DE2746942C2 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft
Derivate des 4,5′,8-Trimethylpsoralens (Trioxsalen)
mit einem organischen funktionellen Substituenten am 4-Kohlen
stoffatom. Die neuen 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate besitzen die allgemeine
Formel
worin X für eine Halogenalkyl,
Alkohol-, Aether- oder
Aminoalkylgruppe steht, in denen die Alkylreste
jeweils bis zu 7 C-Atome aufweisen können.
Der Ausdruck Alkyl bezeichnet vorzugsweise
Methyl, Aethyl und Propyl,
wobei Methyl bevorzugt ist. Ein Alkohol-Substituent ist vor
zugsweise ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit einer oder
mehreren Hydroxygruppen, z. B. Hydroxy-nieder-alkyl. Ein Aether-
Substituent ist vorzugsweise ein nieder-Alkoxy-nieder-alkyl
rest.
Beispiele von erfindungsgemäßen Psoralenderivaten sind
4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen-hydrochlorid.
4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen,
4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen-hydrochlorid.
In anderer Beziehung betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Psoralenderivate zur Herstellung von Desoxyribo
nucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren, an welche an mindestens
einer Bindungsstelle ein 4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethylpsoralens
covalent gebunden ist.
Die Erfindung ermöglicht ein Verfahren
zum Eingreifen in die Replikation von Nucleinsäuren, wobei
man Nucleinsäuren mit einem
4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethylpsoralens zusammenbringt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung dieser Psoralenderivate in einem Verfahren
zur Inaktivierung von Viren,
wobei man Viren mit einem 4′-Derivat des 4,5′,8-Trimethyl
psoralens zusammenbringt und diese dann einer Energiestrahlung
aussetzt.
Psoralene sind lineare Isomere der Furocumarinfamilie
und kommen in der Natur in gewissen Früchten und Samen,
z. B. Ammi majus und psoralea corylifolia vor. Extrakte dieser
Früchte und Samen sind seit alter Zeit als Hautsensibilisie
rungsmittel bei der Behandlung von Vitiligo in Gebrauch. Die
topische Anwendung von Psoralenextrakten und anschließende
Bestrahlung mit Licht resultiert in einer Stimulierung der
Melaninproduktion und bewirkt so einen Hautgerbungseffekt.
In den vergangenen Jahren sind Psoralene in der Photo
chemotherapie von Psoriasis verwendet worden. Bei dieser
Behandlung werden Psoralene dem Patienten oral oder topisch
verabreicht. Danach wird die Haut einer Ultraviolett-Bestrahlung
ausgesetzt.
Mit zunehmendem Interesse an der Molekularbiologie und
deren Studium sind Psoralene in bezug auf ihre Fähigkeit,
covalente Bindungen mit Nucleinsäuren zu bilden, untersucht
worden. Infolge ihrer planaren Struktur können sich Psoralene
zwischen die Basenpaare der Doppelhelix-Molekularstruktur
von Nucleinsäuren einlagern. Auf Bestrahlung mit Licht geeig
neter Wellenlänge können die Psoralene covalente Bindungen
mit den Pyrimidinnucleotiden, welche als integrale Bestand
teile der Nucleinsäurestränge auftreten, bilden. Das Zustande
bringen covalent gebundener Psoralenbrücken oder Querverbindungen
zwischen Nucleinsäuresträngen der Doppelhelix stellt ein
weiteres Werkzeug bei in vivo-Studien der Sekundärstruktur
von Nucleinsäuren dar. Zusätzlich sind die Psoralene ein
Mittel zur Inaktivierung von Viren bei der Vaccineproduktion
und sie sind auch potentielle chemotherapeutische Mittel.
Die covalent gebundenen Psoralene wirken als Hemmer der DNS-
Replikation und haben somit die Fähigkeit, den Replikations
prozeß zu verlangsamen oder zu stoppen. Die covalente Bindung
kann nur in einem Zweistufenverfahren hergestellt werden,
indem zuerst das Psoralen sich in die Nucleinsäurehelix ein
lagert und sodann jene Stellen der elektromagnetischen Strahlung
ausgesetzt werden. Man erkennt somit sofort, daß der Vorgang
der covalenten Bindung sowohl zeitlich als auch räumlich
kontrolliert werden kann.
Es ist auch ersichtlich, daß Querverbindungen nur bei
solchen Psoralenmolekülen auftreten können, die zur richtigen
Zeit am richtigen Platz sind, d. h. ein Psoralenmolekül muß
sich in der richtigen Stellung in genau dem Moment eingelagert
haben, in dem die Strahlungsenergie an dieser Stelle auftrifft.
Die Anwesenheit eines Psoralenmoleküls an der richtigen
Position hängt von der Löslichkeit des Psoralens in wäßriger
Lösung und von der Dissoziationskonstante für die nicht-covalente
Bindung des Psoralens zu Nucleinsäuren ab. Je höher somit
die Löslichkeit ist, desto größer ist die Anzahl der Moleküle
in dem umgebenden flüssigen Medium, die für die Bindungsstellen
verfügbar sind. In ähnlicher Weise ist die Zahl der Psoralene,
die eine potentielle Bindungsstelle irgendwann zur richtigen
Zeit besetzen umso größer, je niedriger die Dissoziations
konstante ist. Die Dissoziationskonstante K D für die nicht-
covalente Bindung des Psoralens an die Nucleinsäure wird durch
den Ausdruck
definiert. Dabei ist (P) die Konzentration des freien Psoralens,
(S) die Konzentration der nicht besetzten Bindungsstellen, wobei
jedes Basenpaar an einer Nucleinsäure als Bindungsstelle be
trachtet wird, und (PS) die Konzentration von Psoralen-gebundenen
Stellen.
Die neuen Psoralenderivate können im wesentlichen in
der gleichen Weise wie bekannte Psoralene verwendet werden,
d. h. als Hautsensibilisierungsmittel, z. B. in der Behandlung
von Vitiligo und Psoriasis; und als Mittel zur Inaktivierung
von Viren.
Die neuen, oben definierten Psoralenderivate sind
bekannten Psoralenen in bezug auf die Monoaddition an Nuclein
säuren überlegen. Die Überlegenheit bezieht sich auf die
resultierende Dichte covalent gebundenen Psoralens an der
Nucleinsäure, ohne daß an der allgemeinen Eingangskonzentration
an Bindungsstellen und der totalen Psoralenkonzentration
etwas geändert wird.
Die neuen Psoralene haben zwei Vorteile, d. h. sie zeigen
verbesserte Löslichkeit in Wasser und/oder besitzen eine
niedrige Dissoziationskonstante von DNS und/oder RNS.
Das 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen
kann auch als
Zwischenprodukt bei der Herstellung der übrigen erfindungsgemäßen
Psoralene verwendet werden.
Im Falle des 4′-Chlormethyl
psoralens wird der Chlormethylsubstituent in wäßriger Lösung
leicht hydrolysiert und es ist infolgedessen schwierig, dessen
spezifische Aktivität in bezug auf die Bindung an DNS oder
RNS festzustellen.
Das 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, das 4′-
Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen und das 4′-Aminomethyl-
4,5′,8-trimethylpsoralen zeigen alle ausgezeichnete Reaktivität
mit DNS, wie man nachfolgend sehen wird.
Alle erfindungsgemäßen Psoralene lassen sich bequem
aus 4,5′,8-Trimethylpsoralen (Trioxsalen) herstellen, obschon
auch andere bekannte Synthesemethoden verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Psoralene können dadurch hergestellt
werden, daß man Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl,
Alkohol, Aether oder Aminoalkyl in einer Halomethylierungs
reaktion oder einer Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt. Bei
spielsweise wird Trioxsalen mit einem halogenierten (vorzugs
weise chlorierten) Methylalkyläther oder Methylbenzyläther
bei Raumtemperatur während einer ausreichenden Zeit behandelt,
worauf das erhaltene 4′-substituierte Trioxsalen aus dem
Reaktionsgemisch durch Kühlen und Ausfällen abgetrennt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird das Trioxsalen vor oder während der Halo
methylierung in konzentrierter Essigsäure gelöst.
Die Halomethylgruppe am Kohlenstoffatom 4′ des Trioxsalen
moleküls
kann dadurch modifiziert werden, daß man das 4′-
Halomethyl-trioxsalen mit Wasser oder einem geeigneten Alkohol
zum Rückfluß erhitzt, um das Halogen durch einen Hydroxy-
oder Alkoxy-Substituenten zu ersetzen.
Die Halomethylgruppe kann auch dadurch modifiziert werden,
daß man das 4′-Halomethyl-trioxsalen mit einem Phthalimid
alkalimetallsalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels
wie Dimethylformamid zu 4′-Phthalimidomethyl-trioxsalen um
setzt und das 4′-Phthalimidomethyl-trioxsalen
mit Hydrazinhydrat und Aethanol zum Rückfluß erhitzt und
danach das gebildete 4′-Aminomethyl-trioxsalen aus dem Reaktions
gemisch abtrennt.
659 mg Trioxsalen wurde in 75 ml Eisessig unter schwachem
Erwärmen gelöst. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt
und mit 5 ml Chlormethyl-Methyläther versetzt. Das Reaktions
gemisch wurde 24 Stunden stehengelassen und danach ein zweites
Mal mit 5 ml Chlormethyläther versetzt. Nach 48 Stunden wurde
das Reaktionsgefäß eisgekühlt und nach weiteren 12 Stunden
wurde der weiße Niederschlag abgetrennt. Umkristallisation
aus Acetonitril liefert 435 mg reines 4′-Chlormethyl-4,5′,8-
trimethylpsoralen. Eine weitere Fraktion wurde aus dem Filtrat
isoliert, so daß insgesamt 499 mg erhalten wurden. Schmelz
punkt 215-217°, NMR (CDCl3) δ 2,6-2,7 (9 H, m) 4,8 (2 H, s)
6,3 (1 H, s), 7,6 (1 H, s); Massenspektrum m/e (relative
Intensität) 276 (m⁺, 48), 278 (m⁺ 2, 15).
53 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurden
in 50 ml destilliertem Wasser 7 Stunden zum Rückfluß erhitzt.
Danach wurde 2 Stunden eisgekühlt, das Produkt abfiltriert
und getrocknet. Man erhielt 25 mg (50,5%) 4′-Hydroxymethyl-
4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 221-224°,
NMR (DMSO-d6) δ 2,5-2,7 (9 H, m), 4,5-4,7 (2 H, m), 5,0-5,2
(1 H, bs), 6,3 (1 H, s), 7,8 (1 H, s), Massenspektrum m/e
(relative Intensität) 258 (M⁺, 100) 241 (17).
78 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen wurden
in 30 ml Methanol 5 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Nach Ent
fernung des Lösungsmittels durch Eindampfen wurden 74 mg
(97,2%) 4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt
171-174° erhalten. NMR (CDCl3) δ 2,4-2,6 (9 H, m), 3,4
(3 H, s), 4,6 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), Massenspektrum m/e
(relative Intensität) 272 (M⁺, 93), 241 (100).
200 mg 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen, 165 mg
Phthalimid-Kalium und 20 ml NN-Dimethylformamid wurden
6 Stunden unter konstantem Rühren auf 100° erhitzt. Das
Lösungsmittel wurde auf dem Wasserbad und unter vermindertem
Druck abgedampft und man erhielt eine gelbe Paste, die in
Chloroform aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen wurde.
Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und eingedampft und lieferte 222 mg (79,3%) 4′-
N-Phthalimidomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralen vom Schmelz
punkt 267-274°, NMR (CDCl3) δ 2,5-2,8 (9 H, m), 5,0 (2 H, s),
6,3 (1 H, s), 7,7-7,8 (7 H, d), 8,0 (1 H, s), Massenspektrum m/e
(relative Intensität) 387 (m⁺, 80), 241 (20), 240 (75).
848 mg dieses 4′-N-Phthalimidomethyl-4,5′,8-trimethylpsoralens,
0,5 ml Hydrazinhydrat (85% in Wasser) und 100 ml 95%iges
Aethanol wurden 4 Stunden zum Rückfluß erhitzt und danach
noch einmal mit 0,5 ml Hydrazinhydratlösung versetzt. Nach
2 Stunden Rückflußerhitzen war mit Dünnschichtchromatographie
kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Das Aethanol wurde
abgedampft und der Rückstand in 200 ml 0,1 n-Natronlauge auf
genommen, und die Lösung mit 53 ml Portionen Chloroform extra
hiert. Man erhielt 193 mg rohes 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethyl
psoralen. Zur Herstellung des Hydrochlorids wurde das Amin
in 100 ml 1,2 n Salzsäure aufgenommen und die Lösung dreimal
mit 30 ml Portionen Chloroform extrahiert um Verunreinigungen
zu entfernen. Eindampfen unter vermindertem Druck lieferte
das rohe Hydrochlorid, das in 175 ml absolutem Aethanol gelöst
und durch Zusatz eines gleichen Volumens Diäthyläther ausgefällt
wurde. Nach Kühlen über Nacht (7°) wurden 161 mg reines Hydro
chlorid erhalten, Schmelzpunkt 260-269°, NMR-Spektrum des
Amins (CDCl3) δ 1,4-1,6 (2 H, s), 2,6-2,7 (9 H, m), 4,1 (2 H, s),
6,3 (1 H, s), 7,7 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative
Intensität) 257 (M⁺, 36), 240 (100).
Verwandte Derivate können in der gleichen Weise herge
stellt werden. Für die erfindungsgemäßen Zwecke sind jedoch
die wichtigen Eigenschaften solcher Derivate hohe Löslichkeit
in wäßriger Lösung und niedrige Dissoziationskonstante von
DNS und/oder RNS.
Für das Studium der Löslichkeit und der Dissoziations
konstanten ist es am bequemsten, tritiierte Derivate der
Psoralene herzustellen. Sodann können bekannte Zählverfahren
angewandt werden, um die Anwesenheit von Psoralen in Lösung
oder in Nucleinsäuren zu verfolgen.
Die Tritium-markierten Psoralene können aus Tritium-
markiertem Trioxsalen hergestellt werden. Tritiiertes Wasser
wird mit normalem Trioxsalen zum Rückfluß erhitzt, wobei ein
Austausch des Tritiums mit Trioxsalen-Wasserstoff eintritt.
Das tritiierte Trioxsalen wird abgetrennt und zur Herstellung
der Psoralene gemäß den vorstehend beschriebenen Beispielen
verwendet. Das folgende Beispiel illustriert ein spezifisches
Verfahren zur Herstellung von tritiiertem Trioxsalen.
1153 mg 4,5′,8-Trimethylpsoralen, T2O (wäßrig, 100 Curie
in 4 ml) 675 ml Dioxan und 7,5 ml rauchende Schwefelsäure
(30% SO3) wurden unter konstantem Rühren 2 Stunden zum Rückfluß
erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden
125 ml Eis zugesetzt und das Gemisch 1 Stunde eisgekühlt.
Der Niederschlag wurde abfiltriert, luftgetrocknet und lieferte
900 mg (78%) rohes, tritiiertes 4,5′,8-Trimethylpsoralen.
30 mg Rophprodukt wurden in 75 ml 100%igem Aethanol gelöst
und mit 2 g Kohle versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten
zum Rückfluß erhitzt, heiß über ein gesintertes Glasfilter
filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde
aus Methanol/Wasser (90 : 10) kristallisiert. Durch analytische
Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 98 : 2) wurden
mehr als 95% der Zählimpulse im Trimethylpsoralen gefunden.
Die spezifische Aktivität wurde bestimmt durch Auszählung
eines Aliquots in absolut äthanolischer Lösung bekannter
Konzentration in Toluol-Omnifluor. Die spezifische Aktivität
war 6,7 × 105 Imp/min. Von diesem Psoralen wurden tritiierte
Produkte gemäß Beispiel I-IV hergestellt. Diese wurden
verwendet, um ihre Bindungseffektivität mit Nucleinsäure zu
studieren. Die Untersuchungen waren darauf gerichtet, Daten
über die Löslichkeiten und die Dissoziationskonstanten
sowohl mit DNS als auch RNS zu erhalten. Weiterhin wurde die
Fähigkeit der Psoralene untersucht, covalente Bindungen mit
DNS und RNS einzugehen. Diese Untersuchungen wurden wie
folgt durchgeführt:
Zur Feststellung der Dissoziationskonstanten mit DNS
und RNS wurde die nicht-covalente Bindung ermittelt. Sie bestimmt
die Gegenwart des Psoralens innerhalb der Nucleinsäurehelix
und wird in Abwesenheit von Energiestrahlung ermittelt.
Wie erwähnt, ist Energiestrahlung erforderlich, um das Psoralen
zur covalenten Bindung mit den Nucleinsäurebasen-Paaren zu
bringen.
Zur Bestimmung der nicht-covalenten Bindung, wurde Kalbs
thymus-DNS (Sigma Typ I) in einem 0,01 m-Tris, 0,001 m-Aethylen-
diamin-tetraessigsäurepuffer von pH 8,5 in einer Konzentration
von 25 µg pro ml gelöst. Ein Quantum dieser DNS-Lösung wurde
in einem Dialysesack (vorbehandelt durch Kochen in NaHCO3)
gebracht und die verschiedenen tritiierten Derivate wurden
in der Hälfte der Fälle in den Dialysesack gegeben und in der
anderen Hälfte der Fälle der Außenlösung zugesetzt. Das
molare Verhältnis von Psoralenmolekülen zu Basenpaaren war
etwa 1 : 25. Die Dialysesäckchen wurden in Röhrchen gegeben,
die mit 18 ml Puffer gefüllt waren und 48-60 Stunden geschüttelt
wurden. Danach wurde die Radioaktivität innerhalb und außerhalb
des Dialysesacks und die optische Dichte der DNS-Lösung
gemessen. Aus diesen Meßwerten und der spezifischen Akti
vität jedes Derivates wurde die Menge des nicht-covalent
an die DNS gebundenen Präparate bestimmt. In genau der gleichen
Weise wurde die Bindung der Derivate an Drosophila melanogaster
Ribosomen-RNS gemessen.
Die Resultate aus den Messungen der Dialysegleichgewichte
sind in Tabelle I angegeben. Die Einheiten für die Dissoziations
konstante sind Mol/Liter. Löslichkeiten und molare Extinktions
koeffizienten ( ε ) wurden in reinem Wasser, die Gleichgewichts
konstanten (K D ) in 0,01 m Tris-Puffer aufgenommen.
Die Daten für 8-Methoxypsoralen in den Spalten 2-7
in der Tabelle I wurden aus in der Literatur vorliegenden
Daten berechnet. Die anderen Daten wurden im Rahmen der Er
findung ermittelt.
8-Methoxypsoralen und 4,5′,8-Trimethylpsoralen sind in
der Tabelle I als Vergleichssubstanzen mit den erfindungs
gemäßen Psoralenen aufgeführt.
Es wurde die covalente Bindung der Psoralene an DNS und
RNS untersucht. Um covalente Bindung herzustellen, ist es
erforderlich, Strahlungsenergie (Licht) an den Bindungsstellen
einwirken zu lassen. Diese Untersuchungen wurden wie folgt
ausgeführt:
Die in den Untersuchungen für die covalente Bindung
verwendete DNS und RNS wurde bereits beschrieben. Proben
jeder Nucleinsäure wurden in Konzentrationen von 25 µg pro ml
in 0,01 m Tris und 0,001 m Aethylendiamintetraessigsäure
puffer bereitet. Die radioaktiven Psoralenderivate wurden im
Verhältnis 1 Psoralen auf 3 Basenpaare zugesetzt. Die Be
strahlung wurde mit einer der beiden nachstehend beschriebenen
Vorrichtungen durchgeführt.
Bestrahlungen mit niederer Intensität wurden mit einem
modifizierten Diapositiv-Projektor durchgeführt, der mit einer
400-Watt-Quecksilberdampflampe ausgerüstet war. Das Licht
wurde durch eine Kobaltnitratlösung gefiltert; die auf die
Probe eingestrahlte Intensität betrug 4-6 mW/cm2. Die Bestrahlungen
mit hoher Intensität wurden in einer Vorrichtung vor
genommen, bei der zwei 400-Watt-Quecksilberdampflampen beid
seitig von der Probe in einem Abstand von 4 cm angebracht waren.
Der Probenbehälter wurde durch zirkulierende Kobaltnitrat
lösung (40 Gewichtsprozent) auf 10° gekühlt. Die Kobaltlösung
diente als Ultraviolettfilter, das einen Durchlässigkeits
bereich von 340-380 nm mit einer maximalen Durchlässigkeit
bei 365 nm aufwies. Die Lichtintensität an der Oberfläche
im Inneren der Bestrahlungskammer betrug etwa 100 mW/cm2.
Das Nucleinsäure-Psoralengemisch wurde in die Probenkammer
gegeben und während der Bestrahlung dauernd gerührt. Teile
der Lösung wurden nach 20, 40 und 60 Minuten entnommen, zwei
mal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert, um nicht
umgesetztes Psoralen zu entfernen, und anschließend erschöpfend
gegen 0,01 m Tris, 0,001 m Aethylendiamintetraessigsäurepuffer
dialysiert. Für eine erfolgreiche Extraktion nicht gebundenen
Psoralens durch Chloroform/Isoamylalkohol war es erforderlich,
daß die wäßrige Phase mindestens 0,15 molar an Kochsalz
war. Schließlich wurde die optische Dichte des Nucleinsäure
psoralengemisches und dessen Radioaktivität bestimmt, woraus
sich die Menge des covalent an DNS oder RNS gebundenen Derivats
ergab. Die Probenentnahme erlaubte auch eine Verfolgung der
Kinetik der covalenten Bindung.
Die Tabelle II enthält die Ergebnisse dieser Untersuchungen
in bezug auf DNS.
Aus den in Tabelle II wiedergegebenen Daten wird ersichtlich,
daß 4′-Aminomethyltrioxsalen mit DNS viel schneller als
Trioxsalen reagiert, welches wiederum eine größere Anfangsrate
der photochemischen Bindung besitzt als 4′-Hydroxymethyl-tri
oxsalen. Bei einer Bestrahlungszeit von 90 Minuten beträgt
die Anzahl der gebundenen Mole Psoralen pro Mol Basenpaar
0,18 für die Aminomethylverbindung, während die Werte für
Trioxsalen und die Hydroxymethylverbindung 0,09 bzw. 0,06 sind.
Die Tabelle II zeigt auch, daß nach 90 Minuten Bestrahlung
über die Hälfte der Moleküle des 4′-Aminomethyl-trioxsalens
in Lösung covalent an DNS gebunden sind, während mehr als
80% des 4-Hydroxymethyl-trioxsalens frei in Lösung bleibt.
Diese Unterschiede resultieren sehr wahrscheinlich aus dem
Einfluß der Molekularstruktur der verschiedenen Psoralene
auf ihre Löslichkeiten, photochemische Reaktivität und auf
die Photodestruktion der Verbindungen selbst.
Die Tabelle III gibt die Resultate der Hochenergie-
Bestrahlung auf die covalente Bindung von Psoralen und DNS
wieder:
Die Tabelle IV gibt die Resultate der covalenten Bindung
der Psoralene mit RNS bei Bestrahlung mit hoher Intensität
wider:
Aus den in den Tabellen I, II, III und IV enthaltenen
Daten können die folgenden Schlußfolgerungen gezogen werden:
Die Tabelle I mit den Dissoziationskonstanten für die Gleich
gewichtsbindung an DNS zeigt, daß 4′-Aminomethyl-4,5′,8-tri
methylpsoralen etwa 8mal stärker an DNS gebunden wird als
Trioxsalen. Die Bindung von Trioxsalen ist 5mal stärker als
4′-Hydroxymethyl- und 2mal stärker als 4′-Methoxymethyl-triox
salen. Diese beiden neuen Derivate werden aber noch 10mal
stärker an DNS gebunden als Methoxsalen, das andere kommerziell
verfügbare Psoralen.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß die relativen
Löslichkeiten der Psoralene in der Reihenfolge 4′-Aminomethyl-
trioxsalen, 4′-Hydroxymethyl-trioxsalen, 4′-Methoxymethyl-triox
salen, Methoxsalen, und Trioxsalen etwa 10,000 : 68 : 17 : 80 : 1 sind.
Wenn man die molare Löslichkeit durch die Dissoziationskonstante
teilt, wird ersichtlich, daß es beim Gleichgewicht in einer
mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten Lösung nicht möglich
ist, die DNS-Bindungsstellen mit Trioxsalen oder Methoxsalen
abzusättigen. Bestenfalls kommt etwa ein Psoralen auf 20 Basen
paare. Die Spalte 5 in Tabelle I gibt das Verhältnis von ge
bundenen zu freien Stellen in einer mit dem entsprechenden
Psoralen gesättigten DNS-Lösung wieder. Es kann davon ausge
gangen werden, daß das 4′-Hydroxymethyl-trioxsalen und das
4′-Methoxymethyl-trioxsalen die Bindungsstellen an der DNS nahe
zu sättigt, wobei ein Psoralen auf 3 Basenpaare [(PS)]/(S) =
0,5] kommt, während sich für das 4′-Aminoäthyl-trioxsalen eine
104fach stärkere Effektivität für die Erreichung dieses Sätti
gungszustandes berechnet (es ist 150mal löslicher als 4′-
Hydroxymethyl-trioxsalen und wird etwa 100 ml stärker gebunden).
Die erfindungsgemäßen Psoralene sind auch bei der Inaktivierung
von RNS-Viren verwendbar. In dieser Beziehung zeigen
sie eine Aktivität, die signifikant höher ist als die anderer
bekannter Psoralene. Bei hohen Dosierungen, z. B. 30 µg/ml, sind
das 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen, das 4′-Methoxy
methyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen und das 4′-Aminomethyl-4,5′,8-
trimethyl-psoralen alle beinahe 1000mal wirksamer als das
kommerziell verfügbare 4,5′,8-Trimethyl-psoralen bei der Inaktivierung
des Vesicular-Stomatitis-Virus, eines menschlichen RNS-
Virus.
Diese hervorragende Wirksamkeit ergibt sich aus der Fig. 1
der Zeichnungen, wobei die Kurven das Überleben von plaque-
bildenden Einheiten von Vesicular-Stomatitis-Viren als Funktion
der Bestrahlungszeit mit langwelligem UV in Gegenwart des angegebenen
Psoralens widergeben. Bei den angegebenen Dosierungs
raten (etwa 20-30 µg/ml) wird die enorme Überlegenheit der
erfindungsgemäßen Psoralene über Trioxsalen ohne weiteres er
sichtlich. Alle drei erfindungsgemäßen Psoralene sind bei die
sen hohen Dosierungen im wesentlichen äquivalent. Dies läßt
sich aus ihren Dissoziationskonstanten K D , die in Tabelle I
angegeben sind, voraussagen und aus ihren hohen Löslichkeiten,
die früher erwähnt wurden (im Falle des 4′-Methoxymethyl-triox
salens ist die Lösung übersättigt). Bei den wiedergegebenen
Dosierungsraten ist die RNS mit nicht-covalent gebundenen, ein
gelagerten Psoralenen fast gesättigt. Somit dürfen alle drei
Psoralene in der Aktivität äquivalent sein. Das Trioxsalen ist
jedoch nur bis zu 0,6 µg/ml löslich und eine Steigerung seiner
Konzentration von 10 µg/ml auf 30 µg/ml hat keine Wirkung auf
seine Fähigkeit, das Virus zu inaktivieren.
Fig. 2 der Zeichnungen gibt ähnliche Kurven wie in Fig. 1
wieder, jedoch resultieren die Werte von wesentlich geringeren
Konzentrationen an Psoralen, d. h. 1-3 µg/ml. Fig. 2 zeigt auch
die unbestrittene Überlegenheit des 4′-Aminomethyl-4,5′,8-
trimethyl-psoralens über alle anderen Psoralene, sowohl die er
findungsgemäßen als auch das kommerzielle Trioxsalen. Diese
Überlegenheit des 4′-Aminomethyl-Derivats ergibt sich aus
seiner stärkeren Bindung an die Nucleinsäuren, was auch aus
der Dissoziationskonstante K D (siehe Tabelle I) ersichtlich
wird.
Die in Fig. 1 und 2 wiedergegebenen Daten wurden unter Ver
wendung folgender Verfahren erhalten:
500 µl-phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 × 104
Virus-plaque-bildenden Einheiten wurden in Petrischalen von
3,5 cm Durchmesser gegeben und in Gegenwart oder Abwesenheit
des Psoralens mit langwelligem UV bestrahlt. Nach verschiedenen
Zeitintervallen wurden 50-µl-Proben entnommen und die Menge der
Virus-plaque-bildenden Einheiten titriert. Verdünnte Lösungen
der Proben wurden auf in Plastikschalen gezogene primäre
Hühner-Fibroblasten gebracht. Nach Absorption des Virus wurden
die Kulturen mit Nährmedium, das 20% Kalbsserum und 3% Methyl
cellulose enthielt, überdeckt. Nach 2 bis 4 Tagen Inkubation
bei 35°C wurde Neutralrot zugegeben. Das Virus war Vesicular-
Stomatitis-Virus Indiana.
In Fig. 1 bezeichnen die vollen Punkte (⚫) nur Licht, Kreise
(○) 30 µg/ml Trioxsalen, die Quadrate () 30 µg/ml 4′-Hydroxy
methyl-trioxsalen, die offenen Dreiecke (∆) 30 µg/ml 4′-Triox
salen und die vollen Dreicke (▲) 20 µg/ml 4′-Aminomethyl-
trioxsalen. In Fig. 2 bezeichnen die vollen Punkte (⚫) nur Licht,
die Kreise (○) 10 µg/ml Trioxsalen, die Quadrate () 1 µg/ml
4′-Hydroxymethyl-trioxsalen, die offenen Dreiecke (∆) 3 µg/ml
4′-Methoxymethyl-trioxsalen und die vollen Dreiecke (▲) 2 µg/ml
4′-Aminomethyl-trioxsalen.
Claims (8)
1. 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate der allgemeinen Struk
turformel:
in der X für eine Halogenalkyl-, Alkohol-, Aether- oder
Aminoalkylgruppe steht, in denen die Alkylreste jeweils
bis zu 7 C-Atome aufweisen können.
2. 4′-Chlormethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.
3. 4′-Hydroxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.
4. 4′-Methoxymethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen.
5. 4′-Aminomethyl-4,5′,8-trimethyl-psoralen-hydrochlorid.
6. Verfahren zur Herstellung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-
Derivate nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß man Trioxsalen in an sich bekannter Weise
mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder
Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer
Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt.
7. Verwendung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate nach
den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von Desoxyribo
nucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren mit covalent gebun
denen 4′-substituiertem 4,5′,8-Trimethyl-psoralen, wobei
man Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure mit
einer Lösung eines der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate
behandelt und die Lösung bestrahlt.
8. Verwendung der 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivate nach
den Ansprüchen 1 bis 5 zur Inaktivierung von Viren, wobei
man Viren mit einem 4,5′,8-Trimethyl-psoralen-Derivat in
Kontakt bringt und dann bestrahlt.
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