplexen und den ternären Komplexen
mit Polylysinen durch Pancrease RNase: i
rln.rcn, r(I21,U)n.rCn# rln'r (C4,ü)n, XrIn(Cp)48Op und [
ihre Komplexe mit L- und D-Polylysin wurden wie oben be- :
schreiben hergestellt. Die verwendete Nucleotidkonzentration
war einmal 1o M und das Verhältnis von Phosphat ; (Nucleotid) zu Stickstoff (Lysin) war 1:1. Die niedrige
NucleotidkonzenLration wurde verwendet, um Ausfällung des
Komplexes durch PolyIysin zu vermeiden. Bovin Pancreas ; RNase wurde in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 1 mg/ml gelöst, 60 ,ul der Enzymlösung wurde dann 7. λ j 36 ml der Komplexlösung gegeben und gut gemischt. Die ; Mischung wurde bei Raumtempratur gehalten. Ihre Absorptionsspektren wurden in geeigneten Zeitintervallen unter Ver- : Wendung einer Zelle mit einer 1o< cm Weglänge aufgenommen.
NucleotidkonzenLration wurde verwendet, um Ausfällung des
Komplexes durch PolyIysin zu vermeiden. Bovin Pancreas ; RNase wurde in destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 1 mg/ml gelöst, 60 ,ul der Enzymlösung wurde dann 7. λ j 36 ml der Komplexlösung gegeben und gut gemischt. Die ; Mischung wurde bei Raumtempratur gehalten. Ihre Absorptionsspektren wurden in geeigneten Zeitintervallen unter Ver- : Wendung einer Zelle mit einer 1o< cm Weglänge aufgenommen.
Die Experimente wurden durchgeführt, um sicherzugehen, daß
das Fehlen des Anstiegs der Absorption der Polynucleotidkomplexe mit Polylysin in Gegenwart von Nuclease ein verlässlicher
Indikator dafür ist, daß die Polynucleotide
unversehrt bleiben. Djes wurde durch Zusatz von gesättigter . (NH4J2SCK Lösung zu einer endgültigen Konzentration von
2o % Sättigung erreicht. Unter diesen Bedingungen ist die
Nucleaseaktivität verhindert und der Polylysin-Polynucleotidkomplex dissoziiert. Es wurde kein Anstieg der Ab- : sorption ( absorbance) des Polylysin-Polynucleotid-Kompiexes
unversehrt bleiben. Djes wurde durch Zusatz von gesättigter . (NH4J2SCK Lösung zu einer endgültigen Konzentration von
2o % Sättigung erreicht. Unter diesen Bedingungen ist die
Nucleaseaktivität verhindert und der Polylysin-Polynucleotidkomplex dissoziiert. Es wurde kein Anstieg der Ab- : sorption ( absorbance) des Polylysin-Polynucleotid-Kompiexes
(1:1) nach Inkubation mit dem Enzym wegen des Zusatzes . von (NH4J2SO. gefunden (nach Anpassung für die Verdünnung).
Der Zusatz von (NH4J2SO4 veränderte dun Anstieg der Absorption
nicht, die durch Polynucleotidabbau nach der In- , kubation mit dem Enzym in Abwesenheit von Polylysin ver- ,
ursacht worden war.
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Physico-chemische Eigenschaften: !
Absorptionspektren wurden in bekannter Weise gemessen.
Die T wurde als die Temperatur definiert, bei der dio ,
Hälfte der gesamten optischen Änderungen eintrat. Sedimentationskoeffizienten
wurden auf einer Spinco-Modell E
analytischer Ultrazentrifuge bestimmt, die mit einen i photoeiektrischen Abtaser ausgerüstet war. Die Konzentration dieser Proben wurde eingestellt, um eine o,5 bis
o,8 optische Dichteeinheit bei 265 nm zu ergeben.
analytischer Ultrazentrifuge bestimmt, die mit einen i photoeiektrischen Abtaser ausgerüstet war. Die Konzentration dieser Proben wurde eingestellt, um eine o,5 bis
o,8 optische Dichteeinheit bei 265 nm zu ergeben.
Biologische Studien: j
Lösungen: j
Puffer A ist o,15 M NaCl, o,o1 M Natriumphosphat (pH 7,2)
und o,oo1 M MgCl2. Dieser Puffer wurde sowohl für die
physikalischen als auch biologischen Studien verwendet, so daß die Resultate direkt verglichen werden konnten. Minimal Eagle Medium wurde hergestellt, um entweder 12 % oder 6 % fötales Kalbsserum, wie spezifiziert, zu enthalten, und '. Glutamin (2 mMol), Penicillin G (2oo Einheiten /ml) und
Streptomycin (2oo ug/ml) wurden kurz vor der Verwendung
zugegeben. Salin D ist o,i4. M NaCl, o,oo17 M Na2HPO.,
o,oo54 M KCl, o,oo23 M KH3PO4 und 0,6 mg Phenol rot pro
ml. Trypsin (ο,2 %) wurde in Saline D hergestellt, um ■ o,oo5 M Äthylendiamintetraessigsäure zu enthalten. j National Cancer Institute Medium 2X wurde verwendet als j Fleckenbedeckungsmedium. ι
physikalischen als auch biologischen Studien verwendet, so daß die Resultate direkt verglichen werden konnten. Minimal Eagle Medium wurde hergestellt, um entweder 12 % oder 6 % fötales Kalbsserum, wie spezifiziert, zu enthalten, und '. Glutamin (2 mMol), Penicillin G (2oo Einheiten /ml) und
Streptomycin (2oo ug/ml) wurden kurz vor der Verwendung
zugegeben. Salin D ist o,i4. M NaCl, o,oo17 M Na2HPO.,
o,oo54 M KCl, o,oo23 M KH3PO4 und 0,6 mg Phenol rot pro
ml. Trypsin (ο,2 %) wurde in Saline D hergestellt, um ■ o,oo5 M Äthylendiamintetraessigsäure zu enthalten. j National Cancer Institute Medium 2X wurde verwendet als j Fleckenbedeckungsmedium. ι
Zellen:
Menschliche Neonatal-Fibroblaste,als Monoschichten gewachsen, wurden in 75 ml Plastikflaschen gehalten. Zum [
Studium des Interferons wurden sie auf Plastikplatten ■ (35 mm χ 1o mm) überführt. Diese Zellen, die relativ geringe
Mengen von extracellularem Interferon in vitro ] bilden, wurden nach den üblichen Methoden gewonnen.
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-2ο-
Her^tellung des Virusstocks: |
Bovine vesicular stomatitis-Virus, New Jersey Serotyp, wurde aus infiziertem Mausembryo und Mausamnionzellen
gewonnen, um einen Titer von 1 bis 1o χ 1o fleckbildenden
Einheiten/ml zu ergeben. Der Virnastock, üblicherweise
I6ofach verdünnt, wurde bei -7o°C aufbewahrt. j
I Interferon-Induktion und Versuch:
Um ein empfindliches Maß der Interferenz zu erhalten, ί
wurden verschiedene Messungen des antiviralen Zustande
gleichzeitig quantitativ bestimmt: j
a) Interferon-Versuche und zwei Indices von Intracellularinterferenz,
|
b) Colcrimetaischer Versuch der viralen Cytopathicität und
c) Reduktion der Virusausbeute. I
Die letztgenannte Methode ermöglichte den antiviralen ; Schutz in Regionen nahe ο % und 1oo % von überlebenden '
Zellen zu vergleichen;die vorhergehenden Methoden versagten,
üblicherweise wurden die Zellen zwischen Passagen 7 und 25 verwendet, da die Empfindlichkeit dieser Zellen
auf rl *rC von Zeit zu Zeit sich verändert/ jeder Satz ,
Experimente enthält eine interne Referenz, üblicherweise
-3 .. ς rl *rC , untersucht bei 1o bis Io 3M,
Zellen wurden den Polynucleotidkomplexen in minimal
Eagle Medium bei angegebenen Konzentrationen für eine j
Stunde·ausgesetzt und dann 3 mal gewaschen, bevor sie \
in frischem Medium bei 37°C wieder bebrütet wurden. j
(a) Interferon wurde aus extracellularen Flüssigkeiten
18 Stunden später gewonnen und colorimetrisch ge- !
messen unter Verwendung von Bovine vesicular Sto- ι
matitis Virus als angreifender Virus. Versuche \ wurden doppelt oder dreifach durchgeführt, und als '
Bezug Interferon (geliefert von Biologie Resources Branch, National Institutes of Health) wurde ebenfalls
von Zeit zu Zeit verarbeitet, um die Empfindlichkeit
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des Versuchssystems zu bestätigen.
Versuche von intracellular Interferenz
(b) Intracellulare Widerstandsfähigkeit colorimetrisch bestimmt:
Im allgemeinen wurde eine Vielzahl von Infektionen von
etwa 1 Fleckenbildungseinheit/üelle verwendet. Der Widerstand
(%) wurde definiert als Verhältnis der Zahl i
ι der viablen Zellen (nach Virusinfektion) zu der Zahl ■
der lebenden Zellen (nur scheinbar infiziert). Die ! colorimetrysehe Titration (doppelt) wurde üblicherweise.
72 Stunden nach der Infektion gemacht. ·
(c) Reduktion der Virenausbeute als Maß von intracellularer.
i Interferenz j
Zellen wurden mit Bovin vesicular Stomatitis virus ,
7 !
(1o fleckenbildenden Einheiten pro Schale, Vielfalt [
der Infektion etwa 2o) 6o Minuten behandelt und· der ;
nicht absorbierte Virus dann entfernt. Die Zellen wurden
2 mal gewaschen und die Kulturen 2o Stunden in frischem Medium bebrütet. Der Virustiter wurde dann bestimmt
(doppelt) in Mäusezellen durch Fleckentitration. j
Kriterien für die Identifizierung von menschlichem Interferon:
Die Interferone mussten anfänglich 2 dieser Kriterien erfüllen: sie waren Trypsinsensitiv, nicht dialysierban und
sedin entwerten nicht bei 1o5 ooo g während 2 Stunden. Sie ;
schon '
demonstrierten Speciesspezifität wie/durch die Abwesenheit
von Aktivität in Mäuse- r>der Kükenzellen gezeigt. Repräsentative
Interferone, die bei^ese1" Studien erhalten worden ;
sind, wurden an Sephadex G15o und G 2oo chromatographiert, ; · wobei ein einzelner Aktivitätspeak erhalten wird, der einem
Molekulargewicht von etwa 96 ooo Daltons entspricht.
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Interpretation der Resultate: Allgemeine Annäherung:
Es ist im allgemeinen anerkannt, daß Ribosylpolynucleotide die sekundäre Struktur einer Doppelkettenspirale besitzen
müssen, um als Interferonanreger wirksam zu sein. Außerdem Müssen die Polynucleotide gegen Nucleasen widerstandsfähig
sein, um für eine genügend lange Zeit Makromoleküle zu bleiben. Polynucleotide sind üblicherweise viel weniger
qegenüber Angriffen empfindlich, wenn sie in einem spiralrörmigen Komplex sind. Daher müssen diese beiden Grund- forderungen
für jegliche Modifikation des rl *rC -Komplexes beachtet werden.
Beispielsweise muss der modifizierte rIn*rC -Komplex (in
Eagle's ausgewogener Salzlösung, Puffer A) einen T -Wert im wesentlichen überhalb der Inkubationstemperatur (37°C) j
der Zellen aufweisen. Die Empfindlichkeit dieser modifizierten Komplexe gegenüber Nuclease ist festgestellt worden. j
Wenn gefunden wurde, daß diese Verbindungen anfälliger als
die Stamm-rl'rC -Komplexe sind, wurden Maßnahmen ergriffen,'
um ihre Widerstandsfähigkeit zu vergrößern. Die für diesen j Zweck ergriffene Maßnahme ist die Einführung von Polylysin \
(sowohl die D- als auch die L-Form) für die Bildung von i Polykation-Polynucleotidkomplexen, die sich als sehr wider- :
standsfähig gegenüber Nucleasen erwiesen. Dies führte zur | Untersuchung der biologischen Aktivität des Polylysin-Poly- ;.
nucleotidkomplexes.Es ist wichtig zu zeigen, daß die An- j lagerung von Polylysin an rl *rC die Interferonanregungsfähigkeit
des ursprünglichen Polynucleotidkomplexes nicht ; wesentlich verändert. Mit der obigen Strategie im Sinne wurde
der modifizierte rl'rC -Komplex hinsichtlich seiner ther- j
"mischen Schmelzeigenschaften, seiner biologischen Aktivität | als Interferonanreger in menschlichen Zellen, seiner Empfindlichkeit
gegenüber Nuclease und der Wirkung von Komplexbil-r.· j
dung mit Polylysin in allen diesen Aspekten überprüft.
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rl *rC -Komplexe, die unpaarige Basen enthalten: =
üridylatreste wurden in die rIn~Kette und die rC -Kette
als unpaarige Basen eingeführt und in einem speziellen Fall wurde Guanylat in die rC -Kette für den gleichen ;
Zweck eingeführt. Die Zusammensetzung dieser wahrscheinlich regellosen Copolymeren und ihre Sedimentations- '
koeffizienten sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Polynu- ■
cleotide haben ein Molekulargewicht, dae von 3o ooo bis
loo ooo reicht, wie es aus ihren Sedimentationskoeffi- ;
zienten-Werten geschlossen wurde. Die Schmelzprofile ;
und die T -Werte von 7 unvollständigen I 'C-Komplexen
in Puffer A (Eaglefe Salzlösung) zusammen mit ihren '
Stämmen rIn*rCn sind in Fig. 2 und 3 dargestellt. Alle \
diese Komplexe ergaben hoch zusammenwirkende Profile mit T (5o - 6o°C) etwas niedriger als die von rl *rC
(64,8°C), aber im wesentlichen über 37°C, d.h. der In- ; kubationsteperatur. Die kleine Verringerung der T und ;
das leichte Erweitern der Spiral-Windungsübergangs- ;
profile (helical-coil transition profile) sind von die- ' sen unvollständigen Komplexen zu erwarten. j
Wenn diese unvollständigen Komplexe auf Antivirusfunktionen
(Tabelle 3) geprüft wurden, wurde es sofort klar, [ daß die Einführung von U in die rl -Kette eine sehr viel
größere Verringerung der Aktivität des erhaltenen Komplexes verursachte, als wenn U in die rC -Kette eingeführt
war. Die biologischen Aktivitäten von rl »r(C13,U) und rl *r(C7»ü)n sind bedeutsam höher
als die von r(I3g,U) *rC und r(I2-»u)n*rC n in- zwei j
separaten Experimenten (Tabelle 3), obwohl alle diese i Komplexe spiralförmig bei 37°C sind. Der T -Wertvon.
r(I39,ü)n*rCn war nur 2°C niedriger als der von
rIn*rCn(Fig. 2), aber die biologische Aktivität wird
etwa 1oo mal verringert. Während andererseits das ^In*
r (Cj3,U) einen etwa 5°C tieferen Tm-Wert als rIn*rCn
hat, ist die biologische Aktivität dieses unvollständi-
ΤοΊΓβ 1Υ/Τ0ΤΤ
gen Komplexes nur leicht reduziert. Sogar das rl *r (C7Ju)
ist bestimmt aktiv, obwohl die Aktivität von rl *r(C4,U)
nur sehr gering ist und auf eine Steigerung der Konzentration nicht anspricht. Es wurde festgestellt, daß
die Bildung eines *"(CfU)n Copolymeren mit einem 1:1
Verhältnis in einem biologisch inerten Π *r(C,U) Komplex resultiert. Innerhalb des experimentellen Fehlers ist . rIn #r(C22,U) genauso aktiv wie rIn*r(C)n. j
die Bildung eines *"(CfU)n Copolymeren mit einem 1:1
Verhältnis in einem biologisch inerten Π *r(C,U) Komplex resultiert. Innerhalb des experimentellen Fehlers ist . rIn #r(C22,U) genauso aktiv wie rIn*r(C)n. j
Oligo I'rCn und rln*Oligo C-Kornplexe, der Effekt der '
Kettenunterbrechung: j
Es wurde gezeigt, daß die biologischen Aktivitäten von PoJy(C)'Hexainosinatkomplex nur vernachlässigbar ehne
den steigernden Effekt von DEAE-Dextran sind.
In den vorliegenden Studien wurde dieses System genauer
untersucht und versucht* die Bedingungen für die Kettenfestzulegen
länge von entweder Oligo (I) oder Oligo (C)/ die, wenn mit einem komplementären Polymer komplexiert, die Inter- ; feroninduktionsfahigkeit des Poly(I,C)-Komplexes behalten würden. Die thermodynamisehen unefoptisehen Eigenschaften von Oligo(I)"Poly (C)-Komplexen sind detailliert beschrieben worden.
länge von entweder Oligo (I) oder Oligo (C)/ die, wenn mit einem komplementären Polymer komplexiert, die Inter- ; feroninduktionsfahigkeit des Poly(I,C)-Komplexes behalten würden. Die thermodynamisehen unefoptisehen Eigenschaften von Oligo(I)"Poly (C)-Komplexen sind detailliert beschrieben worden.
Die T des Oligomer-Polymer-Komplexes hängt von der Oli-
gomer-Kettenlänge und der Konzentration des Komplexes
ab und ist weniger als die des Polymerkomplexes. Die ;
Schmelzprofile von r(Ip)QI*rC (festgestellt durch Ah-- :
y η I
sorption) und von r (Ip) 1£-I°rC (festgestellt durch opti-
i ο η ι
sehe Rotation) sind in Fig. 4 gezeigt und einige der !
T -Werte der Komplexe in Tabelle 4 aufgeführt. Die Komplexe von r(I) « TC haben niedezereT -Werte als 37°C.
Ä& > g ^J* IA All
Deshalb ist das Fehlen der biologischen Aktivität dieser
Komplexe (Tabelle 4) nicht überraschend. Im Falle von
rCn'r(Ip)lgI wurde die Bebrütungstemperatur während
der Aussetzung (1 Stunde) auf 3o°C anstelle von 37°C j
rCn'r(Ip)lgI wurde die Bebrütungstemperatur während
der Aussetzung (1 Stunde) auf 3o°C anstelle von 37°C j
S09819/101 5
erniedrigt (eine Praxis, von der sich herausstellte, daß sie keinen signifikanten Effekt hat), so daß die Oligo-I*rC
-Komplexe (T ~47°C)während der Aussetzung spiralförmig
bleiben konnten. Unt°.r diesen Bedingungen wurde die biologische Aktivität des 01igo-I*rCn-Komplexes als
nur unbedeutend befunden, selbst" bei einer Konzentration
VrCn-
von 1o M. Für den r(Ip)1RI*rC -Komplex (T ungefähr
5o°C)wurde eine bestimmte Indikation der biologischen
Aktivität beobachtet (Tabelle 3), obwohl sie wenigstens 1oo mal geringer ist als die von rl *rC .
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Antivirale Widerstandsfähigkeit durch Oligo I·rCn-Komplexe
Anregender
Komplex
Komplex
Konzentration der Mononucleotide (M)
Interferenz IntereelIulare
r Schutz
Exp. A
Exp. B
Virusausbeute
Exp. A Exp.B
Interferon- ;
einheiten/ml)
einheiten/ml)
TiJ11T(Tp)11I
J-InTCn
Noiio
7-0
20·Γ>
■15 0
20·Γ>
■15 0
47-0
;.ίο·ο
I X Kr'' I X Κ)"='
ι χ ιο-3 2χ10-η
I ViO"3
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I χ Ki-' I χ 10-°
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| ι -ο χ | O | |||||||
Die Komplexe wurden auf Zellen bei 4°C für 6o Minuten in Standard-Pufferlösung einwirken gelassen,
mit Ausnahrcs, wo angegeben (t).
x) Die Komplexe wurden bei 3o°C für 6o Minuten in einer Mg-enthaltenden Pufferlösung (o,15 NaCl,
o,o1 M MgCl2F o,o1 M Natriumphosphat (pH 7,4)) ausgesetzt.
Die Unterbrechung der rC -Kette wurde durch Copolymerisation von GMP in rC durchgeführt, gefolgt von enzymis
schein Abbau durch RNase T.. Die G-Reste dienen sowohl
als anfällige Stellen für die spezielle Hydrolyse, als auch als Identifikationspunkt für die Kettenlänge,
da die endständigen Reste in allen diesen Oligomeren die G-Reste sind. Daher weisen rl T(Cp) G>p-Komplexe
nicht nur eine Kettenunterbrechung auf, sondern auch ■ ein Herauswinden (looping out) des G-Restesbei jeder ;
Unterbrechung. Die Schmelzprofile aller dieser rl · r (Cp) G>ρ ,-Komplexe sind in Fig. 5 gezeigt. Die rl OIi--
Λ ν ΓΙ
go C-Komplexe haben niedrigere T -Werte als die rC -Oligo
I mit Oligomeren derselben Kettenlänge. Deshalb ist in thermaler Stabilität ausgedrückt rl T(Cp),,., G^p
etwa äquivalent zu r(Ip)-gI*rC unter ähnlichen Bedin- ,
gungen. Die biologischen Aktivitäten dieser rl *'r(Cp)v ;
G>p -Komplexe sind niedriger als die der originalen ; rl *r(C2 ,G) -Komplexe, was fast das gleiche ist als der :
>rl TC . Der Komplex mit dem größten Oligomer ! rln«r (Cp)48Op hat eine sehr hohe Tm(59,6°C), aber ist
1o mal weniger aktiv als rl Vr(C-,G) . j
rl T(CpL G>p ist etwa lofach aktiver als
rCn· '
rl "r(ep)-G>p ägt nur eine geringe Aktivität, wie vorauszusehen, da die T dieses Komple;
kubationstemperatur von 37°C liegt.
auszusehen, da die T dieses Komplexes unter der In
Zwei Schlußfolgerungen können aus den oben genannten ;
Resultaten gezogen werden: 1. die Unterbrechung einer* i der Ketten im spiralförmigen Komplex reduziert definitiv
die Interferon-anregende Aktivität, #ie es durch den !
Vergleich zwischen rln*r(C2o,G)n gegen rln*r(Cp)48Op
gezeigt wird (Tabelle 5). In diesem Fall hat rl *r(Cp)4g
G>p fast den gleichen Tm (59,60C)-Wert wie rI n"r(c 2o'G)n
(6o,9°C) und das rl T(Op)48Op enthält sogar weniger '
Frequenz von unpaarigem G. Jedoch ist die biologische Aktivität rlnτ(Cp)48 G>p1omal geringer als die des ;
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nicht unterbrochenen rln*r(C30,G)n. 2. der rln*01igo C-Komplex
ist biologisch aktiver als der Oligo ITC -Komplex selbst wenn sie eine ähnliche thermale Stabilität
und nicht grosse Unterschiede in der Oligomerkettenlänge aufweisen. Dies erläutert dt;r Vergleich zwischen .
rlnT(Cp)23 G>p versus r (Ip) ..g«ITC , in dem der erstgenannte
Komplex lofach aktiver ist als der letztgenannte Diese Beobachtungen verstärken den Schluss, daß die
Modifikation in der rl -Kette einen größeren biologischen
Effekt hat als die in der rC -Kette.
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Tabelle 5
Antivirale Resistenz durch Π ·uligocytidylatkomplexe:
Antivirale Resistenz durch Π ·uligocytidylatkomplexe:
Anreger
Konzentration (M)
Intracellularer Schutz (%)
Virusausbeute
Interferonausbeute (Einheiten)
O (O OO
n(a0)n
rXnT(C20,G)n
rI.-r(Cp)„G>p rInT(Cp)40O>j>
Tl»T(Cp)38G>p
Viral control
| ixio~a | 1OO |
| ix ίο-·1 .'■■-.' .. | K)O |
| lXlO"0 · · · | 9R (Sl) |
| Ix ίο-·1 | 100 |
| ι χ ίο--* | 100 |
| 1 XlO"6 | |
| Ix)O-3 | loo |
| JxIO-" | JOO |
| ixio-15 | 10 |
| lxlO'6 (I : 1 poly-L-lysino) | — |
| lxio-3 | 8Π (92) |
| ixio-« | 7 |
| I XlO-0 | — |
| IxIO"0 (I : 1 poly-i^-lyeino) | ΰ |
| lxio-3 | 21 |
| Ix K)-* | I |
| 1 xlO"& | O |
| G | |
| lxio-8 | 100(40) |
2-J XlO5 7-2x10"
1-2x10" (1-1 ν κι")
G-!) X 10s
2·7χ1Ο7 1-2 χ K)10
7-ßxlO0
1-ßXlO0 (1-7 X 10r·)
9-0x10° 3-3x10°
1-3X1010 (6-0x10°)
— ..(2-IxIO7)
<5 O-r') 20
ΰ
ro cn
co
cn
CO
-3ο-
Empfindlichkeit des modifizierten rl «rC -Komplexes und
die Eigenschaften von ternären Komplexen rl *rC (beide
modifiziert und nicht modifiziert) mit Polylysin (beide D und L-Formen): >
Die obigen in den rl *rCn-Komplex eingeführten Modifik-tio
nen (Fehlanpassung (mismatching) und Unterbrechung) führen unveränderlich zu einem Verlust von biologischer Aktivität
in verschiedenen Graden. Bevor diese Beobachtung richtig interpretiert werden kann, muss man sicher sein, daß
dieser Verlust an biologischer Aktivität nicht einfach eine Nachwirkung auf die Steigerung der Empfindlichkeit
dieser modifizierten Komplexe gegenüber Angriffen von l^ucleasen ist. Wie in Fig. 6 und 7 gezeigt, sind die biologisch
unaktiven r(I?-,U)*rC und rl «r(C,,U) als auch
das weniger aktive rl *r(Cp)^n G)p bemerkenswert empfindlicher
gegenüber einem Angriff von pancreatischer RNase A
als das hochaktive rIn'rC n· !
Es ist bekannt, RNS vor Nucleasen durch Komplexbildung miteinem Polycation zu schützen. Die Interaktion von Poly-L-lysin
mit rl -rC wurde zuerst von Tsubol, Matsuo und
Ts1O (1966) untersucht. Sie fanden eine Stöchiometrie
von 1 Lysin : 2 Nucleotiden in einer Lösung von verdünntem Salz (o,o5 M NaCl, o,oo1 M Natriumeitrat, pH 7,o) . |
Diese Stöchiometrie wurde wiedergespiegelt durch die Proportionalität eines Zweistufenschmelzprofils, niederer ;
Übergang (57°C) für unkomplexes rl °rC und höheren Übergang
(ungefähr 9o°C) für den ternären Poly-L-lysin + j
rl *rC„-Komplex,
η η ^
η η ^
Es wurde gezeigt, daß die Verbindung von Poly-L-lysin mit RNS (1 mg/ml) auf äquivalenter Basis zu der Bildung eines
unlöslichen Komplexes bei niedriger Salzkonzentration führte. Lösliche Komplexe werden jedoch bei einem niedrigen
Poly-L-lysin RNS-Verhältnis gebildet. Abbau der löslichen Komplexe durch pankreatische Ribonuclease, Ribo- ;
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nuclease T1, nicht spezifische Ribonuclease von Bacillus
cereus und Micrococcal nuclease ergab eine Ausfällung mit einem Lysin/Nudeotid-Verhältnis von 1:1. Zusammen
mit anderen dies unterstützenden Experimenten wurde ^eschlossen,
daß die Komplexbildung zwischen RNS und Poly-L-lysin
die RNS gegen einen Angriff durch diese Nucleasen schützte. Kürzliehe erneute Untersuchungen dieser ;
Interaktion zeigte, daß in Eagle's Salzlösung (0,15 M
NaCl, o,oo1 M MgCl2 und o,o1 M PO., pH 7,2) die Stöchiometrie
des ternären Komplexes von Poly-L-lysin zu !
rl *rC 1 Lysin : 1 Nucleotid einstelle von den» früher
beobachteten Verhältnis von 1 : 2 in verdünntem Salz
ist. !
Ein Zweistnfenübergangsprofil wurde in Lösungen, in de- :
nen Poly-L-lysin in weniger als dem 1 : 1 stöchiometrischen Verhältnis vorhanden war, beobachtet. Die T des
ternären Komplexes ist etwa 83 + 1°C. Bei niedrigen ! Konzentrationen von rI n'rC n (weniger als 5 χ 1o M) ■
kann durch langsamen Zusatz eines gleichen Volumens von
Nucleinsäurelösung mit Mischen zu einer Poly-L-lysin-
em lösung bei Raumtemperatur die Ausfällung auf ein Minimum
gehalten werden (weniger als 1o %). Jedoch wurden diese
erhöhten ;
Lösungen unabänderlich tribe bei/Temperaturen speziell
nahe dem T -Wert. Dieses Phänomen, das Ausfällen des geschmolzenen Komplexes in Gegenwart von Poly-L-lysin
wurde durch die Beobachtungen verifiziert, daß die ; einzelkettigen rl und rc sehr viel weniger löslich sind
als die doppelkettigen Komplexe (rl *rC ) ^n Gegenwart
von Poly-L-lysin.
Die Bildng von rl *rC mit Poly-D-lysin wurde untersucht.
Viele Eigenschaften dieses ternären Komplexes sind de- ]
nen des Komplexes von Poly-L-lysin ähnlich mit der Ausnahme,
daß die T dieses ternären Komplexes nur etwa 68QC ist.
B09819/1015
2A51358
Wie in Fig. 6 und 7 gezeigt, sind in dem ternären Komplex
mit beiden Poly-L-lysin oder Poly-D-lysin in oinera ;
1 : .1 Verhältnis (N/P) die modi feierten oder unmodifizierten
rl *rC -Komplexe am meisten gegen pankreatische PJiase geschützt. Interessant ist, daß in dem Komplex
mit einem 1 Lysin : 2 Nucleotid-Verhältnis nur die Hälfte des Polynucleotidkomplexes geschützt war. Diese Beob- ί
achtung bestätigt die 1 : 1 Stöchiometrie dieser ternären
i Komplexe. j
Tabelle 6
Interferenz induziert durch rI*rC·Polylysinkomplexe
Interferenz induziert durch rI*rC·Polylysinkomplexe
I Anreger
(M)
Polycation
(M) P/N Interferenz Ver- intra- Virushält- cellu- ausnis
larer beute Schutz !
| Π χ ΙΟ"" | pqly-T.-ly.siiio | 2·ί)Χ ΙΟ"" | Ί : | or,' | ΐιΚΙ | ο | •ΐχ | H)* | |
| 1-In-J-O1, | Π χ Ι0-" | poly-i.-lysiiii! | . 5OxHl-" | Λ : | 1 | H)O | |||
| γϊ,,-jC,, | fix ΙΟ"« | poly-u-lysiiiii | .. 2-.r)V|o-s | ή: | S | ΙΟΙ) | TtX | Kl* | |
| 1-T11-IC11 | π κ ι ο"β | None | ΙΟΙ) | 2 X | lOff | ||||
| Nono | jxily-i.-lysiiH? | 2-5 χ ΙΟ"" | _ | M | 2 X | H)* | |||
| Nono | polj'-T.-ly.siiio | Λ-0Χ It)-" | —. | __ | 12 | 2 X | Η>6 | ||
| Nono | ]>i>ly-i.-lysine | 2-5XlO /· | Il | IX | ΙΟ« | ||||
| Noun | None | IO | |||||||
χ) Alle Einwirkungen waren 6ο Minuten bei 37°C.
Tabelle 6 zeigt, daß Poly-L-lysin allein die Vermehrung
des Bovin vesicular stomatitis-Virus nicht verhindert. Ternäre Komplexe von rIn*rCn mit Poly-L-lysin in 1 : υ,5
(P/N), 1 : 1 und 1 ; 5-Verhältnissen haben alle etwa die-:
selbe biologische Aktivität wie die nichtkomplexen rIn*rCn-Komplexe. Komplexbildung mit Poly-L-lysin verstärkt
jedoch die Wirkung jedes rIn«rC nicht besonders,
wenn rln-rCn in niedrigeren Konzentrationen ( 1 χ 1ο~6Μ,
Tabelle 7) als den optimalen Konzentrationen angewandt wurde.
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Die Resultate in den Tabellen 4, 5 und 7 zeigen, daß
bei der ternären Komplexbildung mit entweder PoIy-L-lysin oder Poly-D-lysin im 1 : 1-Verhältnis oder '. 2 ι 1-Verhältnis (N/P) die Interferoninduktionsaktivität des iuodifizierten rl'rCn-Komplexes nicht verstärkt w\irde. Zum Beispiel, obwohl die Einwirkung von Nucleasen
bei der ternären Komplexbildung mit entweder PoIy-L-lysin oder Poly-D-lysin im 1 : 1-Verhältnis oder '. 2 ι 1-Verhältnis (N/P) die Interferoninduktionsaktivität des iuodifizierten rl'rCn-Komplexes nicht verstärkt w\irde. Zum Beispiel, obwohl die Einwirkung von Nucleasen
auf T(It1 ,9J *rC und rl ^r(C., U) durch Komplexbildung
21' η η η 4' η ^ ^
21' η η η 4' η ^ ^
mit Poly-L-lysin stark reduziert ist (Fig. 5), sind
die bioligischen Aktivitäten dieser inaktiven modifizierten Komplexe nicht verstärkt (Tabelle 7).
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Interferenz induziert durch Komplexe von rl *rC (enthaltend Regionen
nicht gepaarter Bas.en) mit Polylysin
Erreger
Konzentration (M)
TlnTCn
TlnTCn
T(I301U)TCn
T(I30-U)TCn
T(I101U)TOn
T(I101U)TCn
T(IjO1U)TCn
TlnT(C71U)
TlnT(C71U)
TlnT(C71U)
TlnT(C71U)
TlnT(C4 1,'^
rIn-r(C<fU)
Viral control
rIn-r(C<fU)
Viral control
io-G
ΙΟ"5
10-5
io-B Kr6
ΙΟ"8 10~B
10"8
io-s
10-5 io-B
10-s
| Polykation | P/N | 1 | Intracellularer | 93 | Exp. B |
| Verhält | I | Schutz | !Μ) | ||
| nis | Exp. A | 92 ' | |||
| __ | 1 | , . | |||
| n-lysino· | 0 . | . | 10 | ||
| L-lyaino- | 2 ■ | , | 13 | ||
| — | 7 | ||||
| !■-lysino | 1 : | 1 | 12 | ||
| — | I | 7 | |||
| 1,-lysinc | 1 | J | IO | 13 | |
| — | 10 | — | |||
| L-lysino | 1 | : J | ll | — | |
| 7,-lysino | 2 | : 1 | [ | 21 | |
| »-lynino | 2 | : 1 | 34 | 27 | |
| — | 1 | 2!) | |||
| !.-lysino | 1 | • 1 | 32 | — | |
| L-Iy si uo | 2 | ||||
| D-lysIno | 2 | ß | |||
| r^-lysino | 15 | ||||
| D-lysine» | |||||
| — |
Virusausbeute Exp. B
1-1x10°
| 7-S | X | 10" | Ι |
| 3-3 | X | 10° | OO |
| 0-9 | X | 10" | I |
| 9-0 | X | 10° | |
| 3-3 | X | 10° | |
| G-O | X | IU3 | |
| 1-0 | X | 10" | |
| 3-2 | X | ΙΟ | |
! X 10"
ro
cn
co
CTJ OQ
Ähnlich werden die Aktivitäten der massig aktiven Komplexe
rl T(Cp),- G>p und rl «r (Cp)9., G>p nicht durch die BiI-dung
eines 1 : 1 Komplexes mit Poly-L-lysin gefördert
(Tabelle 5), obwohl sogar dieser ternäre Komplex die
Empfindlichkeit der Polynucleotide gegenüber Nucleasen '. reduziert haben sollte, wie extrapoliert aus den Resultaten von rl *r(Cp)4gG (Fig. 7). Zusätzlich wurde der | Tm-Wert von rCn*r(Ip)12I auf 45°C, d.h. wesentlich über
der Inkubationstemperatur, durch Komplexbildung mit j Poly-L-lysin gesteigert und dieser rC *01igo I-Komplex · blieb inaktiv (Tabelle 4). Daher überführt die Reduktion
der Empfindlichkeit gegenüber Nucleasen und die Erhöhung
des T -Wertes durch den ternären Komplex mit Polylysin
(L- oder D) nicht die inaktiven modifizierten rl *rC ; Komplexe in einen aktiven Zustand.
(Tabelle 5), obwohl sogar dieser ternäre Komplex die
Empfindlichkeit der Polynucleotide gegenüber Nucleasen '. reduziert haben sollte, wie extrapoliert aus den Resultaten von rl *r(Cp)4gG (Fig. 7). Zusätzlich wurde der | Tm-Wert von rCn*r(Ip)12I auf 45°C, d.h. wesentlich über
der Inkubationstemperatur, durch Komplexbildung mit j Poly-L-lysin gesteigert und dieser rC *01igo I-Komplex · blieb inaktiv (Tabelle 4). Daher überführt die Reduktion
der Empfindlichkeit gegenüber Nucleasen und die Erhöhung
des T -Wertes durch den ternären Komplex mit Polylysin
(L- oder D) nicht die inaktiven modifizierten rl *rC ; Komplexe in einen aktiven Zustand.
Relative Geschwindigkeiten der enzymischen Hydrolyse von verschiedenen Komplexen mit ähnlichen Interferoninduktionsaktivitäten
:
Wie in Tabellen 3 und 5 gezeigt, sind rln*r(C13,U)n und \
rlT(C2 ,G) im wesentlichen genauso aktiv in der Anregung
der Interferonbildung als das unmodifizierte rl *rC .'
Es ist sowohl von theoretischem als auch von praktischem
Interesse, die Anfälligkeit dieser Komplexe gegenüber j
Interesse, die Anfälligkeit dieser Komplexe gegenüber j
Nucleasen zu vergleichen« Die T1 Ribonuclease, eine j
Endonuclease für die rI -Kette und den G-Rest, und die
pankreatische RNase A, eine Endonuclease für rC -Kette, ι wurden beide in diesen Versuchen benutzt. Die Daten in.
Fig. 8 zeigen eindeutig, daß beide modifizierten Komplexe
mit 5 bis 8fach größerer Geschwindigkeit hydrolysiert
wurden als rIn*rCn. Tatsächlich fand etwa 5o % ihrer totalen Hydrolyse während der ersten 12 Minuten der Inkubation statt. Frühere Arbeiten haben nahegelegt, daß die hohe ; antivirals Aktivität von synthetischem Polynucleotidanregerri integral mit ihrer verlängerten Aktivität in biologischen _Flüs si gkeiten assoziiert ist und daß je größere
pankreatische RNase A, eine Endonuclease für rC -Kette, ι wurden beide in diesen Versuchen benutzt. Die Daten in.
Fig. 8 zeigen eindeutig, daß beide modifizierten Komplexe
mit 5 bis 8fach größerer Geschwindigkeit hydrolysiert
wurden als rIn*rCn. Tatsächlich fand etwa 5o % ihrer totalen Hydrolyse während der ersten 12 Minuten der Inkubation statt. Frühere Arbeiten haben nahegelegt, daß die hohe ; antivirals Aktivität von synthetischem Polynucleotidanregerri integral mit ihrer verlängerten Aktivität in biologischen _Flüs si gkeiten assoziiert ist und daß je größere
509819/101 5
antivirale Wirkung erreicht wird, weitere Toxizität
gleichzeitig ansteigt.
Zwei Typen von strukturellen Modifikationen, die an den rl TC -Komplexen in diesen Untersuchungen gemacht worden
sind:
1. Fehlanpassung oder nicht richtiges Anordnen von Basen,
was ein Herauswinden (looping out) aus der Spirale bewirkt, und ,
2. Hauptkettenunterbrechung. Die Interferonanregungs- '. aktivität von rIn^rCn v/ird durch diese Kodifikationen
in verschiedenen Graden verringert. Die Verringerung ist viel/mehr signifikant, wenn die Störung oder Unterbrechung
in der rIn~Kette als in der rCn~Kette durchgeführt wird.
Diese Verringerung der biologischen Aktivität von | Π rCn kann nicht durch die beiden einfachen Bedingungen
für thermische Stabilität und Anfälligkeit, gegenüber j
Nucleasen erklärt werden. Die T -Werte der modifizierten rl TC -Komplexe sind nur wenig niedriger als die des
rl TC und weit oberhalb der Inkubationstemperatur der Zellen. Ternäre Komplexbildung mit Poly-L-lysin erhöht
die T -Werte dieser Polynucleotidspiralen signifikant, hat jedoch einen geringen Einfluss auf ihre biologischen
Aktivitäten. Diese modifizierten Komplexe sind anfälli- \
ger gegenüber Nucleasen, jedoch können modifizierte j
rl *rC -Komplexe hergestellt werden, die biologische ;
Aktivitäten aufweisen e die vergleichbar mit denen der
ursprünglichen rl TC sind, die jedoch anfälliger gegenüber
Nucleasen sind. Zusätzlich schützt die ternäre ; Komplexbildung mit Polylysin (L und D) faktisch alle
diese Polynucleotidspirden gegenüber Nuclease, ändern
ihre biologischen Aktivitäten jedoch nicht signifikant. ] Diese Beobachtungen und Überlegungen zeigen an, daß die
hier eingeführte strukturelle Modifikation direkt zu den strukturellen Bedingungen des Rezeptors in den Zellen
in Beziehung steht, der für den Auslösemechanismus der ;
Interferonproduktion verantwortlich isto j
509819/1015
Die augenscheinlich strengen Bedingungen dafür, daß die Polynucleotidkomplexe effektiv als Anreger der Interferonbildung
sind, sind bekannt. Es wurde berichtet, daß ternäre Komplexbildung mit DEAE-Dextran die biologische
Aktivität von rl *rC signifikant verstärkte. Das meiste
η η in*
dieser Wirkung wurde/einem Anstieg in der Aufnahme und
Schutz von Endonucleasen gesehen. Es war vorgeschlagen worden, daß die Änderung des Verhältnisses von Masse zu
eingebrachter Masse den Aufnahmeprozess erleichtern könnte,
was Teil der Betrachtung ist, die mit der Frage der ; Spezifizität zusammenhangt. Jedoch wurde das Schicksal
eines solchen Komplexes innerhalb der Zelle nicht diskutiert. Es ist nicht bekannt, in welcher Weise das j
DEAE-Dextran von dem rl ·rC -Komplex dissoziiert oder
abgebaut werden kann. Ähnlich veränderte in diesen Untersuchungen
die ternäre Koraplexbildung mit Polylysin (L und
D) nicht die biologische Aktivität von rl .rC als Interferonanreger.
Eine relevante Untersuchung der physikochemischen Eigenschaften yon DNS, RNS, rA *rU und Π «rC
auf die KomplexAldung wurde mitgeteilt. Das kreisförmige Dichroismusspektrum von rl *rC wurde drastisch verändert
nach der Komplexbildung mit Poly-L-lysin und der ternäre Komplex wurde also durch Röntgenstrahlendiffraktionen
mit grossem Winkel und kleinem Winkel und durch Elektronenmikroskopie untersucht. Während endgültige Info
rmationen über die spiralförmige Struktur bis jetzt nicht erhalten werden kcmten,ist es sehr wahrscheinlich,
daß der te::näre Komplex eine vielkettige oder vielstrangige Faser (multiple stranded fiber) ist. Es wurde
auch mitgeteilt, daß die infektiöse RCvIS von 2 Pferde ;
encephalitisch Viren (equine encephalitis viruses) ihre Infektivität nach Komplexbildung mit Poly-L-lysin verloren,
obwohl die Aktivität eines solchen Komplexes nach Pronase-Behandlung oder Dissoziation mit einem starken
Salz zurückgewonnen werden kann. Dieser Polylysin-RNS-Kom
plex war widerstandsfähig gegen Inaktivierung durch Nuclease. !
50981 9/1015
Zur Zeit liegen keine Kenntnise vor über das Schicksal
des Polylysin-rl *rCn-Komplexes außerhalb der Zelle, ■ während der Inkubationsperiode von 1 Stunde oder von dem Komplex der in der Zelle am Ende der Einwirkung nach dem Waschen verbleibt. Es scheint kein einfaches, leichtes
Verfahren für die Entfernung von Polylysin aus dem ternären Komplex entweder durch Dissoziation oder durch
Abbau (speziell des D-Analogen) zu gebea. Es verbleibt die Möglichkeit, daß die "Rezeptoren" in der Zelle * durch den gesamten ternären Komplex ausgelöst werden
können, der Polylysin und rl *rC enthält. Jedoch ist die Konformation des Π *rC stark verändert durch
die Assoziation mit Polylysin. j
des Polylysin-rl *rCn-Komplexes außerhalb der Zelle, ■ während der Inkubationsperiode von 1 Stunde oder von dem Komplex der in der Zelle am Ende der Einwirkung nach dem Waschen verbleibt. Es scheint kein einfaches, leichtes
Verfahren für die Entfernung von Polylysin aus dem ternären Komplex entweder durch Dissoziation oder durch
Abbau (speziell des D-Analogen) zu gebea. Es verbleibt die Möglichkeit, daß die "Rezeptoren" in der Zelle * durch den gesamten ternären Komplex ausgelöst werden
können, der Polylysin und rl *rC enthält. Jedoch ist die Konformation des Π *rC stark verändert durch
die Assoziation mit Polylysin. j
Eine Analyse der Zusammensetzung zeigte, daß die bei
der Synthese tatsächlich produzierten Polymeren nur ■ halb so viel 2'-O-Methylinosin&äure aufweisen wie
sie ursprünglich in die Reaktionsmischung eingesetzt
der Synthese tatsächlich produzierten Polymeren nur ■ halb so viel 2'-O-Methylinosin&äure aufweisen wie
sie ursprünglich in die Reaktionsmischung eingesetzt
worden war. Beispielsweise werden in den Tabellen 8 und
9 in den Fußnoten die Zusammensetzungen I
9 in den Fußnoten die Zusammensetzungen I
als Einsatzkonzentration in das Enzymgemisch während '
des Herstellungsverfahrens angegeben, jedoch zeigt die
Analyse der Resultate, daß die Menge des ml nur die Hallte von der ist, die eingesetzt wurde. Daher enthalten die
korrekten chemischen Zusammensetzungen in den bestimmten Fällen immer die Hälfte von dem ml das in . die
Originalenzymmischung eingebracht wurde» Beispielsweise
stellt xl. ,ml in Tabelle 8 das Einsatzverhältnis dar.
Das chemische Verhältnis des tatsächlichen Produkts ist
rl2 ,ml, siehe Fußn. Tabelle 8. J
Analyse der Resultate, daß die Menge des ml nur die Hallte von der ist, die eingesetzt wurde. Daher enthalten die
korrekten chemischen Zusammensetzungen in den bestimmten Fällen immer die Hälfte von dem ml das in . die
Originalenzymmischung eingebracht wurde» Beispielsweise
stellt xl. ,ml in Tabelle 8 das Einsatzverhältnis dar.
Das chemische Verhältnis des tatsächlichen Produkts ist
rl2 ,ml, siehe Fußn. Tabelle 8. J
sowohl j
Die biologische Aktivität/von Poly 2'-O-Methylinosin- ■
säure als auch von Hybridketten, die beide Inosinsäurereste und 2L O-Methylinosinsäurereste enthalten, wurden
an menschlichen Zellen getestet. Diese Verbindungen bil-
an menschlichen Zellen getestet. Diese Verbindungen bil-
„ , j
509819/ 1015
den zuerst einen Komplex mit rC Polyribocytidylsäure in :
der in den Experimenten beschriebenen Weise. Die Resultate zeigen klar, daß der Poly 2'-O-Methylinosinpolyribocytidyl-1:1-Komplex
keine oder nur geringe Aktivität als Anre- i ger der Interferonbildung in menschlichen Zellen hat, j
im Vergleich zu dem Ausgangs-rl'rC. Jedoch sind im Fall :
von Hybridmolekülen die Resultate total verschieden. ! Wie in Tabellen 8 und 9 dargestellt, sprechen die menschlichen
Zellen und Kulturen sowohl auf den Komplex rC als j
auch auf die Hybridmoleküle von Polyinosin und 2'-O- i
Meinosin an und ergeben signifikant viel bessere Resul- |
täte in Testen gegen Angriff von Viren als verglichen : mit dem ursprünglichen rl'rC. Es kann aus den Fußnoten j
der Tabellen 8 und 9 entnommen werden, daß die Zusammen- '
setzung dieser Produkte sicher nicht identisch mit dem
Einsatz der ursprünglichen Substrate in der Enzymherstellung sind. j
Es kann aus den Tabellen 8 und 9 zusammengefasst werden,;
daß der/Komplex von rC und Polyinosinsäure, der 5 bis 16%
2« -o-Meinosin enthält, 1o=-fach mehr wirksam sein kannals
rl'rC bei der Anregung von Interferonen in menschlichen
Zellen. Dies ist ein sehr wichtiges Resultat, da
es vielleicht die Anwendung der Verbindungen in einer
loofach geringeren Dosierung zur Hervorrufung des therpeutischen Effekts erlaubt.
es vielleicht die Anwendung der Verbindungen in einer
loofach geringeren Dosierung zur Hervorrufung des therpeutischen Effekts erlaubt.
509819/1015
Interferenz induziert durch (rl^ , ,ml)n·rC
durch rIn«rC x'
im Vergleich zu solchen induziert
Konzentration
Intracellularer Schutz (%)
Reduktion der Virusausbeute
rVrCn
(rI40,mI)n3rCn
(rl2o,ml)n,rcn
(rIlO'mI)n'rCn
= 5 χ ΙΟ"4 Μ
H=Ix ΙΟ"5 Μ
III = 5 x 10-5 M
II III
II III
II III
100
44 G
100
15
100
34 0
100
68 60
8.2 χ 10β
3.1 χ ΙΟ4
5.1 χ ΙΟ3
1.5 χ 7.2 χ 10' 4.2 χ ΙΟ
1.8 χ ΙΟ6 1.1 χ ΙΟ4
2.3
10"
2.5 χ
3.1 χ 9.0 χ
χ) Das Verhältnis der Zusammensetzung der Hypoxanthinpolynucleotide ist das Ein- : —Λ
sat ζ Verhältnis von Inosin 51 -Diphosphat/2' -O-Meinosin 51-Diphosphat in dein En- ^°
zymverfahren für die Synthese. Das tatsächliche Verhältnis der chemischen Zu- ^71
sammennetzung des Produkts enthält üblicherweise halb so viel 2' -O-l'leinosinreste00
in der Kette als das Einsatzverhältnis für die Herstellung. z.B. : (rl., ,ml)
(Einsatzverhältnis) ist ungefähr (rl2 ,ml) iProduktverhältnis)
Ίο-
ί Tabelle 9
Interferenz induziert durch (rI2 5-4o/IIlI^n*r''"n ^m Ver9le;i-Cn zu solchen
induziert durch rl *rl_x'
η η
| ■rCn | Konzentration | Ix 10-4M Ix 10 -5m Ix 10-6M . |
Intracellularer Schutz (%) |
Reduktion der /irusausbeute |
lnterferon- Einheiten ml |
|
| rIn | 4O'mI)n*rCn | I. = II = III = |
I II III |
94 88 0 |
3 χ ΙΟ3 1 8 χ 101 |
48 <8 : |
| (rl | 20,mI)n-rCn | I Il III |
90 89 0 |
3.9 χ 10J 1.5 χ 101 |
84 <8 ': |
|
| (rl | 1OC 40 0 |
2.3 χ 10J 1.2 χ 101 |
52 ι |
|||
(rllofml)n*rcn I 96 4.4 χ 10 "
(H) II 96 , III 73 4.2 χ 10 · ^8_
(rllo,ml) -rc I 96 6.1 χ IG3 '
(#2) II - -
III 96 1 χ 104 '
<rl5 ,ItIl)nTCn I 100 6.1 χ ΙΟ3
II " "3
III 100 4.6 X 10J
I 95, 3.9 χ ΙΟ3
III 86 . 4.1 χ ΙΟ3
x) Das Verhältnis der Zusammensetzung der Hypoxanthinpolynucleotide ist das Einsatzverhältnis
von Inosin 51-Diphosphat/2'-0~Meinosin 5'-Diphosphat in dem En-ζyinverfahren
für die Synthese. Das tatsächliche Verhältnis der chemischen Zu-I üanunensetzung des Produkts enthält üblicherweise halb so viel 2'-O-Meinosinreste
in der Kette als das Einsatzverhältnis für die Herstellung.ζ.B.: (rl- ,ml)
(Einsatzverhältnis) ist ungefähr (rl2o,ml)n ίProduktverhältnis)
Claims (1)
- Patentansprüche1J Verfahren zur Herstellung von chemotherapeutischenν . iZusammensetzungen, die geeignet für di3 Anregung der ! Interferonproduktion in Zellen von lebenden Organismen ^ sind, dadurch gekennzeichnet, daß man ein doppelkettiges ! spiralförmiges Ribonucleinsäuremolekül herstellt und j dieses Molekül so modifiziert, daß wenigstens eine chemische Stelle darin erzeugt wird, die das modifizierte ; Molekül leichter hydrolysierbar durch enzy^atische Aktivität in den Zellen macht als das unmodifizierte Molekül. !2. Verfahren nach Ansprach J, dadurch gekennzeichnet,
daß man das doppelkettige spiralförmige RNS-Molekül so : modifiziert, daß das Molekül mit Nucleotiden hergestellt ; wird, die das Paaren von Basen zwischen den Ketten dieses
Moleküls verhindern, wobei Stellen in dem Molekül gebil- ! det werden, die besonders anfällig gegenüber enzymatischer ; Hydrolyse sind.3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das RNS-Molekül rI n*rC n/ Polyinosinsäure, gebunden an Polycytidylsäure ist.4. Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotide aus der Gruppe Guanin und
Uridin ausgewählt werden.5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das RNS-Molektil durch Anordnung einer Methylgruppe
modifiziert.6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man das RNS-Molekül durch Unterbrechung wenigstens
einer der I-lauptketten dieses Moleküls durch Aufbrechen einer Bindung modifiziert.509819/10157, Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nan einen Komplex des modifizierten RNS-Moleküls mit einem Polylysin bildet, um das modifizierte MoJekül
widerstandsfähiger gegen enzynatische Hydrolyse zu
machen.8. Zusammensetzung, enthaltend eine rl *rC -Molekularspecies, die mit einer Substanz aus der Gruppe Guaninnucleotid und üridinnucleotid Komplex-gebunden ist.9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der molekulare Komplex aus der Gruppe · rln'r(C12-13^U)n und rI n*r(C2O-29'G^n aus9ewählt ist· I10. Zusammensetzung, enthaJtend rl -(Cp)9, G>p. !11. Zusammensetzung, enthaltend einen (rl ,ml) TCn-Komplex, worin m die 2'-O-Methylribosylgruppe ist.12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin der iKomplex (rI5_~ »m^^n*raus 5 - 16 % 2"-0-Methylinosinrest besteht.13. Copolynucleotid ausgewählt aus der Gruppe be- j stehend aus PoIy(Cn,U)n,GK worin n eine ganze
Zahl von 4 bis 2915. PoIy(C7,U).16. PoIy(C13,U)17» Poly (C22*U)18. PoIy(C20,G)509819/101519. Poly (C39,G). jaus PoIy(I)'Poly(Cn,U) und Poly(I)'Poly(C ,G), worin u20. Komplexe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PoIy(I)'Poly(Cn,U) und PoIy(Ieine ganze Zahl von 4 bis 29 ist.21. PoIy(I) 'PoIy(C4,U) .22. PoIy(I)'Poly (C7,U).23. PoIy(I)-PoIy(C1^U).24. PoIy(I) -PoIy(C22,U)25. PoIy(I)-PoIy(C20, G).26. PoIy(I) "Poly (C29,G).50981 9/1015
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/411,119 US4024222A (en) | 1973-10-30 | 1973-10-30 | Nucleic acid complexes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2451358A1 true DE2451358A1 (de) | 1975-05-07 |
Family
ID=23627645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19742451358 Pending DE2451358A1 (de) | 1973-10-30 | 1974-10-29 | Verfahren zur herstellung von modifizierte ribonucleinsaeuremolekuele enthaltenden zusammensetzungen und diese zusammensetzungen |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4024222A (de) |
| JP (1) | JPS5082226A (de) |
| BE (1) | BE821651A (de) |
| CA (1) | CA1073387A (de) |
| DE (1) | DE2451358A1 (de) |
| FR (1) | FR2257307B1 (de) |
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