DE2746942C2

DE2746942C2 -

Info

Publication number: DE2746942C2
Application number: DE2746942A
Authority: DE
Inventors: John Eugene Hearst; Henry Rapoport; Stephen Terrence Berkeley Calif. Us Isaacs; Che-Kun James Albany Calif. Us Shen
Original assignee: University of California Berkeley
Current assignee: University of California Berkeley
Priority date: 1976-10-20
Filing date: 1977-10-19
Publication date: 1988-05-26
Also published as: JPS62153B2; FR2376859A1; US4124598A; NL7711539A; FR2376859B1; JPS5353699A; CH635346A5; JPS6326119B2; IT1087022B; JPS6212795A; GB1556307A; DE2746942A1; BE859912A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate des 4,5′,8-Trimethylpsoralens (Trioxsalen) mit einem organischen funktionellen Substituenten am 4-Kohlen stoffatom. Die neuen 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate besitzen die allgemeine Formel

worin X für eine Halogenalkyl, Alkohol-, Aether- oder Aminoalkylgruppe steht, in denen die Alkylreste jeweils bis zu 7 C-Atome aufweisen können.

Der Ausdruck Alkyl bezeichnet vorzugsweise Methyl, Aethyl und Propyl, wobei Methyl bevorzugt ist. Ein Alkohol-Substituent ist vor zugsweise ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, z. B. Hydroxy-nieder-alkyl. Ein Aether- Substituent ist vorzugsweise ein nieder-Alkoxy-nieder-alkyl rest.

Beispiele von erfindungsgemäßen Psoralenderivaten sind
4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen-hydrochlorid.

In anderer Beziehung betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Psoralenderivate zur Herstellung von Desoxyribo nucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren, an welche an mindestens einer Bindungsstelle ein 4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethylpsoralens covalent gebunden ist.

Die Erfindung ermöglicht ein Verfahren zum Eingreifen in die Replikation von Nucleinsäuren, wobei man Nucleinsäuren mit einem 4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethylpsoralens zusammenbringt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung dieser Psoralenderivate in einem Verfahren zur Inaktivierung von Viren, wobei man Viren mit einem 4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethyl psoralens zusammenbringt und diese dann einer Energiestrahlung aussetzt.

Psoralene sind lineare Isomere der Furocumarinfamilie und kommen in der Natur in gewissen Früchten und Samen, z. B. Ammi majus und psoralea corylifolia vor. Extrakte dieser Früchte und Samen sind seit alter Zeit als Hautsensibilisie rungsmittel bei der Behandlung von Vitiligo in Gebrauch. Die topische Anwendung von Psoralenextrakten und anschließende Bestrahlung mit Licht resultiert in einer Stimulierung der Melaninproduktion und bewirkt so einen Hautgerbungseffekt.

In den vergangenen Jahren sind Psoralene in der Photo chemotherapie von Psoriasis verwendet worden. Bei dieser Behandlung werden Psoralene dem Patienten oral oder topisch verabreicht. Danach wird die Haut einer Ultraviolett-Bestrahlung ausgesetzt.

Mit zunehmendem Interesse an der Molekularbiologie und deren Studium sind Psoralene in bezug auf ihre Fähigkeit, covalente Bindungen mit Nucleinsäuren zu bilden, untersucht worden. Infolge ihrer planaren Struktur können sich Psoralene zwischen die Basenpaare der Doppelhelix-Molekularstruktur von Nucleinsäuren einlagern. Auf Bestrahlung mit Licht geeig neter Wellenlänge können die Psoralene covalente Bindungen mit den Pyrimidinnucleotiden, welche als integrale Bestand teile der Nucleinsäurestränge auftreten, bilden. Das Zustande bringen covalent gebundener Psoralenbrücken oder Querverbindungen zwischen Nucleinsäuresträngen der Doppelhelix stellt ein weiteres Werkzeug bei in vivo-Studien der Sekundärstruktur von Nucleinsäuren dar. Zusätzlich sind die Psoralene ein Mittel zur Inaktivierung von Viren bei der Vaccineproduktion und sie sind auch potentielle chemotherapeutische Mittel. Die covalent gebundenen Psoralene wirken als Hemmer der DNS- Replikation und haben somit die Fähigkeit, den Replikations prozeß zu verlangsamen oder zu stoppen. Die covalente Bindung kann nur in einem Zweistufenverfahren hergestellt werden, indem zuerst das Psoralen sich in die Nucleinsäurehelix ein lagert und sodann jene Stellen der elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt werden. Man erkennt somit sofort, daß der Vorgang der covalenten Bindung sowohl zeitlich als auch räumlich kontrolliert werden kann.

Es ist auch ersichtlich, daß Querverbindungen nur bei solchen Psoralenmolekülen auftreten können, die zur richtigen Zeit am richtigen Platz sind, d. h. ein Psoralenmolekül muß sich in der richtigen Stellung in genau dem Moment eingelagert haben, in dem die Strahlungsenergie an dieser Stelle auftrifft. Die Anwesenheit eines Psoralenmoleküls an der richtigen Position hängt von der Löslichkeit des Psoralens in wäßriger Lösung und von der Dissoziationskonstante für die nicht-covalente Bindung des Psoralens zu Nucleinsäuren ab. Je höher somit die Löslichkeit ist, desto größer ist die Anzahl der Moleküle in dem umgebenden flüssigen Medium, die für die Bindungsstellen verfügbar sind. In ähnlicher Weise ist die Zahl der Psoralene, die eine potentielle Bindungsstelle irgendwann zur richtigen Zeit besetzen umso größer, je niedriger die Dissoziations konstante ist. Die Dissoziationskonstante K _D für die nicht- covalente Bindung des Psoralens an die Nucleinsäure wird durch den Ausdruck

definiert. Dabei ist (P) die Konzentration des freien Psoralens, (S) die Konzentration der nicht besetzten Bindungsstellen, wobei jedes Basenpaar an einer Nucleinsäure als Bindungsstelle be trachtet wird, und (PS) die Konzentration von Psoralen-gebundenen Stellen.

Die neuen Psoralenderivate können im wesentlichen in der gleichen Weise wie bekannte Psoralene verwendet werden, d. h. als Hautsensibilisierungsmittel, z. B. in der Behandlung von Vitiligo und Psoriasis; und als Mittel zur Inaktivierung von Viren.

Die neuen, oben definierten Psoralenderivate sind bekannten Psoralenen in bezug auf die Monoaddition an Nuclein säuren überlegen. Die Überlegenheit bezieht sich auf die resultierende Dichte covalent gebundenen Psoralens an der Nucleinsäure, ohne daß an der allgemeinen Eingangskonzentration an Bindungsstellen und der totalen Psoralenkonzentration etwas geändert wird.

Die neuen Psoralene haben zwei Vorteile, d. h. sie zeigen verbesserte Löslichkeit in Wasser und/oder besitzen eine niedrige Dissoziationskonstante von DNS und/oder RNS.

Das 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen kann auch als Zwischenprodukt bei der Herstellung der übrigen erfindungsgemäßen Psoralene verwendet werden. Im Falle des 4′-Chlormethyl psoralens wird der Chlormethylsubstituent in wäßriger Lösung leicht hydrolysiert und es ist infolgedessen schwierig, dessen spezifische Aktivität in bezug auf die Bindung an DNS oder RNS festzustellen.

Das 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, das 4′- Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen und das 4′-Aminomethyl- 4,5′,8-trimethylpsoralen zeigen alle ausgezeichnete Reaktivität mit DNS, wie man nachfolgend sehen wird.

Alle erfindungsgemäßen Psoralene lassen sich bequem aus 4,5′,8-Trimethylpsoralen (Trioxsalen) herstellen, obschon auch andere bekannte Synthesemethoden verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Psoralene können dadurch hergestellt werden, daß man Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder Aminoalkyl in einer Halomethylierungs reaktion oder einer Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt. Bei spielsweise wird Trioxsalen mit einem halogenierten (vorzugs weise chlorierten) Methylalkyläther oder Methylbenzyläther bei Raumtemperatur während einer ausreichenden Zeit behandelt, worauf das erhaltene 4′-substituierte Trioxsalen aus dem Reaktionsgemisch durch Kühlen und Ausfällen abgetrennt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Trioxsalen vor oder während der Halo methylierung in konzentrierter Essigsäure gelöst.

Die Halomethylgruppe am Kohlenstoffatom 4′ des Trioxsalen moleküls kann dadurch modifiziert werden, daß man das 4′- Halomethyl-trioxsalen mit Wasser oder einem geeigneten Alkohol zum Rückfluß erhitzt, um das Halogen durch einen Hydroxy- oder Alkoxy-Substituenten zu ersetzen.

Die Halomethylgruppe kann auch dadurch modifiziert werden, daß man das 4′-Halomethyl-trioxsalen mit einem Phthalimid alkalimetallsalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylformamid zu 4′-Phthalimidomethyl-trioxsalen um setzt und das 4′-Phthalimidomethyl-trioxsalen mit Hydrazinhydrat und Aethanol zum Rückfluß erhitzt und danach das gebildete 4′-Aminomethyl-trioxsalen aus dem Reaktions gemisch abtrennt.

Beispiel 1

659 mg Trioxsalen wurde in 75 ml Eisessig unter schwachem Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 5 ml Chlormethyl-Methyläther versetzt. Das Reaktions gemisch wurde 24 Stunden stehengelassen und danach ein zweites Mal mit 5 ml Chlormethyläther versetzt. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgefäß eisgekühlt und nach weiteren 12 Stunden wurde der weiße Niederschlag abgetrennt. Umkristallisation aus Acetonitril liefert 435 mg reines 4′-Chlormethyl-4,5′,8- trimethylpsoralen. Eine weitere Fraktion wurde aus dem Filtrat isoliert, so daß insgesamt 499 mg erhalten wurden. Schmelz punkt 215-217°, NMR (CDCl₃) δ 2,6-2,7 (9 H, m) 4,8 (2 H, s) 6,3 (1 H, s), 7,6 (1 H, s); Massenspektrum m/e (relative Intensität) 276 (m⁺, 48), 278 (m⁺ 2, 15).

Beispiel II

53 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurden in 50 ml destilliertem Wasser 7 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Danach wurde 2 Stunden eisgekühlt, das Produkt abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 25 mg (50,5%) 4′-Hydroxymethyl- 4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 221-224°, NMR (DMSO-d₆) δ 2,5-2,7 (9 H, m), 4,5-4,7 (2 H, m), 5,0-5,2 (1 H, bs), 6,3 (1 H, s), 7,8 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 258 (M⁺, 100) 241 (17).

Beispiel III

78 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurden in 30 ml Methanol 5 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Nach Ent fernung des Lösungsmittels durch Eindampfen wurden 74 mg (97,2%) 4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 171-174° erhalten. NMR (CDCl₃) δ 2,4-2,6 (9 H, m), 3,4 (3 H, s), 4,6 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 272 (M⁺, 93), 241 (100).

Beispiel IV

200 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, 165 mg Phthalimid-Kalium und 20 ml NN-Dimethylformamid wurden 6 Stunden unter konstantem Rühren auf 100° erhitzt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Wasserbad und unter vermindertem Druck abgedampft und man erhielt eine gelbe Paste, die in Chloroform aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen wurde.

Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft und lieferte 222 mg (79,3%) 4′- N-Phthalimidomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelz punkt 267-274°, NMR (CDCl₃) δ 2,5-2,8 (9 H, m), 5,0 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), 7,7-7,8 (7 H, d), 8,0 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 387 (m⁺, 80), 241 (20), 240 (75).

848 mg dieses 4′-N-Phthalimidomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralens, 0,5 ml Hydrazinhydrat (85% in Wasser) und 100 ml 95%iges Aethanol wurden 4 Stunden zum Rückfluß erhitzt und danach noch einmal mit 0,5 ml Hydrazinhydratlösung versetzt. Nach 2 Stunden Rückflußerhitzen war mit Dünnschichtchromatographie kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Das Aethanol wurde abgedampft und der Rückstand in 200 ml 0,1 n-Natronlauge auf genommen, und die Lösung mit 53 ml Portionen Chloroform extra hiert. Man erhielt 193 mg rohes 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethyl psoralen. Zur Herstellung des Hydrochlorids wurde das Amin in 100 ml 1,2 n Salzsäure aufgenommen und die Lösung dreimal mit 30 ml Portionen Chloroform extrahiert um Verunreinigungen zu entfernen. Eindampfen unter vermindertem Druck lieferte das rohe Hydrochlorid, das in 175 ml absolutem Aethanol gelöst und durch Zusatz eines gleichen Volumens Diäthyläther ausgefällt wurde. Nach Kühlen über Nacht (7°) wurden 161 mg reines Hydro chlorid erhalten, Schmelzpunkt 260-269°, NMR-Spektrum des Amins (CDCl₃) δ 1,4-1,6 (2 H, s), 2,6-2,7 (9 H, m), 4,1 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), 7,7 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 257 (M⁺, 36), 240 (100).

Verwandte Derivate können in der gleichen Weise herge stellt werden. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind jedoch die wichtigen Eigenschaften solcher Derivate hohe Löslichkeit in wäßriger Lösung und niedrige Dissoziationskonstante von DNS und/oder RNS.

Für das Studium der Löslichkeit und der Dissoziations konstanten ist es am bequemsten, tritiierte Derivate der Psoralene herzustellen. Sodann können bekannte Zählverfahren angewandt werden, um die Anwesenheit von Psoralen in Lösung oder in Nucleinsäuren zu verfolgen.

Die Tritium-markierten Psoralene können aus Tritium- markiertem Trioxsalen hergestellt werden. Tritiiertes Wasser wird mit normalem Trioxsalen zum Rückfluß erhitzt, wobei ein Austausch des Tritiums mit Trioxsalen-Wasserstoff eintritt. Das tritiierte Trioxsalen wird abgetrennt und zur Herstellung der Psoralene gemäß den vorstehend beschriebenen Beispielen verwendet. Das folgende Beispiel illustriert ein spezifisches Verfahren zur Herstellung von tritiiertem Trioxsalen.

Beispiel V

1153 mg 4,5′,8-Trimethylpsoralen, T₂O (wäßrig, 100 Curie in 4 ml) 675 ml Dioxan und 7,5 ml rauchende Schwefelsäure (30% SO₃) wurden unter konstantem Rühren 2 Stunden zum Rückfluß erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden 125 ml Eis zugesetzt und das Gemisch 1 Stunde eisgekühlt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, luftgetrocknet und lieferte 900 mg (78%) rohes, tritiiertes 4,5′,8-Trimethylpsoralen. 30 mg Rophprodukt wurden in 75 ml 100%igem Aethanol gelöst und mit 2 g Kohle versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten zum Rückfluß erhitzt, heiß über ein gesintertes Glasfilter filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol/Wasser (90 : 10) kristallisiert. Durch analytische Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 98 : 2) wurden mehr als 95% der Zählimpulse im Trimethylpsoralen gefunden. Die spezifische Aktivität wurde bestimmt durch Auszählung eines Aliquots in absolut äthanolischer Lösung bekannter Konzentration in Toluol-Omnifluor. Die spezifische Aktivität war 6,7 × 10⁵ Imp/min. Von diesem Psoralen wurden tritiierte Produkte gemäß Beispiel I-IV hergestellt. Diese wurden verwendet, um ihre Bindungseffektivität mit Nucleinsäure zu studieren. Die Untersuchungen waren darauf gerichtet, Daten über die Löslichkeiten und die Dissoziationskonstanten sowohl mit DNS als auch RNS zu erhalten. Weiterhin wurde die Fähigkeit der Psoralene untersucht, covalente Bindungen mit DNS und RNS einzugehen. Diese Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt:

Zur Feststellung der Dissoziationskonstanten mit DNS und RNS wurde die nicht-covalente Bindung ermittelt. Sie bestimmt die Gegenwart des Psoralens innerhalb der Nucleinsäurehelix und wird in Abwesenheit von Energiestrahlung ermittelt. Wie erwähnt, ist Energiestrahlung erforderlich, um das Psoralen zur covalenten Bindung mit den Nucleinsäurebasen-Paaren zu bringen.

Zur Bestimmung der nicht-covalenten Bindung, wurde Kalbs thymus-DNS (Sigma Typ I) in einem 0,01 m-Tris, 0,001 m-Aethylen- diamin-tetraessigsäurepuffer von pH 8,5 in einer Konzentration von 25 µg pro ml gelöst. Ein Quantum dieser DNS-Lösung wurde in einem Dialysesack (vorbehandelt durch Kochen in NaHCO₃) gebracht und die verschiedenen tritiierten Derivate wurden in der Hälfte der Fälle in den Dialysesack gegeben und in der anderen Hälfte der Fälle der Außenlösung zugesetzt. Das molare Verhältnis von Psoralenmolekülen zu Basenpaaren war etwa 1 : 25. Die Dialysesäckchen wurden in Röhrchen gegeben, die mit 18 ml Puffer gefüllt waren und 48-60 Stunden geschüttelt wurden. Danach wurde die Radioaktivität innerhalb und außerhalb des Dialysesacks und die optische Dichte der DNS-Lösung gemessen. Aus diesen Meßwerten und der spezifischen Akti vität jedes Derivates wurde die Menge des nicht-covalent an die DNS gebundenen Präparate bestimmt. In genau der gleichen Weise wurde die Bindung der Derivate an Drosophila melanogaster Ribosomen-RNS gemessen.

Die Resultate aus den Messungen der Dialysegleichgewichte sind in Tabelle I angegeben. Die Einheiten für die Dissoziations konstante sind Mol/Liter. Löslichkeiten und molare Extinktions koeffizienten ( ε ) wurden in reinem Wasser, die Gleichgewichts konstanten (K _D ) in 0,01 m Tris-Puffer aufgenommen.

Tabelle I

Extinktionskoeffizienten, Löslichkeiten, Dissoziationskonstanten und Konzentrationsverhältnisse von besetzten zu unbesetzten Bindungsstellen in gesättigten Lösungen von Psoralenderivaten

Die Daten für 8-Methoxypsoralen in den Spalten 2-7 in der Tabelle I wurden aus in der Literatur vorliegenden Daten berechnet. Die anderen Daten wurden im Rahmen der Er findung ermittelt.

8-Methoxypsoralen und 4,5′,8-Trimethylpsoralen sind in der Tabelle I als Vergleichssubstanzen mit den erfindungs gemäßen Psoralenen aufgeführt.

Es wurde die covalente Bindung der Psoralene an DNS und RNS untersucht. Um covalente Bindung herzustellen, ist es erforderlich, Strahlungsenergie (Licht) an den Bindungsstellen einwirken zu lassen. Diese Untersuchungen wurden wie folgt ausgeführt:

Die in den Untersuchungen für die covalente Bindung verwendete DNS und RNS wurde bereits beschrieben. Proben jeder Nucleinsäure wurden in Konzentrationen von 25 µg pro ml in 0,01 m Tris und 0,001 m Aethylendiamintetraessigsäure puffer bereitet. Die radioaktiven Psoralenderivate wurden im Verhältnis 1 Psoralen auf 3 Basenpaare zugesetzt. Die Be strahlung wurde mit einer der beiden nachstehend beschriebenen Vorrichtungen durchgeführt.

Bestrahlungen mit niederer Intensität wurden mit einem modifizierten Diapositiv-Projektor durchgeführt, der mit einer 400-Watt-Quecksilberdampflampe ausgerüstet war. Das Licht wurde durch eine Kobaltnitratlösung gefiltert; die auf die Probe eingestrahlte Intensität betrug 4-6 mW/cm². Die Bestrahlungen mit hoher Intensität wurden in einer Vorrichtung vor genommen, bei der zwei 400-Watt-Quecksilberdampflampen beid seitig von der Probe in einem Abstand von 4 cm angebracht waren. Der Probenbehälter wurde durch zirkulierende Kobaltnitrat lösung (40 Gewichtsprozent) auf 10° gekühlt. Die Kobaltlösung diente als Ultraviolettfilter, das einen Durchlässigkeits bereich von 340-380 nm mit einer maximalen Durchlässigkeit bei 365 nm aufwies. Die Lichtintensität an der Oberfläche im Inneren der Bestrahlungskammer betrug etwa 100 mW/cm². Das Nucleinsäure-Psoralengemisch wurde in die Probenkammer gegeben und während der Bestrahlung dauernd gerührt. Teile der Lösung wurden nach 20, 40 und 60 Minuten entnommen, zwei mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert, um nicht umgesetztes Psoralen zu entfernen, und anschließend erschöpfend gegen 0,01 m Tris, 0,001 m Aethylendiamintetraessigsäurepuffer dialysiert. Für eine erfolgreiche Extraktion nicht gebundenen Psoralens durch Chloroform/Isoamylalkohol war es erforderlich, daß die wäßrige Phase mindestens 0,15 molar an Kochsalz war. Schließlich wurde die optische Dichte des Nucleinsäure psoralengemisches und dessen Radioaktivität bestimmt, woraus sich die Menge des covalent an DNS oder RNS gebundenen Derivats ergab. Die Probenentnahme erlaubte auch eine Verfolgung der Kinetik der covalenten Bindung.

Die Tabelle II enthält die Ergebnisse dieser Untersuchungen in bezug auf DNS.

Tabelle II

Photoaddition von Psoralenderivaten bei niederer Intensität in einer Lösung mit 25 µg/ml DNS und einem molaren Psoralen: Basenpaar-Verhältnis von 1 : 3-

Aus den in Tabelle II wiedergegebenen Daten wird ersichtlich, daß 4′-Aminomethyltrioxsalen mit DNS viel schneller als Trioxsalen reagiert, welches wiederum eine größere Anfangsrate der photochemischen Bindung besitzt als 4′-Hydroxymethyl-tri oxsalen. Bei einer Bestrahlungszeit von 90 Minuten beträgt die Anzahl der gebundenen Mole Psoralen pro Mol Basenpaar 0,18 für die Aminomethylverbindung, während die Werte für Trioxsalen und die Hydroxymethylverbindung 0,09 bzw. 0,06 sind. Die Tabelle II zeigt auch, daß nach 90 Minuten Bestrahlung über die Hälfte der Moleküle des 4′-Aminomethyl-trioxsalens in Lösung covalent an DNS gebunden sind, während mehr als 80% des 4-Hydroxymethyl-trioxsalens frei in Lösung bleibt. Diese Unterschiede resultieren sehr wahrscheinlich aus dem Einfluß der Molekularstruktur der verschiedenen Psoralene auf ihre Löslichkeiten, photochemische Reaktivität und auf die Photodestruktion der Verbindungen selbst.

Die Tabelle III gibt die Resultate der Hochenergie- Bestrahlung auf die covalente Bindung von Psoralen und DNS wieder:

Tabelle III

Photoaddition von Psoralenderivaten bei hoher Intensität in Lösung mit 25 µg/ml DNS und einem Psoralen: Basenpaar-Ver hältnis von 1 : 3.

Die Tabelle IV gibt die Resultate der covalenten Bindung der Psoralene mit RNS bei Bestrahlung mit hoher Intensität wider:

Tabelle IV

Photoaddition von Psoralenderivaten mit hoher Intensität in einer Lösung mit 25 µg/ml RNS und einem Psoralen: Basenpaar- Verhältnis von 1 : 3.

Aus den in den Tabellen I, II, III und IV enthaltenen Daten können die folgenden Schlußfolgerungen gezogen werden:

Die Tabelle I mit den Dissoziationskonstanten für die Gleich gewichtsbindung an DNS zeigt, daß 4′-Aminomethyl-4,5′,8-tri methylpsoralen etwa 8mal stärker an DNS gebunden wird als Trioxsalen. Die Bindung von Trioxsalen ist 5mal stärker als 4′-Hydroxymethyl- und 2mal stärker als 4′-Methoxymethyl-triox salen. Diese beiden neuen Derivate werden aber noch 10mal stärker an DNS gebunden als Methoxsalen, das andere kommerziell verfügbare Psoralen.

Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß die relativen Löslichkeiten der Psoralene in der Reihenfolge 4′-Aminomethyl- trioxsalen, 4′-Hydroxymethyl-trioxsalen, 4′-Methoxymethyl-triox salen, Methoxsalen, und Trioxsalen etwa 10,000 : 68 : 17 : 80 : 1 sind. Wenn man die molare Löslichkeit durch die Dissoziationskonstante teilt, wird ersichtlich, daß es beim Gleichgewicht in einer mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten Lösung nicht möglich ist, die DNS-Bindungsstellen mit Trioxsalen oder Methoxsalen abzusättigen. Bestenfalls kommt etwa ein Psoralen auf 20 Basen paare. Die Spalte 5 in Tabelle I gibt das Verhältnis von ge bundenen zu freien Stellen in einer mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten DNS-Lösung wieder. Es kann davon ausge gangen werden, daß das 4′-Hydroxymethyl-trioxsalen und das 4′-Methoxymethyl-trioxsalen die Bindungsstellen an der DNS nahe zu sättigt, wobei ein Psoralen auf 3 Basenpaare [(PS)]/(S) = 0,5] kommt, während sich für das 4′-Aminoäthyl-trioxsalen eine 10⁴fach stärkere Effektivität für die Erreichung dieses Sätti gungszustandes berechnet (es ist 150mal löslicher als 4′- Hydroxymethyl-trioxsalen und wird etwa 100 ml stärker gebunden).

Die erfindungsgemäßen Psoralene sind auch bei der Inaktivierung von RNS-Viren verwendbar. In dieser Beziehung zeigen sie eine Aktivität, die signifikant höher ist als die anderer bekannter Psoralene. Bei hohen Dosierungen, z. B. 30 µg/ml, sind das 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen, das 4′-Methoxy methyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen und das 4′-Aminomethyl-4,5′,8- trimethyl-psoralen alle beinahe 1000mal wirksamer als das kommerziell verfügbare 4,5′,8-Trimethyl-psoralen bei der Inaktivierung des Vesicular-Stomatitis-Virus, eines menschlichen RNS- Virus.

Diese hervorragende Wirksamkeit ergibt sich aus der Fig. 1 der Zeichnungen, wobei die Kurven das Überleben von plaque- bildenden Einheiten von Vesicular-Stomatitis-Viren als Funktion der Bestrahlungszeit mit langwelligem UV in Gegenwart des angegebenen Psoralens widergeben. Bei den angegebenen Dosierungs raten (etwa 20-30 µg/ml) wird die enorme Überlegenheit der erfindungsgemäßen Psoralene über Trioxsalen ohne weiteres er sichtlich. Alle drei erfindungsgemäßen Psoralene sind bei die sen hohen Dosierungen im wesentlichen äquivalent. Dies läßt sich aus ihren Dissoziationskonstanten K _D , die in Tabelle I angegeben sind, voraussagen und aus ihren hohen Löslichkeiten, die früher erwähnt wurden (im Falle des 4′-Methoxymethyl-triox salens ist die Lösung übersättigt). Bei den wiedergegebenen Dosierungsraten ist die RNS mit nicht-covalent gebundenen, ein gelagerten Psoralenen fast gesättigt. Somit dürfen alle drei Psoralene in der Aktivität äquivalent sein. Das Trioxsalen ist jedoch nur bis zu 0,6 µg/ml löslich und eine Steigerung seiner Konzentration von 10 µg/ml auf 30 µg/ml hat keine Wirkung auf seine Fähigkeit, das Virus zu inaktivieren.

Fig. 2 der Zeichnungen gibt ähnliche Kurven wie in Fig. 1 wieder, jedoch resultieren die Werte von wesentlich geringeren Konzentrationen an Psoralen, d. h. 1-3 µg/ml. Fig. 2 zeigt auch die unbestrittene Überlegenheit des 4′-Aminomethyl-4,5′,8- trimethyl-psoralens über alle anderen Psoralene, sowohl die er findungsgemäßen als auch das kommerzielle Trioxsalen. Diese Überlegenheit des 4′-Aminomethyl-Derivats ergibt sich aus seiner stärkeren Bindung an die Nucleinsäuren, was auch aus der Dissoziationskonstante K _D (siehe Tabelle I) ersichtlich wird.

Die in Fig. 1 und 2 wiedergegebenen Daten wurden unter Ver wendung folgender Verfahren erhalten:

500 µl-phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 × 10⁴ Virus-plaque-bildenden Einheiten wurden in Petrischalen von 3,5 cm Durchmesser gegeben und in Gegenwart oder Abwesenheit des Psoralens mit langwelligem UV bestrahlt. Nach verschiedenen Zeitintervallen wurden 50-µl-Proben entnommen und die Menge der Virus-plaque-bildenden Einheiten titriert. Verdünnte Lösungen der Proben wurden auf in Plastikschalen gezogene primäre Hühner-Fibroblasten gebracht. Nach Absorption des Virus wurden die Kulturen mit Nährmedium, das 20% Kalbsserum und 3% Methyl cellulose enthielt, überdeckt. Nach 2 bis 4 Tagen Inkubation bei 35°C wurde Neutralrot zugegeben. Das Virus war Vesicular- Stomatitis-Virus Indiana.

In Fig. 1 bezeichnen die vollen Punkte (⚫) nur Licht, Kreise (○) 30 µg/ml Trioxsalen, die Quadrate () 30 µg/ml 4′-Hydroxy methyl-trioxsalen, die offenen Dreiecke (∆) 30 µg/ml 4′-Triox salen und die vollen Dreicke (▲) 20 µg/ml 4′-Aminomethyl- trioxsalen. In Fig. 2 bezeichnen die vollen Punkte (⚫) nur Licht, die Kreise (○) 10 µg/ml Trioxsalen, die Quadrate () 1 µg/ml 4′-Hydroxymethyl-trioxsalen, die offenen Dreiecke (∆) 3 µg/ml 4′-Methoxymethyl-trioxsalen und die vollen Dreiecke (▲) 2 µg/ml 4′-Aminomethyl-trioxsalen.

Claims

1. 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate der allgemeinen Struk turformel: in der X für eine Halogenalkyl-, Alkohol-, Aether- oder Aminoalkylgruppe steht, in denen die Alkylreste jeweils bis zu 7 C-Atome aufweisen können.

2. 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.

3. 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.

4. 4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.

5. 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen-hydrochlorid.

6. Verfahren zur Herstellung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen- Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß man Trioxsalen in an sich bekannter Weise mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt.

7. Verwendung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Desoxyribo nucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren mit covalent gebun denen 4′-substituiertem 4,5′,8-Trimethyl-psoralen, wobei man Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure mit einer Lösung eines der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate behandelt und die Lösung bestrahlt.

8. Verwendung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Inaktivierung von Viren, wobei man Viren mit einem 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivat in Kontakt bringt und dann bestrahlt.