DE2746942A1 - Neue psoralenderivate - Google Patents

Neue psoralenderivate

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DE2746942A1 DE19772746942 DE2746942A DE2746942A1 DE 2746942 A1 DE2746942 A1 DE 2746942A1 DE 19772746942 DE19772746942 DE 19772746942 DE 2746942 A DE2746942 A DE 2746942A DE 2746942 A1 DE2746942 A1 DE 2746942A1
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Description

DR. A. VAN DERWERTH
DlPL-ING. (1934-1974)
PATENTANWÄLTE DR. FRANZ LEDERER
DlPL-CHEM.
27A69A2
REINER F.MEYER
DlPL-ING.
8000 MÜNCHEN 80
LUCILE-GRAHN-STRASSE
TELEFON: (089) 472947 TELEX: S24624 LEOER O TELEGR.: LEDERERPATENT
19. Oktober 1977 UN 4051/6
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2200 University Avenue, Berkeley, Kalif., USA
Neue Psoralenderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Psoralenderivate, insbesondere Derivate des 4,5',8-Trimethylpsoralens (Trioxsalen) mit einem organischen funktioneilen Substituenten am 4-Kohlenstoffatom. Die neuen Psoralenderivate besitzen die allgemeine Formel
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1 worin X einen Substituenten, wie Halogenalkylgruppen, Alkoholgruppen, Aethergruppen und Aminoalkylgruppen darstellt.
Der Ausdruck Alkyl bezeichnet vorzugsweise niedere Alkylgruppen mit bis zu 7 C-Atomen wie Methyl, Aethyl und Propyl, wobei Methyl bevorzugt ist. Ein Alkohol-Substituent ist vorzugsweise ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, z.B. Hydroxy-nieder-alkyl. Ein Aether-Substituent ist vorzugsweise ein nieder-Alkoxy-nieder-alkylrest.
Beispiele von erfindungsgemässen Psoralenderivaten sind
15 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Hydroxymethyl-4, 5 ' ,8-trimethylpsoralen, 4'-Methoxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 4'-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und
4'-Aminomethyl-4, 5 ' ,e-trimethylpsoralen-hydrochlorid.
In anderer Beziehung betrifft die Erfindung Deoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure, an welche an mindestens
einer Bindungsstelle ein 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens covalent gebunden ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung batrifft ein Verfahren zum Eingreifen in die Replikation von Nucleinsäuren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Nucleinsäuren mit einem 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens zusammenbringt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Viren mit einem 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens zusammenbringt und diese dann einer Energiestrahlung
35 aussetzt.
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•j Psoralene sind lineare Isomere der Furocumarinfamilie und kommen in der Natur in gewissen Früchten und Samen, z.B. Ammi majus und psoralea corylifolia vor. Extrakte dieser Früchte und Samen sind seit alter Zeit als Hautsensibilisierungsmlttel bei der Behandlung von Vitiligo in Gebrauch. Die topische Anwendung von Psoralenextrakten und anschliessende Bestrahlung mit Licht resultiert in einer Stimulierung der Melaninproduktion und bewirkt so einen Hautgerbungseffekt.
In den vergangenen Jahren sind Psoralene in der Photochemotherapie von Psoriasis verwendet worden. Bei dieser Behandlung werden Psoralene dem Patienten oral oder topisch verabreicht. Danach wird die Haut einer Ultraviolett-Bestrahlung ausgesetzt.
Mit zunehmendem Interesse an der Molekularbiologie und deren Studium sind Psoralene in bezug auf ihre Fähigkeit, covalente Bindungen mit Nucleinsäuren zu bilden, untersucht worden. Infolge ihrer planaren Struktur können sich Psoralene zwischen die Basenpaare der Doppelhelix-Molekularstruktur von Nucleinsäuren einlagern. Auf Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge können die Psoralene covalente Bindungen mit den Pyrimidinnucleotiden, welche als integrale Bestandteile der Nucleinsäurestränge auftreten, bilden. Das Zustandebringen covalent gebundener Psoralenbrücken oder Querverbindungen zwischen Nucleinsäuresträngen der Doppelhelix stellt ein weiteres Werkzeug bei in vivo-Studien der Sekundärstruktur von Nucleinsäuren dar. Zusätzlich sind die Psoralene ein Mittel zur Inaktivierung von Viren bei der Vaccineproduktion und sie sind auch potentielle chemotherapeutische Mittel.
Die covalent gebundenen Psoralene wirken als Hemmer der DNS-Replikation und haben somit die Fähigkeit, den Replikationsprozess zu verlangsamen oder zu stoppen. Die covalente Bindung kann nur in einem Zweistufenverfahren hergestellt werden, indem zuerst das Psoralen sich in die Nucleinsäurehelix einlagert und sodann jene Stellen der elektromagnetischen Strahlung
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ausgesetzt werden. Man erkennt somit sofort, dass der Vorgang der covalenten Bindung sowohl zeitlich als auch räumlich kontrolliert werden kann.
Es ist auch ersichtlich, dass Querverbindungen nur bei solchen Psoralenmolekülen auftreten können, die zur richtigen Zeit am richtigen Platz sind, d.h. ein Psoralenmolekül muss sich in der richtigen Stellung in genau dem Moment eingelagert haben, in dem die Strahlungsenergie an dieser Stelle auftrifft.
10 Die Anwesenheit eines Psoralenmoleküls an der richtigen
Position hängt von der Löslichkeit des Psoralens in wässriger Lösung und von der Dissoziationskonstante für die nicht-covalente Bindung des Psoralens zu Nucleinsäuren ab. Je höher somit die Löslichkeit ist, desto grosser ist die Anzahl der Moleküle in dem umgebenden flüssigen Medium, die für die Bindungsstellen verfügbar sind. In ähnlicher Weise ist die Zahl der Psoralene die eine potentielle Bindungsstelle irgendwann zur richtigen Zeit besetzen umso grosser, je niedriger die Dissoziationskonstante ist. Die Dissoziationskonstante K für die nicht- covalente Bindung des Psoralens an die Nucleinsäure wird durch den Ausdruck
ν -
D "
definiert. Dabei ist (P) die Konzentration des freien Psoralens, (S) die Konzentration der nicht besetzten Bindungsstellen, wobei jedes Basenpaar an einer Nucleinsäure als Bindungsstelle betrachtet wird, und (PS) die Konzentration von Psoralen-gebundenen Stellen.
Die neuen Psoralenderivate können im wesentlichen in der gleichen Weise wie bekannte Psoralene verwendet werden, d.h. als Hautsensibilisierungsmittel, z.B. in der Behandlung von Vitiligo und Psoriasis; und als Mittel zur Inaktivierung
35 von Viren.
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Die neuen, oben definierten Psoralenderivate sind bekannten Psoralenen in bezug auf die Monoaddition an Nucleinsäuren überlegen. Die Ueberlegenheit bezieht sich auf die resultierende Dichte covalent gebundenen Psoralens an der Nucleinsäure, ohne dass an der allgemeinen Eingangskonzentration an Bindungsstellen und der totalen Psoralenkonzentration etwas geändert wird.
Die neuen Psoralene haben zwei Vorteile, d.h. sie zeigen verbesserte Löslichkeit in Wasser und/oder besitzen eine niedrige Dissoziationskonstante von DNS und/oder RNS.
Das 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und das 4'-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen kann als Zwischenprodukt bei der Herstellung der übrigen erfindungsgemässen Psoralene verwendet werden. Es gibt Anhaltspunkte, dass diese Psoralene auf den gleichen Gebieten wie andere Psoralene Verwendung finden können. Im Falle des 4-Chlormethylpsoralens wird der Chlormethylsubstituent in wässriger Lösung leicht hydrolysiert und es ist infolgedessen schwierig, dessen spezifische Aktivität in bezug auf die Bindung an DNS oder RNS festzustellen. Auf jeden Fall wird die Rolle der beiden Verbindungen aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich werden.
Das 4'-Hydroxymethy1-4,5',8-trimethylpsoralen, das 41-Methoxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und das 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen zeigen alle ausgezeichnete Reaktivität mit DNS, wie man nachfolgend sehen wird.
Alle erfindungsgemässen Psoralene lassen sich bequem aus 4,5',8-Trimethylpsoralen (Trioxsalen) herstellen, obschon auch andere bekannte Synthesemethoden verwendet werden können.
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Die erfindungsgemässen Psoralene können dadurch hergestellt werden, dass man Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt. Beispielsweise wird Trioxsalen mit einem halogenierten (vorzugsweise chlorierten) Methylalkyläther oder Methylbenzyläther bei Raumtemperatur während einer ausreichenden Zeit behandelt, worauf das erhaltene 4'-substituierte Trioxsalen aus dem Reaktionsgemisch durch Kühlen und Ausfällen abgetrennt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Trioxsalen vor oder während der HaIomethylierung in konzentrierter Essigsäure gelöst.
Die Halomethylgruppe am Kohlenstoffatom 41 des Trioxsalenmoleküls kann dadurch modifiziert werden, dass man das 41-Halomethyl-trioxsalen mit Wasser oder einem geeigneten Alkohol zum Rückfluss erhitzt, um das Halogen durch einen Hydroxy- oder Alkoxy-Substituenten zu ersetzen.
Die Halomethylgruppe kann auch dadurch modifiziert werden, dass man das 4'-Halomethyl-trioxsalen mit einem Phthalimidalkalimetallsalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylformamid zu 4'-Phthalimidomethyl-trioxsalen umsetzt und gewünschtenfalls das 4■-Phthalimidomethyl-trioxsalen mit Hydrazinhydrat und Aethanol zum Rückfluss erhitzt und danach das gebildete 4'-Aminomethyl-trioxsalen aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.
Beispiel I 30
659 mg Trioxsalen wurden in 75 ml Eisessig unter schwachem Erwärmen gelöst. Die Lösung wnrde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 5 ml Chlormethyl-Methyläther versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden stehen gelassen und danach ein zweites Mal mit 5 ml Chlormethyläther versetzt. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgefäss eisgekühlt und nach weiteren 12 Stunden
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wurde der weisse Niederschlag abgetrennt, ümkristallisation aus Acetonitril lieferte 435 mg reines 4·-Chlormethyl-4,5·,8-trimethylpsoralen. Eine weitere Fraktion wurde aus dem Filtrat isoliert, so dass insgesamt 499 mg erhalten wurden. Schmelzpunkt 215-217°, NMR (CDCl3) 62,6-2,7 (9 H, m) 4,8 (2 H, s) 6,3 (1 H, s), 7,6 (1 H, s); Massenspektrum m/e (relative Intensität) 276 (m+, 48), 278 (m+ 2, 15).
Beispiel II
53 mg 4 *-Chlormethyl-4,5 *,8-trimethylpsoralen wurden in 50 ml destilliertem Wasser 7 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Danach wurde 2 Stunden eisgekühlt, das Produkt abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 25 mg (50,5%) 4'-Hydroxymethyl-
4,5',8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 221 - 224°,
NMR (DMSO-d6) 6 2,5-2,7 (9 H, m) , 4,5-4,7 (2 H, m) , 5,O-5,2 (1 H, bs), 6,3 (1 H, s), 7,8 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 258 (M+, 100) 241 (17) .
20 Beispiel III
78 mg 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen wurden in 30 ml Methanol 5 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Eindampfen wurden 74 mg (97,2%) 4'-Methoxymethyl-4,5f,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 171-174° erhalten. NMR (CDCl3) £2,4-2,6 (9 H, m), 3,4 (3 H, s), 4,6 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 272 (M+, 93), 241 (10O).
30 Beispiel IV
200 mg 4·-Chlormethyl-4,5",8-trimethylpsoralen, 165 mg Phthalimid-Kalium und 20 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden 6 Stunden unter konstantem Rühren auf lOO erhitzt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Wasserbad und unter vermindertem Druck abgedampft und man erhielt eine gelbe Paste, die in Chloroform aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen wurde.
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- JlT-
Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft und lieferte 222 mg (79,3%) 4'-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 267-274°, NMR (CDCl3) 6*2,5-2,8 (9 H, m), 5,0 (2 H, s), 6,3 (IH, s), 7,7-7,8 (7 H, d), 8,0 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 387 (m+, 80), 241 (20), 240 (75).
Beispiel V
848 mg 4•-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, 0,5 ml Hydrazinhydrat (85% in Wasser) und 100 ml 95%iges Aethanol wurden 4 Stunden zum Rückfluss erhitzt und danach noch einmal mit 0,5 ml Hydrazinhydratlösung versetzt. Nach 2 Stunden Rückflusserhitzen war mit Dünnschichtchromatographie kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Das Aethanol wurde abgedampft und der Rückstand in 200 ml 0,1 η-Natronlauge aufgenommen, und die Lösung mit 53 ml Portionen Chloroform extrahiert. Man erhielt 193 mg rohtis 4 '-Aminomethy 1-4 ,5 ', 8-trimethylpsoralen. Zur Herstellung des Hydrochlorids wurde das Amin in 100 ml 1,2 η Salzsäure aufgenommen und die Lösung dreimal mit 30 ml Portionen Chloroform extrahiert um Verunreinigungen zu entfernen. Eindampfen unter vermindertem Druck lieferte das rohe Hydrochlorid, das in 175 ml absolutem Aethanol gelöst und durch Zusatz eines gleichen Volumens Diäthyläther ausgefällt wurde. Nach Kühlen über Nacht (7 ) wurden 161 mg reines Hydrochlorid erhalten, Schmelzpunkt 260 - 269°, NMR-Spektrum des Amins (CDCl3) 6 1,4-1,6 (2H, s), 2,6-2,7 (9 H, m), 4,1 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), 7,7 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative
Intensität) 257 (M+, 36), 240 (100).
Verwandte Derivate können in der gleichen Weise hergestellt werden. Für die erfindungsgemässen Zwecke sind jedoch die wichtigen Eigenschaften solcher Derivate hohe Löslichkeit in wässriger Lösung und niedrige Dxssoziationskonstante von DNS und/oder RNS.
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Für das Studium der Löslichkeit und der Dissoziationskonstanten ist es am bequemsten, tritiierte Derivate der Psoralene herzustellen. Sodann können bekannte Zählverfahren angewandt werden, um die Anwesenheit von Psoralen in Lösung
5 oder in Nucleinsäuren zu verfolgen.
Die Tritium-markierten Psoralene können aus Tritiummarkiertem Trioxsalen hergestellt werden. Tritiiertes Wasser wird mit normalem Trioxsalen zum Rückfluss erhitzt, wobei ein Austausch des Tritiums mit Trioxsalen-Wasserstoff eintritt, Das tritiierte Trioxsalen wird abgetrennt und zur Herstellung der Psoralene gemäss den vorstehend beschriebenen Beispielen verwendet. Das folgende Beispiel illustriert ein spezifisches Verfahren zur Herstellung von tritiiertem Trioxsalen.
Beispiel VI
1153 mg 4,5',8-Trimethylpsoralen, T-O (wässrig, 100 Curie in 4 ml) 67,5 ml Dioxan und 7,5 ml rauchende Schwefelsäure (30% SO3) wurden unter konstantem Rühren 2 Stunden zum Rückfluss erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden 125 ml Eis zugesetzt und das Gemisch 1 Stunde eisgekühlt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, luftgetrocknet und lieferte 900 mg (78%) rohes, tritiiertes 4,5',8-Trimethylpsoralen.
30 mg Rohprodukt wurden in 75 ml 100%igem Aethanol gelöst und mit 2 g Kohle versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten zum Rückfluss erhitzt, heiss über ein gesintertes Glasfilter filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol/Wasser (90:10) kristallisiert. Durch analytische Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 98:2) wurden mehr als 95% der Zählimpulse im Trimethylpsoralen gefunden. Die spezifische Aktivität wurde bestimmt durch Auszählung eines Aliquots in absolut äthanolischer Lösung bekannter Konzentration in Toluol-Omnifluor. Die spezifische Aktivität war 6,7 χ 10 Imp/min. Von diesem Psoralen wurden tritiierte Produkte gemäss Beispiel I - V hergestellt. Diese wurden verwendet, um ihre Bindungseffektivität mit Nucleinsäure zu studieren. Die Untersuchungen waren darauf gerichtet, Daten
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über die die Löslichkeiten und die Dissoziationskonstanten sowohl mit DNS als auch RNS zu erhalten. Weiterhin wurde die Fähigkeit der Psoralene untersucht, covalente Bindungen mit DNS und RNS einzugehen. Diese Untersuchungen wurden wie
5 folgt durchgeführt:
Zur Feststellung der Dissoziationskonstanten mit DNS und RNS wurde die nicht-covalente Bindung ermittelt. Sie bestimmt die Gegenwart des Psoralens innerhalb der Nucleinsäurehelix und wird in Abwesenheit von Energiestrahlung ermittelt, Wie erwähnt, ist Energiestrahlung erforderlich, um das Psoralen zur covalenten Bindung mit den Nucleinsäurebasen-Paaren zu bringen.
■|5 Zur Bestimmung der nicht-covalenten Bindung, wurde Kalbsthymus-DNS (Sigma Typ I) in einem 0,01 m-Tris, 0,001 m-Aethylendiamin-tetraessigsäurepuffer von pH 8,5 in einer Konzentration von 25μg pro ml gelöst. Ein Quantum dieser DNS-Lösung wurde in einem Dialysesack (vorbehandelt durch Kochen in NaHCO.,) gebracht und die verschiedenen tritiierten Derivate wurden in der Hälfte der Fälle in den Dialysesack gegeben und in der anderen Hälfte der Fälle der Aussenlösung zugesetzt. Das molare Verhältnis von Psoralenmolekülen zu Basenpaaren war etwa 1:25. Die Dialysesäckchen wurden in Röhrchen gegeben, die mit 18 ml Puffer gefüllt waren und 48-60 Stunden geschüttelt wurden. Danach wurde die Radioaktivität innerhalb und ausserhalb des Dialysesacks und die optische Dichte der DNS-Lösung gemessen. Aus diesen Messwerten und der spezifischen Aktivität jedes Derivates wurde die Menge des nicht-covalent an die DNS gebundenen Präparate bestimmt. In genau der gleichen Weise wurde die Bindung der Derivate an Drosophila melanogaster Ribosomen-RNS gemessen.
Die Resultate aus den Messungen der Dialysegleichgewichte sind in Tabelle I angegeben. Die Einheiten für die Dissoziationskonstante sind Mol/Liter. Löslichkeiten und molare Extinktionskoeffizienten (£") wurden in reinem Wasser, die Gleichgewichtskonstanten (Kß) in 0,01 m Tris-Puffer aufgenommen.
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Tabelle 1
Extinktionskoeffizienten, Löslichkeiten, Dissoziationskonstanten
und Konzentrationsverhältnisse von besetzten zu unbesetzten Bindungsstellen in gesättigten Lösungen von Psoralenderivaten
09 O (O CO
1. 2. 3. Mol/A 4. 5. 6. 7.
Verbindung 250 run
ε
Ä/Mol cm		 Löslichkeit l,7xio"4 K0DNA
MoI/£		 Kolonne 3/
Kolonne 4
(PS) / (S)
für DNS in
gesättigter
Lösung		 K0RNA
Mol/1 		Kolonne 3/
Kolonne 6
(PS) / (S)
für RNS in
gesättigter
Losung
8-Methoxypsoralen l,9xlO4 yg/mi 2,6xl0"6 2,5xio"3 0,068 1,7x10*2 0,010
4,5',8-Trimethyl-
psoralen		 1,8xlO4 36 3,7xl0"5 5,6xlO~5 0,046 ίο'4 0,026
4-Me thoxymethy1-
4,5',8-trimethyl-
psoralen		 2,IxIO4 0,6 l,6xio'4 9,4xlO~5 0,39 Kf3 0,037
4'-Hydroxymethyl-
4,5',8-trimethyl-
psoralen		 2,5xlO4 10 3,4xlO~2 2,9xio"4 0,55 ίο"3 0,16
4·-Arainomethyl-
4,5',8-trimethyl-
psoralen-
hydrochlorid		 2,5xlO4 41 6,6xl0"6 5000 2xl0"5 1700
io4
ω ·
ro -«α
an
Die Daten für 8-Methoxypsoralen in den Kolonnen 2-7 in der Tabelle I wurden aus in der Literatur vorliegenden Daten berechnet. Die anderen Daten wurden im Rahmen der Erfindung ermittelt.
8-Methoxypsoralen und 4,5',8-Trimethylpsoralen sind in der Tabelle I als Vergleichssubstanzen mit den erfindungsgemässen Psoralenen aufgeführt.
Es wurde die covalente Bindung der Psoralene an DNS und RNS untersucht. Um covalente Bindung herzustellen, ist es erforderlich, Strahlungsenergie (Licht) an den Bindungsstellen einwirken zu lassen. Diese Untersuchungen wurden wie folgt ausgeführt:
Die in den Untersuchungen für die covalente Bindung verwendete DNS und RNS wurde bereits beschrieben. Proben jeder Nucleinsäure wurden in Konzentrationen von 25 Mg pro ml in 0,Ol m Tris und 0,001 m Aethylendiamintettaessigsäurepuffer bereitet. Die radioaktiven Psoralenderivate wurden im Verhältnis 1 Psoralen auf 3 Basenpaare zugesetzt. Die Bestrahlung wurde mit einer der beiden nachstehend beschriebenen Vorrichtungen durchgeführt.
Bestrahlungen mit niederer Intensität wurden mit einem modifizierten Diapositiv-Projektor durchgeführt, der mit einer 400 Watt-Quecksilberdampflampe ausgerüstet war. Das Licht wurde durch eine Kobaltnitratlösung gefiltert; die auf die Probe eingestrahlte Intensität betrug 4-6 mW/cm . Die Bestrahlungen mit hoher Intensität wurden in einer Vorriciitung vorgenommen, bei der zwei 400 Watt-Quecksilberdampflampen beidseitig von der Probe in einem Abstand von 4 cm angebracht waren. Der Probenbehälter wurde durch zirkulierende Kobaltnitratlösung (40 Gewichtsprozent) auf 10° gekühlt. Die Kobaltlösung diente als Ultraviolettfilter, das einen Durchlässigkeits-
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bereich von 340-380 nm mit einer maximalen Durchlässigkeit bei 365 nm aufwies. Die Lichtintensität an der Oberfläche
2 im Inneren der Bestrahlungskammer betrug etwa 100 mW/cm .
Das Nucleinsäure-Psoralengemisch wurde in die Probenkammer gegeben und während der Bestrahlung dauernd gerührt. Teile der Lösung wurden nach 20, 40 und 60 Minuten entnommen, zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, um nicht umgesetztes Psoralen zu entfernen, und anschliessend erschöpfend gegen O,01 m Tris, Ο,ΟΟΙ m Aethylendiamintetraessigsäurepuffer dialysiert. Für eine erfolgreiche Extraktion nicht gebundenen Psoralens durch Chloroform/Tsoamylalkohol war es erforderlich, dass die wässrige Phase mindestens 0,15 molar an Kochsalz war. Schliesslich wurde die optische Dichte des Nucleinsäurepsoralengemisches und dessen Radioaktivität bestimmt, woraus sich die Menge des covalent an DNS oder RNS gebundenen Derivats ergab. Die Probenentnahme erlaubte auch eine Verfolgung der Kinetik der covalenten Bindung.
Die Tabelle II enthält die Ergebnisse dieser Untersuchungen in bezug auf DNS.
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"ft
Tabelle II
Photoaddition von Psoralenderivaten bei niederer Intensität in einer Lösung mit 25 pg/ml DNS und einen molaren Psoralen; Basenpaar-Verhältnis von 1:3.
Bestrahlungs-
Zeit
(Min.)		 Trioxsalen 15,5 4'-Hydroxymethy1
trioxsalen		 B 4'-Aminomethy1
trioxsalen
hydrochlorid
Λ1 19,7 A 3,0 A B
5 19,7 22,1 89,0 4,6 15,0 19,3
10 15,5 23,6 59,6 10,3 10,5 27,4
30 13,7 28,5 26,0 13,8 6,9 41,8
60 12,8 19,5 15,7 5,9 48,7
90 10,6 17,2 5,5 52,4
1 _ Mol Basenpaare 15 Mol gebundenes Psoralen
B = Prozent des covalent gebundenen zugesetzten Psoralens
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Aus den in Tabelle II wiedergegebenen Daten wird ersichtlich, dass 4-Aminomethyltrioxsalen mit DNS viel schneller als Trioxsalen reagiert, welches wiederum eine grössere Anfangsrate der photochemischen Bindung besitzt als 4-Hydroxymethyl-trioxsalen. Bei einer Bestrahlungszeit von 90 Minuten beträgt die Anzahl der gebundenen Mole Psoralen pro Mol Basenpaar 0,18 für die Aminomethylverbindung, während die Werte für Trioxsalen und die Hydroxymethylverbindung 0,09 bzw. 0,06 sind. Die Tabelle II zeigt auch, dass nach 90 Minuten Bestrahlung über die Hälfte der Moleküle des 4-Aminomethyl-trioxsalens in Lösung covalent an DNS gebunden sind, während mehr als 80% des 4-Hydroxymethyl-trioxsalens frei in Lösung bleibt. Diese Unterschiede resultieren sehr wahrscheinlich aus dem Einfluss der Molekularstruktur der verschiedenen Psoralene auf ihre Löslichkeiten, photochemische Reaktivität und auf die Photodestruktion der Verbindungen selbst.
Die Tabelle III gibt die Resultate der Hochenergie-Bestrahlung auf die covalente Bindung von Psoralen und DNS wieder:
20 Tabelle III
Photoaddition von Psoralenderivaten bei hoher Intensität in Lösung mit 25 yg/ml DNS und einem Psoralen: Basenpaar-Verhältnis von 1:3.
Bestrahlungs- Trioxsalen 4'-Hydro- 4'-Methoxy- 4'-Aminomethyl
zeit methyl methyl trioxsalen
(Min.) triox- triox- hydrochlorid
salen salen
AB AB AB AB
20 11.6 25,9 9,1 33,0 14,1 21,3 4,7 63,8
4O 1Ο.6 28,3 9,2 32,6 14,3 21,0 4,8 62,5
6O 12,2 24,6 9,1 33,0 13,8 21,7 4,8 62,5
1 _ Mol Basenpaare
Mol covalent gebundenes Psoralen
B = Prozentsatz von covalent gebundenem zugesetzten Psoralen
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~M '
Die Tabelle IV gibt die Resultate der covalenten Bindung der Psoralene mit RNS bei Bestrahlung mit hoher Intensität wider:
Tabelle IV
Photoaddition von Psoralenderivaten mit hoher Intensität in einer Lösung mit 25 yg/ml RNS und einem Psoralen: Basenpaar-Verhältnis von 1:3.
Bestrahlungs
zeit
(Min.)		 2O Trioxsalen
A B		 1 13 ,0 41
A		 -Hydro-
me thyl
triox
salen
B		 4 ■ Methoxy-
methyl
t riox-
salen
A B		 4 1 Ami nome thyI
trioxsalen
hydrochloric!
A B
40 23, 6 13 ,9 26 ,3 11,5 264,2 1,2 5,1 59,4
6O 21, 6 14 ,8 24 ,8 12,1 216,8 1,4 5,3 57,2
2O, Mol Basenpaare 23 ,5 13,O 183,4 1,6 5,3 57,3
1
Mol covalent gebundenes Psoralen
B = Prozentsatz von covalent gebundenem zugesetzten Psoralen
Aus den in den Tabellen I, II, III und IV enthaltenen Daten können die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden:
Die Tabelle I mit den Dissoziationskonstanten für die Gleichgewichtsbindung an DNS zeigt, dass 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen etwa 8 mal stärker an DNS gebunden wird als Trioxsalen. Die Bindung von Trioxsalen ist 5 mal stärker als 4'-Hydroxymethyl- und 2 mal stärker als 4^Methoxymethyl-trioxsalen, Diese beiden neuen Derivate werden aber noch 10 mal stärker an DNS gebunden als Methoxsalen, das andere kommerziell verfügbare Psoralen.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die relativen Löslichkeiten der Psoralene in der Reihenfolge 4'-AminomethyI-trioxsalen,41-Hydroxymethyl-trioxsalen, 4'-Methoxymethyl-triox-
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salen, Methoxsalen, und Trioxsalen etwa 10,000:68:17:80:1 sind. Wenn man die molare Löslichkeit durch die Dissoziationskonstante teilt, wird ersichtlich, dass es beim Gleichgewicht in einer
mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten Lösung nicht möglich ist, die DNS-B indungr.stel lon mit Trioxsalen oder Methoxsalen
abzusättigen. Bestenfalls kommt etwa ein Psoralen auf 20 Basenpaare. Die Kolonne 5 in Tabelle I gibt das Verhältnis von gebundenen zu freien Stellen in einer mit dem entsprechenden
Psoralen gesättigten DNS-Lösung wieder. Es kann davon ausgegangen werden, dass das 4' -Hydroxyinethyl- trioxsalen und das
4'-Methoxyniethy 1-tr Loxsalen die Bindungsstellen an der DNS nahezu sättigt, wobei ein Psoralen auf 3 Basenpaare [(PS) / (S) =
0,5] kommt, v/ährend sich für das 4'-Aminoäthyl-trioxsalen eine
4
10 fach stärkere Effektivität für die Erreichung dieses Sätti-
Ib gungszustandes berechnet (es ist 150 mal löslicher als 41-
Hydroxymethyl-trioxsalen und wird etwa 100 mal stärker gebunden).
üie erfindungsgemässen Psoralene sind auch bei der Inaktivierung von RlE Viren verwendbar. In dieser Beziehung zeigen
sie eine Aktivität, die signifikant höher ist als die anderer
bekannter Psoralene. Bei hohen Dosierungen, z.B. 30 yg/ml, sind das 4'-Hydroxymethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen, das 4'-Methoxymethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen und das 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen alle beinahe 1000 mal wirksamer als das
kommerziell verfügbare 4,5',8-Trimethy1-psoralen bei der Inaktivierung des Vesicular-Stomatitis-Virus, eines menschlichen RNS-Virus.
Diese hervorragende Wirksamkeit ergibt sich aus der Fig. 1 der Zeichnungen, wobei die Kurven das Ueberleben von plaquebiidenden Einheiten von Vesicular-Stomatitis-Virus als Funktion der Bestrahlungszeit mit langwelligem UV in Gegenwart des angegebenen Psoralens widergeben. Bei den angegebenen Dosierungsraten (etwa 20-30 yg/ml) wird die enorme Ueberlegenheit der
erfindungsgemässen Psoralene über Trioxsalen ohne weiteres ersichtlich. Alle drei erfindungsgemässen Psoralene sind bei diesen hohen Dosierungen im wesentlichen äquivalent. Dies lässt
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sich aus ihren Dissoziationskonstanten K , die in Tabelle I angegeben sind, voraussagen und aus ihren hohen Löslichkeiten, die früher erwähnt wurden (im Falle des 4'-Methoxymethyl-trioxsalens ist die Lösung übersättigt). Bei den wiedergegebenen Dosierungsraten ist die RNS mit nicht-covalent gebundenen, eingelagerten Psoralenen fast gesättigt. Somit dürfen alle drei Psoralene in der Aktivität äquivalent sein. Das Trioxsalen ist jedoch nur bis zu 0,6 yg/ml löslich und eine Steigerung seiner Konzentration von 10 yg/ml auf 30 pg/ml hat keine Wirkung auf seine Fähigkeit, das Virus zu inaktivieren
Fig. 2 der Zeichnungen gibt ähnliche Kurven wie in Fig. 1 wieder, jedoch resultieren die Werte von wesentlich geringeren Konzentrationen an Psoralen, d.h. 1-3 pg/ml. Fig. 2 zeigt auch die unbestrittene Ueberlegenheit des 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethyl-psoralens über alle anderen Psoralene, sowohl d:.e erfindungsgemässen als auch das kommerzielle Trioxsalen. Diese Ueberlegenheit des 41-Aminomethyl-Derivats ergibt sich aus seiner stärkeren Bindung an die Nucleinsäuren, was auch aus der Dissoziationskonstante K (siehe Tabelle I) ersichtlich
20 wird.
Die in Fig. 1 und 2 wiedergegebenen Daten wurden unter Verwendung folgender Verfahren erhalten:
4 500 μΐ-phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 χ 10
Virus-plaque-bildenden Einheiten wurden in Petrischalen von 3,5 cm Durchmesser gegeben und in Gegenwart oder Abwesenheit des Psoralens mit langwelligem UV bestrahlt. Nach verschiedenen Zeirinterve.llen wurden 50 μΙ-Proben entnommen und die Menge der Virus-plaque-bildenden Einheiten titriert. Verdünnte Lösungen der Proben wurden auf in Plasticschalen gezogene primäre Hühner-Fibroblasten gebracht. Nach Absorption des Virus wurden die Kulturen mit Nährmedium, das 20% Kalbsserum und 3% Methylcellulose enthielt, überdeckt. Nach 2 bis 4 Tagen Inkubation bei 35 C wurde Neutralrot zugegeben. Das Virus war Vesicular-Stomatitis-Virus Indiana.
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af
In Fig. 1 bezeichnen die vollen Punkte (·) nur Licht, Kreise (o) 30 yg/ml Trioxsalen, die Quadrate (α) 30 yg/ml 4'-Hydroxymethyltrioxsalen, die offenen Dreiecke (A) 30 yg/ml 4'-Trioxsalen und die vollen Dreiecke (A) 20 yg/ml 4'-Aminomethyltrioxsalen. In Fig. 2 bezeichnen die vollen Punkte (·) nur Licht, die Kreise (o) 10 yg/ml Trioxsalen, die Quadrate (α) 1 yg/ml 4'-Hydroxymethy1-trioxsalen, die offenen Dreiecke (a) 3 yg/ml 4'-Methoxymethyl-trioxsalen und die vollen Dreiecke (*) 2 yg/ml 4'-Aminomethy 1- trioxsalen.
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Claims (15)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des 4,5',8-Trimethyl-psoralens mit einem funktionellen organischen Substituenten am Kohlenstoffatom 41, dadurch gekennzeichnet/ dass man Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder
Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer
Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Trioxsalen mit einem Halogenmethyl-alkylather oder Halogenmethylbenzyläther umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Trioxsalen vor oder während der Halomethylierung in
konzentrierter Essigsäure löst.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen Chlor ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass man das erhaltene 4'-Halomethy1-trioxsalen mit Wasser oder einem entsprechenden Alkohol zwecks Austausch des Halogens
gegen eine Hydroxy- oder Alkoxy-Gruppe umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass man ein erhaltenes 4'-Halomethyl-trioxsalen mit einem
Phthalimidalkalisalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels zu 4'-Phthalomidomethyl-Trioxsalen umsetzt und letzteres gewünschtenfalls durch Behandlung mit Hydrazinhydrat und Aethanol in 4' Aminomethvl-trioxsalen überführt.
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ORIGINAL INSPECTED
7. Verwendung von 4'-substituiertem 4, 5',8-Trimethylpsoralen zur Herstellung von Deoxyribonucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren mit covalent gebundenen 4'-substituiertem 4,5',8-Trimethyl-psoralen, wobei man Deoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure mit einer Lösung eines 4·-substituierten 4/5'-8-Trimethyl-psoralens behandelt und die Lösung bestrahlt.
8. Verwendung von 4■-substituierten 4,5',8-Trimethylpsoralen zur Inaktivierung von Viren, wobei man Viren mit einem 4'-substituierten 4,5',8-Trimethyl-psoralen in Kontakt bringt und dann bestrahlt.
9. 4,5',8-Trimethyl-psoralen-Derivate mit einem organischen funktioneilen Substituenten am 4'-Kohlenstoffatom.
10. Psoralen-Derivate gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der organische funktioneile Substituent ein halogeniertes Alkyl, eine Alkohol-, Aether-, oder Aminoalkyl-Gruppe ist.
11. 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen.
12. 4·-Hydroxymethyl-4,5·,8-trimethyl-psoralen.
13. 4'-Methoxymethyl-4,5l,8-trimethyl-psoralen.
14. 4'-N-Phtalomidomethyl-4,5·,8-trimethyl-psoralen.
15. 4I-Aminomethyl-4,5I ,8-trimethyl-psoralen-hydrochlorid.
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