DE102006029448A1

DE102006029448A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem extrazellulären Polyanion aus Arthrospira

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Publication number: DE102006029448A1
Application number: DE102006029448A
Authority: DE
Inventors: Christian Dr. Ing. Walter; Tanja Dipl.-Ing. König; Rainer Prof. Dr. Buchholz; Stefanie Dipl.-Ing. Thulke; Manfred Prof. Dr. Marschall; Sabine Dipl.-Biol. Rechter; Andreas Dr. Nitsche; Berit Smestad Prof. Dr. Paulsen
Original assignee: Marschall Manfred Prof Dr
Current assignee: Marschall Manfred Prof Dr
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2007-12-27
Also published as: WO2007147404A2; WO2007147404A3

Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen mit Viren, enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eines polyanionischen Polysaccharides oder deren Salz, wobei das polyanionische Polysaccharid durch Extraktion eines Kulturüberstandes von Arthrospira erhältlich ist. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Description

Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eines polyanionisches Polysaccharides oder dessen Salz, wobei das polyanionische Polysaccharid aus der Algengattung Arthrospira erhältlich ist.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung.
Arthrospira (Spirulina) ist ein Cyanobakterium, dessen zylindrische Zellen einen Durchmesser von 1–12 μm aufweisen und in langen Filamenten (einige Millimeter) hintereinander angeordnet sind. Die Struktur und Länge der helikalen Filamente können von Spezies zu Spezies, aber auch innerhalb einer Spezies stark variieren. Die Ultrastruktur und Morphologie der Zellen wird dabei durch Umweltfaktoren (z. B. Temperatur) beeinflusst. Die Zellwand von Arthrospira ist aus vier Lagen aufgebaut (fibrillär, Peptidoglycan, fibrillär und strukturiert), wobei das Peptidoglycan die stärkste Schicht darstellt. Die Septen/Querwände zwischen den Zellen eines Filaments bestehen ebenfalls aus Peptidoglycanen, welche aus N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure aufgebaut sind. Die Reproduktion der Alge erfolgt durch Fragmentierung der Filamente in kürzere Segmente; das Längenwachstum dieser Filamente wiederum durch Zellteilung. Im Rahmen dieser Beschreibung werden die Bezeichnungen Arthrospira und Spirulina gleichbedeutend, i.e. synonym, verwendet.
Arthrospira kommt häufig als dominante Spezies in stark alkalischen Salzseen vor. Sie besiedelt flache, subtropische bis tropische Gewässer mit hohem Salzgehalt, vor allem in Mittelamerika, Afrika und Australien. Die getrocknete Biomasse aus Arthrospira enthält 50–70 % Proteine, bis zu 17 % Lipide (mit einem hohen Anteil an γ-Linolensäure), 1,6 % Lipopolysaccharide und ca. 15 % Kohlenhydrate. Bedeutend sind zudem Carotenoide, Vitamine (besonders Vitamin B₁₂) und Mineralstoffe. Arthrospira platensis findet über den Nahrungsmittelbereich hinaus Anwendung in der pharmazeutischen Industrie und in der Kosmetik. Zu den potentiellen medizinischen Anwendungen zählen unter anderem: Inhibierung zahlreicher pathogener Viren, Stärkung des Immunsystems und Prävention von Krebs-/Tumorentwicklung [Hu, 2004].
Das intrazelluläre, sulfatierte Polysaccharid Ca-Spirulan (Ca-SP) wurde erstmals 1996 aus der Biomasse von A. platensis isoliert [Hayashi T. et al, 1996]. Es ist aus den Monomeren Rhamnose (Rha), 3-O-M-Rha (Acofriose), 2,3-di-O-M-Xyl, Uronsäuren und Sulfat aufgebaut und besitzt ein MW von ca. 7,5 10⁴ [Lee et al., 1998]. Eine weitere Strukturanalyse [Lee et al., 2000] zeigte, dass Ca-SP zwei repetitive Einheiten aufweist: O-Rhamnosylacofriose und O-Hexuronosylrhamnose (Aldobiuronsäure). Ca-Polysaccharide besitzt gegenüber einer Vielzahl von behüllten Viren einen inhibierenden Effekt: HSV-1, HCMV, Masern, Mumps, Influenza A und HIV-1 [Hayashi T. et al., 1996].
Ein anti-HIV-1 Effekt wird auch von einem wässrigen Extrakt aus A. platensis Biotrockenmasse von Ayehunie et al. [1998] berichtet. Hinsichtlich der Strukturcharakterisierung der aktiven Substanzen gehen aus dieser Literaturstelle jedoch keine eindeutigen Angaben hervor.
Bezüglich des Wirkmechanismus von Ca-SP wird eine Blockade der Viruspenetration in die Wirtszelle postuliert [Hayashi T. et al., 1996]. Im Vergleich zu Dextransulfat besitzt Ca-SP einen geringen antikoagulierenden Effekt und eine längere Halbwertzeit in Mäuseblut (Hayashi K. et al., 1996]. Bei Substitution von Calcium durch Natrium oder Kalium bleibt die antivirale Wirksamkeit erhalten, während zwei- und dreiwertige Kationen die Aktivität reduzieren [Lee et al., 2001].
Filali Mouhim et al. [1993] beschreiben die Synthese und vorläufige Charakterisierung eines sogenannten „extrazellulären Polysaccharids" aus A. platensis. Da die Biomasse zur extrazelluläre Polysaccharide-Gewinnung bei 100 °C für 20 min. behandelt und die Polysaccharide anschließend aus dem Überstand isoliert wurden, kann es sich bei diesen „extrazellulären Polysaccharid" allerdings nur um zellassoziierte und/oder intrazelluläre Polysaccharide handeln. Als Bausteine dieses Polysaccharides wurden identifiziert: Xyl, Rha, Fucose (Fuc), Gal, Mannose (Man) und Glc im Verhältnis 1,3/0,3/0,7/2,7/Spuren/sowie zwei nicht identifizierte Zucker, zwei Uronsäuren und Sulfate (5 % der Molmasse). Der Sulfatgehalt wurde dabei aus dem elementaren Schwefelgehalt im extrazelluläre Polysaccharide berechnet.
Xia et al. [2001] und Nie et al. [2002] beschreiben eine Isolierung von Polysacchariden aus dem Kulturmedium von Arthrospira maxima. Er enthält ca. 30 % Kohlenhydrate (Phenol-Schwefelsäure-Methode) und ist aus Glc (21 %), Rha (21 %), Xyl (33 %), Fuc (4 %), Man (9 %), Gal (6 %), GlcA (4 %) und Galacturonsäure (GalA) (2 %) aufgebaut. Biologische Untersuchungen mit diesem Polysaccharid wurden nicht beschrieben. Weiterhin wurden intrazelluläre Polysaccharide (Speicherstoffe und Zellwandbausteine) und zellassoziierte Polysaccharide („external layers of the cell") von der Arbeitsgruppe analysiert. Es zeigte sich, dass die intrazellulären Polysaccharide fast ausschließlich aus Glucose aufgebaut sind. Die zellassoziierten Polysaccharide bestehen ebenso wie die Polysaccharide im Kulturmedium aus einer Mischung von sechs neutralen Monosacchariden (Glc, Rha, Xyl, Fuc, Man, Gal) und zwei Uronsäuren. Die molaren Verhältnisse der Monomere von zellassoziierten Polysaccharide und extrazellulären Polysaccharide im Kulturmedium unterscheiden sich dabei signifikant, so dass von unterschiedlichen Molekülen ausgegangen werden kann.
In einem Beitrag von Liu et al. [2003] findet sich eine nicht weiter spezifizierte Anmerkung, dass extrazelluläre Polysaccharide aus Spirulina maxima eine antifungale und antivirale Aktivität besitzen.
Auf Grund der Bildung von Resistenzen besteht ein ständiger bedarf an neuen antiviralen Wirkstoffen. Insbesondere besteht ein Bedarf zur Prophylaxe und/oder Behandlung von viralen Infekten, beispielsweise mit humanen Herpesviren, bei immunsupprimierte Patienten auf Grund deren erhöhten Gesundheitsrisiko.
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung anzugeben, welche einen neuen antiviralen Wirkstoff enthält, dessen Wirksamkeit verbessert ist und/oder gegen welchen Resistenzen nicht bestehen. Des Weiteren liegt der Erfindung das technische Problem zu Grunde, eine pharmazeutische Zusammensetzung anzugeben, deren Wirkstoffkomponente in einfacherer Weise aus Arthrospira herstellbar ist.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen mit Viren, enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eines polyanionisches Polysaccharides oder dessen Salz, wobei das polyanionische Polysaccharid aus einem Kulturüberstand der Kultivierung von Arthrospira erhältlich ist.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass in dem Kulturüberstand der Algengattung Arthospira polyanionische Polysaccharide enthalten sind, die sich von intrazellulären oder membrangebundenen Polysaccariden in der Struktur sowie in der Wirksamkeit vorteilhaft unterscheiden. Dadurch werden einerseits neue pharmazeutischen Zusammensetzungen erhalten, die gegenüber bekannten Pharmaka eine verbesserte Wirkung zeigen, insbesondere im Falle von gegen die bekannten Pharmaka entstandenen Resistenzen. Ein weiterer Vorteil ist andererseits, dass die Herstellung erfindungsgemäßer pharmazeutischer Zusammensetzungen einfacher und kontrollierter möglich ist, da lediglich der Kulturüberstand einer weiteren Verarbeitung zugeführt werden muss und folglich ein Aufschluss von Zellen entbehrlich ist.
Das polyanionische Polysaccharid weist vorzugsweise eine Molmasse von mehr als 500.000 Da, insbesondere von 800.000 bis 2.000.000 Da, beispielsweise von 1.000.000 bis 1.200.000 Da, auf. Des Weiteren weist es vorzugsweise einen Schwefelgehalt im Bereich von 2,5 bis 6,5 Gew.-%, beispielsweise von 3,0 bis 5,5 Gew.-%, insbesondere von 3,4 bis 5,0 Gew.-%, beispielsweise von 3,4 bis 4,7 Gew.-%, höchstvorzugsweise von 4,2 bis 4,6 Gew,-%. Eine besonderes bevorzugte Eigenschaft ist, dass es keine Zuckersäuren, insbesondere keine Glucoronsäure (GlcA) und/oder Galacturonsäure (GalA) Einheiten aufweist.
Grundsätzlich kann der Kulturüberstand als solcher bereits zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Es wird sich jedoch empfehlen, vergleichsweise niedermolekulare Komponenten, insbesondere mit einem Molekulargewicht unterhalb von 500.000 Da, insbesondere unterhalb von 50.000 Da, vorzugsweise unterhalb von 14.000 Da beispielsweise mittels Dialyse abzutrennen.
Die Viren können vorzugsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus „Viren mit Glycoprotein Hülle, orthopox Viren, insbesondere Kuhpocken, Kamelpocken, Mauspocken, Affenpocken, Vaccinia, Variola, HIV-1 Virus, Doppelstrang DNA Viren, insbesondere Herpesviren, HSV-1 Virus, HCMV, HHV-6, HSV-2, Varizella Zoster, HHV-7 und HHV-8''.
Die Algenspezies ist vorzugsweise Arthrospira platensis.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird in der Regel neben dem Extrakt aus dem Kulturüberstand galenische Träger- und Hilfsstoffe enthalten. Die galenische Herrichtung erfolgt dabei in fachüblicher Weise. Als Gegenionen für ionische Gruppen kommen beispielsweise Ca²⁺, Na⁺, K⁺, Li⁺ oder Cyclohexylammonium, bzw. Cl^–, Br^–, Acetat, Trifluoracetat, Propionat, Laktat, Oxalat, Malonat, Maleinat, Citrat, Benzoat, Salicylat usw. in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.v., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass das Extrakt in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit den folgenden Verfahrensschritten: a) ein Photobioreaktor wird optional sterilisiert, b) der Photobioreaktor wird dann mit Zellen der Algengattung Arthrospira in einem Nährmedium beschickt, c) Die Zellen werden dann für einen definierten Zeitraum in dem Nährmedium kultiviert, d) anschließend werden die Zellen von dem Kulturüberstand abgetrennt, e) der Kulturüberstand wird einer Aufreinigungsverfahrenstufe oder mehreren Aufreinigungsverfahrensstufen unterworfen, f) der aufgereinigte Kulturüberstand wird in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur gewünschten Darreichungsform hergerichtet. Die Reaktion kann mit photoautotrophem oder mixotrophem Wachstum gesteuert werden.
Der Photobioreaktor wird vorzugsweise thermisch, beispielsweise mittels Wasserdampf einer Temperatur oberhalb von 95 °C, insbesondere oberhalb von 100 °C, sterilisiert. Die Kultivierungstemperatur kann zwischen 5 °C und 45 °C, insbesondere zwischen 20 °C und 40 °C, vorzugsweise zwischen 30 °C und 40 °C liegen. Die Oberflächenbestrahlungsstärke kann zumindest 20 μE m^–2s^–1, vorzugsweise zumindest 50 μE m^–2s^–1, höchstvorzugsweise zumindest 100 μE m^–2s^–1, betragen. Der pH-Wert kann auf 9,0 bis 12,5, vorzugsweise 10,0 bis 11,5, eingestellt sein. Die Kultivierung erfolgt vorzugsweise bis zum Ende der stationären Phase, typischerweise nach ca. 3 bis 8 Tagen. Die Trennung der Zellen von dem Kulturüberstand kann mittels Zentrifugation, beispielsweise 2000 g bis 20000 g bei 5 °C bis 25 °C, erfolgen. Der so erhaltene Kulturüberstand kann dann einer Dialyse (14.000 Da) aufgereinigt werden. Eine weitere Aufreinigungsverfahrensstufe kann eine Proteinabtrennung, beispielsweise eine Ammoniumsulfatfällung (z. B. 80 %-ig) umfassen. Eine weitere Aufreinigung kann mittels chromatographischer Methoden, beispielsweise präparativer Ionenaustauschchromatographie in fachüblicher Weise erfolgen. Hierbei sind Fraktionen zu selektieren, deren polyanionischen Polysaccharide den vorstehenden stofflichen Eigenschaften entsprechen.
Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung eines durch Extraktion eines Kulturüberstandes der Algengattung Arthrospira gewonnen polyanionischen Polysaccharides oder dessen Salzes zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Infektion mit einem Virus. Hierfür gelten alle zuvor angebrachten Anmerkungen analog.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Kultivierung von Arthrospira platensis
Die Kultivierungen von A. platensis erfolgte unter phototrophen Bedingungen in UTEX-Medium gemäß Tabelle 1 und bei 35 °C. Tab. 1: Zusammensetzung des Arthrospira-Mediums (UTEX)

Tab. 2: Zusammensetzung der PIV Metall-Lösung
Tab. 3: Zusammensetzung der Chu Spurenelemente
Hauptkulturen wurden mit einer 8 Tage alten Vorkultur (100 rpm, ca. 40 μE m^–2s^–1, 25 °C) und einer Animpfdichte von OD_750nm = 0,1 gestartet. Die Kultivierungsparameter für die Ansätze TK17, TK18 und TOK02 sind in Tab. 4 zusammengefasst. Zu den angegebenen Erntezeiten wurden die Zellsuspensionen zentrifugiert (Contifuge Stratos 10.000 g, 8 °C) und die Biomasse und der Kulturüberstand wurden separat lyophilisiert. Voruntersuchungen erfolgten in EMK (Erlenmeyerkolben) und 1 l-PSM (Photobioreaktor Screening-Modulen), die Hauptkultivierungen TK17 und TK18 unter Standardbedingungen im 25 l-Photobioreaktor (PBR) Medusa bei einer Oberflächenbestrahlungsstärke von I₀ = 200 μE m^–2s^–1 und einer Temperatur von T = 35 °C. Die Biomasse wurde am Ende der stationären (Wachstums) Phase geerntet und zur Isolierung sulfatierter Polysaccharide verwendet. Der Kulturüberstand diente zudem zur Isolierung extrazellulärer Komponenten durch Dialyse sowie zusätzlich durch Fällung oder Ionenaustauschchromatogrpahie. Tab. 4: Bezeichnungen und Parameter der Kultivierungen von A. platensis. Die Bestrahlung erfolgte kontinuierlich mit einer zu 100 % (1 l-PSM Modell II) bzw. 50 % (25 l-Medusa) bestrahlten Reaktoroberfläche.
Die zeitlichen Verläufe der erhaltenen Biotrockemasse (BTM), extrazellulärer Produktkonzentration (TK18 V3, siehe unten) und pH (ohne pH-Steuerung) sind in der 1 dargestellt. Man erkennt die zeitlichen Verläufe von Biomassekonzentration, pH-Wert und extrazellulärer Produktkonzentration einer Batchkultivierung von A. platensis im 25 l-Medusa-PBR. Das extrazelluläre Produkt wurde durch Dialyse (14 kDa) des zentrifugierten Kulturüberstandes und anschließender Gefriertrocknung gewonnen.
Das Biomassewachstum von A. platensis weist bis zu einer Prozesszeit von 60 h (= 2,5 d) einen exponentiellen Verlauf auf. Nach t = 92 h (= 3,8 d) wird unter den gegebenen Bedingungen eine maximale BTM von 1,4 g l^–1 erreicht (berechnet aus der OD bei 750 nm). Die Bestimmung der OD_750nm ist im Fall von A. platensis aufgrund der filamentösen Form des Mikroorganismus mit vergleichsweise großen Standardabweichungen verbunden (± 4–10 %). Nach Erreichen des Maximums nimmt die optische Dichte der Suspension ab, begleitet von einer Agglomeratbildung der Zellen. Da die Agglomeration der Zellen nicht mit einer Abnahme der BTM gleichzusetzen ist, ist dieser Wert der BTM in 1 mit einer Klammer gekennzeichnet.
Der pH-Wert der Zellsuspension steigt während der Wachstumsphase kontinuierlich an und erreicht nach einer Prozesszeit von 5 Tagen einen maximalen Wert von pH 12,2. Die extrazelluläre Produktbildung findet sowohl in der Wachstumsphase als auch im wachstumslimitierten Stadium statt (Tag 5: 0,14 g l^–1). Die mittlere spezifische Produktkonzentration in Zeitraum von Tag 2 bis Tag 4 beträgt 0,065 mg mg^–1 (Produkt/BTM). Qualitative Angaben zum extrazellulären Produkt erfolgen weiter unten.
Um den Einfluss des pH-Werts auf das Wachstum und die Produktbildung von A. platensis zu ermitteln, wurden Ansätze mit pH-Steuerung durchgeführt. In 2 sind die Kultivierungen TOK02-1 und -2 als Referenzen für Batchprozesse ohne pH-Steuerung dargestellt. Ansatz TOK02-5 wurde bei pH 10 gestartet und satzweise mit HCl auf pH 10 eingestellt. Ansatz TOK02-6 wurde mit einem pH-Wert von 11 gestartet, wobei im weiteren Verlauf keine Steuerung notwendig war. Für diese Versuchsreihe wurden 1 l-PSM mit einer zu 100 % bestrahlten Reaktoroberfläche und ein I₀ von 150 μE m^–2s^–1 verwendet. Weitere Kultivierungsparameter sind Tab. 4 zu entnehmen.
Das Wachstum von A. platensis bei den Ansätzen ohne pH-Steuerung sowie bei pH 10 unterscheiden sich bis zu einer Prozesszeit von ca. t = 3 d nur geringfügig (2). Bedingt durch die pH-Einstellung auf pH 10 wird die Wachstumsphase von A. platensis verlängert und nach 7 d eine maximale BTM von 4,2 g l^–1 erreicht. Bei einem Anfangs-pH von 11 wurde im Vergleich zum Standard eine verminderte Wachstumsrate ermittelt. Nach einer Kultivierungsdauer von 7 d wurde mit diesem Ansatz eine maximale BTM von 1,9 g l^–1 erreicht. Die Ausbeute extrazellulärer Komponenten beträgt bei der Kultivierung ohne pH-Steuerung nach 5 d durchschnittlich 0,12 g l^–1, gegenüber 0,45 g l^–1 bei Ansatz pH 10 bzw. 0,15 g l^–1 bei Ansatz pH 11 nach jeweils 8 Kultivierungstagen. Das entspricht Raum-Zeit-Ausbeuten von 0,025 g l^–1 d^–1 (ohne pH-Steuerung), RZA_pH10 = 0,058 g l^–1 d^–1 und RZA_pH11 = 0,019 g l^–1 d^–1.
Bei einem Vergleich der Batchprozesse TOK02-1 und -2 (1 l-PSM) mit den Ansätzen TK17 und TK18 (25 l-Medusa) ist zu erkennen, dass die BTM-Ausbeute im 1 l-Maßstab nach einer Prozesszeit von 5 d mit 2,2 g l^–1 größer ist als im 25 l-Maßstab (1,4 g l^–1). Dieser Unterschied steht vermutlich im Zusammenhang mit der pH-Differenz von einer Einheit (pH 11 gegenüber pH 12,2). Unterschiede der Prozesse bestehen im Anteil der bestrahlten Reaktoroberfläche und der Oberflächenbestrahlungsstärke (s. Tab. 4).
Beispiel 2: Extraktion intrazellulärer Polysaccharide aus A. platensis (Vergleichsbeispiel)
Zur Isolierung intrazellulärer Polysaccharide aus A. platensis erfolgte zunächst eine Extraktion der Biotrockenmasse mit CH₂Cl₂/MeOH (1:1, v/v), um lipophile Komponenten zu entfernen. Anschließend wurde die trockene Biomasse entsprechend Lee et al. [1998] zweimal für 1 h bei 100 °C mit Reinstwasser extrahiert. Die kombinierten wässrigen Extrakte wurden für 30 min bei 10.000 g zentrifugiert sowie gegen Rein- und Reinstwasser dialysiert (14 kDa, Roth, 0653.1) und lyophilisiert. Nach Lösen des trockenen Materials in 10 % TCA (Fluka, 91228) erfolgte eine Dialyse des löslichen Anteils (14 kDa, Roth, 0653.1) mit anschließender Gefriertrocknung. Das erhaltene Produkt ist als TK17 V2 bezeichnet und enthält das bekannte Polysaccharid Ca-Spirulan.
Beispiel 3: Aufreinigung extrazellulärer Komponenten aus A. platensis (Erfindung)
Extrazelluläre Komponenten aus A. platensis wurden aus dem zentrifugierten Kulturüberstand durch Lyophilisation und Dialyse (14 kDa, Roth, 0653.1) gegen Rein- und Reinstwasser isoliert. Die entstehenden Lösungen sind als TOK02 V3, TK17 V3 und TK18 V3 bezeichnet. Der Extrakt TK17 V3 wurde zusätzlich mit 80 % Ammoniumsulfat (AS) gefällt and der zentrifugierte Überstand dialysiert und lyophilisiert. Das Produkt ist als TK17 V4 bezeichnet.
Für die präparative Ionenaustauschchromatographie (IEC) der extrazellulären Komponenten aus A. platensis wurde ein Kontron HPLC System (Goebel, Ludwigshafen) mit einem Kontron DAD 540 verwendet. Allgemeine Chromatographiebedingungen waren wie folgt: TMAE-IEX (Merck, 1.17973), Glassäule (23,5 × 1,5 cm); manuelle Probenaufgabe, Eluent A: 50 mM Acetat/Phosphat-Puffer pH 7; Eluent B: 4 M NaCl. Gradientenelution (Zeit/%A): 0 min/0, 5 min/0, 35 min/100, 45 min/100. Anschließend 10 min Eluent C: 6 M Urea bei ca. 60 °C; Fluss 3 ml min^–1, p_max: 60 bar. Detektion: 280 nm und Kontur-Plot von 200-600 nm. Fraktionssammler: 0–6 min: eine Fraktion pro min, 7–45 min: eine Fraktion pro 2 min. Die Fraktionen wurden jeweils separat dialysiert (14 kDa, Roth, 1785.1) und lyophilisiert. Aufgrund des Elutionsprofils wurden die Fraktionen in fünf Gruppen zusammengeführt: 1–4 min = TMAE I, 11–22 min = TMAE II, 23–28 min = TMAE III, 29–45 min = TMAE IV und Urea = TMAE V. In 3 sind die Probenbezeichnungen im Aufarbeitungsschema der IEC dargestellt.
Fraktion 18 TMAE I wurde anschließend erneut unter den zuvor beschriebenen Bedingungen chromatographisch separiert. Das Eluat wurde in vier Fraktionen gesammelt: 1–4 min = TMAE I-I, 5–28 min = TMAE I-II, 29–45 min = TMAE I-III und Urea = TMAE I-IV.
Beispiel 3: Biologische Aktivitäten (antiviral und cytotoxisch)
Die extrazellulären Produkte der Reinigungsstufe „V3" (TK17 V3, TK18 V3 und TOK02 V3) zeigen eine signifikante antivirale Aktivität gegen HCMV ohne nachweisbare Toxizität gegenüber der Wirtszelllinie MRC-5. 4a zeigt die Zytotoxizität des extrazellulären Extrakts TK17 V3 aus A. platensis und des Standards Gancyclovir (GCV) gegen humane Fibroblasten, angegeben als relative Extinktion im WST-1 Assay. 4b zeigt die antivirale Aktivität der Substanzen gegen HCMV, angegeben als relative Viruslast (Antigen produzierende Einheit, APU pro Well) im Peroxidaseassay. Es ist eine deutliche konzentrationsabhängige Inhibierung von HCMV durch TK17 V3 zu erkennen. Im Vergleich zu Gancyclovir ist die antivirale Wirksamkeit von TK17 V3 gegen HCMV stärker, bei gleichzeitig geringerer Toxizität gegenüber der Wirtszelllinie MRC-5. Zudem wird durch TK17 V3 ab einer Konzentration von 20 μg ml^–1 eine vollständige Inhibierung der Virusinfektion erzielt.
In Tab. 5 sind weitere Ergebnisse der antiviralen Untersuchungen von intra- und extrazellulären Extrakten aus A. platensis gegen HCMV sowie zytotoxische Eigenschaften als IC₅₀ bzw. CC₅₀ dargestellt. Der wässrige, intrazelluläre Extrakt TK17 V2 weist mit einer IC₅₀ von 39 μg ml^–1 eine starke antivirale Aktivität gegen HCMV auf. Bis zu einer Konzentration von 5000 mg ml^–1 findet keine Inhibierung der Wirtszellen statt, so dass ein SI > 128 resultiert. Mit einem SI > 1250 ist das extrazelluläre Produkt TK17 V3 aus A. platensis um eine Größenordnung aktiver als TK17 V2. Dieser Wert übertrifft die in vitro Wirksamkeit des synthetischen Virustatikums Gancyclovir (SI = 430). Eine Fällung des extrazellulären Produkts mit 80 % Ammoniumsulfat und Dialyse des löslichen Überstands (TK17 V4) übt keinen Einfluss auf die Aktivität der Substanz aus.
Um zu überprüfen, ob die antiviralen, extrazellulären Komponenten bereits während der Wachstumsphase synthetisiert werden, wurde der Kulturüberstand von A. platensis prozessbegleitend zu t = 2, 3, 4 und 5 d mittels Dialyse aufgereinigt und hinsichtlich der antiviralen Aktivität analysiert. (TK18 V3 t₂–t₅, Tab. 5). Das Ergebnis der Untersuchung belegt, dass bereits nach 2 Tagen, d. h. während der exponentiellen Wachstumsphase, der antivirale Wirkstoff von A. platensis synthetisiert und ins Kulturmedium ausgeschieden wird. Es zeigte sich keine signifikante Abhängigkeit der Wirksamkeit vom Zeitpunkt der Ernte bzw. der Wachstumsphase.
In Bezug auf die Variation des pH-Wertes des Kulturmediums während der Kultivierung ist ebenfalls kein Einfluss auf die antivirale Aktivität der extrazellulären Komponenten zu beobachten (siehe TOK02 V3 in Tab. 5). Tab. 5: Antivirale Aktivität der intra- und extrazellulären Wirkstoffe aus A. platensis gegen HCMV. Die Zytotoxizität wurde mit dem WST-1 Zellproliferationsassay und die antivirale Aktivität durch Peroxidase-Färbung HCMV-infizierter Zellen bestimmt.

Abk.: CC₅₀: 50 % zytotoxische Konzentration, IC₅₀: 50 % virusinhibierende Konzentration,
SI: Selektivitätsindex, >: größere Konzentrationen wurden nicht getestet

Für den extrazellulären Extrakt TK17 V3 aus A. platensis wurde zudem die Zytotoxizität über einen Zeitraum von 7 d ermittelt (Tab. 6). Auch bei einer Behandlungsdauer der MRC-5 Zellen mit den Extrakten über einen Zeitraum von 7 d ist die Zytotoxizität vergleichsweise gering (CC₅₀ = 1200 μg ml^–1). Tab. 6: Zytotoxizität von TK17 V3 aus A. platensis gegenüber MRC-5 Zellen bei Behandlung der Zellen über eine Prozesszeit von 1, 3 und 7 Tage.
Beispiel 4: Weitere antivirale Aktivitäten der Wirkstoffe aus A. platensis
4.1: Antivirale Aktivitäten gegen HHV-6A
Eine Zusammenstellung der antiviralen Aktivitäten der Mikroalgenextrakte gegen HHV-6A ist in Tab. 7 gegeben. Die Extrakte weisen gegenüber der im Testsystem verwendeten HSB-2 Zelllinie keine bedeutende Zytotoxizität auf (CC₅₀ mind. > 2800 μg ml^–1). Für die extrazellulären Extrakte TK17 V3 aus A. platensis konnten mit IC₅₀ < 25 μg ml^–1 eine signifikante antivirale Aktivität gegenüber HHV-6A ermittelt werden. Für den intrazellulären Extrakt ergab sich demgegenüber eine IC₅₀ von mindestens < 250 μg ml^–1. Als antivirale Referenz wurde in der HHV-6A Kultur Dextransulfat mitgeführt. Tab. 7: Antivirale Aktivitäten gegen HHV-6A und Zytotoxizitäten gegenüber HSB-2 Zellen der Extrakte aus A. platensis.

Abk.: CC₅₀: 50 % zytotoxische Konzentration, IC₅₀: 50 % virusinhibierende Konzentration,
SI: Selektivitätsindex, < kleinere Konzentrationen wurden nicht getestet

4.2: Antivirale Aktivitäten gegen GFP-HCMV, HSV-1 und GFP-HIV-1
Die folgenden Untersuchungen zu antiviralen Aktivitäten der Wirkstoffe stellen zum einen eine unabhängige Reproduktion der anti-HCMV Aktivität mit einem GFP-basierenden HCMV-Stamm dar, zum anderen eine Erweiterung des untersuchten humanpathogenen Viren. Unterschiede der verwendeten HCMV-Assays sind in Tab. 8 gegenübergestellt. Tab. 8: Verwendete HCMV-Assays zum antiviralen Screening der Mikroalgenextrakte.
Vor der Bestimmung der antiviralen Aktivität der Mikroalgenextrakte gegen GFP-HCMV, GFP-HIV-1, HSV-1, EBV und Influenza-A-Virus, wurde zunächst die Toxizität der Extrakte mit einem Lactat-Dehydrogenase-Assay über einen Zeitraum von 7 Tagen u. a. gegen die Wirtszelllinie HFF (humane Fibroblasten) des GFP-HCMV Stamms ermittelt. Im Gegensatz zum WST-1 Test, der die mitochondriale Aktivität von Zellen erfasst, beruht der LDH-Assay auf einer Bestimmung der durch Zelllyse freigesetzten Lactat-Dehydrogenase. Der Standard Taxol wurde als Refenz einer zytotoxischen Verbindung mitgeführt. Die intra- und extrazellulären Extrakte aus A. platensis weisen hierbei keine Zytotoxizität im Bereich bis 90 μg ml^–1 auf.
Im Folgenden sind die Ergebnisse der antiviralen Untersuchungen der Extrakte aus A. platensis gegen das GFP-markierte HCMV beschrieben. Wie bereits im HCMV-Assay mit POX-Färbung viraler Antigene weisen vor allem die Extrakte TK17 V3 und V4 eine antivirale Wirkung auf. Für die dosisabhängige Aktivität gegen HCMV ist eine Vorinkubation der Wirtzellen (pre-post) von entscheidender Bedeutung, was in Bezug auf den Wirkmechanismus auf ein frühes Stadium der Virusinhibierung (Adsorption und/oder Penetration) hinweist. Die HCMV-Infektion wurde bei Zugabe von 3,3 μg ml^–1 des extrazellulären Extrakts TK17 V3 und V4 ins Kulturmedium bereits um > 50 % inhibiert.
Die Extrakte aus A. platensis sind ebenfalls wirksam gegen das α-Herpesvirus HSV-1. Die extrazellulären Extrakte TK17 V3 und V4 erwiesen sich effektiver als das intrazelluläre TK17 V2. Zudem erwies sich eine Vorinkubation der Zellen für eine effektive antivitale Wirksamkeit als wichtig. Das Ergebnis lässt auf einen ähnlichen Wirkmechanismus bei HCMV und HSV-1 schließen.
Auch HIV-1 wurde in der Infektion bei Anwesenheit von 90 μg ml^–1 Extrakt TK17 V2, V3 und V4 um über 50 % im Vergleich zur Infektion ohne Inhibierung blockiert. Weiterführende Untersuchungen mit TK17 V4 zeigten, dass die HIV-1 Inhibierung bereits bei 10 μg ml^–1 erfolgt. Im Gegensatz zu HCMV und HSV-1 wurde die antivitale Aktivität gegen HIV-1 nicht durch eine Vorinkubation der Zellen verstärkt.
4.3: Antivirale Aktivitäten gegen Vacciniavirus
Die extrazellulären Extrakte aus A. platensis weisen eine deutliche Aktivität gegen das Vacciniavirus auf. Im Vergleich zur Kontrolle ist in einem Konzentrationsbereich von 2,5–25 μg ml^–1 bereits eine deutliche Reduzierung der Virusinfektion zu erkennen. Unter den gewählten Versuchsbedingungen inhibieren die Extrakte die Virusinfektion nahezu vollständig bei Konzentrationen von 250 μg ml^–1.
Beispiel 5: Voruntersuchungen zum antiviralen Wirkmechanismus
Erste Untersuchungen zur Wirkungsweise der Polysaccharide deuten auf ein frühes Stadium in der Virusreplikation hin. Zur Aufklärung der Wirkungsweise wurden unter anderem TOA-Versuche (time of addition) durchgeführt, die das Stadium der Virusinhibierung im Verlauf der Replikation aufklären sollen. Im Falle der extrazellulären Wirkstoffe aus A. platensis führt eine Vorinkubation der Viren (HCMV) und der Wirtzellen zu einer verstärkten antiviralen Aktivität.
Eine Inhibierung der Virusadsorption und/oder Penetration wurde auch bei Untersuchungen mit GFP-HCMV postuliert. Weiterführende Untersuchungen mit einer Westernblot-Analyse der viralen Proteine deuten zusätzlich auf einen späteren inhibierenden Schritt in der Virusreplikation hin. Da auch HSV-1 bei Vorinkubation der Wirtszellen eine starke Inhibierung erfährt, kann ein ähnlicher Wirkmechanismus bei den β-Herpesviren angenommen werden. Im Gegensatz zu den β-Herpesviren zeigten die Extrakte aus A. platensis bei HIV-1 keine Abhängigkeit von einer Vorinkubation, so dass in diesem Fall ein anderer Wirkmechanismus zu erwarten ist.
Beispiel 6: Strukturcharakterisierung und weitere antivirale Ergebnisse
Im Rahmen der Strukturuntersuchungen wurden die antiviralen wässrigen Extrakte aus A. platensis zunächst auf die Grundbestandteile analysiert. Der Kohlenhydrat (KH)-Nachweis erfolgte mit dem Anthron-H₂SO₄-Assay und der Nachweis von Proteinen mit dem Biuret-Assay. Zur KH-Analyse der Extrakte aus A. platensis wurden die Proben mit dem Anthron-H₂SO₄-Assay umgesetzt und das Absorptionsspektrum von 400–800 nm aufgenommen. Der Wellenlängenscan zeigt deutliche Unterschiede zwischen intra- (TK17 V2) und extrazellulären Extrakten (TK17 V3 und V4). Im Vergleich zu den Standards Galactose und Rhamnose (Abs_625nm = 1,3 bei 0,25 mg ml^–1) weist das intrazelluläre Produkt bei 625 nm eine um den Faktor 1,4 bis 1,5 stärkere Absorption auf.
Für die Aufarbeitungsstufen TK17 V3 und V4 und für verschiedene Erntezeiten TK18 V3 t₂–t₅ sind die Gesamtkohlenhydrate der extrazellulären Wirkstoffe im Verhältnis zum Standard Rhamnose in 5a dargestellt. Rha ist mit 52,3 % bzw. 89,2 % (inkl. Methylrahmnose) als Hauptbaustein des intrazellulären Ca-Spirulan beschrieben [Lee et al., 1998].
Der KH-Anteil der extrazellulären Komponente TK17 V3 beträgt ca. 40 % (Rha-Äquivalente). Die Ammoniumsulfat-Fällung führt zu keiner wesentlichen KH-Anreicherung im löslichen Überstand der Fällung (TK17 V4). Der KH-Anteil im extrazellulären Extrakt während des Verlaufs der fünftägigen Kultivierung von TK18 liegt im Bereich von 25–42 % Rha-ÄV/Probe, wobei der höchste KH-Gehalt nach einer Prozessdauer von t = 2 d zu verzeichnen ist.
Des Weiteren wurden die Proben mit dem Biuret-Assay und BSA als Standard auf ihren Proteingehalt analysiert. Der intrazelluläre Extrakt TK17 V2 enthält keine detektierbaren Proteine. Das Ergebnis der Proteinbestimmung für die extrazellulären Extrakte aus A. platensis ist in 5b gegeben. TK17 V3 besitzt einen Proteingehalt von ca. 57 % (BSA-Äquivalente). Durch Ammoniumsulfat-Fällung wurde der Proteingehalt auf ca. 17 % BSA-ÄV reduziert (TK17 V4). Dabei können trotz Dialyse in dieser Probe Spuren von Ammonium enthalten sein, die den Biuret-Assay stören und das Ergebnis beeinflussen. Der Proteingehalt im Verlauf der Kultivierung TK18 weist im extrazellulären Extrakt Werte von 41–64 % BSA-ÄV auf.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das intrazelluläre Produkt TK17 V2 ein KH-haltiger Extrakt ohne nachweisbare Proteine ist. Die extrazellulären Wirkstoffe sind dagegen zu ca. 35 % aus Kohlenhydraten (Rha-ÄV) und ca. 50 % aus Proteinen (BSA-ÄV) aufgebaut. Die Zusammensetzung bezüglich dieser Komponenten weist Schwankungen von ca. ± 10 % (KH) bzw. ca. ± 15 % (Proteine) über den Kultivierungszeitraum von fünf Tagen auf.
Die extrazellulären Komponenten der Kultivierungen TOK02 (mit und ohne pH-Steuerung) wurden ebenfalls hinsichtlich KH- und Protein-Gehalt analysiert. Zudem erfolgte mit dem Alcian-Blau Assay die Bestimmung des Gehalts anionischer Polymere. Ziel dieser Analyse ist insbesondere die Quantifizierung sulfatierter Polysaccharide, die potentielle Bestandteile des antiviralen Extrakts darstellen. Zur Quantifizierung wurde in diesem Assay Dextransulfat als Standardsubstanz verwendet. 6 zeigt den Gehalt an Proteinen, Kohlenhydraten und anionischen Polymeren im extrazellulären Extrakt aus A. platensis, gewonnen aus den Kultivierungen TOK02 (1, 2: ohne pH-Steuerung, 5: pH 10, 6: pH 11). Die Angaben erfolgen in Bezug auf den KH-Standard Rha, den Proteinstandard BSA und das anionische Polymer Dextransulfat.
Der KH-Gehalt im Produkt bei den Ansätzen mit pH-Steuerung steigt im Vergleich zu den Kultivierungen ohne pH-Steuerung von 50–55 % Rha-ÄV auf 60 % (pH 10) bzw. 74 % (pH 11) an. Bei den nicht regulierten Ansätzen entspricht der Anteil an Gesamt-KH nahezu dem Gehalt anionischer Polymere. In den Ansätzen 5 (pH 10) und 6 (pH 11) liegt der Gesamt-KH-Anteil im Verhältnis höher als der Gehalt anionischer Polymere. Der Proteinanteil beträgt bei den Standardkultivierungen und beim Ansatz pH 10 ca. 50 % BSA-ÄV. Die pH-Einstellung auf pH 11 führt zu einem verminderten Proteinanteil im extrazellulären Extrakt von ca. 37 % BSA-ÄV.
Die Summe der Bestandteile überschreitet in einzelnen Fällen 100 %. Der Grund dafür liegt in der Vereinfachung der Quantifizierungen, die jeweils in Bezug auf die Standardkomponenten Rhamnose (KH), BSA (Proteine) und DS (anionische Polymere) erfolgten.
Die KH-Monomere der extrazellulären Extrakte TK17 V3 und V4 wurden mittels GC-FID analysiert. Das Analysenergebnis ist in 7 dargestellt. Hierin sind Monosaccharide pro KH (%) im extrazellulären Extrakt TK17 V3 und TK17 V4 Angegeben. Abk.: Rha: Rhamnose, Xyl: Xylose, Man: Mannose, Gal: Galactose, Glc: Glucose, GlcA: Glucuronsäure.
Die KH-Monomere der beiden Proben weisen keine wesentlichen Unterschiede auf. Die größten Anteile der Monosaccharide stellen mit ca. 50 % Rhamnose, 16–17 % Glucose und 17 % eine methylierte Methylpentose dar. Weitere Hauptbestandteile sind Xylose (6,2–8,3 %), Galactose (3,5–4,3 %) und Glucuronsäure (2,9–3,9 %). Zudem sind kleine Mengen an Mannose vorhanden.
Zur weiteren Charakterisierung des Extrakts TK17 V4 erfolgte eine Molmassenbestimmung mittels Gelpermeationschromatographie. Das Ergebnis der GPC-Analyse des Extrakts TK17 V4 weist auf mindestens vier Komponenten mit einem Molmassenbereich von 1 10⁴–1 10⁷ (Universität Duisburg-Essen) bzw. 1 10³–2 10⁶ (PSS, Mainz) hin. Des Weiteren erfolgte eine Elementaranalyse des Extrakts, die eine elementare Zusammensetzung von 4,3 % N, 36,5 % C, 5,7 % H und 2,5 % S ergab. Der Sauerstoffgehalt dieser Probe wurde nicht bestimmt.
Da der Extrakt TK17 V4 aus A. platensis aus mindestens vier Komponenten zusammengesetzt ist, erfolgte die Identifizierung der aktiven Komponente des Extrakts mit einer sogenannten Bioassay Guided Fractionation. Die gewonnenen Fraktionen wurden bezüglich der antiviralen Aktivität gegen HCMV und der strukturellen Eigenschaften analysiert.
Die chromatographische Aufreinigung erfolgte mit der Probe TK18 V3 t₅ in einer IEC. Die Reinigungsstufe der Ammoniumsulfat-Fällung wurde ausgelassen, da keine wesentliche Steigerung der Produktqualität von Aufarbeitungsstufe „V3" zu „V4" zu verzeichen war.
Für Ionenaustauschchromatographie (IEC) der extrazellulären Komponenten aus A. platensis konnte ein semipräparatives HPLC-System mit TMAE als stationärer Phase verwendet werden. Die Elution erfolgte mit einem linearen NaCl-Gradienten und anschließender Elution mit 6 M Urea bei 60 °C. Das Chromatogramm ist als Konturen-Plot in 8 dargestellt (DAD-Konturen-Plot der präparativen IEC des extrazellulären Produkts TK18 V3 t₅ aus A. platensis mit TMAE als stationärer Phase. LC-Bedingungen: Eluent A: 50 mM Acetat/Phosphat-Puffer (pH 7); Eluent B: 4 M NaCl. Gradientenelution (Zeit/%A): 0 min/0, 5 min/0, 35 min/100, 45 min/100. Anschließend 10 min Eluent C: 6 M Urea; Fluss 3 ml min^–1. Detektion: Kontur-Plot von 200–600 nm. Die stärkste Absorption im UV-VIS Bereich (200–600 nm) wurde bei Retentionszeiten von 10–18 min detektiert.
Das Eluat wurde in den dargestellten Fraktionen gesammelt, dialysiert (14 kDa), lyophilisiert und das Gewicht einzelner oder zusammen gefasster Eluatfraktionen quantifiziert (9, Ausbeuten der Fraktionen nach TMAE-IEC des extrazellulären Extraktes TK18 V3 t₅ aus A. platensis nach anschließender Dialyse (14 kDa) und Lyophilisation. Die Fraktionen wurden aufgrund des Elutionsprofils und chromatographischer Daten in fünf Hauptfraktionen TMAE I bis V eingeteilt.). Aus dem Elutionsprofil und den chromatographischen Daten resultieren fünf Hauptfraktionen (TMAE I bis V), die gepoolt und erneut lyophilisiert wurden.
Um zu überprüfen, ob Fraktion TMAE I durch Überladen der Säule resultiert oder einen Komponentenanteil darstellt, der ohne (starke) Wechselwirkung mit der stationären Phase von der Säule eluiert, erfolgte mit dieser Fraktion eine erneute chromatographische Trennung unter den zuvor beschriebenen Bedingungen mit anschließender Dialyse und Lyophilisation. Dabei wurden vier Fraktionen TMAE I-I und I-IV gewonnen, deren Mengen in Tab. 9 dargestellt sind. Tab. 9: Ergebnis der IEC von Fraktion TMAE I mittels TMAE-IEC.
Nur Fraktion I-I und I-II enthalten quantifizierbare Substanzmengen (I-I: 1,9 mg und I-II: 6,6 mg) von insgesamt 16,1 mg Ausgangsmaterial. Es ist anzunehmen, dass Moleküle der Fraktion I-I keine Wechselwirkungen mit der stationären Phase ausüben. Komponenten der Fraktion I-II wurden evtl. durch Überladen der Säule im ersten Chromatographieschritt nicht retardiert. Fraktion I-III und I-IV enthalten keine detektierbaren Substanzmengen. Die Differenz zu 16,1 mg resultiert evtl. durch irreversible Bindung von Molekülen an die stationäre Phase oder durch Probenmaterial, dass aufgrund der geringen Menge nach der Dialyse nicht quantifiziert werden kann.
Das Ergebnis der antiviralen Untersuchungen der Extraktfraktionen ist in Tab. 10 gegeben. Die antivirale Aktivität gegen HCMV ist qualitativ in den Fraktionen TK18 V3 TMAE IV und V wiederzufinden. Die IC₅₀ liegen mit 5 μg ml^–1und 6 μg ml^–1in der gleichen Größenordnung wie beim Ausgangsprodukt TK18 V3 t₅. Die Fraktionen TMAE II und III wiesen ebenfalls eine Virusinhibierung auf, wobei Fraktion II jedoch keine vollständige Virushemmung erreicht. Zur Kennzeichnung einer Virusinhibierung um 90 % wurde an dieser Stelle der IC₉₀ verwendet. Die IC₉₀ von Fraktion IV und V liegen bei sehr geringen Konzentrationen von 8,4 μg ml^–1 bzw. 8,6 μg ml^–1, was auf eine effektive Inhibierung der Virusinfektion von MRC-5 Wirtszellen schließen lässt. Tab. 10: Antivirale Aktivitäten gegen HCMV von des fraktionierten extrazellulären Extrakts A. platensis. Der Rohextrakt TK18 V3 t5 wurde mittels TMAE-IEC in einem ersten Schritt in fünf Fraktionen separiert (TMAE I-V) und Fraktion TMAE I in einer zweiten IEC erneut getrennt (TMAE I-I, I-II).

Abk.: CC₅₀: 50 % zytotoxische Konzentration, IC₅₀: 50 % virusinhibierende Konzentration, IC₉₀: 90 % virusinhibierende Konzentration, SI: Selektivitätsindex (= CC₅₀/IC₅₀)

Die Extraktfraktionen wurden quantitativ hinsichtlich KH, anionischen Polymeren und Proteingehalt analysiert. Zudem erfolgte eine Analyse der polysaccharidhaltigen Fraktion IV und V auf ihre Monomere und elementare Zusammensetzung. Von Fraktion IV wurde zudem mittels GPC die Molmassenverteilung bestimmt.
Das Ergebnis der KH-Bestimmung mit dem Anthron-H₂SO₄-Assay für die Extraktfraktionen TK18 TMAE I bis V ist in 10 (Gesamtkohlenhydrate in den IEC Fraktionen TK18 TMAE I bis V. Fraktion 1 wurde chromatographisch in zwei Unterfraktionen getrennt. Angaben in [%] erfolgen in Relation zum Standard Rha (Rha-ÄV)) dargestellt. Die Angaben erfolgen in Relation zum Monosaccharid Rhamnose, da dieses Monosaccharid mit ca. 50 % den größten Monomergehalt aufweist. Fraktion I-I besitzt im Vergleich zum Standard Rha den höchsten KH-Gehalt von 145 %. Hierbei ist zu beachten, dass verschiedene Monosaccharide ein unterschiedliches Absorptionsverhalten nach Inkubation in Anthron-H₂SO₄-Assay aufweisen. Aus diesem Grund kann der KH-Gehalt einer Probe den Wert von 100 % übersteigen. Von Fraktion II zu IV ist ein Anstieg im KH-Gehalt von 10 % auf 38 % Rha-ÄV zu verzeichnen. Fraktion V, die mit Harnstoff von der Säule eluiert wurde, weist einen KH-Gehalt von 22,6 % Rha-ÄV auf.
In 11 (anionische Polymere in den IEC Fraktionen TK18 TMAE I bis V. Fraktion I wurde chromatographisch in zwei Unterfraktionen getrennt. Angaben in [%] erfolgen in Relation zum Standard Dextransulfat (DS-ÄV)) ist der Gehalt anionischer Polymere der Fraktionen im Verhältnis zum Standard Dextransulfat dargestellt. Entsprechend der Erwartung eines Anionenaustauschers steigt der Gehalt anionischer Polymere mit steigender Ionenstärke an. Der höchste Gehalt anionischer Polymere weist Fraktion IV mit 83 % DS-ÄV auf. In Fraktion V ist der Gehalt anionischer Polymere mit 62 % DS-ÄV geringer als in Fraktion V.
Aus den Ergebnissen ist zu schließen, dass Fraktion TK18 TMAE IV ein stark anionisches Polymer ist, das aufgrund der Ergebnisse des Anthron-H₂SO₄-Assays zu ca. 38 % aus Rha-ÄV aufgebaut ist. Bei der Annahme eines anionischen Polysaccharids in Fraktion TMAE IV erscheint der KH-Gehalt mit 38,2 % zunächst gering. Bei einem Vergleich der Absorptionseigenschaften von z. B. Glucose zu Dextransulfat im Anthron-H₂SO₄-Assay (Daten nicht gezeigt) ergibt sich eine Reduzierung der Absorption bei 625 nm um den Faktor 2,7. Daraus ist zu schließen, dass Derivatisierungen der KH (z. B. Sulfatierungen und/oder Methylierungen) zu einer (stark) verminderten Absorption im Anthron-H₂SO₄-Assay führen. Diese Abnahme ist zum einen bedingt durch den mengenmäßigen geringeren Anteil der KH am Gesamtgewicht. Zum anderen wird vermutet, dass die Derivate die Reaktion der KH mit dem Anthronreagenz negativ beeinflussen. Aus dieser Überlegung heraus kann die Differenz des KH-Anteils in Fraktion IV zu 100 % erklärt werden.
Der Proteingehalt der Fraktionen wurde einerseits durch die Absorption des Eluats der IEC bei 280 nm abgeschätzt und zudem für Fraktion II mittels Biuret-Assay in Bezug auf den Standard BSA quantifiziert. Aufgrund des hohen Substanzbedarf für den Biuret-Assay (Nachweisgrenze: 0,25 mg ml^–1 reines Protein) wurde bei Fraktionen, die keine Absorption bei 280 nm aufweisen (I-IV) oder solchen mit geringem Probenmaterial (I-I, I-II, III und V) keine Proteinbestimmung durchgeführt.
Aufgrund der Absorption bei 280 nm kann abgeschätzt werden, dass Fraktion II eine stark proteinhaltige Probe darstellt. Fraktion III enthält zudem Komponenten, die schwach bei 280 nm absorbieren. Die Proteinquantifizierung ergab einen Gehalt von 85,5 % Protein in Probe TK18 IEC TMAE II.
Nachfolgend sind die chemisch-physikalische Charakterisierung der Extraktfraktionen TK18 TMAE IV und V dargestellt. Diese Proben zeichnen sich im antiviralen Screening durch eine hohe Aktivität gegenüber HCMV aus (IC₅₀ = 5 bzw. 6 μg ml^–1). Durch die IEC erfolgte eine effektive Separation dieser Fraktionen von einer neutralen Polysaccharidfraktion (TMAE I-I) und den proteinhaltigen Fraktionen (I-II, II und III), die im Screening vergleichsweise geringere Aktivitäten aufweisen.
Die GC-FID Analyse der Kohlenhydrate der Fraktion TMAE IV und V weist einen KH-Gehalt pro Probe von ca. 74 % (TMAE IV) bzw. ca. 11 % (TMAE V) auf. Die KH-reiche Fraktion TMAE IV ist aus drei Komponenten aufgebaut, von der Rhamnose mit 58 % (Rha/KH) den Hauptbestandteil darstellt. Die anderen beiden Komponenten weichen aufgrund des Retentionsverhaltens von den Standardzuckern Glc, Gal, Xyl, Fuc, Man, Arabinose, GlcA und GalA sowie Aminozuckern ab. Untersuchungen deuten auf methylierte Methylpentosen in Probe TMAE IV hin, bei denen es sich wahrscheinlich um Monomethyl-Rha (ca. 23 %) und Dimethyl-Rha (ca. 19 %) handelt. Die Quantifizierung dieser KH wurde im Vergleich zum Monosaccharid Rha durchgeführt.
Für eine exakte Kalkulation kann zunächst eine Kalibrierung mit den entsprechenden methylierten Monosacchariden erfolgen. Für eine eindeutige Strukturcharakterisierung der methylierten Monomere ist zudem eine Methylierungsanalyse zweckmäßig.
Die KH-Fraktion in TMAE V besteht zu ca. 73 % aus Rha. Eine zweite Komponente ist mit ca. 27 % enthalten; wobei es sich wahrscheinlich ebenfalls um eine M-Rha handelt.
Eine Molmassenbestimmung der Probe TK18 TMAE IV ergab einen Hauptbestandteil von 83 % bei einem Mw von 1,1 10⁶ g mol^–1 (Tab. 11). Zudem sind Spuren von Komponenten mit einem Mw von 6,9 10³ und 9,1 10² g mol^–1 zu detektieren. Die Probe TK18 TMAE V wurde nicht mittels GPC analysiert, da das Probenmaterial nicht ausreichend zur Verfügung stand. Tab. 11: Molmassenbestimmung des extrazellulären EPS TK18 TMAE IV aus A. platensis mittels GPC. Die Kalibrierung erfolgte mit externen Standards.
Elementaranalyse der isolierten extrazelluläre Polysaccharide aus A. platensis
In Tab. 12 ist die elementare Zusammensetzung (CHNS-O) der extrazelluläre Polysaccharide TK18 TMAE IV und V aus A. platensis dargestellt. Zudem wird eine empirische Summenformel für das extrazelluläre Polysaccharide TK18 TMAE IV aufgestellt, wobei Vereinfachungen in der Berechnung angegeben sind. Tab. 12: Elementare Zusammensetzung der extrazelluläre Polysaccharide aus A. platensis nach IEC mit TMAE, angegeben als Massenprozent pro Einwaage.
Berechnung der empirischen Summenformel für die extrazelluläre Polysaccharide TK18 TMAE IV aus A. platensis:
Molares Verhältnis → C_2,53H_5,12O_2,52S_0,14 Umwandlung → C_18,1H_36,6O₁₈S₁, näherungsweise → C₁₈H_36,5O₁₈S₁ Annahme S = Sulfat → (C₁₈H_36,5O₁₄(SO₄))_n (empirische Summenformel) (1)mit n = Vielfaches der beschrieben Grundeinheit im Polymer.
Somit resultiert ein Sulfatgehalt pro extrazelluläre Polysaccharide von ca. Sulfat/extrazelluläre Polysaccharide = 96,06 g mol^–1/(476,97 + 96,06) g mol^–1 = 0,168 ≡ ca. 16,8 %
Unter der Berücksichtigung, dass das Polymer aus Pentosen (Rha) und (methylierten) Methylpentosen aufgebaut ist, wird postuliert, dass im extrazelluläre Polysaccharide TK18 TMAE IV ca. jedes 3. Monomer sulfatiert ist.
Die vorstehenden beispielhaften Berechnungen sind nicht limitierend und die jeweiligen stöchiometrischen Parameter können um bis zu ± 30 %, meist bis zu ± 20 %, variieren, beispielsweise in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen.
Die Summe der Elemente in Probe TK18 TMAE IV beträgt 81 % (Tab. 12). Die Differenz zu 100 % kann zum Teil durch das Kation Na gedeckt werden, das zur Elution der Probe verwendet wurde. Bei der Annahme, dass pro mol S bzw. Sulfat ein mol Na gebunden ist, resultiert ein Na-Gehalt von 3,2 % Na w/w. Zudem können weitere Kationen mit größerem Molekulargewicht (z. B. K, Ca) und/oder durch Spuren von z: B. Proteinen in der Probe enthalten sein.
Für die Struktur der Wirkstoffe aus A. platensis ergibt sich insgesamt das folgende Bild. Nach IEC des extrazellulären Extrakts TK18 V3 aus dem Kulturmedium von A. platensis konnten als wirksame Substanzgruppen zwei anionische, polysaccharidhaltige Fraktionen identifiziert werden. Das quantitative Verhältnis der aktiven Fraktionen TMAE IV und TMAE V beträgt ca. 3:1. Die chemische Charakterisierung der Fraktionen ist nachfolgend diskutiert. Das Ausgangsmaterial TK18 V3 besteht zu ca. 30 % aus Rha-Äquivalenten. Eine Aufreinigung mittels TMAE-IEC führte zu einer Separierung von Proteinen und KH-Komponenten. Eine nicht retardierte Fraktion TMAE I-I enthält einen hohen KH-Anteil, angegeben als 145 % Rha-ÄV. Die übrigen Fraktionen enthalten im Vergleich wesentlich geringere Rha-ÄV, ermittelt im Anthron-H₂SO₄-Assay. Wie bereits diskutiert, ist das Absorptionsverhalten der KH im Assay stark von den KH-Monomeren und von Derivaten der Monomere (Methylierung, Sulfatierung, etc.) abhängig. Aus diesem Grund gibt der Assay nur einen ersten Hinweis auf KH-Komponenten in den einzelnen Fraktionen der IEC. Die Fraktionen TMAE IV und V, die auf dem IEX-Material stark retardiert werden und bei > 2 M NaCl bzw. 6 M Urea (60 °C) eluieren, besitzen einen KH-Gehalt von 38 % bzw. 23 % Rha-ÄV. Die Analyse hinsichtlich anionischer Polymere ergab für diese Fraktionen einen Gehalt von 83 % bzw. 62 % DS-ÄV. Die Absorption bei 280 nm und eine Proteinanalyse zeigten, dass eine mengenmäßig große Proteinfraktion (TMAE II) zu einem früher Zeitpunkt von der Säule eluiert. Das in dieser Arbeit isolierte extrazelluläre Produkt TK18 TMAE IV aus A. platensis hebt sich in der Monomerkomposition insbesondere durch das Fehlen von Zuckersäuren (GlcA und GalA) vom intrazellulären Produkt Ca-Spirulan ab. Der KH-Gehalt von 74 % in Probe TMAE IV, ermittelt mit der GC-FID Analyse, bestätigt das Postulat eines anionischen Polysaccharids. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die Quantifizierung der methylierten Methylpentose, wahrscheinlich M-Rha, mit den Standard Rha erfolgte. Die Elementaranalyse hat einen Schwefelgehalt von 4,4 % in Probe TK18 TMAE IV ergeben. Aufgrund einer empirischen Summenformel für das extrazelluläre Polysaccharide wurde kalkuliert, dass ca. jedes dritte Monomer sulfatiert ist. Im Vergleich gibt Lee et al. [1998] einen S-Gehalt von 5,7 % für Ca-Spirulan an. Die Bestimmung der mittleren Molmasse ergab ein Mw von 1,1 10⁶ g mol^–1 für TMAE IV. Es handelt sich somit um ein Molekül mit größerer Kettenlänge als Ca-Spirulan, bei dem eine Molmassenverteilung abhängig von der Literaturangabe von 7,5 10⁴–3,1 10⁵ angegeben wird [Hayashi et al., 1996, Lee et al., 1998]. Die Monomerzusammensetzung ergibt sich auch aus Tabelle 13. Tab. 13: Kohlenhydratmonomere der extrazellulären Polysaccharide aus Arthrospira.

* methylierte Methylpentose, wahrscheinlich M-Rha

Literatur:

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2: Hayashi, T. et al., 1996, J Nat Prod, 59 (1), 83–87
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10: Nie et al., 2002, J Cent South Univ Technol, 9 (2), 81–86
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Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen mit Viren enthaltend eine physiologisch wirksame Dosis eines polyanionisches Polysaccharides oder dessen Salz, wobei das polyanionische Polysaccharid aus einem Kulturüberstand von Arthrospira erhältlich ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das polyanionische Polysaccharid eine Molmasse von mehr als 500.000 Da, insbesondere von 800.000 bis 2.000.000 Da, vorzugsweise von 1.000.000 bis 1.200.000 Da, aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das polyanionische Polysaccharid einen Schwefelgehalt im Bereich von 2,5 bis 6,0 Gew.-%, beispielsweise von 3,0 bis 5,5 Gew.-%, insbesondere von 3,4 bis 5,0 Gew.-%, vorzugsweise von 3,4 bis 4,7 Gew.-%, höchstvorzugsweise von 4,2 bis 4,6 Gew,-%, aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das polyanionische Polysaccharid keine Zuckersäuren, insbesondere keine Glucuronsäure (GlcA) und/oder Galacturonsäure (GalA) Einheiten aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Viren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus „Viren mit Glycoprotein Hülle, orthopox Viren, insbesondere Kuhpocken, Kamelpocken, Mauspocken, Affenpocken, Vaccinia, Variola, HIV-1 Virus, Doppelstrang DNA Viren, insbesondere Herpesviren, HSV-1 Virus, HCMV, HHV-6, HSV-2, Varizella Zoster, HHV-7 und HHV-8''
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Algenspezies Arthrospira platensis ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend galenische Träger- und Hilfsstoffe.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit den folgenden Verfahrensschritten: a) ein Photobioreaktor wird optional sterilisiert, b) der Photobioreaktor wird dann mit Zellen der Algengattung Arthrospira in einem Nährmedium beschickt, c) die Zellen werden dann für einen definierten Zeitraum in dem Nährmedium kultiviert, d) anschließend werden die Zellen von dem Kulturüberstand abgetrennt, e) der Kulturüberstand wird einer Aufreinigungsverfahrenstufe oder mehreren Aufreinigungsverfahrensstufen unterworfen, f) der aufgereinigte Kulturüberstand wird in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur gewünschten Darreichungsform hergerichtet.
Verwendung eines durch Extraktion eines Kulturüberstandes der Algengattung Arthrospira gewonnen polyanionischen Polysaccharides oder dessen Salzes zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Infektion mit einem Virus.
Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer viralen Infektion, wobei einer Person, die an der viralen Infektion erkrankt ist oder hieran zu erkranken droht, eine physiologisch wirksame Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dargereicht wird.