DE1667897C2

DE1667897C2 - Zytostatisch wirksame Mittel

Info

Publication number: DE1667897C2
Application number: DE19681667897
Authority: DE
Inventors: Rudolf Karl Prof. Dr. 6500 Mainz Zahn
Original assignee: HEINRICH MACK NACHF 7918 ILLERTISSEN DE
Current assignee: HEINRICH MACK NACHF 7918 ILLERTISSEN DE
Priority date: 1968-03-13
Filing date: 1968-03-13
Publication date: 1983-02-10
Also published as: DE1667897A1

Description

Beispiel 1

a) Herstellung von Apurinsäure (APA) in

Analogie zur Methode von EXhargaff,

J. BioL Chem. 195,49 (1952)

Eine wäßrige DNA-Lösung von etwa 2,5 mg/ml H₂O wird mit 0,1 N HCI vorsichtig und langsam unter Rühren auf pH 1,6 eingestellt Hierzu benötigt man etwa 20 ml 0,1 N HCI pro 100 mg DNA. Die trübe Suspension wird sofort in einen Dialyseschlauch überführt und gegen verdünnte HCl von pH 1,5 für 26 Std. bei 37° C dialysiert

Das pH muß nach der Dialyse noch 1,6 betragen. Der jetzt klare Inhalt des Dialyseschlauches wird gegen Boratpuffer, 0,2 M, pH 7,3 für 22 Std. bei 4°C dann gegen fließendes Leitungswasser (etwa 12° C) für 22 Std. weiterdialysiert

Danach folgt eine Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 4°C, das Wasser muß häufig gewechselt werden. Anschließend Gefriertrocknung.

Das Endprodukt ist ein rein weißes hygroskopisches lockeres Material, das sich in Wasser sofort löst

b) Herstellung von Apurinsäure nach einem Kurzverfahren

Eine wäßrige DNA-Lösung von 2—4 mg/ml H₂O wird mit 0,1 N HCI auf pH 2,5 eingestellt (etwa 5 ml/100 mg eingesetzter DNA) und anschlie3end schnell auf dem Bunsenbrenner (mit Thermometer, Temperatur muß ständig notisrt wenden für Temperatur-Zeitprofil) zum Kochen erhitzt und dann genau 2 min bei 100° C gehalten. Sofort danach wird unter Rühren im Alkohol-Eisbad auf Zimmertemperatur abgekühlt, neutralisiert mit 0,1 N NaOH, im Eisbad stehengelassen, bis die Purine ausgefallen sind. Danach wird der Niederschlag abzentrifugiert (z. B. 30 000 g 10 min). Der Überstand wird auf Sephadex G-25 Säule übergeführt Für 100-300 mg DNA hat die Säule

so folgende Maße:

24 x 95 cm. Äquilibrierung und Elution mit Wasser.

Der erste Gipfel, den die APA enthält, wird im Rotationsverdampfer eingeengt und dann gefriergetrocknet.

Charakterisierung der erhaltenen Apurinsäure

Nach dem Gesetz der Basenpaarung muß bekanntlich im Fall der DNA aus sterischen Gründen ein Purin

eo einem Pyrimidin gegenüberstehen: Hieraus folgt, daß das molare Verhältnis der Purinbasen z'j den Pyrimidinbasen gleich I sein muß. Ferner muu das molare Verhältnis der heterozyklischen Basen (Purin- + Pyrimidinbasen) zum Phosphat ebenfalls gleich 1 sein, da ja im Monomer pro Phosphatrest eine Purin- oder Pyrimidinbase vorhanden ist. Im Falle der APA bzw. APyA, bei denen die Hälfte der betreffenden Basen fehlt, muß also das molare Verhältnis der Gesamtbasen zum Phosphat

0,5 betragen. In den o'per, unter a) und b) beschriebenen Fällen wurde nach Ameisensäurehydrolyse und quantitativer Papierchromatographie das molare Verhältnis von Base zu Phosphat im Falle der APA sowie der APyA ermittelt und dabei festgestellt, daß dieses den halben Wert des Verhältnisses Basen/Phosphat in der als Ausgangsma'terial verwendeten DNA darstellte. Ferner wurde am C\ der Desoxyribose, an welchem die Abspaltung stattgefunden hatte, die theoretisch zu erwartende Zahl von 0,5 Mol Aldehydgruppen pro MoI Phosphat gefunden. Auch die Stickstoff- und Phosphorbestimmung ergab im Falle der gemäß Beispiel 1 a) und b) hergestellten APA nahezu den theoretischen Wert (636 bzw. 11,52 Gewichtsprozente). Molekulargewichtsbestimmungen mit Hilfe der Streulichtmethode ergaben im Falle der gemäß Beispiel 1 a) hergestellten APA einen Wert von ca. 2,7 · 10⁴. Im Falle der als Ausgangsmaterial dienenden DNA lag das Molekulargewicht etwas unter 2,7 - 10⁷.

c) Darstellung von Apyrimidinsäure

Hydrazin, wasserfrei 100 g Hydrazinhydrat und 100 g feste NaOH werden in einer Schliff-Dest-Apparatur langsam im Ölbad erhitzt Die Ölbad-Temperatur soll nach 2 Std. ca. 120⁰C betragen. Zu diesem Zeitpunkt muß alles NaOH gelöst sein. Wenn die Destillation in Gang gekommen ist, erhitzt man langsam weiter, bis die Badtemperatur auf 150° C gestiegen ist

Kp: 113-113,5"C

Das Destillat wird nochmals fiber fester NaOH destilliert (NaOH löst sich nicht mehr auf) und sofort verwendet

20

30

Kp:112°C

35

Apyrimidinsäure

4 g über P2O5 getrocknete DNA werden bei Raumtemperatur in 32 ml Hydrazin innerhalb einer Stunde in einem verschlossenen Schlifferlenmeyerkolben unter Schütteln gelöst und 3 Std. bei 37° C unter zeitweiligem Schütteln gehalten. Mit Leitungswasser wird schnell abgekühlt und die Mischung in das 5fache Volumen 96%igen Äthanols, welches Na-Acetat enthält, gegossen (160 ml). Dabei wird mit einem Glasstab kräftig gerührt Das faserige Produkt wickelt sich am Glasstab auf.

Die Apyrimidinsäure wird schnell mit 60 ml 70%igem Äthanol gewaschen, in der gerade zur Lösung notwendigen Menge bidest H₂O (200 ml) gelöst und ^M wieder wie oben gefällt, ur.H zwar wurde die Lösung in 500 ml 96%iges Äthanol, enthaltend 1% Na-Acetat gegossen und die Apyrimidirsäure mit 50 ml 70%igem Äthanol nachgewaschen. Diese Maßnahme wird noch 2mal wiederholt Die Apyrimidinsäure läßt sich in der Kälte besser zu grosLen Flocken ausfällen. Demgemäß wurde bei den folgenden Umfällungen die Apurinsäure gelöst in 250 ml, gefällt in 1500 ml 96% Äthanol+1% Na-Acetat, wobei die Temperatur bei 0⁰C gehalten wurde.

Nach der dritten Fällung wird das Präparat in 200 ml bidest. H-2O gelöst, mit t Ltr. 96% CjHsOH + Wo Na-Acetat gefällt, mit 100 ml 70% C₂H₅OH nachgewaschen und mit 3 χ 50 ml 96% C₂H₅OH und 100 ml Äther gewaschen.

Gelöst in ca. 200 ml bidest. Wasser wird die Substanz gefriergetrocknet.

60 Analyse:

N; gefunden: 12,03 Gewichts-%

P: gefunden: 10,56 Gewichts-%, Ausbeute:

2,70 Gramm.

d) Als Ausgangsmaterial für die unter a) bis c) beschriebenen Herstellungsverfahren diente DNA, weiche aus Heringssperma analog zu der von R. K. Zahn et al. in »Biochemische Zeitschrift« 336,281 —298 (1962) beschriebenen Methode hergestellt worden war. Die so erhaltene DNA wies die folgenden charakteristischen Daten auf:

Analyse:

N: gefunden: 15,79 Gewichts-% Theorie: 15.73 Gewichts-% P: gefunden: 933 Gewichts-% Theorie: 935 Gewichts-% Gewichtsverhältnis: N : P:

gefunden: 1,69; Theorie: 1,68. Molare Extinktion £>(xlO-³)=6,O8 i-J,02 Hyperchromer Effekt bei 260 πιμ in % de' Ausgangsmaterials:ca. 150.

Das unter a) bis c) beschriebene Verfahren kann ebenfalls erfolgreich mit einer Ausgangs-DNA durchgeführt werden, welche aus einer der im allgemeinen Teil der Beschreibung aufgeführten Quellen, z. B. Forellensperma, stammt

Beispiel 2

Die Prüfung auf zytostatische Aktivität der gemäß Beispiel 1 a) und 1 b) hergestellten Apurinsäure erfolgte an menschlichen Tumorstämmen, welche auf die Backentasche des Goldhamsters dauerhaft überpflanzt worden waren, nach einer Methode, wie sie von D. M. Goldenberg et al. z. B. in »Arzneimittelforschung«, 16. Jahrgang, S. 808—812 (1966) beschrieben wurde.

Es handelte sich im vorliegenden Fall um 2 Tumoren, welche aus dem menschlichen Dickdarm stammten und im folgenden als GW-39 und GW-77 bezeichnet werden. Als weitere Tumorstämme wurden dauerhaft überpflanzt: GW-127, ein aus dem Ovar stammendes Carcinom und GW-176, ein Carcinoma sclidum simplex.

a) Methodik

Das Tumorwachstum wird an anästhesierten Tieren durch einfaches Ausstülpen der Backentaschen fortlaufend beobachtet Dabei wird das Tumorvolumen durch Anlegen einer Schublehre entsprechend der Länge, Breite und Dicke des Tumors gemessen. Als Überpflanzungsort wurde die Backentasche des Goldhamsters gewählt, und zwar aus folgenden Gründen:

1. Sie läßt sich leicht und oft herausstülpen, so daß man das Tumorv/achstum durch direkte Beobachtung verfolgen kann.

2. Sie ist besonders gut vascularisiert.

3. Sie gilt als immunologisch privilegiert bezüglich der Transplantation .on fremdem Gewebe.

Zum Nachweis der chemotherapeutischen Wirkung wurde die gleichförmige und konstante Wachstumsgeschwindigkeit dieser Tumoren, nicht die absoluten Tumorgrößen von behandelten und unbehandelten Gruppen verwendet. Dementsprechend wurde das Lei der ersten Messung erhaltene Tumorvolumen jedes

Falles gleich 1 gesetzt und die weiteren Messungen im Verlauf der Behandlungsperiode als Vielfache dieses Ausgangsvolumens umgerechnet und als »Wachstumsfaktor« bezeichnet. Mittelwerte der individuellen Wachstumsfaktoren können dann in den verschiedenen Versuchsgruppen gebildet und auf halbiogarithmischem Papier eingezeichnet werden. Die prozentuelle Hemmung des Tumorwachstums durch das Zytostatikum wird dann ausgedrückt durch Vergleich der Wachstumsfaktoren einer behandelten Gruppe mit der Kontrolljjruppe am letzten Beobachtungstag.

b) Ergebnisse

Die Apurinsäure wurde sowohl an den langsam wachsenden relativ differenzierten Dickdarmtumoren GW-39 und GW-77, als auch an den schneller proliferierenden. mehr anaplastischen Carcinomen des Ovars und des Magens. GW-127 und GW-176, getestet. Die Abbildung Nr. I (Anhang) veranschaulicht die

r:_i _j ; ι . ι ■ _L

τ* it mi ng ut: iticiAiiitfji iuiti ici υ

von Apurinsäure auf das GW-39-Tumorsystem. Man sieht, daß mit dieser Verbindung sowohl bei intraperitonaler (i. p.) wie bei subkutaner (s. c.) Applikation — man verabreichte die Tagesdosis in physiologischer Kochsalzlösung in zwei Gaben über 7 Tage — eine Hemmung von etwa 45% erreicht wird. Im ganzen gesehen, lag die Tumorhemmung bei GW-39 und GW-77 fürd.ie höchste tolerierte Dosis, gleichgültig ob die Tagesdosis in einmaligen oder zweimaligen Gaben verabreicht wurde, zwischen 44% und 64%. Diese Wachstumshemmung hängt von der fortlaufenden Zufahr des Zytostatikums ab. Die Abbildung Nr. 2 (Anhang) zeigt beim GW-77-Tumor die Möglichkeit einer wirksamen oralen Applikation.

c) Aufgrund der außerordentlich großen Proliferationsrate des Tumors GW-127 — er verdoppelt sein Volumen in etwa 12 bis 24 Stunden — wurde die Gabe von mehreren kleinen Dosen für aussichtsreicher gehalten als die einmalige tägliche Gabe von 1 Giamm pro kg Körpergewicht — eine Vermutung, die durch eine erzielte Hemmung von 53% bei täglich zweimaliger Verabreichung bestätigt wurde. Dies gilt auch für das Carcinoma solidum simplex des Magens GW-176, wie die Abbildung Nr. 3 (Anhang) zeigt (hier mit einer Hemmung von über 60%).

d) Bekanntlich wird die Mäuseleukämie L 1210 allgemein als Testmodell zur Auswertung von zytostatisch wirksamen Verbindungen verwendet — vor allem in Hinblick auf die menschliche Leukämie. Es wurde deshalb auch die Apurinsäure in ihrer Wirkung auf diesen Tumor untersucht, nachdem dieser nach der Methode von Gold'.nberg et al. in die Hamsterbackentasche verpflanzt worden war.

e) Die toxikologischen Untersuchungen zeigten eine hohe Verträglichkeit der Apurinsäure beim Versuchstier, dem Goldhamster: die maximal tolerierbare Dosis betrug 1100 mg pro Kilogramm Körpergewicht täglich über eine Woche. Bei dieser Dosis wurde eine Woche nach Therapie-Ende — verglichen mit den unbehandelten tumortragenden Kontrolltieren — ein Gewichtsverlust von weniger als 10% beobachtet.

Beispiel 3

:») Ts wurde festgestellt, daß Apurinsäure (APA) und Apyrimidirisäure (¹¹PyA) im gereinigten Enzymsystem aus Kalbsthymus die DNA-Synthese hemmen, und zwar 'Ί sowohl Replikasereaktion als auch Oligonukleotidpolymerisa'.ion durch die terminale Transferase.

b) Zur weiteren Untersuchung der Hemmung der Zellverm-hrung wurde als biologisches Modell in Suspensionskuitcir wachsende Tumorzellen der Maus ?■·■■ (Mäüsclyrr.phoir.zcücn vorn Hxu~,~, L 5!78 Y, Masiocytomzellen vom Stamm 815) verwendet. Das Zellwachstum erfolgte unter den üblichen Zellkulturbedingungen in einem halbsynthetischen Medium mit 10% Pferdeserum in Suspensionskultur. Die Zählung der Zellen }'■> erfolgte jeweils mit einem elektronischen Zählgerät (»Coulter Counter«). Das Zellwachstum war unter diesen Bedingungen sehr schnell; die mittlere Generationsdauer lag bei günstigen Bedingungen unter IO Stunden, !n einer größeren Zahl von Kulturröhrchen JO wurden 5000 Zellen/ml eingesetzt. Hierzu wurde Apurinsäure mit einer Endkonzentration von 30 jig/ml zugesetzt. Als Paraüelversuch lief eine Kontrollreihe mit ebenfalls 5000 Zellen/ml und physiologischer Kochsalzlösung. Die mit 30ng/ml Apurinsäure behandelte Reihe zeigte eine nahezu vollständige Hemmung der Zellvermehrung. Nach etwa 70 Stunden beginnen bei der angegebenen Dosierung die Zellen wieder stärker zu wachsen, ohne jedoch das Wachstum der Kontrollen zu erreichen. Die EDso(50%ige Hemmdosis) ■>o ergab bei der APA den Wert von I8μg/ml. Die als Ausgangsmaterial dienende DNA zeigte auch in 50fach höherer Konzentration keine Hemmwirkung, sondern eher eine geringe Zeilwachstumsförderung. Die Bausteine der Apurinsäure (Pyrimidinbasen, Pyrimidinnu-■•5 kleoside und -nukleotide) zeigten in äquimolekularen Konzentrationen keinen Effekt. APA hemmt somit die Zellvermehrung von Mäuselymphomzellen in eindeutiger Weise.

Bei der Prüfung gegen die obenerwähnten Zellstäm-5n me wurde im Falle der Apyrimidinsäure eine ED_W von 37 μg/ml ermittelt. Auch APyA hemmt somit deutlich das Wachstum der Lymphomzellen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Zytostatisch wirksames Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff Apurinsäure oder Apyrimidinsäure,

Die vorliegende Erfindung betrifft zytostatisch wirksame Mittel.

Es ist bekannt, daß sich in den Desoxyribonukleinsäuren (DNA) die N-glykosidische Bindung zwischen Desoxyribose und Purinbase durch milde Säurehydrolyse selektiv spalten läßt, während die Bindung zwischen Pyrimidinbase und Zucker unter diesen Bedingungen stabil bleibt Die solchermaßen erhaltene, von Purinbasen freie DNA mit unverändertem Gehalt an Pyrimidinbasen wird als Apurinsäure (APA) bezeichnet

Aus Biochim. Biophys. Acta 91 (1964) 462—476 ist es weiterhin bekannt, daß bei Umsetzung von DNA mit Hydrazin eine selektive Abspaltung der Pyrimidine ohne Verlust der Purinbasen erreicht werden kann und man auf diese Weise zur Apyrimidinsäure (APyA) gelangt

Gegenstand der Erfindung ist nun ein zytostatisch wirksames Arzneimittel, das als Wirkstoff Apurinsäure oder Apyrimidinsäure enthält

Die genannten Mittel können sich dabei sowohl von der Desoxyribonukleinsäure (DNA), als auch von der Ribonukleinsäure (RN A) ableiten.

Hierbei sind die Apurinsäure enthaltenden Mittel als bevorzugte Ausfu.hrungsform der Erfindung zu betrachten.

Die Gewinnung der als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäß verwendeten. Wirkstoffe dienenden DNA kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen, wie sie z.B. R.K. Zahn et al. in BIOCHEMISCHE ZEITSCHRIFT336,281 -298 (1962) beschrieben haben. Die »Ausgangs-DNA« kann dabei aus einem beliebigen, in der Literatur als Quelle für die DNA-Herstellung beschriebenen Material stammen, z. B. aus Gonaden von Seetieren, wie Seeigeln, Holothurien, Muscheln und Ascicien, aus Fischspermien, wie Herings-, Lachs- oder Forellenspermien, aus Kalbsthymus usw.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß die im einleitenden Teil der Beschreibung aufgeführten Wirkstoffe eine signifikante Hemmung unerwünschten Zellwachstums aufweisen. Insbesondere wurde im Falle der Apurinsäure nach der weiter unten von Goldenberg et al. beschriebenen Methode eine besonders ausgeprägte cancerostatische Wirkung gegen Colon-Carcinom, Ovorial-Tumor, Magen-Carcinom sowie Sarkom von Gehirngefäßen festgestellt Von besonderer Bedeutung ist dabei die Tatsache, daß die Nebenwirkungen der Apurinsäure wesentlich geringer sind als bei anderen bisher verwendeten Zytostatika, z. B. Actinomycin C. Die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe sind besonders wirksam gegen solide Tumoren, zeigen jedoch auch guten zytostatischen Effekt bei Leukämie. Die erfmdungsgemäßen Wirkstoffe können in den üblichen therapeutischen Darreichungsformen eingesetzt werden, z. B. intraperitoneal, subkutan, peroral. Die Mittel können somit in Form der verschiedenen üblichen pharmazeutischen Zubereitungen vorliegen, L. B. als Lösungen auf wäßriger Basis, als Tabletten. Dragees usw. Die Tatsache, daß die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Wirkstoffe auch bei oraler Applikation nicht aufgehoben wird, ist dabei als nicht voraussehbar zu bezeichnen.

Zu erwähnen ist außerdem eine immunosuppressive Wirkung der eingangs beschriebenen Wirkstoffe. Außerdem liegt eine antivirale Wirkung vor, z. B. gegen Herpes simplex-Virus.

Die erfindungsgemäßen Mittel eignen sich z. B. allgemein zur Blockierung einer unerwünschten DNA-Synthese, z. B. des sogenannten DNA-Repairs, wie nach Einwirkung bestimmter Zytostatika eintreten kann.