DE3854297T2

DE3854297T2 - Nucleoside und nucleotide mit antiviraler, antitumoraler, antimetastatischer sowie immunstimulierender wirkung.

Info

Publication number: DE3854297T2
Application number: DE3854297T
Authority: DE
Inventors: Howard Cottam; Roland Robins
Original assignee: Brigham Young University
Current assignee: Anadys Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1988-09-02
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2008-09-03
Also published as: CA1319931C; DK406389D0; EP0348446A4; WO1989005649A1; ATE173929T1; KR900700106A; DE3856279D1; ES2010786A6; AR246104A1; DE3856279T2; JPH03504122A; EP0348446B1; DK406389A; US5041426A; DE3854297D1; EP0636372B1; ATE126060T1; JP2590248B2; KR970002611B1; EP0636372A1

Description

Diese Erfindung ist aufneue und verbesserte Antitumor- und das Immunsystem verstärkende Nukleoside und Nukleotide gerichtet.
Das Immunsystem ist ein inhärent komplexes System, das seinem Wirt dient, indem es eine natürliche Resistenz und Genesung gegen Pathogene einer externen Quelle und auch gegen anomale "Selbst"-Zellen, d. h. Tumorwachstum bereitstellt. Es stellt eine "natürliche", d. h. angeborene und nicht wechselnde oder eine "erworbene", d. h. adaptive Immunantwort bereit.
Größtenteils ist das Immunsystem gegen "Selbst" unschädlich. Das Immunsystem kann in den meisten Fällen "Selbst", seinen Wirt, erkennen und zwischen "Selbst" und Nichtselbst differenzieren. Das heißt das Immunsystem ist "selbsttolerant". In bestimmten Fällen jedoch greift das Immunsystem seinen Wirt an, als wenn er fremd wäre, welches in Autoimmunität oder in Autoimmunerkrankung oder in Hypersensitivität, ausgedrückt in der Form von Allergien, bestimmten Formen von Nierenerkrankungen und ähnlichem resultiert.
Während ein effektives und aktives Immunsystem größtenteils biologische Vorteile für den Wirt bringt, hat die moderne Medizin versucht, in bestimmten Fällen das Immunsystem aufgrund von Autoimmunität, Hypersensitivität im Transplantat oder Organtransplantat zu reprimieren, und in anderen Fällen das Immunsystem durch Immunisierung zu stimulieren. Es ist daher vorteilhaft, in bestimmten Fällen zu versuchen, das Immunsystem gegen ein Pathogen oder Tumorangriff zu stimulieren, und in anderen Fällen das Immunsystem zu reprimieren, wenn es selbstzerstörerisch gegen den Wirt oder gegen ein Organtransplantat oder ähnliches wird.
Während die meisten entweder synthetischen oder natürlichen, molekularen Einheiten, die bekannt sind, das Immunsystem zu stimulieren, große Moleküle wie Interferon, Poly I:C oder große Botenproteine sind, ist auch von bestimmten, kleinen Molekülen gezeigt worden, daß sie das Immunsystem modulieren. Bei den kleinen, molekularen Einheiten ist von dem Nukleosid 3-Deaza-adenosin im US-Patent 4,309,419, von Walberg et al., herausgegeben am 5. Januar 1982, berichtet worden, ein Inhibitor der Immunantwort zu sein. Andere Nukleoside, insbesondere 8-Bromguanosin, 8-Mercaptoguanosin und 7-Methyl-8- oxoguanosin sind erwähnt worden, daß sie eine Stimulation des Immunsystems zeigen.
Bestimmte Komponenten des Immunsystems sind der Natur nach zellulär, während andere humoral sind, d. h. sie kommen frei im Serum oder in anderen Körperflüssigkeiten vor. Die adaptive Immunität basiert aufspeziellen Eigenschaften von Lymphozyten. Die Lymphozytenpopulation wird im allgemeinen in T-Lymphozyten, im allgemeinen T-Zellen genannt, und in B-Lymphozyten, im allgemeinen B-Zellen genannt, geteilt. Die T-Lymphozyten unterliegen einem Reifungsprozeß im Thymus, während die B- Lymphozyten kontinuierlich im Knochenmark erzeugt werden und für die Produktion von Antikörpern verantwortlich sind. Die Lymphozyten zirkulieren frei im Blut und haben vom Blut Zugang in die Gewebe, aus denen sie gesammelt und zurück über das Lymphsystem einschließlich der Lymphdrüsen und der Milz rezirkuliert werden.
Komponenten der zellulären Immunmechanismen beinhalten Makrophagen (im folgenden auch als MAC bezeichnet), polymorphkernige Leukozyten, im allgemeinen PMN genannt, Mastzellen und andere zelluläre oder molekulare Einheiten so wie Interferon und ähnliche. Weiterhin können Komplemente, die eine Reihe von Proteinen im Serum sind, durch andere Immunkomponenten oder direkt durch Pathogene wie Bakterien und ähnlichem aktiviert werden.
Natürliche Killerzellen, im folgenden auch als NK-Zellen bezeichnet, bilden eine Gruppe von Zellen, die an der natürlichen Immunität beteiligt sind. Diese sind lymphoide Zellen, die im allgemeinen wenigstens in den jungen aller Säugetierspezies gefunden werden und in älteren Tieren ohne weiteres hervorgerufen werden können. Sie üben im allgemeinen eine selektive Zytotoxizität gegen einen Bereich von Zielzellen, meistens malignen Tumorzellen aus.
Die B-Zellen produzieren Antikörper. Antikörper sind eine Gruppe von Proteinen verschiedener Klassen, die IgG, IgM, IgA, IgD, IgE beinhalten. Nicht alle spezifischen Antikörperklassen sind in den verschiedenen Tierspezies vorhanden. Im allgemeinen sind, je höher auf der evolutionären Treppe der Tiere, um so mehr Antikörperspezies vorhanden, wobei warmblütige Säugetiere im allgemeinen ein volles Kontingent der verschiedenen Antikörperspezies haben. Das Immunsystem ist in der Lage, bestimmte Regionen des Antikörperproteins zu modifizieren, welches es dem Antikörperprotein erlaubt, an spezifische Antigene verschiedenen Ursprungs zu binden. Diese beinhalten Pathogene, Teile von Pathogenen wie Polysaccharidmoleküle zellulärer Wände, große Proteine und ähnliches, und fremde Trümmer wie Pollen und sogar bei Autoimmunerkrankungen Teile des Wirtes selbst. Ein Teil der Antikörperproduktion von B- Zellen ist unabhängig von T-Zellen, während andere Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist.
Es gibt mehrere Gruppen von T-Zellen einschließlich T- Helferzellen, welche andere T-Zellen und B-Zellen zur Produktion von Antikörpern stimulieren, Suppressor-T-Zellen, welche die Immunantwort modulieren, um ein überwältigen des Wirtes zu vermeiden, zytotoxische T-Zellen (CTL), welche gegen Pathogene, insbesondere virale Pathogene sehr wichtig sind, und verzögerte Hypersensitivitäts-T-Zellen, welche wichtig sind, um eine Vielzahl anderer Zellen einschließlich der Makrophagen anzulocken und zu aktivieren.
Das Immunsystem ist wichtig, um den Wirt gegen eine Vielzahl von Pathogenen einschließlich Bakterien, Viren, Protozoen, parasitären Würmern, wie Saugwurmern, Bandwürmern und Spulwürmern, Pilzen und Tumorzellen des Wirtes, welche parasitär für den Wirt werden, zu schützen. Die antivirale Aktivität des Immunsystems ist im allgemeinen mit den T-Zellen assoziiert, wobei die natürliche Antitumorfähigkeit des Wirtes bei den Makrophagen, den natürlichen Killerzellen, bestimmten Nicht-T- und Nicht-B-myeloischen Zellen und bei bestimmten Teilen des Komplementsystems liegt.
Wie ersichtlich ist, ist das Immunsystem ein sehr komplexes System, welches für den Wirt sehr wichtig ist, um einen Schutz des Wirt es gegen äußere Pathogene und auch gegen innere, anomale Zellen zu erhalten. Katastrophale Effekte für den Wirt können entstehen, wenn Pathogene, Tumore oder ähnliches das Immunsystem des Wirtes überwältigen. Es ist sogar gedacht worden, daß Tumore die Fähigkeit haben können, das Immunsystem des Wirtes zu unterdrücken oder zu unterminieren. Dieses wird durch die Beobachtung von Klinikern gestützt, daß virale und bakterielle Infektionen ein Hauptbeitrag für den Tod von Tumorpatienten sein können.
Die US-A-4, 746,651 offenbart eine antimikrobielle Zusammensetzung, umfassend ein Guanamino-Aldoglycosid-Derivat als ein die Immunantwort verstärkendes und ein antibiotisches Agens. Die EP-A-343,945, welche ein späteres Prioritätsdatum als die vorliegende Erfindung hat, offenbart auch solche Guanamino-Aldoglycosid-Derivate als immunverstärkende Agenzien.
Aus Sicht des Obigen ist ersichtlich, daß ein Bedarf an neuen und verbesserten immunverstärkenden Antitumor-Agenzien besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Klasse von Nukleosiden und Nukleotiden des Thiazol[4,5- d]pyrimidinringsystems und bestimmten neuen Verbindungen dieser Klasse.
Die vorliegende Erfindung stellt den Gebrauch von Verbindungen mit der Formel bereit:
wobei R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; einzeln H, OH oder C&sub1;-C&sub1;&sub8; O-Acyl sind
und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8; Acyl oder
ist;
oder R&sub5; und R&sub7; H oder OH sind, R&sub6; H ist und R&sub3; und R&sub4; zusammen
sind;
und X ist =O oder =S;
Y ist -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen;
und Z ist H, -NH&sub2;, -OH oder Halogen;
wobei Halogen Cl oder Br ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung beim Behandeln von Tumoren bei Säugetieren oder, um Tumormetastasen bei befallenen Säugetierwirten zu inhibieren.
Die Erfindung stellt weiterhin Verbindungen der Formel bereit:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln H oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;Acyl sind und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;- Acyl
oder
ist, oder R&sub1; ist H und zusammen R&sub2; und
R&sub3; sind
und X ist =0 oder =S;
Y ist -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen;
und Z ist H, -NH&sub2;, -OH oder Halogen;
wobei Halogen Cl oder Br ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes zum Verwendung beim Stimulieren des Immunsystemes eines Säugetierwirtes.
Bei diesen Verbindungen sind R&sub1; und R&sub2; zum Beispiel H, Acetyl oder Benzoyl,
und R&sub3; ist H, Acetyl, Benzoyl oder
oder R&sub1; ist H und zusammen sind R&sub2; und R&sub3;
Weiterhin bevorzugt ist Z -NH&sub2; und Y ist -OH und X ist bevorzugt =O. R&sub1; und R&sub2; können zum Beispiel H sein, in diesem Fall ist R&sub3; bevorzugt auch H.
Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen sind als Immunsystemverstärker verwendbar und haben bestimmte Immunsystemeigenschaften einschließlich Modulation, Mitogenizität, Verstärkung und/oder Potenzierung oder sie sind Zwischenprodukte für Verbindungen, die diese Eigenschaften haben. Von diesen Verbindungen wurde gezeigt, daß sie wenigstens auf die natürlichen Killer-, Makrophagen- und Lymphozytenzellen des Immunsystems eines Wirtes Wirkungen ausüben. Aufgrund dieser Eigenschaften sind sie als Antitumor- und antimetastatische Agenzien oder als Zwischenprodukte für Antitumor- und antimetastatische Agenzien verwendbar. Sie können verwendet werden, einen betroffenen Wirt dadurch zu behandeln, daß sie als die aktiven Bestandteile von geeigneten, pharmazeutischen Zusammensetzungen dienen.
Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können verwendet werden, um Tumore bei Säugetierwirten zu behandeln, indem die Verbindungen den Säugern in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht werden.
Auch können die in der Erfindung benutzten Verbindungen verwendet werden, um Tumormetastasen bei Säugetierwirten zu inhibieren, indem man dem Säuger eine therapeutisch effektive Menge der Verbindungen verabreicht.
Zusätzlich können die in der Erfindung gebrauchten Verbindungen verwendet werden, um das Immunsystem eines Säugetierwirtes zu stimulieren, indem man-dem Säugetierwirt eine therapeutisch effektive Menge der Verbindungen verabreicht.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung, um natürliche Killerimmunzellen in einem Säugetierwirt zu verstärken, bereit.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung, um Makrophagenzellen in einem Säugetierwirt zu verstärken, bereit.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin-2,7- (6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes für die Verwendung, um Lymphozytenzellen in einem Säugetierwirt zu verstärken, bereit.
Zusätzlich wird in Übereinstimmung mit der Erfindung eine therapeutische, pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die als aktiven Bestandteil eine therapeutisch effektive Menge an 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)dion enthält.
Zusätzlich wird in Übereinstimmung mit der Erfindung eine prophylaktische, pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die als aktiven Bestandteil eine prophylaktisch effektive Menge an 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion enthält. Zusätzlich kann die prophylaktische Zusammensetzung weiterhin ein antivirales Agens als einen weiteren aktiven Bestandteil enthalten.
Da die Verbindungen der Erfindung als Antitumor- und antimetastatische Agenzien verschiedene natürliche Immunsystemantworten stimulieren, würden die Verbindungen der Erfindung gegen ein breites Spektrum an Tumore einschließlich, aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt, Karzinome, Sarkome und Leukämien verwendbar sein. In einer solchen Klasse sind Brust-, Darm-, Blasen-, Lungen-, Prostata-, Magen- und Pankreaskarzinome und lymphoblastische und myeloische Leukämien enthalten.
Das Verfahren, Tumore zu behandeln, ist wirksam, eine Rückbildung, Linderung, Inhibition des Wachstums, Inhibition von Metastasen und Remission von Tumoren zu bewirken.
Die in der Erfindung benutzten Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man ein Derivat eines 2,5,7- substituierten Thiazol[4,5-d]pyrimidins silyliert und das Silyl-Derivat mit einer 1-O-substituierten-blockierten D- Pentofuranose in der Gegenwart eines Katalysators umsetzt, um ein blockiertes Nukleosid zu bilden. Die Schutzgruppe kann weiterhin von dem Nukleosid entfernt werden. Außerdem kann das Nukleosid phosphoryliert werden. Die Substituentengruppe am 2,5,7-substituierten Thiazol[4,5-d]pyrimidin wird aus der Gruppe, die aus H, Halogen, -NH&sub2;, -OH, =O und =S besteht, ausgewählt. Für bestimmte Verbindungen der Erfindung wird der substituierte, blockierte Pentofuranosylzucker als 1-O-Acetyl- 2,3,5-tri-O-acyl-D-pentofuranose, insbesondere als 1-O-Acetyl- 2,3,5-tri-O-benzoyl-D-ribofuranose ausgewählt.
Die Synthese des Guanosinanalogons 5-Amino-3-β-D- ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion kann durch die direkte Glycosylierung des zuvor hergestellten Guaninbasenanalogons bewirkt werden (Schema I). So wurde 5- Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (i), hergestellt in fünf Schritten aus dem im Handel erhältlichen Diaminopyrimidinon nach dem Verfahren von Baker und Chatfield, J.Chem. Soc. (C), 2478 (1970), durch Trimethylsilylierung unter Verwendung von Hexamethyldisilazan, gefolgt von einer Behandlung mit 1-O-Acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-D-ribofuranose (5) in Gegenwart von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat als einem Katalysator glykosyliert. Das Hauptprodukt 5-Amino-3- (2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(6H)-dion (6) wurde isoliert.
Behandlung von 6 mit Natriummethoxid in Methanol ergab das ungeschützte Guanosinanalogon 5-Amino-3-β-D- ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (2). Wenn 7 mit überschüssiger salpetriger Säure desaminiert wurde, wurde das Xanthosinanalogon 3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5- d]pyrimidin-2,5,7(4H,6H)-trion (8) hergestellt. Ersatz der 5- Aminogruppe in Verbindung 6 durch ein Wasserstoffatom wurde durch Behandlung von 6 mit t-Butylnitrit in Tetrahydrofuran erreicht, um 3-(2,3,5-tri-I-benzoyl-β-)2- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (9) zu ergeben. Deprotektion von 9 unter Verwendung von Natriummethoxid in Methanol oder methanolischem Ammoniak stellte das Inosinanalogon 3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5- d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (10) bereit.
Das Guanosinanalogon 7 wurde phosphoryliert, und das 5'- Monophosphat (11) wurde erhalten. Das 3',5'-zyklische Monophosphatderivat 12 wurde dann aus 11 hergestellt.
Die Herstellung der analogen 8-Mercaptoverbindung in dem Thiazol[4,5-d]pyrimidin-System ist in Schema II dargestellt, ausgehend von 5-Amino-2-chlorthiazol[4,5-d]pyrimidin-7(6H)-on (13). Verbindung 13 wurde mit NaSH in Ethylenglykol bei 110º behandelt, um den 2-Thioxo-Heterozyklus 14 bereitzustellen. Die Glykosylierung von 14 durch dasselbe Verfahren, das benutzt wurde, die 2-Oxoverbindung 6 herzustellen (ausgenommen, daß etwas Erhitzen nötig war, um sicherzustellen, daß jegliches gebildetes S-Glykosid in die thermodynamisch stabilere N- Glykosidform umgewandelt werden würde), ergab die Bildung von 5-Amino-2-thioxo-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d)pyrimidin-7(6H)-on (15). Behandlung von 15 mit Natriummethoxid in Methanol ergab das 8- Mercaptoguanosinanalogon 5-Amino-2-thioxo-3-β-D- ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-7(6H)-on (16).
Verschiedene verwandte Derivate in der Guanosinanalogonserie wurden auch hergestellt. Das 6- Thioguanosinanalogon wurde auf zwei Wegen ausgehend von 6 hergestellt (Schema III). In einem Ansatz wurde 6 mit dem milden, chlorierenden Agens Dimethyl(chlormethylen)ammoniumchlorid (erzeugt in situ aus Thionylchlorid und DMF) behandelt und lieferte 5-Amino-7-chlor-3-(2,3,5-tri-2-benzoylβ-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (17). Reaktion von 17 mit Thioharnstoff unter Ethanolrückfluß ergab das geschützte Thioguanosinanalogon 5-Amino-7(6H)-thioxo-3-(2,3,5- tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (18). Verbindung 18 wurde auch direkt aus 6 durch Reaktion mit P&sub2;S&sub5; in Pyridin hergestellt. Deprotektion von 18 wurde entweder mit Natriummethoxid in Methanol oder mit methanolischem Ammoniak erreicht und das 6-Thioguanosinanalogon 5-Amino-7(6H)thioxo-3-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (19) wurde als das kristalline Monohydrat isoliert. Die Chlorfunktion an Position 7 wurde durch Azid unter Verwendung von Natriumazid in trockenem DMF auch nukleophil substituiert, welches nachfolgend einen Ringschluß auf N-6 bewirkte, um die neue trizyklische Ringverbindung 5-Amino-7-(2,3,5-tri-O- benzoyl-β-D-ribofuranosyl)tetrazol[1,5-c]thiazol[4,5- d]pyrimidin-2-on (20) zu bilden.
In einem Versuch, das Thiazol[4,5-d]pyrimidinringsystem bezüglich der Reihenfolge der nukleophilen Substitution an den 2, 5 und 7-Positionen zu studieren, und diese Information zur Synthese des Adenosinanalogons möglicherweise zu verwenden, wurde die Chlorierung des ohne weiteres erhältlichen 2- Chlorthiazol[4,5-d]pyrimidin-5,7(4H,6H)-dion (21) unter Verwendung von POCl&sub3; und N,N-Dimethylanilin unter Rückfluß bewirkt (Schema IV). Das gewünschte 2,5,7-Trichlorthiazol[4,5- d]pyrimidin (22) wurde gemeinsam mit einer kleinen Menge von 5,7-Dichlor-2-(N-methylanilin)thiazol[4,5-d]pyrimidin (23) erhalten. Die Trichlorverbindung 22 wurde sorgfältig bei 60ºC in 1N NaOH hydrolysiert, um das Monooxoderivat 5,7- Dichlorthiazol[4,5-d]pyrimldin-2(3H)-on (24) zu erhalten, dessen Struktur durch Einkristallröntgenstrukturanalyse bestätigt wurde. Umsetzung von (24) mit 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl- D-ribofuranose (25) unter Schmelzglykosylierungsbedingungen ergab 5,7-Dichlor-3-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5]pyrimidin-2-on (26). Versuche, 26 für weitere Modifikationen zu verwenden, um das Adenosinanalogon zu erhalten, waren aufgrund der labilen Natur des Thiazolringes, eine nukleophile Ringöffnung durchzuführen, erfolglos.
Dieses wurde durch die Synthese des Adenosinanalogons aus seinem zuvor hergestellten Heterozyklus auf die gleiche Art umgangen, die benutzt wurde, um das Guanosinanalogon zu erhalten. Das bekannte 2,7-Diaminothiazol[4,5-d]pyrimidin (27) diente als Ausgangsmaterial (Schema V). Behandlung von 27 mit salpetriger Säure unter ähnlichen Bedingungen wie die, die verwendet wurden, um 13 herzustellen, lieferte 7-Amino-2- chlorthiazol[4,5-d]pyrimidine (28). Die Struktur von Verbindung 28 wurde durch Einkristallröntgenstrukturanalyse bestätigt. Behandlung von 28 mit NaSH in DMF bei 0ºC ergab das 2- Mercaptoderivat 7-Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-thion (29). Die Umwandlung der 2-Thioxofunktion in 29 in eine 2- Oxofunktion wurde unter Verwendung von kaltem, alkalischem Wasserstoffperoxid erreicht, um 7-Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin- 2(3H)-on (30) zu ergeben. Umsetzung von 30 mit dem Benzoylgeschütztem Zucker 5 ergab unter den gleichen Glykosylierungsbedingungen (bei Zimmertemperatur), die verwendet wurden, um das blockierte Guanosinanalogon 6 herzustellen, die Bildung des unerwarteten, blockierten 4- Ribofuranosylisomeren 7-Amino-4-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D- ribofuranosyl)-thiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (31) als dem einzigen nachgewiesenen detektierten und isolierten Isomer. Wenn jedoch die gleiche Reaktion bei erhöhter Temperatur (80ºC) durchgeführt wurde, war das vorwiegend erhaltene Produkt das gewünschte 3-Ribofuranosylisomer 7-Amino-3-(2,3,5-tri-O- benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (32). Beide Isomere 31 und 32 wurden unter Verwendung von Natriummethoxid in trockenem Methanol deprotektiert, um 7- Amino-4-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (33) und 7-Amino-3-β-D-ribofuranosy1thiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (34) zu erhalten.
Die 2'-Deoxyerythropentofuranosyl-, die Xylofuranosyl- und die Arabinofuranosylanaloga von Verbindung 7 können auf eine ähnliche Art, wie für Verbindung 7 beschrieben (Schema VI), hergestellt werden. So ergibt Umsetzen von 4 mit 1-Chlor-2- deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-α-D-erythropentofuranose, gefolgt vom Entblocken, 5-Amino-3-(2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (36). Ebenso wird nach Entblocken der jeweiligen Zwischenprodukte 4 und 1,2,3,5-Tetra- O-acetyl-D-xylofuranose 5-Amino-3-(β-D-xylofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (38) ergeben und 4 und 1-Chlor-2,3,5-tri-O-benzyl-α-D-arabinofuranose wird 5-Amino-3- (β-)2-arabinofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (40) ergeben. Die Tri-O-acetyl (40) Prodrug-Form von Verbindung 7 wird aus 4 und 1,2,3,5-Tetra-Q-acetyl-D-ribofuranose hergestellt, und das 2,3-Di-O-isopropyliden-Derivat (42) wird direkt aus 7 hergestellt (Schema VI).
Für die in der Erfindung verwendeten Verbindungen können durch Zugabe von pharmazeutisch annehmbarer Säure Salze der basischen Komponenten aus der Gruppe, aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt, die aus Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, Citrat, Sulfat, substituiertem Sulfat, Phosphat, Carbonat, Bicarbonat und Formiat besteht, ausgewählt werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze der Phosphatkomponente können aus der Gruppe, die aus Alkali und Erdalkalien, z. B. Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Lithium, Ammonium und substituiertem Ammonium, Trialkylammonium, Dialkylammonium, Alkylammonium, z. B. Triethylammonium, Trimethylammonium, Diethylammonium, Octylammonium, Cetyltrimethylammonium und Cetylpyridium besteht, aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt, ausgewählt werden.
Die Hydroxylgruppen am Glykon und Heterozyklus und die Aminogruppen des Heterozyklusses können mit Gruppen wie Acyl, Isopropyliden und Dimethylaminomethylen, aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt, blockiert werden. Die Acylgruppe kann aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus einer C&sub1;-C&sub1;&sub8;-geradkettigen, verzweigten, substituierten, ungesättigten, gesättigten oder aromatischen Säure wie, aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt, Essig-, Trifluoroessig-, Propion-, n-Butan-, Isobutan-, Valerian-, Capron-, Pelargon-, n-Heptyl-, n-Capryl-, Milch-, Acryl-, Propargyl-, Palmitin-, Benzoe-, Phthal-, Salicyl-, Zimt-, Naphthalincarbonsäuren besteht.
Schmelzpunkte wurden in einem Thomas-Hoover-Kapillar- Schmelzpunktapparat oder in einem Haake-Buchler- Digitalschmelzpunktapparat bestimmt und sind unkorrigiert. Kernspinresonanz (¹H NMR)-Spektren wurden mit 300.1 MHz in einem IBM NR300AF-Spektrometer bestimmt. Die chemischen Verschiebungen werden in δ-Werten (Teile pro Million) relativ zu Tetramethylsilan als internem Standard ausgedrückt. Ultraviolett-Spektren (UV: sh = Schulter) wurden mit einem Beckman DU-50-Spektrophotometer aufgenommen. Elementanalysen wurden vom Robertson Laboratorium, Madison, N. J. durchgeführt. Verdampfungen wurden bei einem verminderten Druck mit einer Badtemperatur unter 40ºC durchgeführt. Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf Kieselgel 60 F-254- Platten (EM Reagenzien) durchgeführt. E. Merck Kieselgel (230- 400 Mesh) wurde für Blitzsäulenchromatographie benutzt.

BEISPIEL 1

5-Amino-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4.5- d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (6)

Eine Mischung aus trockenem 5-Aminothiazol[4,5- d]pyrimidin-2,7-(3H,6H)-dion 4 (5,5 g, 30 mmol), Hexamethyldisilazan (HMDS, 100 ml), Ammoniumsulfat (15 mg) und Pyridin (10 ml) wurden für 4 Stunden unter Rückfluß und dem Ausschluß von Feuchtigkeit erhitzt. Überschüssiges HMDS wurde durch Destillation entfernt, um das sirupähnliche Bis-silyl- Derivat zu liefern. Das Bis-Silyl-Zwischenprodukt wurde in trockenem Acetonitril (300 ml) aufgelöst und 1-O-Acetyl-2,3,5- tri-O-benzoyl-D-ribofuranose (5 : 15,1 g, 30 mmol) wurde, gefolgt von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (9,3 ml, 42 mmol), zugegeben. Die klare Reaktionsmischung wurde bei der umgebenden Temperatur für 16 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft, und der zurückgebliebene Sirup wurde in EtOAc (600 ml) aufgelöst. Die Lösung wurde mit 5% NaHCO&sub3;-Lösung (2·150 ml) gewaschen, und die getrocknete (Na&sub2;SO&sub4;) organische Schicht wurde eingedampft. Der zurückgebliebene Sirup wurde mit Ether verrieben, um 18,1 g (96%) zu ergeben. Der resultierende Schaum wurde auf einer Kieselgelsäule durch präparative LC-Technik unter Verwendung von CHCl&sub3;-MeOH (9 : 1, V/V) als dem Lösungsmittel gereinigt. Umkristallisation des Rückstandes aus EtOH gab 5-Amino-3- (2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(6H)-dion (6) als farblose Kristalle: Ausbeute 14,5 g (77%: Fp 248-250ºC: UV λmax (pH 1) 215 sh nm (&epsi; 28000), 219 (28000) 224 sh (27600), 301 (8500) : UV λmax (pH 7) 215 sh nm (&epsi; 28900) 222 (29500), 301 (10600): UV λmax (pH 11) 218 nm (&epsi; 27800), 273 (6900): Anal. berechn. für C&sub3;&sub1;H&sub2;N&sub4;O&sub9;S: C, 59.23: H, 3.85: N, 8.91: S, 5.10. Gefunden: C, 59.26: H, 3.89: N, 8.93: S, 5.23.

BEISPIEL 2

5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (7)

Eine Lösung von 6 (0,75 g, 1 mmol) in Methanol (75 ml) wurde mit NaOCH&sub3; auf pH 9 eingestellt und bei Zimmertemperatur für 16 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bis zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde mit Ether (2·75 ml) verrieben. Der Ether unlösliche Feststoff wurde in Wasser gelöst (15 ml) und mit Essigsäure angesäuert, woraufhin das rohe Produkt ausfiel. Kristallisation von diesem Material aus Wasser gab ein farbloses Pulver: Ausbeute 0,31 g, 78%: Fp 238ºC (Zers.) : UV λmax (pH 1) 215 nm (&epsi; 2280), 245 (6900), 301 (8400): UV λmax (pH 7) 215 nm (&epsi; 22100), 245 (6900), 301 (8000): UV λmax (pH 11) 245 nm (&epsi; 5700), 291 (6000). NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.79 (1H, d, J = 5.32 Hz, C&sub1;, H), 6.90 (2H, s, NH&sub2;), 11.12 (1H, s, NH), und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub6;S·H&sub2;O: C, 35.92: H, 4.22: N, 16.76: S, 9.59. Gefunden: C, 35.82: H, 4.02: N, 16.92: S, 9.66.

BEISPIEL 3

3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,5,7(4H,6H)trion (8)

Zu einer Suspension von 2 (0,76 g, 2,4 mmol) in Eisessig (150 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus Natriumnitrit (1,5 g, 21,7 mmol) in Wasser (15 ml) unter Rühren zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Suspension klar und das Rühren wurde bei Raumtempertur über Nacht fortgesetzt. Die weißen Feststoffe, welche sich abgetrennt hatten, wurden filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet. Umkristallisation aus heißem Wasser gab feine, farblose Kristalle von 8: Ausbeute 0,3 g, 40%: Fp 250ºC Zers.: UV λmax (pH 1) 293 nm (&epsi; 5500): UV λmax (pH 7) 212 nm (e 14200), 301 (6100): UV λmax (pH 11) 204 nm (&epsi; 21900), 301 (5600). Anal. berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;N&sub3;O&sub7;S: C, 37.86: H, 3.49: N, 13.24: S, 10.10. Gefunden: C, 37.81: H, 3.42; N, 13.01: S, 10.01.

BEISPIEL 4

3-(2,3,5-Tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5- d]pyrimidin-2.7(6H)-dion (9)

Zu einer Lösung aus 6 (6,65 g, 10,6 mmol) in trockenem THF (350 ml) wurde tert.-Butylnitrit (6,2 ml, 52,3 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde bei Zimmertemperatur für eine Stunde gerührt. Zusätzliches Nitritreagenz (2,0 ml) wurde zugegeben, und die Mischung wurde bei 50-60ºC über Nacht gerührt. Die Mischung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde durch Blitzsäulenchromatographie über Kieselgel unter Verwendung von 8-10% Aceton in CH&sub2;Cl&sub2; gefolgt von 10-11% gereinigt. Das gewünschte Produkt eluierte als letztes und gab 3,45 g (46%) von 9 als einen Schaum: UV λmax (EtOH) 220 nm (&epsi; 46600), 259 sh (11000), 271 sh (8400): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6.31 (d, J = 6.45 Hz, 1H, C&sub1;, H), 7.38-7.98 (m, 15H, Benzoyl Aromaten), 8.25 (s, 1H, C&sub5;H), 13.16 (b, 1H, N&sub6;H, ausgetauscht mit D&sub2;O), und anderen Zuckerprotonen.

BEISPIEL 5

3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion (10)

Verbindung 9 (1,0 g, 1,63 mmol) wurde mit methanolischem Ammoniak (gesättigt bei 0ºC, 50 ml) gemischt und bei 90ºC für 14 Stunden in einer Stahlbombe erhitzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde mit heißem Benzol behandelt, welches dekantiert wurde. Der resultierende Feststoff wurde über Kieselgelblitzchromatographie unter Verwendung von Chloroform und dann CHCl&sub3;-MeOH (6 : 1) gereinigt, um 280 mg (57%) von 10 nach Kristallisation aus Wasser zu ergeben: Fp 216- 218ºC: UV λmax (pH 1) 217 nm (Ω 25300), 259 (9700), 286 (6300): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.85 (d, J = 5.1 Hz, 1H, C&sub1;, H), 8.30 (s, 1H, C&sub5;H), 13.09 (b, 1H, N&sub6;H, tauscht aus mit D&sub2;O), und anderen Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;N&sub3;O&sub6;S: C, 39.87: H, 3.68: N, 13.95: S, 10.64. 3.61: N, 14.06: S, 10.43.

BEISPIEL 6

5-Amino-3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion 5'-Monophosphat Ammoniumsalz (11)

Zu einer Suspension aus 2 (2,1 g, 6,6 mmol) in frisch destilliertem Trimethylphosphat (25 ml) wurde bei -20ºC POCl&sub3; (0,64 ml, 6,6 mmol) zugegeben und dann nach 1 h ein zusätzliches Äquivalent von POCl&sub3;. Die Mischung wurde bei -5ºC für weitere 2 h gerührt und dann in Ethylether (150 ml, wasserfrei) gegossen und zentrifugiert (6000 Upm, 10 min). Die Etherschicht wurde dekantiert und Eiswasser (100 ml) wurde zu dem verbliebenen Öl zugegeben. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniumbicarbonat auf 7,5 eingestellt, und die Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule (3,2·35 cm) gegeben, mit Wasser gewaschen und mit einem Gradienten (0 bis 0,25 M, 2 l Reservoir) einer wäßrigen Ammoniumbicarbonatlösung eluiert. Während des Waschens mit Wasser wurde nicht umgesetztes Ausgangsmaterial eluiert (0,5 g). Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und lyophylisiert mehrere Male, um 1,01 g (48% basierend auf dem umgesetzten Ausgangsmaterial) zu ergeben: Fp 190-194ºC UV X- (pH 1,7) 243 nm (&epsi;), 301 () : UV λmax (pH 11) 243 nm (&epsi;), 289 () : ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.71 (s, 1H, C&sub1;, H), 7.15 (b, 5H, NH&sub2; und NH&sub4;&spplus;, tauscht aus mit D&sub2;O), 11.25 (b, 1H, N&sub6;H, tauscht aus mit D&sub2;O), und anderen Zuckerprotonen. Anal. C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub4;N&sub5;O&sub8;SP·1·25H&sub2;O: C, 28.75: H, 3.98: N, 16.76: S, 7.67: P, 7.41. Gefunden: C, 29.15: H, 3.68; N, 16.39: S, 7.76: P, 7.22.

BEISPIEL 7

5-Amino-3-β-D-Ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion 3',5'-zyklisches Monophosphat Ammoniumsalz (12)

Verbindung 11 (1,02 g, 2,28 mmol) wurde in Wasser (10 ml) und Pyridin (3 ml) gelöst, und Morpholindicyclohexylcarbodiimid (667 mg, 2,28 mmol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde eingedampft und mehrere Male mit trockenem Pyridin zu einem Sirup ko-eingedampft. Nach Trocknen über Nacht über P&sub2;O&sub5; im Vakuum wurde der Sirup in trockenem Pyridin (100 ml) aufgelöst und tropfenweise zu einer unter Rückfluß kochenden Lösung von Pyridin (300 ml), die DCC (25 g) enthält, gegeben. Die Lösung wurde für weitere 2 h unter Rückfluß gekocht, gekühlt und gestattet über Nacht zu rühren. Die Mischung wurde bis zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde zwischen Wasser (150 ml) und Ethylether (150 ml) aufgeteilt. Die wäßrige Schicht wurde auf ungefähr 100 ml konzentriert und mit einem pH von 7,7 auf eine DEAE-Cellulosesäule (3,2·30 cm) gegeben und mit Wasser gewaschen, gefolgt von einer Elution unter Verwendung eines wäßrigen Ammoniumbicarbonatgradienten (0 bis 0,19 M). Die richtigen Fraktionen wurden, basierend auf einer UV-Aufzeichnung, gesammelt, eingedampft und lyophylisiert mehrere Male, um 190 mg (22%) der Titelverbindung zu ergeben: Fp 244ºC (Zers.) : UV λmax (pH 1,7) 243 nm (&epsi;), 300 () : UV λmax (pH 11) 243 nm (&epsi;), 289 () : ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.60 (d, J = 4.44, 1H, 2'OH, tauscht aus mit D&sub2;O), 5.72 (s, 1H, C&sub1;, H), 7.15 (b, 6H, NH&sub2; und NH&sub4;, tauscht aus mit D&sub2;O), 11.40 (b, 1H, N&sub6;H, tauscht aus mit D&sub2;O), und anderen Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub1;N&sub4;O&sub8;SP·NH&sub3;·1·25H&sub2;O: C, 28.75: H, 3.98: N, 16. Gefunden: C, 29.15: H, 3.68: N, 16.39; S, 7.76: P, 7.22.

BEISPIEL 8

5-Amino-2-thioxothiazol[4,5-d]pyrimidin-7(6H)-on (14)

Eine Suspension aus 5-Amino-2-chlorthiazol[4,5- d]pyrimidin-7(6H)-on (13 : 1.5 g, 7.4 mmol) in Ethylenglycol (30 ml) wurde auf 110ºC erhitzt und NaSHxH&sub2;O (420 mg, 74 mmol) wurde zugegeben. Eine klare Lösung wurde jedoch nicht erhalten, bis weitere 250 mg zugegeben wurden. Die klare Lösung wurde für 2 h bei 110ºC gerührt und dann wurde die Reaktionsmischung auf Zimmertemperatur gekühlt, auf Eis gegossen (300 ml) und der pH mit 10%iger HCl auf 2 bis 3 eingestellt. Die resultierende pinkfarbene, gelatineartige Mischung wurde für 1 h gekocht und der pinkfarbene Feststoff wurde mittels Filtration durch einen mittleren Glasfrittenfilter gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet: Ausbeute 1,2 g, 81%: eine analytische Probe wurde über Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von EtOAc- MeOH-H&sub2;O-Aceton (7 : 1 : 1 : 1) hergestellt. Fp > 300ºC: UV λmax (pH 1) 243 nm (&epsi; 13700), 266 (16500), 351 (17200): UV λmax (pH 7) 262 nm (&epsi; 14800), 345 (12700): UV λmax (pH 11) 250 nm (&epsi; 19300), 335 (14300): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6.91 (s, 2H, NH&sub2;), 11.18 (s, 1H, N&sub6;H), 13.78 (s, 1H, N&sub3;H). Anal. berechn. für C&sub5;H&sub4;N&sub4;OS&sub2;:

BEISPIEL 9

5-Amino-2-thioxo-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4.5-d]pyrimidin-7(6H)-on (15)

Verbindung 14 (1,0 g, 5 mmol) wurde auf die gleiche Weise, wie die verwendet um 6 herzustellen, glycosyliert, benötigend HMDS (20 ml), Benzoyl-blockierter Zucker (5 : 2.52 g, 5 mmol), und TMS-Trifluormethansulfonsäure (1,45 ml, 7,5 mmol). Am Ende der 16 h Reaktionszeit wurde die Reaktionsmischung bei 70ºC für 3 h erhitzt, um jegliches gebildetes S-Glycosid in das stabilere N-Glycosid umzulagern. Nach derselben Aufarbeitung wurde 15 (2,1 g unbearbeitet) über Blitzsäulenchromatographie unter Verwendung von Hexan-Aceton (1 : 1) gereinigt und aus Toluol-EtOAc kristallisiert: Ausbeute 1,9 g, 59%: Fp 230-233ºC dunkelt 195ºC). Anal. berechn. für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub8;S&sub2;: C, 57.76: H, 3.75: N, 8.69: S, 9.95. Gefunden: C, 57.98: H, 3.46: N, 8.40: S, 9.66.

BEISPIEL 10

5-Amino-2-thioxo-3-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin- 7(6H)-on (16)

Zu einer Lösung aus 15 (1,25 g, 1,94 mmol) in trockenem Methanol (100 ml) wurde Natriummethoxidpulver zugegeben bis der pH 10 erreichte. Die Lösung wurde über Nacht gerührt und dann mit Dowex H&spplus; Harz neutralisiert und filtriert. Nach Eindampfung des Filtrates wurde der Rückstand mit Ether gewaschen, um Methylbenzoat zu entfernen und das rohe Material wurde aus Wasser kristallisiert: Ausbeute 520 mg, 81%: Fp 220ºC Zers.: UV λmax ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6.48 (d, J= 3.00 Hz; 1H, C&sub1;, H), 6.99 (s, 2H, NH&sub2;), 11.47 (s, 1H, NH) und anderen Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S&sub2;·H&sub2;O: C, z34.28: H, 4.03: N, 15.99: S, 18.30. Gefunden: C, 33.99: H, 3.92: N, 15.68: S, 18.22.

BEISPIEL 11

5-Amino-7-chlor-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (17)

Trockenes, gereinigtes 6 (10 g, 16 mmol) wurde in trockenem Methylenchlorid (350 ml) aufgelöst und eine Lösung aus frisch destilliertem Thionylchlorid (40 ml), trockenem DMF (20 ml) in trockenem Methylenchlorid tropfenweise über 2 h zugegeben und die Reaktion wurde für 16 h bei 60ºC (Rückfluß) gehalten. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig in eine Eis- und NaHCO&sub3;-Lösung gegossen und für 30 Minuten gerührt. Die Schichten wurden separiert und die wäßrige Schicht mit Methylenchlorid (2·150 ml) extrahiert und die vereinigten Schichten über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo eingedampft. Der zurückbleibende Sirup wurde durch Geben über eine Kieselgelsäule (4·40 cm) gereinigt und mit CHCl&sub3;-Aceton (4 : 1) eluiert, um die Chlorverbindung als einen weißen Schaum zu erhalten, 8,6 g, 84%: Fp 88-90ºC: Anal. berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub3;C&sub1;N&sub4;O&sub8;S: C, 57.54: H, 3.58; Cl, 5.47: N, 8.66: S, 4.96. Gefunden: C, 58.06: H, 3.99: Cl, 5.95: N, 9.41: S, 4.75.

BEISPIEL 12

5-Amino-7(6H)-thioxo-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (18)

Verfahren 1

Eine Mischung von 17 (3,3 g, 5 mmol), Thioharnstoff (0,719 g, 1 mmol) und EtOH (100 ml) wurde für 6 Tage unter Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde mit CHCl&sub3; (200 ml) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde in vacuo bis zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde über Kieselgelsäulenchromatographie mit CHCl&sub3;-Aceton (7 : 1) als dem Elutionsmittel gereinigt. Nach Eindampfung wurde der Rückstand aus Ethanol kristallisiert, um ein farbloses Pulver zu ergeben: Ausbeute 1,9 g, 58%: Fp 227-229ºC: UV λmax (pH 1) 234 nm (&epsi; 26000), 280 sh (9000), 365 (11800): UV λmax (pH 11) 230 nm (&epsi; 40500), 267 (8700), 327 (14100): Anal. berechn. für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub8;S&sub2;: C, 57.75: H, 3.75: N, 8.69: S, 9.95. Gefunden: C, 57.79: H, 3.79: N, 8.69: S, 9.98.

Verfahren 2

Zu einer Lösung aus 6 (1 g, 1,6 mmol) in Pyridin (50 ml) wurde unter Rühren P&sub2;S&sub5; (1,5 g, 6,2 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde vorsichtig für 29 h unter Rückfluß gekocht (Badtemperatur 130-140). Die Reaktionsmischung wurde in vacuo bis zur Trockene eingedampft. Das überschüssige P&sub2;S&sub5; wurde durch Zugabe von Wasser (200 ml) bei 60ºC zersetzt. Die Mischung wurde für 1 h gerührt, dann bei Zimmertemperatur über Nacht gelassen. Der resultierende Festkörper wurde filtriert, aufgelöst in CHCl&sub3;, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenchromatographie mit CHCl&sub3;-Aceton 7 : 1 als dem Elutionsmittel gereinigt. Nach Konzentration wurde der Rückstand aus EtOH kristallisiert und gab 18 (0,43 g, 43%). Die physikochemischen Eigenschaften von Verbindung 18, hergestellt nach Verfahren 2, wurden hinsichtlich zu denen, der nach obigem Verfahren 1 hergestellten Verbindung, als identisch gefunden.

BEISPIEL 13

5-Amino-7(6H)-thioxo-3-β-D-ribofuranoxylthiazol[4,5- d]pyrimidin-2-on (19)

Verfahren 1

Eine Lösung von 18 (1 g, 1,6 mmol) in Methanol (50 ml) wurde mit NaOCH&sub3; auf pH 9 eingestellt und für 16 h bei Zimmertemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde mit Ether (2·75 ml) zerrieben. Der Ether-unlösliche Festkörper wurde in Wasser aufgelöst (15 ml) und mit Essigsäure angesäuert, worauf das Rohprodukt präzipitiert wurde. Umkristallisation dieses Materials aus EtOH-H&sub2;O gab farblose Prismen: Ausbeute 0,47 g, 87%: Fp 185-187ºC: UV λmax (pH 1) 214 nm (&epsi; 2700), 230 sh (14000), 263 (6700), 354 () : UV λmax (pH 7) 213 nm (Ω 25900) 247 (9100), 266 sh (7700), 334 (12100), 353 (11800): UV λmax (pH 11) 247 nm (&epsi; 12300), 266 sh (8800), 327 (16100): ¹H NMR (DMSO- d&sub6;) 55.76 (d, J = 5.32 Hz, C&sub1;,H), 7.22 (s, 2H, NH&sub2;), 12.41 (s, 1H, NH) und andere Zuckerprotonen. Anal. berechnet für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S&sub2;·H&sub2;O: C, 34.28: H, 4.03: N, 15.99: S, 18.30. Gefunden C, 34.28: H, 3.99: N, 16.24: S, 18.51.

Verfahren 2

Eine Lösung von 18 (1,0 g, 1,6 mmol) in methanolischem Ammoniak (gesättigt bei 0ºC, 60 ml) wurde für 48 h bei Zimmertemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde mit kochendem Benzol (2·100 ml) verrieben. Der Benzol-unlösliche Festkörper wurde aus EtOH-H&sub2;O kristallisiert, um 19 (0,36 g, 67%) zu ergeben. Die Verbindung, hergestellt nach diesem Verfahren, war identisch zu Verbindung 19, hergestellt nach obigem Verfahren 1, beurteilt durch die spektralen physikalischen Daten.

BEISPIEL 14

5-Amino-7-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)tetrazol[1,5- c]thiazol[4,5-dipyrimidin-2-on (20)

Zu einer Lösung von 12 (3,0 g, 4,6 mmol) in trockenem DMF (30 ml) wurde Natriumazid (0,3 g, 4,6 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde für 3 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Eindampfung des Lösungsmittels wurde der Rückstand in EtOAc (250 ml) aufgelöst und mit Wasser (2·50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der resultierende Schaum wurde über Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3;-Aceton 7 : 1 gereinigt. Das Produkt wurde aus EtOH kristallisiert, um ein weißes Pulver zu geben: Ausbeute 2,0 g, 67%: Fp 112-114ºC: IR zeigte in der Region von 2100 bis 2200 cm&supmin;¹ keine Azidbande: UV λmax (MeOH). Anal. berechn. für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub3;N&sub7;O&sub8;S: C, 56.96: H, 3.55: N, 15.00: S, 4.91. Gefunden: C, 57.19: H, 3.88: N, 15.26: S, 4.75.

BEISPIEL 15

2,5,7-Trichlorthiazol[4,5-d]pyrimidin (22)

Eine Mischung aus 2-Chlorthiazol[4,5-d]pyrimidin-5,7- (4H,6H)-dion (21, 15,8 g, 78 mmol), POCl&sub3; (220 ml) und N,N- Dimethylanilin (12,3 g, 0,1 mmol) wurde für 3 h unter Rückfluß gekocht. Das überschüssige POCl&sub3; wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand wurde unter Rühren in Eiswasser (500 ml) gegossen. Die resultierende wäßrige Lösung wurde mit CHCl&sub3; (3·400 ml) extrahiert und die organische Schicht wurde mit Wasser (2·400 ml), 0,1 N NaOH (2·300 ml) und Wasser (2· 400 ml) sukzessive gewaschen und dann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Abdampfung des Chloroforms erzeugte einen Rückstand, der über Kieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung von CHCl&sub3; gereinigt wurde, um die Titelverbindung (22) nach Kristallisation aus EtOH zu liefern. Ausbeute 13,8 g, 74%: Fp 121-122ºC: UV λmax (pH 1,7,11) 296 nm (&epsi; 10800) . Anal. berechn. für C&sub5;Cl&sub3;N&sub3;S: C, 24.97: Cl 44.22: N, 17.48. Gefunden: C, 25.02: Cl, 44.39: N, 17.37.

BEISPIEL 16

5,7-Dichlorthiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (24)

Eine Suspension der Trichlorverbindung (22 : 3,0 g, 12 mmol) in 1N NaOH (35 ml) wurde bei 60ºC für 1 Stunde erhitzt. Die Lösung wurde mit entfärbender Kohle behandelt und dann mit 10% wäßriger HCl angesäuert. Das erhaltene Präzipitat wurde gesammelt und aus verdünnter Base mit Eisessig repräzipitiert, um 24 als orangene Nadeln (1.38 g, 50%) zu liefern:- Fp 191- 192ºC: UV λmax (pH 1) 254 nm (&epsi; 5300), 290 (11400): UV λmax (pH 7,11) 226 nm (&epsi; 28900), 300 (14100). Anal. berechn. für C&sub5;HCl&sub2;N&sub3;OS: C, 27.04: H, 0.45: Cl, 31.93: N, 18.93. Gefunden: C, 26.78: H,- 0.61: Cl, 32.15: N, 18.66. Einkristall- Röntgenstrukturanalyse von 24 zeigte die Strukturzuweisung als korrekt an.

BEISPIEL 17

5,7-Dichlor-3-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (26)

Eine fein gepulverte Mischung von 24 (3,7 g, 16 mmol), 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-D-ribofuranose (5.3 g, 16 mmol) und Bis- (p-nitrophenyl)phosphat (20 mg) wurde bei 170ºC für 10 min unter vermindertem Druck erhitzt. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde die braune, feste Masse in EtOAc aufgelöst (500 ml) und mit einer gesättigten, wäßrigen Natriumbicarbonatlösung (3·300 ml) gewaschen. Die getrocknete (Na&sub2;SO&sub4;) organische Schicht wurde eingedampft, um einen Sirup zu ergeben, der über Kieselgelsäulenchromatograhie (4·40 cm) unter Verwendung von Toluol-EtOAc (5 : 1) gereinigt wurde. Der resultierende Sirup wurde aus Ethanol kristallisiert, um ein farbloses Pulver zu ergeben: Ausbeute 6,4 g, 80%: Fp 125-126ºC: ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ1.99, 2% 06, 2.08 (3s, 9H, Acetyl), 6.07, (d, J = 3.40 Hz, 1H, C1, H, und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub5;Cl&sub2;N&sub3;O&sub8;S: C, 40.01: H, 3.15: Cl, 14.76: N, 8.75: S, 6.68. Gefunden: C, 40.20: H, 3.31: Cl, 14.79: N, 8.61: S, 6.66.

BEISPIEL 18

7-Amino-2-chlorthiazol[4,5-d]pyrimidin (28)

Zu einer Suspension aus 2,7-Diaminothiazol[4,5-d]pyrimidin (27 : 16,3 g, 97,3 mmol) in Wasser (200 ml) wurde bei 55ºC genügend 1N NaOH (ungefähr 100 ml) zugegeben, um das Ausgangsmaterial aufzulösen und dann wurde Natriumnitrit (8,0 g) zugegeben.,Diese Lösung wurde dann bei 30ºC tropfenweise über 30 min zu einer Lösung, die kon HCl (400 ml), Wasser (100 ml) und LiCl (60 g) enthält, zugegeben. Die resultierende Mischung wurde auf 45ºC für 15 min erwärmt und dann wurde heißes Wasser (1 l, 90º) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, gefiltert, um nicht umgesetztes Ausgangsmaterial zu entfernen und das Filtrat wurde mit fester NaOH auf pH 4 neutralisiert. Der resultierende Festkörper wurde rausgefiltert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 28 zu ergeben: 5,38 g, 34%: Umkristallisation aus Wasser ergab eine analytische Probe: Fp > 234ºC Zers.: UV λmax (pH 1) 228 nm (&epsi;), 296 () : UV λmax (pH 7) 232 nm (&epsi;), 298 (): UV λmax (pH 11) 227 nm (&epsi;), 300 () : ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 7.82 (b, 2H, NH&sub2;, tauscht aus mit D&sub2;O), 8.41 (s, 1H, C&sub5;H). Anal. berechn. für C&sub5;H&sub3;N&sub4;SCl·0·1H&sub2;O: C, 31.87: H, 1.71: N, 29.74: S, 17.02: Cl, 18.82. Gefunden: C, 31.71: H, 1.50: N, 29.35: S, 16.92: Cl, 19.54.

BEISPIEL 19

7-Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-thion (29)

Eine Suspension von Verbindung 28 (1,11 g, 5,9 mmol) in trockenem DMF (10 ml) wurde in einem Eisbad auf 0ºC gekühlt und NaSHxH&sub2;O (0,87 g, 11,8 mmol) wurde zugegeben. Die resultierende, klare Lösung wurde über Nacht bei 0ºC gerührt und dann für 2 h bei Zimmertemperatur. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis gegossen (300 ml) und der pH auf 3-4 mit Eisessig eingestellt. Das feste Präzipitat wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, um 0,96 g (88%) zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Kristallisation aus DMF-Wasser hergestellt: Fp > 370ºC: UV λmax (pH 1) 248 nm (&epsi;), 263 (), 345 () : UV λmax (pH 7, 11) 228 nm (&epsi;), 258 (), 329 () : ¹NMR (DMSO-d&sub6;) δ 7.57 (b, 1H, NH&sub2;, tauscht aus mit D&sub2;O), 8.23 (s, 1H, C&sub5;H), 14.13 (b, 1H, N&sub3;H, tauscht aus mit D&sub2;O). Anal. berechn. für C&sub5;H&sub4;N&sub4;S&sub2;: C, 32.60: H, 2.19: N, 30.41: S, 34.81. Gefunden: C, 32.97: H, 2.13: N, 30.29: S, 34.59.

BEISPIEL 20

7-Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin-2(3H)-on (30)

Zu einer Suspension aus 29 (770 mg, 4,2 mmol) in Wasser (30 ml) wurde IN NaOH (4,2 ml) und 30% H&sub2;O&sub2; (1,0 ml) zugegeben, und die Reaktion wurde für 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Weiteres Peroxid (2,0 ml) und Hydroxid (5,0 ml) wurde zugegeben, und die Mischung wurde für 1 h bei 70ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit Eisessig neutralisiert. Das resultierende Präzipitat wurde, während es noch heiß war, herausgefiltert, mit kaltem Wasser gewaschen und getrocknet, um 0,52 g (74%) zu ergeben: Fp > 370ºC: UV λmax (pH 1) 267 nm (&epsi;), 289 () : UV λmax (pH 7, 11) 285 nm (e) : ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 7.18 (b, 2H, NH&sub2;, tauscht aus mit D&sub2;O). 8.12 (s, 1H, C&sub5;H), 12.30 (b, 1H, N&sub3;H, tauscht aus mit D&sub2;O). Anal. berechn. für C&sub5;H&sub4;N&sub4;OS: C, 35.71: H, 2.40: N, 33.31: S, 19.07. Gefunden: C, 35.50: H, 2.36: N, 33.13: S, 18.79.

BEISPIEL 21

7-Amino-4-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5- d]pyrimidin-2-on (31)

Verbindung 30 (460 mg, 2,7 mmol) wurde auf die-gleiche Weise, wie die, verwendet um 6 herzustellen, glycosyliert, benötigend HMDS (30 ml) Benzoyl-geblockter Zucker (5 : 1,5 g, 3,0 mmol) und TMS-Trifluormethansulfonsäure (0,76 ml, 3,9 mmol). Der Reaktionsmischung wurde gestattet über Nacht bei Zimmertemperatur zu rühren und wurde dann aufgearbeitet, wie für 6 beschrieben, um 1,6 g (95%) von 31, isoliert als einen Schaum, zu ergeben: UV λmax (MeOH) 230 nm (&epsi;), 310 (): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6.45 (d, J = 2.73 Hz, 1H, C&sub1;,H), 7.4-8,0 (m, 15H, Benzoyl Aromaten, 8.59 (s, 1H, C&sub5;H), und andere Zuckerprotonen C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub8;S: C, 60.78: H, 3.95: N, 9.15: S, 5.23. Gefunden:

BEISPIEL 22

7-Amino-3-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)thiazol[4,5- d]pyrimidin-2-on (32)

Verbindung 30 (1,22 g, 7.25 mmol) wurde glycosyliert, wie für die Herstellung von 6 beschrieben, benötigend HMDS (35 ml), Benzoyl-blockierter Zucker (5 : 4,4 g, 8,7 mmol) und TMS- Trifluormethansulfonsäure (2,0 ml, 10,3 mmol). Nach Rühren über Nacht bei Zimmertemperatur wurde die Reaktionsmischung unter Rückfluß für 2 Tage gekocht und dann in der gewohnten Art aufgearbeitet. Die rohe Mischung wurde einer Blitzkieselgelsäulenchromatographie unter Verwendung eines Gradienten von Methylenchlorid zu Methylenchlorid-Aceton 10 : 1 (V/V) unterworfen und ergab zwei Produkte. Von dem ersten, das von der Säule eluiert, wurde aufgrund des ¹H NMR angenommen, ein Bis-Glycosid zu sein mit einer Menge von 660 mg. Das zweite und Hauptprodukt von der Säule wurde als ein Schaum erhalten und durch UV und ¹H NMR als das gewünschte 3-Ribosylisomer bestimmt: Ausbeute 1,04 g (24%). UV λmax (EtOH) 232 nm (&epsi;), 283 () : ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 6.34 (t, 1H, C&sub1;,H), 7.39-7.98 (m, 17H, Benzoyl Aromaten und NH&sub2;, 8.19 (s, 1H, C&sub5;H) und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C, 60.78: H, 3.95: N, 9.15: S, 5.23. Gefunden: 3.93: N, 8.13: S, 4.85.

BEISPIEL 23

=7-Amino-4-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (33)

Verbindung 31 (310 mg, 0,51 mmol) wurde in trockenem Methanol aufgelöst (35 ml) und auf 5ºC gekühlt. Zu dieser Lösung wurde festes Natriummethoxid (82 mg, 1,5 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde für 5 h bei Zimmertemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit Dowex-50 H&spplus;-Harz neutralisiert, gefiltert und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylether verrieben und dann aus wäßrigem Ethanol umkristallisiert, um farblose Nadeln zu ergeben: 120 mg, 80%: Fp 132-134ºC: UV λmax (pH 1) 227 nm (&epsi; 17230), 301 (15750): UV λmax (pH 7, 11) 233 nm (&epsi; 22300), 305 (19100): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.96 (d, J = 3.51 Hz, 1H, C&sub1;,H), 7.75 (b, 2H, NH&sub2;), und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S·O·2H&sub2;O: C, 35.71: 9.53. Gefunden: C, 35.45: H, 4.88: N, 16.44: S, 9.50.

BEISPIEL 24

7-Amino-3-β-D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2-on (34)

Verbindung 32 (0,76 g, 1,2 mmol) wurde in der gleichen Art, wie oben für 31 beschrieben, unter Verwendung von Natriummethoxid (200 mg, 3,7 mmol) in trockenem MeOH (50 ml) deblockiert. Die Titelverbindung (34) wurde nach Kristallisation aus Wasser erhalten (0,12, 32%): Fp 248-250ºC: UV λmax (pH 1), 222 nm (&epsi; 35100), 265 (14300), 290 (11400): UV λmax (pH 7, 11) 215 nm (&epsi; 45000), 262 (13200): ¹H NMR (DMSO-d&sub6;) δ 5.91 (d, J = 5.43 Hz, 1H, Q,H), 7.44 (b, 1H, NH&sub2;), 8.22 (s, 1H, C&sub5;H), und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S: C, 40.00: H, 4.03: N, 18.66: S, 10.68. Gefunden: C, 39.80: H, 3.99: N, 18.39: S, 10.57.

BEISPIEL 25

5-Amino-3-(2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-β-D- erythropentofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion (35)

5-Aminothiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion (4,3 g, 23,3 mmol) wurde mit Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (13,6 ml, 73,4 mmol) in Hexamethyldisilazan (70 ml) gemischt, und die Mischung wurde für 3 h unter Rückfluß gekocht, wonach das überschüssige Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt wurde. Die resultierende, feste Masse wurde mit 1-Chlor-2-deoxy-3,5-di-O- (p-toluoyl)-α-D-erythro-pentofuranose (11,8 g, 73 mmol) gemischt, und die Mischung wurde für 30 Minuten bei 110ºC geschmolzen. Das resultierende Produkt wurde in EtOAc (400 ml) aufgelöst und in eine gerührte wäßrige 5% NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Die organische Phase wurde isoliert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und über Blitzsäulenchromatographie (Dichlormethan/Aceton, 4 : 1 als Elutionsmittel) gereinigt, um 1,7 g (14%) einer Mischung von α- und β-Isomeren zu ergeben; Fp 268-270ºC; UV λmax (pH 1) 243, 300 nm; UV λmax (pH 7) 243, 302 nm; UV λmax (pH 11) 243, 284 nm; ¹H NMR (Me&sub2;SO-d6) δ 6,37 (t,1,C&sub1;'H) 7.0 (bs, 2, NH&sub2;, ausgetauscht mit D&sub2;O) 7.2 und 7.9 (m, 5, CH&sub3;C&sub6;H&sub5;) 11.35 (bs, 1, N&sub6;H, ausgetauscht mit D&sub2;O) und anderen Zuckerprotonen. NMR scheint nur ein Isomer anzuzeigen.

BEISPIEL 26

5-Amino-3-(2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl)thiazol[4,5- d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (36)

Natriummethoxid (120 mg, 2,2 mmol) wurde zu einer Lösung aus 5-Amino-3-(2-deoxy-3,5-di-O-(p-toluoyl)-β-D- erythropentofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion (35; 0,465 g, 0,87 mmol) in wasserfreiem Methanol (100 ml) zugegeben und die resultierende Lösung für 8 h bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit Dowex 50W-X8 Harz (H&spplus;-Form) neutralisiert, gefiltert und zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit wasserfreiem Ether behandelt (35 ml). Nach Verreibung wurde die Suspension dekantiert, um ein trockenes Pulver zu ergeben, das aus Ethanol (Aktivkohlebehandlung, Norit A) kristallisiert wurde. Nach Abfiltern des ursprünglichen Präzipitats konnten 110 mg (42%) des β-Isomers durch fraktionierte Kristallisation unter Verwendung von Ethanol zurückgewonnen werden. FP > 170ºC (scinters), UV ¹H NMR (Me&sub2;SO- d&sub6;) σ 4.68 (t, 1, J = 5.7 Hz, C&sub3;,OH, ausgetauscht mit D&sub2;O), 5.20 (d, 1, J = 3.9 Hz, C&sub5;,OH, ausgetauscht mit D&sub2;O), 6.24 (t, 1, J = 7.2 Hz, C&sub1;'H), 6.94 (bs, 2, NH&sub2;, ausgetauscht mit D&sub2;O), 11.23 (bs, 1, N&sub6;H, ausgetauscht mit D&sub2;O); Anal. berechn. für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub5;S: C, 40.00: H, 4.03; N, 18.66; S, 10.68; Gefunden: C, 40.27; H. 3.92; N, 18.75; S, 10.42.

BEISPIEL 27

5-Amino-3-(β-D-xylofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2.7- (3H,6H)-dion (38)

Die Titelverbindung wird durch Glycosylierung von 4 hergestellt, genau wie oben für die Synthese von 6 beschrieben, ausgenommen, daß 1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-D-xylofuranose verwendet werden muß. Das rohe Acetyl-blockierte Nukleosid (37) wird dann unter Verwendung von Natriummethoxid, wie für die Präparation von 7 beschrieben, deprotektiert und ergibt 38 als einen amorphen Festkörper.

BEISPIEL 28

5-Amino-3-(2,3,5-tri-O-benzyl-β-D-arabinofuranosyl)thiazol[4,5- d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (39)

Das benzyl-geschützte Titel-Nukleosid wird auf die gleiche Art hergestellt, wie das für 35 beschrieben, ausgenommen, daß der zu verwendende Zucker 1-Chlor-2,3,5-tri-O-benzyl-α-D- arabinofuranose aus dem korrespondierenden 1-O-(p- Nitrobenzoyl)-Zucker unter Verwendung von trockenem Chlorwasserstoffgas in Dichlormethan bei 0ºC erzeugt wird. Die Anomerenmischung wird über Blitzkieselgelsäulenchromatographie getrennt, um 39 und sein α Anomer als trockenen Schaum zu ergeben.

BEISPIEL 29

5-Amino-3-(β-D-arabinofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(3H,6H)-dion (40)

Verbindung 39 wird in trockenem Dichlormethan aufgelöst und bei -78ºC unter Verwendung eines Überschusses von Bortrichlorid (1M in Dichlormethan) deprotektiert und gestattet für 2 h bis -40ºC aufzuwärmen, bevor mit Methanol gelöscht wird. Der Rückstand wird nach Aufarbeitung aus Wasser kristallisiert, um 40 als eine farblose, kristalline Festsubstanz zu ergeben.

BEISPIEL 30

5-Amino-3-(2,3,5-tri-O-acetyl-β-D-ribofuranosyl)tiazol[4,5- d]pyrimidin-2,7(3H,6H)-dion (41)

Verbindung 4 (10 g, 54,4 mmol) wurde, genau wie für die Synthese von 6 beschrieben, glycosyliert, ausgenommen, daß der Zucker, der in diesem Fall verwendet wurde, 1,2,3,5-Tetra-O- acetyl-D-ribofuranose (20,7 g, 65,1 mmol) war. Nach der üblichen Aufarbeitung des rohen Restes wurde eine Blitzchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 10% Methanol in Dichlormethan durchgeführt. Ausbeute des reinen Materials 7,1 g (29%), als ein trockener Schaum oder ein amorpher Festkörper.

BEISPIEL 31

5-Amino-3-(2,3-di-O-isopropyliden-β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion (42)

Zu einer eiskalten Suspension aus 5-Amino-3-(β-D- ribofuranosyl)thiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7-dion (7; 1.86 g, 6 mmol) in einer Mischung aus Aceton (100 ml) und Dimethoxypropan (150 ml) wurde Perchlorsäure (1,0 ml) tropfenweise zugegeben und die resultierende Mischung bei 0ºC für 30 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Kalten mit 1N Natriumhydroxid auf pH 7 neutralisiert. Die resultierende Lösung wurde in vacuo konzentriert und der Rückstand über Kieselgel mit 10% Aceton in Chloroform als Elutionsmittel blitzchromatographiert, um die Titelverbindung als einen amorphen Festkörper zu ergeben. (1,7 g, 80%). ¹H NMR (DMSO d&sub6;, 300 MHz) : δ 1.28, 1.47 (2s, 6H, Isopropyliden Methyl), 6.0 (d, 1H, C&sub1;H), 7.0 (bs, 2H, NH&sub2;), 11.29 (s, 1H, NH) und andere Zuckerprotonen. Anal. berechn. für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub6;N&sub4;SO&sub6;: C, 43.82; H, 4.53; N, 15.72; S, 9.00. Gefunden: C, 43.65; H, 4.48; N, 15.41; S, 8.94.
SCHEMA I
SCHEMA II
SCHEMA III
SCHEMA IV
SCHEMA V
SCHEMA VI
Natürliche Killerzellen sind impliziert worden, eine Verteidigung gegen virale Infektionen und maligne Zellen bereitzustellen. Anomalien in der Aktivität von natürlichen Killerzellen können so bei der Entwicklung von Krankheiten resultieren. Biologische Immunmodulatoren können bestimmte fehlerhafte Immunfunktionen wiederherstellen oder korrigieren. Kürzlich wurde gezeigt, daß Interleukin-2 bei Tumorpatienten ein immuntherapeutisches Potential besitzt. Interleukin-2 und andere bekannte Immunpotentiatoren sind allgemein Proteine in natura und können nach ihrer Anwendung schwere Nebenwirkungen verursachen. Nichttoxische, niedrigmolekulare, synthetische Verbindungen, welche keine Proteine sind, können empfohlen werden, um die Nebenwirkungen bekannter proteinischer immunotherapeutischer Potentiatoren zu vermeiden.

BEISPIEL 32 - In vitro induzierte Potenzierung von natürlicher Killerzellaktivität

Die nichtproteinischen Nukleosid- und Nukleotid- Verbindungen der Erfindung haben eine verstärkte natürliche Killerzellaktivität gezeigt. In diesem Beispiel wird die natürliche Killerzellaktivität bei Mäusen demonstriert.
Milzzellen aus CBA/CaJ oder C57BL/6J-Mäusen wurden für 20 bis 44 Stunden mit Verbindung 7 in einer Konzentration von 0,05 mM bei 37ºC in einer angefeuchteten 5% CO&sub2; Atmosphäre, wie beschrieben in Djeu, J-Y, Heinbaugh, J. A., Holden, H. T., Herberman R. B.: Journal Immunoloay 122 : 175, 1979 und Gonzales, H., Karriger, K., Sharma, B., Vaziri, H.: Federal Procedures 42 : 1195, 1983, kultiviert. Nach Inkubation wurde die Zytotoxizität von behandelten und unbehandelten Zellen gegen YAC-1-Zellen bestimmt. Bei Durchführung dieser Tests wurden gleichzeitig mit Verbindung 7 eine Nicht-Medikamenten-Kontrolle und eine Kontrolle unter Verwendung von Poly I:C durchgeführt. Tabelle 1 In vitro-induzierte Potenzierung von natürlicher Killerzellaktivitäta Effektorzellen % Natürliche Killerzellzytotoxität aus: Behandlung mit Behandlung Zeit (Stunde) keine Verbindung 7 Poly I : C
a Milzzellen aus Mäusen wurden mit Verbindung 7 in einer Konzentration von 0,05 mM in RPM1-1640 Medium, welches 10% FKS, 0,1 mM nichtessentielle Aminosäuren und 5·10&supmin;&sup5;M Mercaptoethanol enthält, behandelt. Die Effektorenzellen wurden dann in einem 4 h &sup5;¹Cr Freisetzungstest auf ihre zytotoxische Aktivität gegen YAC-1 Targetzellen getestet.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, verstärkte eine Inkubation für 20 Stunden mit Verbindung 7 die natürliche Killerzellzytotoxizität von 4, 8, 1,5 und 1,6% der unbehandelten Kontrolle auf jeweils 34, 62, 35 und 25%. Eine ähnliche Behandlung für 44 Stunden erzeugte auch eine klare Steigerung in der natürlichen Killerzellaktivität. Unter Verwendung von Poly I:C, welches ein bekannter Potentiator von natürlichen Killerzellen ist, als einer weiteren Kontrolle zeigte Verbindung 7, verglichen mit Poly I:C, eine verstärkte Aktivität. Die Ergebnisse in Tabelle 1 demonstrieren, daß Verbindung 7 deutlich eine große Steigerung bei der natürlichen Killerzellaktivität der Maus induzieren.

BEISPIEL 33 - In vitro Verstärkung von humaner natürlicher Killerzellenaktivität

Die natürliche Killerzellaktivität in humanen Zellen wurde auch gemessen. Zum Durchführen dieser Tests wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) über einen Ficoll-Hypaque- Gradienten isoliert, dreimal in Hanks gewaschen und in RPMI- 1640, welches 10% humanes AB-Serum enthält, resuspendiert, wie beschrieben in Rosenberg, S. A.: Journal American Medical Association, 256 : 3117, 1986 und die oben aufgeführte Referenz von Djeu et al. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von elf verschiedenen Spendern wurden mit Verbindung 7 behandelt, wie in Djeu et al. als auch in Sharma, B., Odom, L. F.: Cancer Immunol. Immunother. 7 : 93, 1979 und Sharma, B., Odom, L. F.: Cancer Research 44 : 3258, 1984 beschrieben.
Die PBMNC-Zellen wurden für 20 bis 68 Stunden mit Verbindung 7 bei 37ºC in einer feuchten 5% CO&sub2; Atmosphäre inkubiert, und nach der Inkubation wurde die Zytoxizität gegen K562 Tumorzellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2a und 2b gezeigt. Tabelle 2a In vitro Verstärkung der humanen natürlichen Killerzellaktivitäta Spender % natürliche Killerzellzytoxizität - Verbindung 7 + Verbindung 7
a Periphere mononukleäre Blutzellen wurden für 20 bis 68 Stunden mit Verbindung 7 in Konzentrationen von 0,05 - 0,4 mM in RPM1-1640, welches 10% humanes AB-Serum enthält, behandelt. Nach der Behandlung wurden die Effektorzellen gegen K562 Targetzellen in einem 4 Stunden - &sup5;¹Cr Freisetzungstest getestet, wie schon oben in Sharme et al. beschrieben. Die hier gezeigten Daten repräsentieren die maximale Antwort. Tabelle 2b In vitro Verstärkung von humaner natürlicher Killerzellaktivitäta Natürliche Killerzellzytotoxizität Exp. Spender 1 Spender 2 # -Verbindung 7 +Verbindung
a Periphere mononukleäre Blutzellen wurden für 20 bis 68 Stunden mit Verbindung 7 in Konzentrationen von 0,05-0,4 mM in RPM1-1640 Medium, welches 10% AB-Serum enthält, behandelt. Nach der Behandlung wurden die Effektorzellen gegen K562 Targetzellen in einem 4 Stunden- &sup5;¹Cr-Release Assay getestet, wie vorher oben in Sharma et al. beschrieben. Die Daten repräsentieren die maximale Antwort.
Wie aus Tabelle 2a ersichtlich ist, hatten die PBMC von 11 Donoren eine mittlere natürliche Killerzellzytotoxizitätaktivität von 11,7%. Die PBMNC der gleichen Spender, welche mit Verbindung 7 vorbehandelt wurden, zeigten eine mittlere natürliche Killerzellzytotoxizität von 32,2%. Während es eine gewisse Variabilität zwischen den elf Spendern gibt, zeigten acht der Spender eine Potenzierung in der natürlichen Killerzellzytotoxizität von über 100%. In den vier anderen Fällen erzeugte die Behandlung mit Verbindung 7 in vitro eine deutliche Steigerung in der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität.
Wie in Tabelle 2b zu sehen ist, bewirkte Verbindung 7 übereinstimmend auch eine Potenzierung von humanen natürlichen Killerzellen. Bei dem ersten Spender wurden acht einzelne Tests durchgeführt und eine Steigerung in der vermittelten Potenzierung wurde in acht der acht Tests gesehen. Bei dem zweiten Spender wurde eine Steigerung in sechs von sechs Tests gesehen. Wie aus den Tabellen 2a und 2b ersichtlich ist, induzierte Verbindung 7 signifikant höhere Levels an natürlicher Killerzellaktivität in humanen Zellen.
In weiteren Reproduzierbarkeitstesten wurde Verbindung 7, wie in Tabelle 2c gezeigt ist, auf Reproduzierbarkeit bei der Zunahme der natürlichen Killerzellaktivität und weiter, wie in Tabelle 2d gezeigt ist, auf die Reproduzierbarkeit der humanen natürlichen Killerzellaktivität getestet. Tabelle 2c Reproduzierbarkeit der durch Verbindung 7 induzierten Steigerung in der natürlichen Killerzellaktivität % Steigerung in der natürlichen Killerzellaktivität Exp. Spender Tabelle 2d Wirkung von Verbindung 7 auf humane natürliche Killerzellaktivität Spender % Steigerung bei induzierter natürlicher Killerzellaktivität

BEISPIEL 34 - In vivo Potenzierung von natürlicher Killerzellaktivität in Mäusen

Verbindung 7 wurde weiterhin auf Potenzierung der natürlichen Killerzellaktivität in vivo bei Mäusen studiert. CBA/CaJ-Mäuse wurden mit Verbindung 7 durch Injizieren von 1,68 mg von Verbindung 7 pro 0,5 ml pro Maus behandelt. 1, 2, 3 und 4 Tage nach der Behandlung wurden die Milzen der Mäuse geerntet und die zytotoxische Aktivität der Milzzellen wurde gegen YAC-1 Tumortargetzellen in dem oben erwähnten &sup5;¹Cr- Freisetzungstest, wie in Beispiel 32 ermittelt, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 3, 4, 5 und 6 gezeigt. Tabelle 3 Natürliche Killerzellaktivität in CBA/CaJ-Mäusena Mäuse Behandlung mit Tage n. d. Behandlung % Natürliche Killerzytotoxizität Effektor : Target Gruppe - 1 Saline Gruppe - 2 Verbindung Gruppe - 3 Verbindung Gruppe - 4 Verbindung Gruppe - 5 Verbindung
a Drei Mäuse wurden in jeder Gruppe mit Saline oder Verbindung 7 (1,68 mg/Maus) über den intraperitonealen Weg behandelt. Die Milzen wurden entnommen, die Zellen wurden isoliert und dann wurde ihre Zytotoxizität gegen YAC-1 Targetzellen bestimmt. Jeder Wert repräsentiert die mittlere zytotoxische Aktivität ±SD von drei Mäusen.
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, bewirkte eine einfache Injektion von Verbindung 7 mit 1,68 mg pro Maus eine nachhaltige Steigerung in der natürlichen Killerzellaktivität. Eine Maximalantwort eine 382% Steigerung wurde einen Tag nach der Behandlung erhalten. Mehr als die zweifache Steigerung wurde sogar nach vier Tagen mit Verbindung 7 beobachtet.

BEISPIEL 35 - Dosierungswirkungen auf die natürliche Killerzellaktivität in Mäusen

Tabelle 4 zeigt eine Dosisreaktions-Behandlung mit Verbindung 7. Tabelle 4 Dosierungswirkungen auf natürliche Killerzellaktivität in Mäusena Mäuse Behandlung mit % Natürliche Killerzytotoxizität Effektor : Target Gruppe - 1 Saline Gruppe - 2 Verbindung Gruppe - 3 Verbindung Gruppe - 4 Verbindung Gruppe - 5 Verbindung
a Drei Mäuse in jeder Gruppe wurden mit Saline oder Verbindung 7 über den i.p.-Weg behandelt. Die Milzen wurden entnommen, Zellen wurden isoliert und dann ihre Zytotoxizität gegen YAC-1- Targetzellen bestimmt. Jeder Wert repräsentiert eine mittlere ±SD zytotoxische Aktivität von drei Mäusen
Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, wurden-die Mäuse mit 0,84 mg bis 3,36 mg von Verbindung 7 pro Maus behandelt. Obwohl alle Dosen von Verbindung 7 eine deutliche Steigerung in der natürlichen Killerzellaktivität induzierten, wurde die maximale Verstärkung bei Mäusen gezeigt, die 3,36 mg von Verbindung 7 erhielten.

BEISPIEL 36 - Natürliche Killerzellaktivität in alten Mäusen

Von zwölf Wochen alten C57BL/6J-Mäusen ist gezeigt worden (Djeu et al. oben), eine geringe, spontane natürliche Killerzell-aktivität zu besitzen. Tabelle 5 zeigt die Wirkung der Steigerung der natürlichen Killerzellaktivität in alternden Mäusen (8 Monate alt). Für diesen Test wurde Verbindung 7 mit einer Dosis von 1,67 mg pro Maus und 3,34 mg pro Maus injiziert, und nach einem Tag wurde die natürliche Killerzellaktivität der Milzzellen bestimmt. Tabelle 5 Natürliche Killerzellaktivität in alten Mäusena Mäuse Behandlung mit % Natürliche Killerzellzytotoxizität Effektor : Target Gruppe - 1 (8 Mo. alt) Saline Gruppe - 2 (8 Mo. alt) Verbindung Gruppe - 3 (8 Mo. alt) Verbindung Gruppe - 4 (8 Wo. alt) Saline Gruppe - 5 (8 Wo. alt) Verbindung Gruppe - 6 (8 Wo. alt) Verbindung
a Drei Mäuse wurden in jeder Gruppe mit Saline oder Verbindung 7 über den i.p.-Weg behandelt. Die Milzen wurde nach der Behandlung entnommen, Zellen wurden isoliert und dann ihre Zytotoxizität gegen YAC-1-Targetzellen bestimmt. Jeder Wert repräsentiert die mittlere ±SD zytotoxische Aktivität von drei Mäusen.
Wie ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 eine Steigerung bei der natürlichen Killerzellaktivität, welche sich bei einem Effektor/Targetverhältnis von 50 : 1 zwischen 4%, unbehandelt, und 17%, behandelt, bewegt. Die Größe der Induktion der Steigerung war ähnlich zu der, gezeigt durch Verbindung 7 in acht Wochen alten Mäusen. Diese Nukleosidverbindung mit kleinem Molekulargewicht induzierte Steigerungen in der natürlichen Killerzellaktivität, die so groß sind, wie Steigerungen, verursacht durch Poly I:C, LPS, Pyran oder Interferon, wie oben von Djeu et al. berichtet worden ist.

BEISPIEL 37 - Natürliche Killerzellaktivität in Nackt/Nackt- Mäusen

Verbindung 7 konnte, wie in Tabelle 6 gezeigt ist, die natürliche Killerzellaktivität in T-Zell-defizienten (nackt/nackt) -Mäusen potenzieren. Tabelle 6 Natürliche Killerzellaktivität in Nackt/Nackt-Mäusena Mäuse nackt-nackt Behandlung mit % Natürliche Killerzellzytotoxizität Effektor : Target Gruppe - 1 Saline Gruppe - 2 Verbindung Gruppe - 3 Verbindung
a Drei Mäuse in jeder Gruppe erhielten Saline oder Verbindung 7 über den i.p.-Weg, die Milzen wurden einen Tag nach der Behandlung entnommen, Zellen wurden isoliert und dann ihre Zytotoxizität gegen YAC-1-Targetzellen bestimmt. Jeder Wert repräsentiert eine durchschnittliche ±SD zytotoxische Aktivität von drei Mäusen.
Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 eine effektive Steigerung, die bei beiden untersuchten Dosen über dem Zweifachen bezüglich einer Salinkontrolle lag.

BEISPIEL 38 - In vivo Potenzierung von zytotoxischen Immunfunktionen gegen Tumore

In Bear, H. D. Cancer Research 46 : 1805, 1986 ist gezeigt worden, daß Inokulation von Tumorzellen in Mäuse zu einem Tumorwachstum mit gleichzeitiger Induktion einer antigenspezifischen T-Zell-vermittelten Immunantwort führt. Bei diesen induzierten T-Zellen ist gezeigt worden, daß sie Tumorwachstum in vivo inhibieren und heilen und/oder die Lebensspanne von tumortragenden Mäusen verlängern. Andere haben weiterhin gezeigt, daß tumorspezifische T-Zell-vermittelte Immunantworten durch Immunmodulatoren potenziert werden können. Dieses ist in den oben referierten Referenzen von Bear als auch von Herberman, R. B.; Journal Biol. Resp. Modifiers 3 : 527, 1984, Cheever, M. A., Greenbert, P. D., Gillis, S., Fefer, A. In: A. Fefer und A. Goldstein (Herausgeber) Seite 127, New York, Raven Press, 1982 und Rosenbert, S. A., Journal Biol. Resp. Modifiers 3 : 501, 1984 gezeigt worden. Tabelle 7 In vivo Potenzierung von zytotoxischer Lymphozytenaktivität gegen Mastocytoma (P815) Tumorzellen folgend einer Injektion von Tumorzellen und Medikamenta Mäuse Inokulation mit Behandelt mit % Zytotoxizität Tage Saline Verbindung rekombinantem Interleukin-2
a In jeder Gruppe wurden 10 Mäuse mit 2·10&sup6; Tumorzellen inokuliert. Nach fünf Stunden wurde jeder Maus Saline oder eine Nukleosidverbindung 7-Lösung (2 mg pro Maus) verabreicht. An den Tagen 3, 5, 7 oder 9 wurden die Milzzellen isoliert und ihre Zytotoxizität gegen P815 Tumorzellen, wie bei Gonzales und Sharma beschrieben, bestimmt.
Verbindung 7 wurde untersucht, um zu bestimmen, ob sie die zytotoxische Lymphozytenantwort gegen Mastocytomatumorzellen steigern kann oder ob nicht. In dem Test wurden Mäuse mit Mastocytomazellen (P815) immunisiert und nach 5 Stunden wurde Verbindung 7 als eine Lösung in einer Dosis von 2 ml pro Maus gegeben. Weiterhin wurde rekombinantes Interleukin, gegeben mit 50 E pro Maus, als eine Kontrolle verwendet. Die Fähigkeiten von Milzzellen Tumorzellen zu töten wurde, folgend einer einfachen Injektion von entweder Verbindung 7 oder rekombinantem Interleukin-2, bestimmt.
Wie Tabelle 7 zeigt, zeigten Zellen von Mäusen, behandelt mit Verbindung 7, eine statistisch signifikante höhere Zytotoxizität als die Kontrollgruppe (p< 0.05). Ahnlich zeigten mit rekombinantem Interleukin-2 behandelte Mäuse eine höhere zytotoxische Aktivität, verglichen mit der Kontrollgruppe (p< 0.05). Die Aktivität von Verbindung 7 und rekombinantem Interleukin-2 war grundlegend die gleiche, zeigend, daß Verbindung 7 die zytotoxische Immunantwort gegen Tumorzellen in vivo potenzieren kann.

BEISPIEL 39 - In vitro Potenzierung der IgM Produktion in humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNC)

In diesem Beispiel wird die B-Zellpotenzierung durch Messen von Steigerungen der IgM Produktion gegen Staphylococcus Aureus Cowan (SAC) gemessen. PBMNC-Zellen wurden mit SAC in der Abwesenheit und in der Gegenwart von Verbindung 7 kultiviert. 7 und 10 Tage nach der Inkubation wurden die Überstände geerntet und mit einen ELISA, wie in Engvall, E.; Methods of Enzymology 70 : 419, 1980 beschrieben, auf das Vorhandensein von IgM beurteilt. Tabelle 8 Wirkung auf die in vitro IgM-Produktion von humanen peripheren mononukleären Blutzellen Exp. # Kultur Tag PBMNC alleine Verbindung PBMNc + Verbindung B-zellen alleine B-zellen Verbindung 7 B-zellen + Verbindung PBMNc alleine
a PBMNC oder angereicherte B-Zellen von normalen Spendern wurden alleine oder mit Staphylococcus Aureus Cowan (SAC) in der Abwesenheit und Gegenwart von Verbindung 7 kultiviert. Nach Inkubation wurden Überstände geerntet und mittels ELISA auf IgM kontrolliert.
Wie aus Tabelle 8 ersichtlich ist, produzierten SAC aktivierte PBMNC IgM in den 7- und 10-Tage-Kulturen. Die SAC- aktivierten PBMNC-Kulturen, die Verbindung 7 beinhalteten, zeigten jedoch einen signifikant höheren Level an IgM, eine mehr als zweifache Steigerung wie die Kulturen ohne Verbindung 7. Ähnliche Steigerungen in der IgM-Produktion wurden auch beobachtet, wenn angereicherte B-Zellen in Gegenwart von Verbindung 7 mit SAC aktiviert wurden. Verbindung 7 konnte bis zu 34-fache Steigerungen in der IgM-Produktion induzieren. Diese Steigerung ist viel größer als die durch das bekannte Mitogen "Pokeweed" induzierten Steigerungen. Die Ergebnisse lassen schließen, daß Verbindung 7 die Potenzierung von SAC- induzierten IgM in humanen in vitro Kultursystemen vermittelt.

BEISPIEL 40 - In vitro Verstärkung der primären Antikörperantwort gegen rote Blutzellen vom Schaf

Verbindung 7 wurde getestet, um ihre Wirkungen auf die primäre Antikörperantwort gegen rote Blutzellen vom Schaf in vivo zu bestimmen. Mäuse (C57BL/6) wurden in Gruppen von 4 intraperitoneal 0,1% in Saline suspendierte rote Blutzellen vom Schaf injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Verbindung 7 in verschiedenen Konzentration intraperitoneal verabreicht. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Wirkung auf die primäre Antikorperantwort gegen rote Blutzellen vom Schafa Mäuse Verbindung 7 PFC/10&sup6; Milzzellen Gruppe-1
a Gruppen von vier C57BL/6-Mäusen wurden i.p. 6,5·106 SRBC und verschiedenen Dosen von Verbindung 7 injiziert. Die Zahl von PFC zu SRBC (gezeigt als Mittel ±SD) wurde an Tag 6, wie in Cheever beschrieben, bestimmt.
Für Tabelle 9 wurde die Zahl der Antikörperzellen durch den modifizierten Jerne-Nordin-Plaquetest, wie veröffentlicht in Jerne, N. K., Nordin, A. A., Science 140 : 405, 1963, bestimmt. Die Ergebnisse, die in Tabelle 9 zu sehen sind, zeigen, daß Verbindung 7 eine deutliche Steigerung in der Zahl der Antikörper produzierenden Zellen induziert.
Verbindungen der Erfindung wurden auch auf antivirale Aktivität getestet. Tests wurden für die therapeutische und prophylaktische Wirkung der Verbindungen gegen eine Vielfalt von RNA und DNA-Viren durchgeführt.

Beispiel 41 - Antivirale Aktivität gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und 2

In diesem Test wurde Verbindung 7 gegen Herpes Simplex Typ 1-Virus und Herpes Simplex Typ 2-Virus getestet. Die Tests wurden als prophylaktische Behandlung in vivo unter Verwendung der Maus als einem Modell durchgeführt. In jedem dieser Tests wurde zu Kontrollzwecken ein Plazebo verwendet. Die Überlebenszeit reflektiert die Überlebenszeit solcher Tiere, welche während des Tests erlagen. Tabelle 10 Antivirale Aktivität gegen Wirkungen von Herpex Simplex-Virus Typ 1- Infektion Dosisa Überlebende/ mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag) Total (%) Plazebob Verbindung
a Behandlungen erfolgten einmal am Tag, -48, -24 und -2 Stunden
relativ zur Virusinokulation.
b Eine 2%ige Natriumbicarbonatlösung wurde als Plazebo und als Verdünnung für Verbindung 7 verwendet.
c Statistisch signifikante (.025) Unterschiede zwischen den Medikament-behandelten und Plazebo-Kontrollmäusen, bestimmt mit dem zweigliedrigen Fisher-Exakttest.
Wie in Tabelle 10 gezeigt ist, wurde eine prophylaktische Behandlung einer Herpes Typ 1-Infektion in Mäusen effektiv mit Verbindung 7 behandelt. Es gab eine gewisse Variabilität in der Antwort, wobei die Antwort bei einer Dosis von 100 mg pro kg weniger effektiv war als die niedrigeren -und die höheren Dosierungen. Tabelle 11 Antivirale Aktivität gegen Herpes simplex Virus Typ 2-Infektion Dosisa Überlebende/ mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag) Total (%) Plazebob Verbindung
a Behandlungen erfolgten einmal am Tag, -48, -24 und -2 Stunden relativ zur Virusinokulation.
b Eine 2%ige Natriumbicarbonatlösung wurde als Plazebo und als Verdünnung für Verbindung 7 verwendet.
c Statistisch signifikante (p< .05) Unterschiede zwischen den Medikamenten-behandelten und Plazebo-Kontrollmäusen, bestimmt mit dem zweigliedrigen t-Test. Drei Mäuse starben an den Tagen 1 und 2 nach der Virusinokulation an der Medikamententoxizität. Der Rest der Mäuse starb nach 9,6 ± 0,8 Tagen, welches ungefähr das gleiche war wie die Viruskontrolle.
d Statistisch signifikante (p< .05) Unterschiede zwischen den Medikamenten-behandelten und Plazebo-Kontrollmäusen, bestimmt durch den zweigliedrigen t-Test.
Wie in Tabelle 11 gezeigt ist, war eine prophylaktische Behandlung einer Herpes Typ 2 Infektion auf allen untersuchten Levels wirksam. Bei 50 und 100 mg pro kg war diese statistische Signifikanz in der mittleren Überlebenszeit in dem zweigliedrigen Fisher Exakttest gerade außerhalb des Bereiches einer statistischen Signifikanz von p< 0.1. Bei 200 mg pro kg in der Maus war die Dosis zum Teil toxisch.

BEISPIEL 42 - Antivirale Aktivität gegen Influenza B-Virus- Infektion in Mäusen

Verbindung 7 wurde therapeutisch gegen Influenza B Infektionen in Mäusen getestet. Zusätzlich zu einer Salinekontrolle wurde Ribavirin, ein bekanntes antivirales Mittel für Testzwecke verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12 Antivirale Aktivität gegen Influenza B-Virus-Infektion in Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebens-Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) zeit (Tage) Saline Ribavirin Verbindung
a Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag für 7 Tage verabreicht, beginnend 2 Stunden vor der Virusinokulation.
b Behandelt einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation.
c p< .001 zweigliedriger t-Test.
Wie in Tabelle 12 gezeigt ist, hat Verbindung 7 gegen Influenza B in der Maus eine Wirksamkeit zwischen Saline, die keine antivirale Aktivität gegen Influenza hat, und Ribavirin, welches eine signifikante, antivirale Aktivität gegen Influenza hat.

BEISPIEL 43 - Antivirale Aktivität gegen San Angelo- Virusinfektion in Mäusen

In diesem Beispiel wurde die antivirale Aktivität gegen San Angelo-Virus, einem Encephalitis-Typ-Virus, unter Verwendung von einem therapeutischen und einem prophylaktischen Protokoll gemessen. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 13 gegeben. Wie in dem vorherigen Beispiel wurde Ribavirin als eine positive, antivirale Kontrolle und Saline als eine negative verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 13 gegeben. Tabelle 13 Antivirale Aktivität gegen San Angelo-Virusinfektion in Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebenszeit (21 Tage) Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) Saline Ribaririn Verbindung
a Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag für 7 Tage verabreicht, beginnend 2 Stunden vor der Virusinokulation.
b Behandelt einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation. Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag verabreicht.
c Behandelt einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation.
d Halbtägliche Dosen wurden 24 und 16 Stunden vor Virusinokulation verabreicht.
e p< .02 zweigliedriger Fisher-Exakt.
Wie aus Tabelle 13 ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 sowohl in einem therapeutischen und auch einem prophylaktischen Modus antivirale Aktivität, gleich der von Ribavirin gegen San Angelo Encephalitis-Virus.

BEISPIEL 44 - Antivirale Aktivität gegen Maus-Zytomegalovirus- Infektion in Mäusen

In diesem Test wurde Verbindung 7 sowohl auf therapeutische oder auch prophylaktische Wirksamkeit gegen eine Maus-Zytomegalovirus-Infektion getestet. Das Ergebnis dieser Tests ist in Tabelle 14 und 15 gezeigt. Tabelle 14 Antivirale Aktivität gegen Maus-Zytomegalovirus-Infektion in Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) Saline Verbindung
a Halbtägliche Dosen wurden 24 und 16 Stunden vor Virusinokulation verabreicht.
b Einzeldosis wurde 24 Stunden vor Virusinokulation verabreicht.
c p< .005 zweigliedriger Fisher-Exakt-Test. Tabelle 15 Antivirale Aktivität gegen Maus-Zytomegalovirus-Infektion in Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) Saline Verbindung
a Behandlungen erfolgten einmal am Tag für 6 Tage, beginnend 2 Stunden vor Virusinokulation.
b Behandlungen erfolgten einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation.
Wie ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 bei einer Dosis von 200 mg pro kg eine 100% Heilung, wenn in einem prophylaktischen Modus untersucht. Jedoch wie in Tabelle 15 zu sehen ist wurde diese Aktivität nicht in einem therapeutischen Modus wiederholt.

BEISPIEL 45 - Antivirale Aktivität gegen Semliki Waldvirus- Infektion bei Mäusen

Die antivirale Aktivität wurde auch gegen Semliki Waldvirus, einem Encephalitis-Typ-Virus, getestet. In diesem Beispiel wurden die Verbindungen 7 und 36 auf therapeutische Wirksamkeit und zusätzlich wurde Verbindung 7 auf prophylaktische Wirksamkeit getestet. Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 16 für den therapeutischen Modus und in Tabelle 17 für den prophylaktische Modus gezeigt. Tabelle 16 Therapeutische, antivirale Aktivität gegen Semliki Waldvirus-Infektion bei Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) Saline Verbindung
a Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag für 7 Tage verabreicht, beginnend 2 Stunden vor der Virusinokulation.
b Behandelt -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation. Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag aufgrund von Unlöslichkeit verabreicht.
c Behandelt einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation.
d Halbtägliche Dosen wurden 24 und 16 Stunden vor Virusinokulation verabreicht.
e p< .01 zweigliedriger Fisher
f p< .02 zweigliedriger Fisher Tabelle 17 Prophylaktische, antivirale Aktivität gegen Semliki Waldvirus-Infektion bei Mäusen Dosis Behandlung Überlebende/ Mittlere Überlebenszeit (Tage) Verbindung mg/kg/Tag Zeitplan Total (%) Saline Verbindung
a Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag für 7 Tage verabreicht, beginnend 2 Stunden vor Virusinokulation.
b Behandelt -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation. Halbtägliche Dosen wurden zweimal am Tag aufgrund von Unlöslichkeit verabreicht.
c Behandelt einmal am Tag, -2 Stunden und an den Tagen 2, 4 und 6 relativ zur Virusinokulation.
d Halbtägliche Dosen wurden 24 und 16 Stunden vor Virusinokulation verabreicht.
e p< .01 zweigliedriger Fisher
Wie aus den Tabellen 16 und 17 ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 in einem therapeutischen Modus und auch einem prophylaktischen Modus eine antivirale Aktivität gegen diesen Virus. Weiterhin zeigte Verbindung 36 auch eine therapeutische, antivirale Aktivität gegen diesen Virus.
Wie aus den obigen Tabellen ersichtlich ist, wird antivirale Aktivität gegen eine Vielzahl von Viren gesehen. In einem weiteren Test wurde eine geringe oder keine antivirale Aktivität von Verbindung 7 gegen Influenza B-Virus und Friend Leukämie-Virus induzierte Splenomegalie gezeigt.

BEISPIEL 46 - Antivirale Aktivität gegen humanen Coronavirus

In diesem Experiment wurden 14 Tage alten Mäusen intracerebral mit humanem Coronarvirus inokuliert. Sie wurden mit Verbindung 7 in einer geteilten intraperitonealen Dosis -24 und -18 Stunden relativ zur Virusinokulation behandelt. Wie in der folgenden Tabelle 18 gezeigt, wurde ein statistisch signifikanter Vorteil für die Mäuse gegen diese virale Infektion im Gehirn mit 200 und 100 mg/kg bereitgestellt. Tabelle 18 Antivirale Aktivität gegen humane Coronavirus-Infektion bei 14 Tage alten Mäusen Testverbindunga Überlebende/Total (%) Mittlere Überlebenszeitb (Tage)
a Halbtägliche Dosen wurden -24 und -18 Stunden relativ zur Virusinokulation verabreicht.
b Von Mäusen, die starben. Überlebende lebten während der 21 Tage.
c Eine 2%ige Natriumbicarbonatlösung diente als Plazebo und als Verdünnung für die Testverbindung.
d Standardabweichung.
e Statistisch signifikant (p< .01), bestimmt mit einem zweigliedrigen T-Test.
f Statistisch signifikant (p< .01), bestimmt mit dem zweigliedrigen Fisher-Exakt-Test.
Wie aus Tabelle 18 ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 antivirale Aktivität gegen diesen humanen Virus, der in das Gehirn inokuliert wurde.

BEISPIEL 47 - Antivirale Aktivität gegen Ratten-Coronavirus

Vier bis fünf Tage alte saugende Ratten wurden intranasal mit Ratten-Coronavirus infiziert. Einen Tag vorher wurde eine geteilte intraperitoneale Dosis von Verbindung 7 oder Plazebo gegeben. Wie in der folgenden Tabelle 19 gezeigt, überlebte ein hoher Prozentsatz der mit Verbindung 7 behandelten Ratten diese Lungeninfektion. Weiterhin lebten die Ratten, die starben, länger als die Plazebo-behandelten Kontrollen. Tabelle 19 Antivirale Aktivität gegen Ratten-Coronavirus-Infektion bei saugenden Ratten Testverbindung Überlebende/Total (%) Mittlere Überlebenszeitb (Tage)
a Halbtägliche Dosen wurden -24 und -18 Stunden relativ zur Virusinokulation verabreicht.
b Von Ratten, die starben. Die Überlebenden lebten während der 21 Tage.
c Eine 2%ige Natriumbicarbonatlösung diente als Plazebo und als Verdünnung für die Testverbindung.
d Standardabweichung.
e Statistisch signifikant (p< .02), bestimmt durch einen zweigliedrigen Fisher-Exakt-Test.
f Statistisch signifikant (p< .002), bestimmt mit dem zweigliedrigen t-Test.

BEISPIEL 48 - Antivirale Aktivität gegen virale Encephalomyocarditis Infektion bei Mäusen

In diesem Experiment wurden die Wirkungen verschiedener Behandlungsheilprogramme von Verbindung 7 auf das Ergebnis einer viralen Encephalomyocarditis Infektion bei Mäusen studiert. Behandlungen wurden 24 Stunden vor dem Virus gestartet. Eine einzige Dosis von 200 mg pro kg wurde zwei Gruppen von Mäusen gegeben. Eine der Gruppen erhielt dann für 6 weitere Tage einzelne Injektionen von Verbindung 7 mit 50 mg pro kg. Die Ergebnisse wurden mit einer Plazebo-Kontrolle, die wie die 50 mg/kg Gruppe behandelt wurde, verglichen. Wie in der folgenden Tabelle 20 gezeigt, gibt es einen klaren Beweis, daß Mäuse, die die tägliche Dosis von 50 mg/kg bekommen in größerem Ausmaß geschützt wurden als Mäuse, die nur eine einzelne 200 mg/kg Dosis bekamen. Die erste Gruppe hatte eine geringere Mortalität und ausgedehntere, mittlere Überlebenszeiten. Tabelle 20 Wirkungen von einzelnen Behandlungen relativ zu mehrfachen von Encephalomyocarditis Virusinfektion bei Mäusen Verbindung Behandlunga -24 Std. Tage 0-6 Überlebende/Total (%) Mittlere Überlebenszeitb (Tage) Plazeboc Testverbindung
a Einfache Injektionen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gegeben. Die Zahl in den Spalten bezieht sich auf die Dosis der Testverbindung in mg/kg oder mg/kg/Tag.
b Von den Mäusen, die starben. Die Überlebenden lebten während der 21 Tage.
cEine 2%ige Natriumbicarbonatlösung diente als Plazebo und als Verdünnung für die Testverbindung.
d Standardabweichung.
eStatistisch signifikant (p< .002), bestimmt mit einem 2- gliedrigen t-Test.
f Statistisch signifikant (p< .02), bestimmt durch den zweigliedrigen Fisher-Exakt-Test.

BEISPIEL 49 - Antivirale Aktivität von Nukleosiden und Nukleotiden auf natürliche Maus-Killerzellaktivität in vitro

Andere Verbindungen der Erfindung wurden bezüglich ihrer natürlichen Killerzellaktivität unter Verwendung von Mausmilzzellen wie oben in Beispiel 32 getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 21 aufgelistet. Tabelle 21 Wirkung von Guanosin Nukleosiden und Nukleotiden auf natürliche Mauskillerzellaktivität in vitroa Exp. # Effektorzellen vorbehandelt mit Konzentration % Natürliche Killerzellzytotoxizität Keine Verbindung
a Milzzellen aus Mäusen wurden in Abwesenheit und Gegenwart verschiedener Verbindungen inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen in voll ständigem Medium suspendiert und dann ihre zytotoxische Aktivität gegen YAC-1 Targetzellen, wie im Text beschrieben, bestimmt.

BEISPIEL 50 - Wirkung von Nukleosiden und Nukleotiden auf humane natürliche Killerzellaktivität in vitro

Andere Nukleoside und Nukleotide der Erfindung wurden auf ihre Aktivität bei humanen natürlichen Killerzellen in vivo, wie in Beispiel 33 oben, getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 22 aufgelistet. Tabelle 22 Wirkung von Guanosin Nukleosiden und Nukleotiden auf die humane natürliche Killerzellaktivität in vitro Exp. # Effektorzellen vorbehandelt mit Konzentration %Natürliche Killerzellzytotoxizität Keine Verbindung

BEISPIEL 51 - Tumorzide Aktivität von Makrophagen bei Mäusen

Die Aktivität von Verbindung 7 wurde bezüglich ihrer Fähigkeit, Makrophagen zu aktivieren, durch Injizieren von CBA/CaJ-Mäusen mit einer einzigen Dosis von Verbindung 7 (2 mg pro Maus) getestet, und nach 24 Stunden wurde die Zytotoxizität der Milzzellen (MZ), nicht adhärenten MZ und adhärenten MZ bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 23 gezeigt. Tabelle 23 Aktivierung von Makrophagen folgend einer einzigen Injektion von Verbindung 7 bei Mäusena Effektorzellen Dosis (mg) von Verbindung 7/Maus % Zytotoxizitätstest 4 Std. 20 Std. Milzzellen (MZ) Keine Nichtadhärent (MZ) Adhärente Zellen
a Einer Gruppe von vier Mäusen (CBA/CaJ) wurde eine Lösung von Verbindung 7 mit 2 mg/Maus injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt Saline. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Milzen geerntet. Adhärente und nichtadhärente Zellen wurden durch Inkubation von Milzzellen auf Plastikplatten für eine Stunde separiert. Zellsuspension von Milzzellen, nichtadhärenten Zellen (NZ) und adhärenten Zellen (AZ) wurden im vollständigen Medium präpariert. Zytotoxizität von MZ, NZ und AZ wurde im 4 Std. und 20 Std. Chromfreisetzungstest gegen P8/5- Tumortargetzellen gemessen.
Wie aus Tabelle 23 ersichtlich ist, konnte Verbindung 7 natürliche Killerzellen und adhärente (Makrophagen) Zellen aktivieren, wie durch die Fähigkeit dieser Zellen nachgewiesen, eine verstärkte Zytotoxizität gegen Tumortargetzellen auszuüben.
In den Beispielen 52 und 53 wurde die Kombinations- Aktivität von Verbindungen der Erfindung mit dem bekannten antiviralen Agens Ribavirin gegen San Angelo Virus und Banzi Virus unter Verwendung von Verbindung 7 in einem prophylaktischen Protokoll gemessen. Das Ribavirin diente als ein weiteres antivirales Agens für die Verwendung in Kombination mit den Verbindungen der Erfindung.

BEISPIEL 52 - Kombinations-Chemotherapie gegen San Angelo-Virus bei Mäusen

Die Ergebnisse der Kombinations-Chemotherapie gegen San Angelo-Virus bei Mäusen sind in Tabelle 24 gezeigt. Tabelle 24 Kombinations-chemotherapie gegen San Angelo-Virus Behandlunga Überlebende/Total Mittlere Überlebenszeitb (Tage) -24 Std. Tage 0-6 Saline Verbindung 7 (5)d Ribavirin
a Eine einzige Injektion von Saline oder Verbindung 7 wurde 24 Stunden vor der Virusinokulation gegeben. Behandlungen an den Tagen 0-6 erfolgte zweimal am Tag für 7 Tage, beginnend 2 Stunden vor Virusinokulation.
b Von Mäusen, die starben.
c Standardabweichung.
d Die Dosis in mg/kg/Tag ist in Klammern.
eStatistisch signifikant (p< .05), bestimmt mit dem zweigliedrigen Fisher-Exakt-Test.

BEISPIEL 53 - Kombinations-Chemotherapie gegen Banzi-Virus- Infektion bei Mäusen

Die Ergebnisse der Kombinations-Chemotherapie gegen Banzi- Virus-Infektion in Mäusen ist in Tabelle 25 gezeigt. Tabelle 25 Kombinations-Chemotherapie gegen Banzi-Virus-Infektion Behandlunga Behandlungb Überlebende/Total (%) Mittlere Überlebenszeitc (Tage) -24 Std. Tage 0-6 Plazebod Saline Ribavirin Verbindung
a einfache Injektion, 24 Stunden vor der Virusinokulation gegeben.
b Halbtägliche Dosen zweimal am Tag für 7 Tage gegeben, beginnend 2 Stunden vor der Virusinokulation.
c Von Mäusen, die starben. Überlebende lebten 21 Tage.
d Eine 2%ige Natriumbicarbonatlösung war das Plazebo und Verdünnung für Verbindung 7. Ribavirin wurde in Saline gelöst.
e Statistisch signifikant (p< .05), bestimmt durch den zweigliedrigen t-Test.
Wie aus Tabelle 24 und 25 ersichtlich ist, zeigte Verbindung 7 in einem prophylaktischen Modus in Kombination mit dem bekannten antiviralen Ribavirin Wirksamkeit gegen die Testviren. Verbindungen der Erfindung haben weiterhin die Fähigkeit gezeigt, Metastasen bei Säugetierwirten, die metastatische Tumore tragen, und bei in solchen Wirten artifiziell induzierten Metastasen, zu unterdrücken.
Unter Verwendung des Protokolls von Alessandri, G., Giavazzi, R., Falautano, P., Spreafico, F., Garattini, S. und Mantovani, A., European J. Cancer, 17 : 651-658, 1981 ist die antimetastatische Aktivität von Verbindung 7 bei einem Sarcoma M5076 Tumorsystem zu sehen.

BEISPIEL 54 - Reduktion von Retikulumzellsarcoma metastatischen Krankheitsherden

Fragmente von Retikulumsarcomazellen M5076 wurden in Mäuse eingeführt. Die Tiere wurden für 20 Tage mit Verbindung 7 in verschiedenen Dosierungen behandelt. Nach Behandlung wurde das benötigte Gewebe entnommen, in Bouins Lösung fixiert und einer mikroskopischen Betrachtung unterworfen, um die metastatischen Krankheitsherde zu zählen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26 als Zahl der metastatischen Krankheitsherde gezeigt und in Tabelle 27 als Zahl der Mäuse mit metastatischen Krankheitsherden. In Tabelle 26 ist der Bereich und die mittlere Anzahl an Krankheitsherden für jede Testgruppe angegeben. Tabelle 26 Metastatische Krankheitsherde in Lungen und Leber als Reaktion auf Retikulumsarcomazellen M5076a Medikamentc Zahl der metastatischen Krankheitsherde in Lunge Leber Median Bereich Medium Bereich
a Fragmente von Retikulumsarcomazellen M5076 (=14 mg) wurden sc in die linke Seite von weiblichen BDF&sub1; Mäusen implantiert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurden 24 Stunden später begonnen. Das Medikament wurde auf der Grundlage von 0,01 ml/g Mausgewicht verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09%ige NaCl-Lösung, verabreicht auf der gleichen Grundlage. Sieben Mäuse wurden pro Behandlungsgruppe verwendet. Behandlung angegeben qd für die Tage 1-20.
b Student t-Test.
cVerbindung 7. Tabelle 27 Zahl der Mäuse, die metastatische Krankheitsherde in Lunge und Leber gebildet haben als Reaktion auf Retikulumsarcomazellen M5076a Medikamentc Mäuse mit metastatischen Krankheitsherden in Lunge Leber
a Fragmente von Retikulumsarcomazellen M5076 ( 14 mg) wurden sc in die linke Seite von weiblichen BDF&sub1; Mäusen implantiert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurde 24 Stunden später begonnen. Das Medikament wurde auf der Grundlage von 0,01 ml/g Mausgewicht verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09% NaCl-Lösung, verabreicht auf der gleichen Basis. Sieben Mäuse wurden pro Behandlungsgruppe verwendet. Behandlung gegeben in qd für die Tage 1-20.
b Chi-Quadratanalyse.
cVerbindung 7.
Wie aus den Tabellen 26 und 27 ersichtlich ist, gab es eine statistisch bedeutsame Reduktion bei der Anzahl von metastatischen Krankheitsherden in der Lunge und in der Leber. Weiter zeigte das Testmedikament eine Dosisantwort mit einer totalen Suppression von metastatischen Krankheitsherden in der Leber, was bei einigen der Testtiere bei allen Testdosen gesehen wurde, und eine Suppression von metastatischen Krankheitsherden in der Lunge, was bei Dosen größer als 62 mg/kg gesehen wurde.

BEISPIEL 55 - Steigerung der mittleren Lebensspanne gegen metastatische Retikulumsarcomazellen M5076

Die Wirkung der Medikamentenbehandlung auf die mittlere Lebensspanne von Wirtstieren mit implantierten metastatischen Retikulumsarcomazellen M5076 wurde unter Verwendung des gleichen Testprotokolls wie in Beispiel 54 gemessen. Den Wirtstieren wurden für 20 Tage Medikamente wie in Beispiel 54 dosiert gegeben, jedoch gegensätzlich zu Beispiel 54 wurden sie bezüglich der Überlebensrate beobachtet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 28 gezeigt. Tabelle 28 Wirkung der Medikamentenbehandlung auf die mittlere Lebensspanne von Mäusen in Reaktion auf metastatische Retikulumsarcomazellen M5076a Medikamentc Postinokulations-Lebensspanne (Tage) Vergrößerte Lebensspanne (% der Kontrolle)
a Fragmente von Retikulumsarcomazellen M5076 ( 14 mg) wurden sc in die linke Flanke von weiblichen BDF&sub1; Mäusen implantiert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurden 24 Stunden später begonnen. Das Medikament wurde auf einer Basis von 0,01 ml/g Mausgewicht verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09%ige NaCl-Lösung, verabreicht auf derselben Grundlage. Sechs Mäuse wurden pro Behandlungsgruppe verwendet. Behandlung gibt an qd für Tage 1-20, und die Tiere wurden nach der Behandlung bezüglich des Überlebens beobachtet.
b Studenten t-Test.
c Verbindung 7
Wie aus Tabelle 28 ersichtlich ist, gab es eine statistisch signifikante Steigerung in der Lebensspanne der Wirtstiere, gesehen bei einem Dosislevel von 62 mg/kg oder größer.

BEISPIEL 56 - Wirkung der Behandlung gegen artifiziell induzierte metastatische Krankheitsherde von B16-Melanoma

Artifiziell induzierte metastatische Krankheitsherde von Maus B16-Melanoma wurden in Mäusen unter Verwendung des Verfahrens von Mazumder, A. und Rosenberg, S. A., J. Experimental Medicine, 1S9 : 495, 1984 induziert. Das Testmedikament, Verbindung 7 wurde an Gruppen von Testtieren gegeben. Die Gruppen beinhalten eine erste Kontrollgruppe, eine zweite Gruppe, der 24 Stunden vor der intravenösen Tumorinjektion Medikament gegeben wurde, eine dritte Gruppe, der 24 Stunden vor der intravenösen Tumorinjektion und 72 Stunden nach Tumorinjektion Medikament gegeben wurde, und eine vierte Gruppe, der 72 Stunden nach Tumorinjektion Medikament gegeben wurde. Die mittlere Zahl der induzierten, pulmonalen, metastatischen Krankheitsherde wurden bestimmt wie in Tabelle 29 gezeigt. Tabelle 29 Reduktion der Zahl von artifiziell induzierten, pulmonalen, metastatischen Krankheitsherden von Maus B16-Melanomaa Testgruppe Behandlung (Std.) Mittlere Zahl von metastatischen Krankheitsherden in der Lunge Kontrolle Gruppe 2 Verbindung 7
a 10 Wochen alte, weibliche C57B1/G Mäuse wurden in Gruppen zu 5 mit je 5·10&sup5; B16-Melanoma Tumorzellen intravenös injiziert. Die Mäuse in den Gruppen 2, 3 und 4 wurden durch Injektion des Medikamentes mit 100 mg/kg intraperitoneal behandelt.
Wie aus Tabelle 29 ersichtlich ist, zeigten in allen Beispielen, verglichen mit der Kontrolle, die medikamentenbehandelten Gruppen eine kleinere, mittlere Zahl an metastatischen Krankheitsherden. Es gab wenigstens eine 50%ige Reduktion in der Zahl metastatischer Krankheitsherde zwischen der Kontrollgruppe und jeder der medikamentenbehandelten Gruppen, und es wurde ein sogar größerer, signifikanter Unterschied zwischen der Kontrolle und der Gruppe, die vor und nach der Injektion der Tumorzellen behandelt wurde, bemerkt.
Weitere Antitumorwirkungen sind gegen P388 Tumore unter Verwendung des Standardtumortestprotokolls des National Cancer Institutes gezeigt worden. In den folgenden zwei Beispielen werden unter Verwendung dieses Testtumorsystems Steigerungen in der mittleren Lebensspanne von P388 inokulierten Mäusen und der Zahl der Tiere, die auf verschiedene Tumorinokulumkonzentrationen, variierende Medikamentenkonzentationen und Zeitpläne reagieren, gezeigt.

BEISPIEL 57 - Wirkung von Medikamentenversorgungsheilplänen auf die mittlere Lebensspanne von P388 inokulierten Mäusen

In diesem Beispiel wurden, wie in Tabelle 30 zusammengefaßt, verschiedene Medikamentenversorgungsheilpläne für Verbindung 7 gegen P388 in der Maus verwendet und die Postinokulationslebensspanne, die Änderung in der Lebensspanne und die Zahl der lebenden Tumorzellen am Tag 6 gemessen. Für diesen Test wurden die gezeigten Daten ohne Bezug auf die Dosierung in einem Zeitplan zusammengefaßt. Jede Behandlungsgruppe beinhaltete eine Gesamtheit von 15 Mäusen, geteilt in Untergruppen zu je 5 Mäusen, behandelt je Untergruppe mit 37, 62 oder 104 mg/kg-Injektion des Medikamentes. Nach Behandlung wurden die Testtiere bezüglich Überlebensrate beobachtet. Tabelle 30 Wirkung der Behandlung auf die mittlere Lebensspanne von P388 inokulierten Mäusena Tage der Medikamentenc-gabe Postinokulation Lebensspanne (Tage) Änderung der Lebensspanne (% der Kontrolle) Gebundene Zellen Tag 6 (% der Kontrolle) Kontrolle
a P388 Asziteszellen (1·10&sup6;) wurden ip in weibliche BDF&sub1; Mäuse am Tag 0 implantiert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurden einmal täglich an den angegebenen Tagen verabreicht. Das Medikament wurde auf einer Basis von 0,01 ml/g Mausgewicht verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09% NaCl-Lösung, verabreicht auf der gleichen Basis.
b Student t-Test.
c Verbindung 7.

BEISPIEL 58 - Variation von P388 Testinokulum, Medikamenteninokulum und Zeitplan der Medikamentenverabreichung

Für dieses Beispiel wurden variierende Konzentrationen in der Zahl von Testzellen für das P388 Inokulum verwendet, und Konzentrationen von Verbindung 7 wurden mit verschiedenen Zeitplänen der Medikamentenverabreichung verwendet. Für diese Tests wurde eine Optimierung der Variablen nicht versucht und aufgrund dessen und der Zahl der Variablen in diesem Test wurden die in Tabelle 31 gezeigten Ergebnisse qualitativ interpretiert mit 26 aus den 34 Gruppen (76%), die eine Steigerung in der Lebensspanne zeigen, verglichen mit den verbleibenden 8 Gruppen, welche keine Steigerung in der Lebensspanne zeigten. Tabelle 31 Reaktion von P388 inokulierten Mäusen auf verschiedene Medikamentendosierungen, inokulierte Konzentrationen und Dosierungszeitplänea Studie Nr. P388 Zellkonz Zahl der Mäuse Dosierung Zeitplan der Verabreichung Vergrößerte Lebensspanne Tag 1 (1 kuriert)
a P388 Asziteszellen wurden in den angegebenen Konzentrationen in weibliche BDF&sub1; Mäuse am Tag 0 ip implantiert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurden einmal täglich an den angegebenen Tagen in den angegebenen Konzentrationen verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09%ige NaCl-Lösung, verabreicht auf der gleichen Basis. b Toxisch in einem Tier.

BEISPIEL 59 - Wirkungen der Medikamentenbehandlung auf die mittlere Lebensspanne von C26 inokulierten Mäusen

In einer Art, ähnlich der oben erwähnten P388 Behandlung, wurden Verbindungen der Erfindung auch auf ihre Wirkung gegen den inokulierten Tumor C26 bei Mäusen getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 32 gezeigt. Für die Verwendung dieses Tumors wurde das National Cancer Institute Protokoll benutzt. Tabelle 32 Wirkungen der Behandlung auf die mittlere Lebensspanne von C26 inokulierten Mäusena Verb. 7 Postinokulation Lebensspanne (Tage) Letzter Tod am Tag Vergrößerte Lebensspanne (% von der Kontrolle)
a Weibliche CDF&sub1; Mäuse wurden am Tag 0 mit Coloncarcinoma C26 (0,5 ml eines 1 : 100 Tumorbreis, gebildet aus kleingehackten Tumorfragmenten in TC199) ip inokuliert, und ip Bolusinjektionen des Medikamentes wurden 24 Stunden später begonnen. Das Medikament wurde auf einer Basis von 0,01 ml/g Mausgewicht verabreicht. Kontrollmäuse erhielten eine 0,09% NaCl-Lösung, verabreicht auf der gleichen Basis. Es gab 10 Mäuse/Behandlungsgruppe. Nach Behandlung qd Tage 1-20, wurden die Mäuse bezüglich des Überlebens beobachtet.
b Bestimmte behandelte Mäuse lebten zweimal so lang wie die letzten Kontrollmäuse, und am Tag 53 wurde der Test mit Mäusen, die noch lebten, beendet. Eine Maus, behandelt mit 104 mg/kg des Medikamentes, hatte keinen auffällig detektierbaren Tumor am Terminierungstag.
Obgleich wir von der Theorie nicht gebunden sein wollen, wird angenommen, daß die Antitumoraktivität der Verbindungen der Erfindungen nicht' ein Ergebnis ihrer chemischen, zytotoxischen Wirkung ist, sondern das Ergebnis einer Medikamenten-Stimulation des tierischen Wirtsimmunsystems, um die Tumorzellen zu töten, ist. Dieser Mechanismus wird aus Tabelle 30 nahegelegt, welche zeigt, daß, während nur eine bescheidene Steigerung der Lebensspanne für die Testperiode bemerkt wurde, mehr als 51% der Tumorzellen getötet wurden und aus Tabelle 31, welche anzeigt, daß bei verschiedenen Medikamentenkonzentrationen, Tumorzellinokulatkonzentrationen und Dosierungszeitplänen mehr als 75% der Testprotokolle zu einer positiven Steigerung der Lebensspanne führten, wobei bestimmte Protokolle zur Heilung führten. Wie in Tabelle 32 gezeigt ist, werden Steigerungen in der Lebensspanne auch bei anderen Tumorsystemen festgestellt.
Die Verbindungen der Erfindung können einem warmblütigen Wirt, der deren bedarf, in geeigneten Formulierungen, worin die Verbindungen den aktiven Bestandteil der Formulierungen umfassen, gegeben werden. So können die Verbindungen der Erfindung zu Injektionslösungen, die für intravenöse oder andere Injektionsarten in den Tierwirt geeignet sind, aufbereitet werden. Weiterhin können sie in einer geeigneten oralen Formulierung, z. B. als eine orale Siruppräparation, eine orale Kapsel oder orale Tablette gegeben werden. Ein weiterer Verabreichungsweg könnte ein Zäpfchen sein.
Für eine Injektion würden die Verbindungen in einer geeigneten Lösung aufgelöst werden, wie z. B. in einem Natriumbicarbonat oder anderem Puffer. Eine solche Lösung würde gefiltert und in geeignete Ampullen oder Glasfläschchen gefüllt und verschlossen und sterilisiert werden. Als ein Sirup würden die Verbindungen in gepufferter Lösung unter mildem Rühren mit einem geeigneten Sirup gemischt werden. Für Kapseln wurde die trockenen Verbindungen mit geeigneten Füllstoffen, Bindemitteln und ähnlichen wie z. B. Lactose USP Pulver oder Sterotexpulver gemischt werden. Für die Herstellung von Tabletten würden die Verbindungen der Erfindung mit geeigneten Bindemitteln und Füllstoffen wie z. B. Maisstärke NF, mikrokristalliner Cellulose, Sterotexpulver und Wasser gemischt und bis zu einem niedrigen Wassergehalt getrocknet werden. Dem würde Sieben, Vermahlen, weiteres Sieben und Pressen in geeignete Tabletten folgen.
Für Zäpfchen würden die Verbindungen in geeigneten Schmelzen aus Polyethylenglycol, wie z. B. Polyethylenglycol 1540 und 8000 bei 60ºC gelöst und durch Abformen in die Zäpfchen bei 25ºC geformt werden.
Zusätzlich zu den obigen Formulierungen können die Verbindungen der Erfindung unter Verwendung anderer Verabreichungstechniken wie Einmengen der Verbindungen der Erfindung in Liposomen und ähnlichen verabreicht werden.
Außerdem können Prodrugformen der Verbindungen der Erfindung verwendet werden, um die Arzneizubereitung, Aufnahme, Absorption, metabolische Kontrolle und ähnliches zu erleichtern. Eine solche Prodrug ist Verbindung A4, der Triacetatester von Verbindung 7. Weitere Prodrugs könnten in vivo die enzymatische Umwandlung von Analoga der Verbindungen der Erfindung in Verbindungen der Erfindung erlauben.
Für den Zweck der Kürze sind in bestimmten chemischen Abbildungen und Schemata dieser Spezifikation und den Patentansprüchen, die hiermit verbunden sind, verschiedene tautomere Formen der Heterozyklen bestimmter Verbindungen zwischen den verschiedenen Abbildungen und Schemata gezeigt worden. Es wird verstanden, daß ungeachtet, ob Substituenten in ihrer Enol- oder in ihrer Ketoform gezeigt sind oder nicht, sie dieselbe Verbindung darstellen. So werden in den Patentansprüchen, der Zusammenfassung und der kurzen Beschreibung, um nur eine einzelne strukturelle Abbildung zu verwenden, Sauerstoff- und Schwefelsubstituenten in den 5- und 7-Ringpositionen in einer Enolatform gezeigt, wobei diese Substituenten in den verschiedenen Schemata in ihrer normalen Ketoform gezeigt sind.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Struktur:

worin R&sub4;, R&sub5;&sub1; R&sub6; und R&sub7; einzeln H, OH oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-O-Acyl sind,

und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist

oder R&sub5; und R&sub7; H oder OH sind, R&sub6; H ist und R&sub3; und R&sub4; zusammen sind

und X =O oder =S ist;

Y -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z H, -NH&sub2;, -OH oder Halogen ist;

worin Halogen Cl oder Br ist;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren bei Säugetieren.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine Verbindung der Struktur ist:

worin R&sub1; und R&sub2; einzeln H oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl sind,

und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist;

oder R&sub1; H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

und X =O oder =S ist;

Y -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z H, NH&sub2;, -OH oder Halogen ist;

worin Halogen Cl oder Br ist;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin:

R&sub1; und R&sub2; H, Acetyl oder Benzoyl sind und

R&sub3; H, Acetyl, Benzoyl oder

ist;

oder R¹ H ist und zusammen R&sub2; und R&sub3;

sind;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin:

X =O ist.

7. Verwendung nach einem der Anspruche 4 bis 6, worin R&sub1; und R&sub2; H sind.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin R&sub3; H ist.

9. Verwendung einer Verbindung der Struktur:

worin R&sub4;&sub1; R&sub5;&sub1; R&sub6; und R&sub7; einzeln H, OH oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-O-Acyl sind,

und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist;

und X =O oder =S ist;

Y -OH, -SH, NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z H, -NH&sub2;&sub1; -OH oder Halogen ist;

worin Halogen Cl oder Br ist;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Inhibierung von Tumormetastasen bei einem befallenen Säugetierwirt.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin: die Verbindung eine Verbindung der Struktur ist:

worin R&sub1; und R&sub2; einzeln H oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl sind

und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist;

oder R&sub1; H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

und X =O oder =5 ist;

Y -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z ist H, -NH&sub2;, -OH oder Halogen ist;

worin Halogen Cl oder Br ist;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, worin:

R&sub1; und R&sub2; H, Acetyl oder Bezoyl sind;

R&sub3; H, Acetyl, Benzoyl oder

ist;

oder R¹ H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin:

Z-NH&sub2; ist und Y -OH ist.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin:

X =O ist.

15. Verwendung nach Ansprüchen 12, 13 oder 14, worin:

R&sub1; und R&sub2; H sind.

16. Verwendung nach Anspruch 15, worin:

R&sub3; H ist.

17. Verwendung einer Verbindung der Struktur:

worin R&sub1; und R&sub2; einzeln H oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl sind, OH und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist;

oder R&sub1; H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

und X =O oder =S ist;

Y -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z H, -NH&sub2;&sub1; -OH oder Halogen ist;

worin Halogen Cl oder Br ist;

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung bei der Stimulation des Immunsystems eines Säugetierwirts.

18. Verwendung nach Anspruch 17, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

19. Verwendung nach Anspruch 18, worin:

R&sub1; und R&sub2; H, Acetyl oder Benzoyl sind

R&sub3; H, Acetyl, Benzoyl oder

ist;

oder R¹ H ist und R&sub2; und R&sub3; sind zusammen

oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon.

20. Verwendung nach Anspruch 19, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

21. Verwendung nach Anspruch 20, worin:

X =O ist.

22. Verwendung nach Ansprüchen 19, 20 oder 21, worin:

R&sub1; und R&sub2; H sind.

23. Verwendung nach Anspruch 22, worin:

R&sub3; H sind.

24. Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Anregung von natürlichen Killerimmunzellen in einem Säugetierwirt.

25. Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Anregung von Macrophagenzellen in einem Säugetierwirt.

26. Verwendung von 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol [4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Anregung von Lymphozytenzellen in einem Wirt.

27. Eine Verbindung der Struktur:

worin R&sub1; und R&sub2; einzeln H oder C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl sind,

und R&sub3; H, C&sub1;-C&sub1;&sub8;-Acyl oder

ist;

oder R&sub1; H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

und X =O oder =S ist;

Y -OH, -SH, -NH&sub2; oder Halogen ist;

und Z H, -NH&sub2;, -OH oder Halogen ist;

worin Halogen ist Cl oder Br;

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

28. Eine Verbindung nach Anspruch 27, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

29. Eine Verbindung nach Anspruch 28, worin:

R&sub1; und R&sub2; H, Acetyl oder Benzoyl sind, und R&sub3;, H, Acetyl, Benzoyl oder

ist;

oder R&sub1; H ist und R&sub2; und R&sub3; zusammen sind

oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

30. Eine Verbindung nach Anspruch 29, worin:

Z -NH&sub2; ist und Y -OH ist.

31. Eine Verbindung nach Anspruch 30, worin:

X =O ist.

32. Eine Verbindung nach Ansprüchen 29, 30 oder 31, worin:

R&sub1; und R&sub2; H sind.

33. Eine Verbindung nach Anspruch 32, worin:

R&sub3; H ist.

34. 5-Amino-3-β-D-ribofuranosylthioazol[4,5-d]pyrimidin- 2,7(6H)-dion oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

35. Das 5'-Phosphat der Verbindung von Anspruch 34.

36. Das 3'-5'-zyklische Phosphat der Verbindung von Anspruch 34.

37. 5-Amino-2-thioxo-3-β-D-ribofuranosylthioaZol[4,5- d]pyrimidin-7(6H)-on.

38. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als einen aktiven Inhaltsstoff eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 27 bis 37 beansprucht in Kombination mit einem therapeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.

39. Eine Antitumorzusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von 5-Amino-3-β-D- ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon in Kombination mit einem therapeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.

40. Eine das Immunsystem anregende Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge von 5-Amino-3-β- D-ribofuranosylthiazol[4,5-d]pyrimidin-2,7(6H)-dion oder ein pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon in Kombination mit einem therapeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägerstoff.