NL8801664A - Werkwijze voor de bereiding van nucleinezuurderivaten alsmede werkwijze voor de bereiding van een geneeskundig preparaat dat dergelijke derivaten bevat. - Google Patents

Description

φ NL 35.184-dJ/ab £

Werkwijze voor de bereiding van nucleinezuurderivaten alsmede werkwijze voor de bereiding van een geneeskundig preparaat dat dergelijke derivaten bevat

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van nucleinezuurderivaten alsmede op een werkwijze voor de bereiding van een geneeskundig preparaat dat deze derivaten bevat.

5 Nucleinezuren zijn samengesteld uit purineringen of pyrimidineringen en aan de ringen gebonden ribose of soortgelijke suikers, waarbij deze samenstellende bestanddelen met elkaar zijn verbonden via een fosfaatbrug onder vorming van een ketenstructuur.

10 Onder de nucleinezuren is RNA (ribonucleotide-poly- meer) een macromoleculaire verbinding met een ketenstructuur die ribose als een suiker bevat, waarin de suikereenheden met elkaar zijn verbonden via een fosfaatbrug door middel van de diesterbinding. In de dubbelstrengs nucleinezuren zijn de 15 purinering- of pyrimidineringeenheden van het nucleinezuur, welke de basen vormen (bijvoorbeeld inosine, adenosine, cytidine, uridine enz.) gebonden door middel van een zogenaamde complementaire waterstofbinding onder oplevering van een dubbele helix ruimtestructuur. Daar nucleinezuren met 20 een dubbelstrengs structuur geacht worden bruikbare fysiologische functies te hebben, zijn tot op heden talrijke studies uitgevoerd met betrekking tot de nucleinezuren (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, enz.).

Onder de nucleinezuren van deze soort, wordt een 25 synthetisch dubbelstrengs RNA polyinosinylzuur.polycytidylzuur-derivaat hierna aangeduid als "poly-I.poly-C"-derivaat; terwijl het polyinosinylzuur, dat een samenstellende eenheid is van dit derivaat, wordt aangeduid als "poly-I" en het poly-cytidylzuur als "poly-C".

30 Recentelijk is van verscheidene natuurlijke en synthetische dubbelstrengs RNA's bekend geworden dat ze een interferoninducerend vermogen hebben (Field et al, Proc. Nat.

Acad. Sci., U.S., 58, 1004, 1967; Field et al, Proc. Nat.

Acad. Sci., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al, Proc. Nat.

Acad. Sci., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al, Proc. Nat.

»8801664 - 2 - F ,

Acad. Sci., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al, J. Gen.

Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 1981).

Typische voorbeelden van bekende synthetische 5 nuclelnezuurderivaten zijn hieronder vermeld.

Synthetische nuclexnezuurderivaten voor interferon-inducer (I) Homopolymeer.homopolymeer-complexen (dubbelstrengs nucleinezuurpolymeren met poly-I.poly-C als de basisstructuur) 10 (1) base-gemodificeerde derivaten: polyinosinylzuur.poly(5-broomcytidylzuur); polyinosinylzuur.poly(2-thiocytidylzuur); poly(7-deazainosinylzuur).polycytidylzuur; poly(7-deazainosinylzuur).poly(5-broomcytidylzuur).

15 (2) suiker-gemodificeerde derivaten: poly(2'-azidoinosinylzuur).polycytidylzuur.

(3) fosforzuur-gemodificeerde derivaten: polyinosinylzuur.poly(cytidine-5'-thiofosforzuur).

(II) Intergemodificeerde copolymeren: 20 poly(adenylzuur-uridylzuur).

(III) Homopolymeer.copolymeer-complexen polyinosinylzuur.poly(cytidylzuur, uridylzuur); polyinosinylzuur.poly(cytidylzuur, 4-thiouridylzuur).

(IV) Synthetische zuur/polykation-complexen: 25 polyinosinylzuur.polycytidylzuur.poly-L-lysine (hierna aangeduid als "poly-ICLC").

(V) Andere: polyinosinylzuur.poly(1-vinylcytidylzuur).

Zoals hierboven vermeld zijn in de laatste jaren 30 diverse soorten van dubbelstrengs RNA, in het bijzonder derivaten die poly-I.poly-C als ouderlichaam hebben, gerapporteerd. Er bestaat een gevestigde theorie betreffende een reeks van nucleinezuurderivaten, waaronder deze, ten aanzien van de relatie tussen de structuur van de derivaten en de 35 functies ervan (De Clercq et al, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).

De onderhavige uitvinders hebben gevonden, op basis van de bovengenoemde stand van de techniek, dat wanneer <8801664 - 3 - * .

poly-I.poly-C en diverse derivaten daarvan die een poly-I.poly-C-eenheid als het ouderlichaam hebben, op een geschikte grootte worden gebracht, zodat de totale moleculaire grootteverdeling van de derivaten zal vallen binnen het gebied 5 van 4S tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedimentatie-constante ervan (of van circa 50 tot ongeveer 10.000, als het aantal basen van de derivaten), de zo op geschikte grootte gebrachte derivaten een opmerkelijk verlaagde toxiciteit hebben en nog steeds de hierna te noemen fysiologische activi-10 teiten zullen hebben. Dienovereenkomstig werden octrooiaanvragen ingediend bij de Japanse Octrooiraad (Japanse octrooiaanvrage nr. 62-167433 en een andere octrooiaanvrage welke prioriteit inroept van deze aanvrage nr. 62-167433).

Parallel aan de bovengenoemde studie hebben de 15 onderhavige uitvinders verder diverse wijzen onderzocht ten einde de bovengenoemde produkten doelmatig te verkrijgen. In het bijzonder werd uitvoerig onderzocht een wijze voor het op een geschikte grootte brengen van nuclelnezuurderivaten opdat deze een moleculaire grootteverdeling hebben van 50 tot 20 ongeveer 10.000, uitgedrukt in het aantal basen ervan, en een wijze voor het vormen van een dubbelstrengs nuclelnezuurpoly-meer uit twee soorten van enkelstrengs nuclexnezuurpolymeren.

De eerstgenoemde wijze, betreffende de bewerking van het terugbrengen van de moleculaire grootteverdeling van nucleïne-25 zuurder!vaten tot een vastgesteld gebied, wordt hierin aangeduid als "brengen op een geschikte grootte". Aangezien het op een geschikte grootte brengen gepaard gaat met omzetting in laagmoleculaire stoffen volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding, omvat het op een geschikte grootte brengen 30 tevens het "verkorten van de keten". Het vormen van een dubbelstrengs nucleinezuur uit twee soorten van enkelstrengs nucleinezuren wordt hierna aangeduid met "anelleren".

Het begrip basepaar (hierna aangeduid als "bp"), dat gewoonlijk wordt gebruikt als de eenheid voor het weergeven 35 van de moleculaire grootte van nucleinezuren, kan worden gebruikt voor het weergeven van de moleculaire grootte van nucleinezuren door middel van het aantal basen waaruit het nucleinezuur bestaat. (Bijvoorbeeld, 10 bp betekent een dubbel- .8801664 * - 4 - strengs polymeer dat 10 basen heeft.) In de onderhavige beschrijving wordt tevens ook naar andere nucleinezuurpoly-meren verwezen dan naar dubbelstrengs nucleïnezuurpolymeren en derhalve wordt de term "basegetal" (aantal basen) hierin 5 gebruikt ter vervanging van "bp" ten einde de moleculaire grootte van nucleinezuren weer te geven. (Bijvoorbeeld, een nucleinezuurpolymeer met een "basegetal van 10" betekent dat het polymeer 10 basen heeft).

Wanneer de moleculaire grootte van een nucleinezuur 10 wordt bepaald of geïdentificeerd, is hiervoor de waarde van de zogenaamde sedimentatieconstante (S-waarde) algemeen gebruikelijk. De onderhavige uitvinders konden het bovengenoemde basegetal van nucleïnezuren echter verkrijgen met behulp van high performance liquid chromatography (HPLC) 15 onder gebruikmaking van een gelfiltratiekolom of electroforese (hieronder in detail besproken), waarin dubbelstrengs DNA's (M13 faag-DNA-fragmenten) met bekende moleculaire groottes worden gebruikt als een merker en het basegetal van het te bepalen nucleinezuur wordt berekend op basis van het getal van 20 de controle.

Tot op heden werd de waarde van de sedimentatieconstante (S-waarde) alom gebruikt voor het uitdrukken van het moleculaire gewicht van macromoleculaire nucleinezuursubstanties. Macromoleculaire nucleinezuursubstanties welke commer-25 cieel verkrijgbaar zijn, worden aangeduid aan de hand van de S-waarde ervan. Vanwege de voortgang van experimentele technieken in de laatste jaren, is echter een middel voor het meer nauwkeurig vaststellen van het moleculaire gewicht van macromoleculaire stoffen tot stand gekomen, namelijk door gebruik 30 van gelelectroforese, gelfiltratie-chromatografie, ionuitwis-selingschromatografie of dergelijke, zodat de bepaling van de ketenlengte van macromoleculaire nucleinezuursubstanties mogelijk is geworden. Onder de omstandigheid zou de relatie tussen de aanduiding met de S-waarde en de aanduiding 35 met de ketenlengte problematisch worden. Vooral wanneer de betreffende nucleïnezuurmoleculen hun intrinsieke waarden in het geval van de aanduiding met de S-waarde hebben, bestaat er niet altijd een probleem betreffende het punt dat de aandui- .8801664 - 5 - **· ding met de S-waarde en de aanduiding met de ketenlengte nauwkeurig met elkaar overeenkomen met betrekking tot het weergeven van het moleculaire gewicht van de nuclexnezuren.

Dienovereenkomstig is voor het weergeven van het 5 moleculaire gewicht van de nucleïnezuurpolymeren volgens de onderhavige uitvinding de S-waarde ook gebruikt in de beschrijving van de onderhavige aanvrage in overeenstemming met de conventionele manier in het gebied van de nuclexnezuur-chemie. Aangezien de "S-waarde" een waarde is die verkregen is 10 door middel van een methode voor het meten van het molecuulge-wicht van macromoleculaire nucleinezuursubstanties in de vorm van een moleculaire massa als een geheel (of in de vorm van een moleculaire toestand van de stof), is de aanduiding op basis van de meting van de ketenlengte van de stof (welke 15 hierin wordt aangeduid als "basegetal") eveneens hierin genoemd te zamen met de "S-waarde". Dit is vooral zo, omdat de grens in de molecuulgewichtsverdeling meer exact moet worden voorgesteld in de uitvoering van de onderhavige uitvinding.

Volgens conventionele werkwijzen voor het op ' 20 geschikte grootte brengen van poly-I.poly-C en diverse derivaten daarvan, welke het genoemde poly-l.poly-C als het ouderlichaam hebben, onder oplevering van op geschikte grootte gebrachte nucleïnezuurpolymeren met dubbele keten, worden reeds bestaande nucleïnezuurpolymeren met dubbele keten 25 afgebroken tot laagmoleculaire verbindingen, of alternatief, worden enkelstrengs nucleïnezuren gehydrolyseerd tot laagmoleculaire verbindingen voorafgaande aan het snelleren.

De conventionele werkwijzen zijn echter ongeschikt voor het verkrijgen van het beoogde produkt op een industriële 30 schaal, aangezien het op geschikte grootte brengen een lange tijd vergt en de werkwijze niet snel kan worden uitgevoerd.

Bovendien zijn de conventionele werkwijzen niet altijd bevredigend vanuit het oogpunt van de opbrengst van de produkten.

35 Anderzijds, indien enkelstrengs nuclexnezuurpoly- meren, na op geschikte grootte te zijn gebracht, verzwaveld moeten worden, dan worden de polymeren verzwaveld met water- .8801664 ψ - 6 - * stofsulfide waarna het waterstofsulfide uit het oplosmiddel wordt gedampt, volgens een conventionele methode. Namelijk pyridine wordt uit de reactieoplossing verdampt, na verzwave-ling, bijvoorbeeld met behulp van een vacuümpomp zodat het 5 waterstofsulfide uit de reactieoplossing kan worden verwijderd te zamen met het pyridine door verdamping. Door deze methode verdampt het waterstofsulfide echter in de lucht en derhalve is het toepassen van deze methode op industriële schaal nadelig gezien vanuit het standpunt van milieuverontreiniging.

10 Bovendien wordt volgens deze methode de na de verdamping van pyridine afgescheiden waterige laag in een dialysebuis gebracht ten behoeve van dialyse tegen stromend water, ten einde het beoogde produkt te verkrijgen. De methode vereist echter ten minste 3 dagen voor een volledige bewerking en de 15 opbrengst van het produkt is ten hoogste ongeveer 80 %. Bijgevolg heeft de conventionele methode verscheidene technische nadelen ten aanzien van de opbrengst aan produkten, de bereidingskosten en de bewerkingsduur.

De techniek betreffende het op geschikte grootte 20 brengen zelf leverde geen moeilijkheden op in de stand van de techniek.

In dit technische veld is het gebruikelijk dat een nucleïnezuurpolymeer wordt verhit in aanwezigheid van formaldehyde ten einde het polymeer te hydrolyseren tot laagmole-25 culaire verbindingen. In deze conventionele methode worden produkten met een gewenste ketenlengte verkregen door een geschikte regeling van de reactieduur en de reactietempera-tuur, waarna de reactieoplossing wordt onderworpen aan dialyse ten einde alle te ver ontlede verbindingen met een 30 buitensporige lagere moleculaire grootte te verwijderen.

Volgens de conventionele methode zouden echter verbindingen met een op variërende wijze verschillende moleculaire gewichtsverdeling worden gevormd door het op geschikte grootte brengen, zelfs wanneer de reactieomstandigheden constant 35 worden gehouden, in afhankelijkheid van de eigenschappen van de gebruikte nucleinezuurpolymeren. Derhalve vertoont de methode een probleem inzake de reproduceerbaarheid. De reden hiervan wordt geacht te zijn dat de uitgangsmaterialen voor .8801664 - 7 - £ gebruik in de werkwijze zijn bereid door middel van een enzymreactie, waardoor de grootte van de uitgangsmaterialen niet op constante wijze kan worden gedefinieerd. Daarnaast is het op grond van de in de methode toegepaste dialyse in 5 principe onmogelijk om nucleinezuurpolymeren met een langere ketenlengte dan die van de gevormde produkten te verwijderen.

Onder deze omstandigheden is een fundamentele werkwijze voor het overwinnen van de bovengenoemde problemen in de stand van de techniek gewenst.

10 Dienovereenkomstig werden uitvoerige onderzoeken verricht ten einde de volgende doelstellingen te bereiken: (1) Op geschikte grootte gebrachte dubbelstrengs nucleinezuurpolymeren worden verkregen als produkten door middel van een snelle werkwijze.

15 (2) De opbrengst van de produkten is hoog.

(3) Zelfs wanneer de werkwijze wordt uitgevoerd op een industriële schaal, geeft de werkwijze geen verontreiniging van de omgeving en andere problemen.

(4) Een bewerkingsreeks van de werkwijze is voldoende 20 kwantitatief en reproduceerbaar.

Aldus werd gekomen tot de onderhavige uitvinding, welke verschaft:

Een werkwijze voor de bereiding van dubbelstrengs nuclelnezuurderivaten met RNA als het ouderlichaam, 25 waarvan de totale moleculaire grootteverdeling valt binnen het traject van 4S tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedimentatieconstante ervan, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht alvorens te worden geanelleerd; 30 alsmede,

Een werkwijze voor de bereiding van dubbelstrengs nucleinezuurderivaten met RNA als het ouderlichaam, waarin de moleculen voor de maximum verdeling in de totale moleculaire grootteverdeling van de derivaten het aantal 35 basen hebben dat ligt in het traject van 50 tot 10.000, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht alvorens te worden geanelleerd.

In het bijzonder berust de strekking van de e 8 8 0 1 6 6 4

- 8 -A

onderhavige uitvinding op de volgende punten: (1) Nucleinezuurpolymeren met een enkele keten worden op geschikte grootte gebracht alvorens te worden geanelleerd.

(2) Voor het op geschikte grootte brengen in stap (1) 5 wordt HPLC (gelfiltratie-high performance liquid chromatography) gebruikt in plaats van de conventionele electro-forese zodat de moleculare grootteverdeling van de produkten numeriek wordt gedefinieerd. Bijgevolg kan de fluctuering van de moleculaire grootteverdeling gemakke-10 lijk worden gecontroleerd, zodat de produkten met het beoogde traject van moleculaire grootteverdeling, dat wil zeggen van 4S tot 13S, uitgedrukt in de waarde van de sedimentatieconstante (of van 50 tot 10.000 of daaromtrent, uitgedrukt in het aantal basen) snel kunnen worden 15 verkregen. De snelle en nauwkeurige werkwijze voor het selecteren van de produkten met de gewenste ketenlengte wordt verschaft door de onderhavige uitvinding.

(3) Na het op geschikte grootte brengen kan een lager alcohol worden toegevoegd aan de reactieoplossing ten 20 einde de produkten te isoleren. (In conventionele methoden worden de produkten verkregen door middel van dialyse.) De onderhavige uitvinding heeft derhalve een zeer eenvoudige isolatietrap tot stand gebracht ter verhoging van de opbrengst aan produkten.

25 (4) Indien de op geschikte grootte gebrachte nucleinezuur polymeren met een enkele keten verzwaveld dienen te worden, worden de polymeren na op geschikte grootte te zijn gebracht, eerst verzwaveld met waterstofsulfide en vervolgens, nadat een arylalcohol is toegevoegd aan de 30 verzwavelingsreactieoplossing, wordt de verkregen oplossing onderworpen aan centrifugatie ten einde het waterstofsulfide te verwijderen. (In conventionele methoden wordt het waterstofsulfide rechtststreeks verdampt uit het oplosmiddel.) De onderhavige uitvinding 35 verschaft aldus een zeer eenvoudige waterstofsulfide- verwijderingstrap ter verhoging van de opbrengst van de produkten.

(5) Als een methode voor het controleren en beperken van c 880 1 664 - 9 - de moleculaire gewichtsverdeling van de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren wordt een ion-uitwisselhars gebruikt. (Deze bewerking wordt hierna aangeduid als "grootte-restrictie".) 5 De onderhavige uitvinding zal hieronder gedetail leerd worden toegelicht.

Het anelleren is een stap inhoudende het binden van complementaire enkelstrengs nucleinezuurpolymeren tot een dubbelstrengs polymeer en dit is een bewerking die natuurlijk 10 met gemak kan worden uitgevoerd. Wanneer het op geschikte grootte brengen wordt uitgevoerd na de anellering, dan zou de verzwavelingsgraad onjuist fluctueren, zodat het moeilijk zou worden om het produkt kwantitatief te verkrijgen. Dienovereenkomstig hebben de onderhavige uitvinders de bewerking 15 van het op geschikte grootte brengen uitgevoerd voorafgaande aan de anelleringstrap met als gevolg dat een zeer uitmuntend resultaat werd verkregen. Het bovengenoemde aspect (1) heeft nauw verband met het aspect (2). Volgens de conventionele wijze ter bepaling van een moleculair gewicht door middel van 20 electroforese, is ten minste één volledige nacht vereist voor migratie, kleuren en andere trappen en derhalve is een snelle procedure moeilijk. Volgens de onderhavige uitvinding, wordt daarentegen HPLC-gelfiltratie toegepast ter bepaling van het moleculaire gewicht van nucleinezuurderivaten, waarbij de 25 reactietijd vóór de elutie van de derivaten met een beoogde moleculaire grootteverdeling (dat wil zeggen, vallend in het traject van 4s tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedi-mentatieconstante, of 50 tot 10.000 of daaromtrent, uitgedrukt als het aantal basen) opmerkelijk kan worden verkort.

30 Volgens de onderhavige uitvinding wordt de reactie gestopt nadat de voltooiing van de reactie betreffende het op geschikte grootte brengen is gedetecteerd, waarna een lager alcohol wordt toegevoegd ten einde de reactieoplossing verder te verwerken. Onder de lagere alcoholen verdient ethanol 35 speciale voorkeur.

In het geval van precipitatie met ethanol volgens de onderhavige uitvinding, is bijvoorbeeld de opbrengst aan L-poly-C (op geschikte grootte gebracht poly-C) (het .8801664 *< - 10 - voorvoegsel "L- . . 11 betekent hierna "op geschikte grootte gebracht . . ") uit poly-C bedraagt 93 % en de opbrengst aan L-poly-I uit poly-I bedraagt 78 %. Derhalve is de opbrengst aan de op geschikte grootte gebrachte produkten hoog.

5 Daarentegen moet volgens de conventionele werkwijze een reactieoplossing in een dialysebuis worden gebracht ten behoeve van de dialyse. In dit geval is de terugwinning slechts ongeveer 60 % en de opbrengst aan L-poly-I uit poly-I zou slechts ongeveer 40 % zijn. Bovendien vereist de dialyse-10 bewerking 3 dagen of daaromtrent.

Volgens de precipitatiewerkwijze met ethanol van de onderhavige uitvinding, waarbij ethanol wordt toegevoegd aan een reactieoplossing in een hoeveelheid van tweemaal die van de reactieoplossing, waarbij wordt geroerd ten einde het 15 gewenste produkt neer te slaan en vervolgens de verkregen neerslag wordt verzameld door centrifugatie en wordt gewassen en gedroogd, kan de werkwijze echter worden geëindigd binnen één uur.

Het bovengenoemde aspect (3) is een zeer belang-20 rijk aspect volgens de onderhavige uitvinding.

De reactie van het substitueren van de stikstofatomen in het nuclelnezuurgedeelte in een op een geschikte grootte gebracht enkelstrengs nucleïnezuurpolymeer door zwavelatomen (bijvoorbeeld het substitueren van de amino-25 groep in de cytidine-residu-eenheid in poly-C door een mer-captogroep in een bepaalde verhouding) ten einde het nuclelne-zuurgedeelte om te zetten in een ander nucleïnezuur (welke reactie hierin wordt aangeduid als "verzwaveling") wordt vaak benut in de synthese van copolymeren. Een ander kenmerkend 30 aspect van de onderhavige uitvinding is het toevoegen van een arylalcohol aan de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren ter isolering van verzwavelde copolymeren. Dit is het bovengenoemde aspect (4).

Als een arylalcohol kan bijvoorbeeld voor dit doel 35 fenol worden gebruikt.

Bijvoorbeeld wordt een halve hoeveelheid fenol eerst toegevoegd aan de reactieoplossing, welke pyridine, water en waterstofsulfidegas in een mengsel bevat, waarna geroerd en .8801664 - 11 - gecentrifugeerd wordt, waardoor de waterige laag scherp wordt afgescheiden van de fenollaag en het kleurmiddel in de reactie-oplossing alsmede het daarbij geproduceerd zwavel en dergelijke overgaan in de fenollaag. Vervolgens wordt de waterige 5 laag geïsoleerd en wordt het beoogde produkt neergeslagen door behandeling met een waterige zoutoplossing en een alcohol. Dan wordt het aldus neergeslagen produkt geïsoleerd door middel van centrifugatie en vervolgens gewassen met een alcohol onder verkrijging van een gezuiverd produkt.

10 Volgens deze werkwijze wordt nagenoeg al het waterstofsulfide overgebracht in de supernatant in de vorm van een waterstofsulfideoplossing en derhalve kan deze gemakkelijk worden verwijderd van het reactieprodukt.

Volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding 15 waarbij gebruik wordt gemaakt van fenol, kan de bewerking bijvoorbeeld worden beëindigd binnen één uur en is de opbrengst bijna 100 %. Bovendien kan het produkt kwantitatief worden geïsoleerd.

De bovengenoemde karakteristieke aspecten (2) tot 20 (4) van de onderhavige uitvinding zijn belangrijk betreffende het op geschikte grootte brengen alvorens te anelleren.

Namelijk deze zijn buitengewoon essentieel voor het op effeciënte wijze uitvoeren van de werkwijze betreffende het op geschikte grootte brengen voorafgaande aan het anelleren.

25 Het bovengenoemde aspect (5) is nog een ander karakteristiek aspect van de onderhavige uitvinding, waarbij een trap inzake de grootte-definiëring wordt uitgevoerd tussen de stappen van het op geschikte grootte brengen onderscheidenlijk het anelleren. Dit zal hieronder worden toegelicht.

30 In deze stap wordt een ion-uitwisselingshars gebruikt. Als voorbeeld van het toepassen van een ion-uitwisselingshars op macromoleculaire nuclelnezuren, wordt DEAE-cellu-lose, DEAE-sephadex, gebenzoyleerd DEAE-cellulose of dergelijke toegepast op t-RNA (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 35 200, 1963; Biochem. 6, 3043, 1967). In het voorbeeld wordt de ion-uitwisselingshars echter slechts aangewend voor de zuivering van laagmoleculaire nuclelnezuren die ten hoogste het aantal basen van ongeveer 80 hebben.

.8801664 ·* - 12 -

De onderhavige uitvinders hebben uitvoerig onderzocht of de intrinsieke eigenschap van het lading-adsorptievermogen van ion-uitwisselingsharsen kan worden toegepast voor de zuivering van macromoleculaire nucleïnezuur-5 polymeren op basis van de index van het aantal basen van de polymeren, met als gevolg de totstandkoming van de onderhavige uitvinding. Aangezien de met de onderhavige uitvinding te verkrijgen eindprodukten buitengewoon nuttig zijn als geneesmiddelen, wordt gemeend, dat de groottedefiniëring, welke 10 wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van een ion-uitwisselings-hars (hetgeen hierna ook zal worden aangeduid als "ion-uitwis-selingsproces"), in het bijzonder een uitstekend inventief aspect vormt in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding.

In het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige 15 uitvinding kan een ion-uitwisselingshars in een houder worden gebracht welke een met de hars te verwerken nucleinezuurpoly-meer bevat, ten einde het doel te bereiken (ladingsgewijze proces), doch in het algemeen wordt kolomchromatografie benut voor de fractionering (kolomproces). In het bijzonder wordt 20 een ion-uitwisselingshars in een kolom gebracht en wordt een oplossing van een nucleïnezuurpolymeer op de kolom gebracht, zodat het polymeer in eerste instantie wordt geadsorbeerd aan de ion-uitwisselingshars. Vervolgens wordt een eluens zoals een zout-trisbuffer of dergelijke lineair of stapsgewijze over 25 de kolom gevoerd waarbij de zoutconcentratie wordt gevarieerd, zodat een constante hoeveelheid van een eluaat wordt verkregen. Het aantal basen van het nucleïnezuurpolymeer, zoals aanwezig in elke geëlueerde fractie, wordt bepaald door dezelfde HPLC-gelfiltratie als eerdergenoemd onder gebruik-30 making van een merker als index, en bijgevolg kunnen de fracties welke het beoogde eindprodukt bevatten, worden verzameld.

Ten einde het doel van de onderhavige uitvinding door het bovengenoemde ion-uitwisselingsproces te bereiken, is 35 de soort van de in een kolom te vullen ion-uitwisselingshars alsmede de soort van het voor de elutie te gebruiken eluens een bijzonder belangrijke factor.

Wanneer bijvoorbeeld poly-I werd opgelost in tris-HCL-buffer en werd geadsorbeerd aan QAE (quaternair .8801064 - 13 - aminoethyl), gebruikt voor de grootte-definiëring van poly-I, voor ion-uitwisseling, dan kon het beoogde produkt niet worden verkregen zelfs wanneer de zoutconcentratie in het eluens buitengewoon hoog werd gemaakt. Dit is omdat poly-I zelf onop-5 losbaar werd daar de zoutconcentratie in het eluens hoger was dan die van een geschikt eluens voor poly-I op de QAE-hars.

Dit blijkt duidelijk uit het feit, dat het inosinylzuur, hetgeen de samenstellende eenheid van poly-I is, structureel meer hydrofoob is. In dit geval kan de zoutconcentratie in een 10 geschikt eluens voor poly-I worden bepaald in vergelijking met het geval voor poly-C.

In een ander experiment zoals dat werd uitgevoerd door de onderhavige uitvinders, werd waargenomen, dat een oplossing van poly-I wit en troebelig werd onder vorming van 15 een precipitaat in een buffer met een geschikte eluens-zout-concentratie voor poly-I in een QAE-hars. Dienovereenkomstig dient te worden opgemerkt, dat in het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding de keuze van de soort van de te gebruiken ion-uitwisselingshars alsmede de keuze van de elue-20 rende zoutconcentratie een buitengewoon belangrijke factor is.

Bijvoorbeeld in het geval van poly-I, gaf DEAE-hars een buitengewoon goed resultaat. In het geval van poly-C werd gevonden, dat zowel QAE-hars als ook DEAE-hars een gunstig resultaat konden opleveren. Voor de elutie kan ofwel een 25 elutie met een lineaire zoutgradiënt ofwel een elutie met een stapsgewijze zoutgradiënt worden benut, waarbij de polymeren gefractioneerd en geëlueerd kunnen worden met betrekking tot de lengte van de ketens van de polymeren.

Wanneer bijvoorbeeld poly-C (38 mg, SO^q, 8,6) werd 30 geadsorbeerd aan DEAE-Toyopearl 650 C ( φ 10 x 130 mm) en vervolgens geëlueerd door middel van een elutie met lineaire gradiënt onder gebruikmaking van de volgende eluentia (A) en (B), elk in een hoeveelheid van 100 ml.

(A) - 0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 35 (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

De lineaire gradiënt was voor (B) (van 0 % tot 100 %); en de elutie-omstandigheden waren als volgt: lineaire stroomsnelheid: 1,32 cm/min .8801664 - 14 - elutiesnelheid: 175 druppels/fractie.

Als resultaat werden de volgende fracties met elk de aangegeven ketenlengte in volgorde geëlueerd.

Fractie b.p.

5 33 340 34 470 35 740 36 1000 37 1500 10 Daarnaast werd hetzelfde monster geëlueerd door een elutie met stapsgewijze gradiënt, waardoor een fractie van minder dan 500 b.p. eerst werd geëlueerd met 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml) en vervolgens een fractie van 500 tot1500 b.p. werd geëlueerd met 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl 15 (pH 7,0) (50 ml).

Op dezelfde wijze werd poly-I (7,8 mg, S2g, 7,3) geëlueerd door middel van een elutie met lineaire gradiënt onder dezelfde omstandigheden als hierboven. Als resultaat werden de volgende fracties op rij geëlueerd.

20 Fractie b.p.

35 30 36 140 37 230 38 350 25 39 460 40 540

Daarnaast werd hetzelfde monster geëlueerd door middel van een elutie met stapsgewijze gradiënt, waarbij een fractie van minder dan 300 b.p. eerst werd geëlueerd met 0,3 M 30 NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml) en vervolgens een fractie van 300 tot 600 b.p. werd geëlueerd met 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml).

Zoals eerder vermeld, kunnen zelfs macromoleculaire nucleinezuren worden gefractioneerd met behulp van de werk-35 wijze volgens de onderhavige uitvinding tot door ketenlengte gedefinieerde nucleïnezuurfracties (grootte-definiëring) door een geschikte keuze van de zoutconcentratie in de elutie.

Zoals toegelicht in de bovengenoemde twee voorbeelden, kunnen fracties (hoofdcomponenten) met een .8801664 - 15 - geschikte ketenlengteverdeling, welke vanwege hun farmaceutische eigenschappen geschikt zijn als geneesmiddelen, vrijelijk worden gefractioneerd uit een mengsel dat verscheidene macromoleculaire nucleinezuren bevat met 5 verschillende ketenlengteverdelingen, en de fractionering kan worden uitgevoerd op een industriële massaproduktieschaal. Dit kenmerk betreffende de fractionering is het meest belangrijke aspect in het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding.

10 Wanneer een farmaceutisch preparaat wordt bereid in de vorm van een injectie, is het alom bekend, dat een bewerking ter verwijdering van een pyrogeen uit de injectie onvermijdbaar is. Van het pyrogeen is bekend dat het is samengesteld uit lipopolysacchariden en deze moeten niet 15 worden opgenomen in geneeskundige preparaten. Indien de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt als een injectiepreparaat voor toediening aan mensen, is de verwijdering van alle pyrogenen essentieel.

Gelukkigerwijze werd gevonden, dat de toepassing van 20 het bovengenoemde ion-uitwisselingsproces op de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding geschikt is voor het verwijderen van pyrogenen uit de derivaten.

Derhalve hebben de onderhavige uitvinders verder uitvoerige experimenten uitgevoerd ten einde het bovengenoemde 25 gunstige verschijnsel nauwkeuriger te onderzoeken, met als resultaat, dat verder werd gevonden, dat pyrogenen kunnen worden verwijderd uit elk enkelstrengs nucleinezuurderivaat, onverschillig de ketenlengte daarvan, door het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding. Dit is weer een 30 ander kenmerkend aspect van de onderhavige uitvinding.

Dienovereenkomstig omvat de onderhavige uitvinding tevens een uitvoeringsvorm betreffende het behandelen van de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding met een ion-uitwisselingshars ten einde pyrogenen daaruit te 35 verwijderen, voor de bereiding van een injectiepreparaat welk het derivaat bevat.

De resultaten die verkregen zijn door een limulus-test voor het kwantitatief bepalen van de hoeveelheid van .8801664 > - 16 - ΐ endotoxine in diverse enkelstrengs RNA's (commercieel poly-C en derivaten met verkorte keten daarvan) zijn vermeld in de onderstaande tabel.

In de tabel betekent EU (endotoxine-eenheid) een 5 eenheid in een konijnen-koortstest met USP-referentiestandaard endotoxine (E. coli 0113). (1) geeft aan dat gedestilleerd water werd gebruikt voor injectie (blanco); (2) verwijst naar

poly-C (commercieel produkt-1); (3) verwijst naar poly-C

(commercieel produkt-2); en (4) verwijst naar het produkt 10 verkregen in het volgende voorbeeld (V-d).

Voor of na uitwis-

Test- selings- Concentratie stof_kolom_yg/ml_EU/ml_pg/mg EU/mg 15 (1) - 29,92 0,0868 (2) voor 308,29 0,8941 548,07 1,5895 na 18,68 0,0542 33,96 0,0985 (3) voor 93,89 0,2723 166,18 0,4891 na 19,45 0,0564 34,12 0,0989 20 (4) voor 89,63 0,2599 155,98 0,4520 na 57,45 0,1666 114,90 0,3332

Uit de resultaten van de bovenstaande tabel blijkt duidelijk het pyrogeen-verwijderende effect van de ion-uitwis-seling.

25 De fysiologische activiteit van de nucleinezuurderi- vaten volgens de onderhavige uitvinding is buitengewoon nuttig voor medicijnen. De nucleinezuurderivaten volgens de onderhavige uitvinding hebben een sterke carcinostatische activiteit, hetgeen hierna gedetailleerd zal worden toegelicht. Deze 30 activiteit is slechts één van een aantal verschillende fysiologische activiteiten van de nucleinezuurderivaten volgens de onderhavige uitvinding.

Als andere fysiologische activiteiten van de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding, welke 35 poly-I.poly-C als ouderlichaam hebben, kunnen verder worden genoemd: TNF-producerend vermogen, interferon-producerend vermogen, interleukin 2-producerend vermogen, macrofaag-activerend vermogen, NK cel-activerend vermogen, remmende werking op de proliferatie van tumorcellen, remmende werking .8801664 - 17 - * op de proliferatie van tumorcellen in naakte muizen die een menselijke tumorcel dragen, remmende werking op de metastase van tumorcellen in de long, enz.

De nuclelnezuurderivaten van de onderhavige 5 uitvinding hebben een veiligheid die zeer veel hoger is dan het conventionele poly-I.poly-C en soortgelijke interferon-inducers. Bijgevolg zijn de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding bruikbaar als een antiviraal middel, anti-tumormiddel enz.

10 De fysiologische activiteiten van de nuclelnezuur derivaten van de onderhavige uitvinding, zoals hierboven vermeld, zijn in detail beschreven in de voornoemde octrooi-publicaties (Japanse octrooiaanvrage nr. 62-167433 en andere Japanse octrooiaanvrage welke prioriteit heeft ingeroepen van 15 deze aanvrage nr. 62-157433.)

De volgende voorbeelden zijn bestemd om de bereiding van de nucleïnezuurderivaten van de onderhavige uitvinding meer gedetailleerd toe te lichten, doch niet ter beperking van de reikwijdte van de onderhavige uitvinding.

20 Voorbeeld I: Bereiding en zuivering van L-poly-I (op geschikte grootte gebrachte poly-ï) 200 ml gedestilleerd water, 250 ml formamide en 500 ml van een 5 M NaCl-oplossing werden toegevoegd aan 10 g van

O

een commercieel poly-I en verhit tot 80 C gedurende circa 25 4 uur.

De reactieoplossing werd onderworpen aan gelfil-tratie door HPLC onder gebruikmaking van een gel G-DNA-PW kolom (7,88 mm ID x 300 mm) (eluens: 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 0,3 M NaCl-oplossing, 2 mM EDTA; stroomsnelheid: 0,5 30 ml/min) waarna de reactie werd beëindigd op het tijdstip waarbij een fractie met een maximum piek voor een retentie-tijd van 21,86 + 0,2 minuten werd verkregen.

Een tweevoudige hoeveelheid ethanol werd toegevoegd aan de reactieoplossing en het verkregen gevormde precipitaat 35 werd verzameld door centrifugatie (3000 omwentelingen per

O

minuut, 4 C). Dit werd gewassen met 70 % ethanol en gedroogd in vacuüm onder verkrijging van 10,2 g L-poly-I.

.8801664 *· - 18 -

Het in de bovenstaande werkwijze gebruikte water en de oplossingen waren alle gesteriliseerd. Datzelfde geldt tevens hieronder.

Voorbeeld II: Bereiding en zuivering van L-poly-C 5 (op geschikte grootte gebracht poly-C) 200 ml gedestilleerd water, 250 ml formamide en 50 ml van een 5 M NaCl-oplossing werden toegevoegd aan 10 g

O

poly-C en verhit tot 80 C gedurende circa 4 uur. Door dezelfde HPLC-gelfiltratie als hierboven, werd het eindpunt van de 10 reactie bevestigd (retentietijd: 21,33± 0,2 min).

Een tweevoudige hoeveelheid ethanol werd toegevoegd aan de reactieoplossing en het gevormde precipitaat werd

O

verzameld door centrifugtie (3000 omwentelingen per min, 4 C). Dit precipitaat werd gewassen met 70 % ethanol en vervolgens 15 gedroogd in vacuüm onder verkrijging van 9,5 g L-poly-C.

Voorbeeld III: Verzwaveling van L-poly-C

8.0 g van het in de bovenstaande stap (II) verkregen L-poly-C werd opgelost in 240 ml water en overgebracht in een 500 ml stalen vat. Een waterstofsulfide bevattende pyridine- 20 oplossing (12 g/120 ml) werd daaraan toegevoegd onder koeling

O

met ijs. Nadat het vat was verzegeld, werd het verhit op 50 C gedurende circa 10 uur. Na afkoeling werd een TE-verzadigd fenol (200 ml) toegevoegd, geroerd en gecentrifugeerd (3000

O

omwentelingen per min, 15 C, 5 min). Een 1/10 hoeveelheid van 25 een 5 M NaCl-oplossing en een tweevoudige hoeveelheid ethanol werden toegevoegd aan de afgescheiden waterige fase onder oplevering van een precipitaat daarin. Het precipitaat werd 0 verzameld door centrifugtie (3000 omwentelingen per min, 4 C, 10 min), gewassen met 70 % ethanol en gedroogd in vacuüm onder 4 30 oplevering van 8,0 g L-poly(C20, S U) (namelijk, op geschikte grootte gebracht poly-C-derivaat waarin de cytidylzuren zijn gesubstitueerd door 4-thiouridylzuur in een hoeveelheid van één 4-thiouridylzuur voor 20 cytidylzuren).

De bovengenoemde term TE betekent 10 mM Tris-HCl-35 buffer (pH 7,5) welke EDTA bevat in een hoeveelheid van 1 mM. Voorbeeld IV: Uitvoering van het anelleren 6.00 g van het in de bovengenoemde stap (III) 4 verkregen L-poly(C2Q, S U) en 6,44 g van het in de bovenge- .8801664 - 19 - noemde stap (I) verkregen poly-I werden opgelost in 300 ml 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5)/50 mM NaCl-oplossing en daarin

O

gemengd. De verkregen oplossing werd verhit tot 70 C in een waterbad en op die temperatuur gehouden gedurende 10 minuten.

5 Daarna liet men de oplossing afkoelen gedurende de nacht. Na behandeling met fenol en een precipitatie met ethanol, werd water (circa 200 ml) toegevoegd aan het gevormde precipitaat ten einde dit op te lossen. Dan werd de verkregen oplossing

O

gedialyseerd tegenover water bij 4 C. Het dialysaat werd 10 geconcentreerd tot droogte onder oplevering van 12,4 g van een geanelleerde verbinding.

Voorbeeld V: Grootte-definiëring door ion-uitwisse-lingsproces

De lon-uitwisseling werd uitgevoerd door een staps- 15 gewijze elutie of elutie met lineaire gradiënt. In beide gevallen waren de opbrengst en de ketenlengte van de produkten bijna hetzelfde, mits de elutieomstandigheden geschikt waren uitgekozen. Voor de stapsgewijze elutie van L-poly-C en 4 L-poly(C, S U), werden 0,15 M NaCl/10 mM Tris-HCl 20 (pH 7,0) en 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) continu gebruikt.

Met betrekking tot de stapsgewijze elutie van L-poly-I wordt verwezen naar het volgende voorbeeld V-a.

Voor de elutie met lineaire gradiënt van L-poly-I 25 werden (A) en (B) gebruikt en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.

(A) = OM NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).

Met betrekking tot de elutie met lineaire gradiënt 4 30 van L-poly-C en L-poly(C, S U) wordt verwezen naar voorbeeld V-b en V-d.

V-a: Grootte-definiëring van L-poly-I

210 mg van het in de bovengenoemde stap (I) verkregen L-poly-I werd opgelost in 5 ml van een 10 mM

RTM

35 Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsorbeerd aan DEAE-Toyopear1 650 C ( φ 10 mm x 130 mm). Het geheel werd vervolgens stapsgewijze geëlueerd met een lineaire stromingssnelheid van 1,30 cm/min, met de eluentia 0,03 M NaCl/10 mM Tris-HCl . 880 1 664' * - 20 - '3 i (pH 7,0) (50 ml) en 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (80 ml). De met 0,5 M NaCl geëlueerde fractie werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door middel van dezelfde HPLC-gelfiltratie als in de bovengenoemde stap (I), welke 5 retentietijd 21,90± 0,2 (min) bedroeg.

Het beoogde eindprodukt L-poly-I (grootte-gede- finieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen in een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 91 %.

V-b: Grootte-definiëring van L-poly-C

10 610 mg van het in de bovengenoemde stap (II)

verkregen L-poly-C werd opgelost in 10 ml Tris-HCl-buffer (pH

RTM

7,0) en geadsorbeerd aan QAE-Toyopearl 550 C (φ 10 mm x 130 mm). Daarna werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire gradiënt bij een lineaire stroomsnelheid van 1,30 15 cm/min, waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheid van de oplossing (B) lopende van 0 tot 100 %.

(A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 20 (B) = 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

De fractie, zoals geëlueerd bij de hoofdpiek, werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door middel van HPLC-gelfiltratie, welke 21,35± 0,2 min bedroeg. Het beoogde eindprodukt L-poly-C (grootte-gedefinieerd) met een basegetal van 25 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst was 93 %.

V-c: Grootte-definiëring van L-poly(C^^, U) 19 mg polyiC^, U) (waarin de cytidylzuren werden gesubstitueerd door uridylzuur in een hoeveelheid van één 30 uridylzuur voor 12 cytidylzuren) (dit had een retentietijd van 18,67 minuten in dezelfde HPLC als in de bovengenoemde stap (I)) werd opgelost in 5 ml Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsor-

RTM

beerd aan DEAE-Toyopearl 650 C ( φ10 mm x 130 mm).

Vervolgens werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire 35 gradiënt met een lineaire stroomsnelheid 1,30 cm/min, waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.

.88 0 1 664 3 - 21 - (A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

De fractie zoals geëlueerd bij de hoofdpiek, werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door HPLC-gelfiltratie, 5 welke tijd 18,97± 0,2 min bedroeg. Het beoogde eindprodukt L-poly-(C.j2 / U) (grootte-gedefinieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 87 %.

V-d: Grootte-definiëring van L-poly(C2Q, S^U) 10 600 mg van het in de bovengenoemde stap (III) 4 verkregen L-poly(C2Q, S U) werd opgelost in 10 ml Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsorbeerd aan QAE-Toyopeari™ 550C (Φ10 mm x 130 mm). Daarna werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire gradiënt met een lineaire stroomsneldheid cm/min, 15 waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.

(A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 20 (B) = 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)

De retentietijd werd gemeten door HPLC-gelfiltratie op dezelfde wijze als in de bovengenoemde stap V-b, welke tijd 21,35± 0,2 min bedroeg.

4

Het beoogde eindprodukt L-poly(C2Q, S U) (grootte-25 gedefinieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 90 %.

Voorbeeld VI: Anellering:

VI-a: L-poly-I en L-poly-C

30 3,0 g van het grootte-gedefinieerde L-poly-C

(verkregen in de bovengenoemde stap V-b) en 3,2 g van het grootte-gedefinieerd L-poly-I (verkregen in de bovengenoemde stap V-a) werden afzonderlijk opgelost in 150 ml 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5)/50 mM NaCl en werden vermengd. De

O

35 verkregen oplossing werd verhit tot 70 C in een waterbad en werd op deze temperatuur gehouden gedurende 10 minuten. Daarna liet men de oplossing gedurende de nacht afkoeien. Na een behandeling met fenol en een precipitatie met ethanol werd .8801664 * , - 22 - water (circa 400 ml) toegevoegd aan het gevormde precipitaat ten einde dit op te lossen. Daarna werd de verkregen oplossing

O

gedialyseerd tegen water bij 4 C. Het dialysaat werd geconcentreerd tot droogte onder oplevering van 6,2 g van een geanel-5 leerde verbinding.

Vl-b: L-poly-I en L-polyCCpg, S U) 1,46 g van het grootte gedefinieerde L-poly( C20's u) (verkregen in de bovenstaande stap V-d) en 1,57 g van het grootte-gedefinieerde L-poly-I (verkregen in de bovenstaande 10 stap V-a) werden verwerkt op dezelfde wijze als in de bovengenoemde stap Vl-a, en 3,0 g van een geanelleerde verbinding werd verkregen in elk geval.

De uitvinding is thans in detail en onder verwijzing naar specifieke uitvoeringsvormen ervan beschreven, doch het 15 zal duidelijk zijn aan deskundigen op het vakgebied, dat diverse veranderingen en modificaties daarin kunnen worden gemaakt zonder af te wijken van de geest en reikwijdte van de uitvinding.

.8801664

Claims (8)

1. Werkwijze voor het bereiden van dubbelstrengs nucleïnezuurderivaten die RNA als het onderlichaam hebben, met het kenmerk, dat de gehele moleculaire grootteverdeling daarvan valt binnen het traject van 4S tot 5 13S, uitgedrukt in de waarde van de sedimentatieconstante ervan, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht en vervolgens worden geanelleerd.

2. Werkwijze voor de bereiding van dubbelstrengs nucleïnezuurderivaten die RNA als het ouderlichaam hebben, 10 met het kenmerk, dat daarin de moleculen voor de maximum verdeling in de totale moleculaire grootteverdeling van de derivaten het aantal basen heeft dat valt in het traject van 50 tot 10.000, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht en vervolgens worden 15 geanelleerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat een lager alcohol wordt toegevoegd aan de reactieoplossing welke het op geschikte grootte gebrachte nuclelnezuurpolymeer bevat, voorafgaande aan het anelleren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het lagere alcohol ethanol is.

4 - 23 - 5

5. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de nuclelnezuurgedeelten in de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren 25 worden verzwaveld in aanwezigheid van een arylalcohol, voorafgaande aan het anelleren.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het arylalcohol een fenol is,

7. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het 30 kenmerk, dat de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren worden behandeld met een ion-uitwisselingshars, voorafgaande aan het anelleren, ten einde de polymeren te verzamelen met een moleculaire grootteverdeling die ligt binnen een voorafbepaald traject ten 35 behoeve van grootte-definiëring van de op geschikte grootte gebrachte polymeren. .8801664 * - 24 -

8. Werkwijze voor de bereiding van een injectie-preparaat, dat in wezen nuclexnezuurderivaten bevat, met het kenmerk, dat pyrogenen in de derivaten, indien aanwezig, worden verwijderd onder toepassing van een 5 ion-uitwisselingshars, > 8 8 0 1 6 6 4'