CN112400017A - 用于检测寡核苷酸缀合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测溶液中至少一种所关注的寡核苷酸缀合物的方法，其中所述所关注的寡核苷酸缀合物由核酸实体和非极性实体构成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体，并且其中所述方法包含以下步骤：提供包含所述所关注的寡核苷酸缀合物的液体样品；在包括溶液中至少一种环糊精存在的条件下，通过分析方法从所述液体样品中分离出所述所关注的寡核苷酸缀合物；和借助于定性或定量分析检测所述所关注的寡核苷酸缀合物。

Description

用于检测寡核苷酸缀合物的方法
对来自生物或液体样品的目标分子的高精度分析已发展成为包括医学或药理学诊断在内的各种科学领域中的重要工具。用于寡核苷酸的定性或定量检测和分析的高灵敏度检测系统是最先进的分析实验室和分析应用的重要工具。
结合UV吸收或荧光检测的离子交换色谱法在本领域中常规地用于分析合成寡核苷酸的纯度或检测寡核苷酸修饰。在此，寡核苷酸在带正电的固定相上通过磷酸二酯主链负电荷的数量分离，所述磷酸二酯主链负电荷由其主链的长度限定。在寡核苷酸代谢物的高分辨率分析的背景下，已进一步描述结合有UV检测或荧光读数的离子交换色谱法(WO2010/043512A1)。
在分析如小分子、寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的目标分子的领域中，尤其在化学寡核苷酸合成质量控制的背景下，始终需要改进的分析方法。
在本发明的情境中，已出人意料地发现，在溶液中存在如环糊精的特定水溶性物质的情况下，可以通过分析方法显著改进寡核苷酸的检测、分离和分析。
环糊精为环状寡糖，其由不同数量的α-1-4连接的葡萄糖单元组成。这些葡萄糖链形成锥形腔，化合物可进入所述锥形腔并形成水溶性复合物，从而改变如药物的特定物质的生理化学性质。β-环糊精的羟烷基衍生物2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)已用作赋形剂来改善水溶性差的药物的溶解度(Jiang等人,《脂质研究杂志(Journal of LipidResearch)》，第55卷(2014)，1537-1548)。在反相高效液相色谱法(RP-HPLC)的背景下，含有环糊精的溶液已进一步用于类固醇激素对映体的手性分离(Ye等人，《色谱法杂志B辑(Journal of Chromatography B)》，843(2006)289-294)，或用于分离和鉴定茉莉酸甲酯的四种不同的立体异构体(Matencio等人，《植物化学分析(Phytochemical Analysis)》(2016)，wileyonlinelibrary.com)。因此，环糊精已参与改善如立体异构体的小分子的纯化。
然而，如寡核苷酸的大目标分子的分析和纯化与小分子的分析显著不同，并且高分辨率下寡核苷酸的检测和分析是一个特殊的挑战。在本发明的情境中，已出人意料地发现，在溶液中存在环糊精用作添加剂的情况下并且当目标分子化学连接至如充当环糊精结合部位的亲脂性或疏水性结构的非极性实体时，如一定长度的寡核苷酸的大目标分子的检测和分析得到显著改善。
在第一方面，本发明涉及一种用于检测溶液中至少一种所关注的寡核苷酸缀合物的方法，其中所述所关注的寡核苷酸缀合物由核酸实体和非极性实体构成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体，并且其中所述方法包含以下步骤：
a)提供包含所述所关注的寡核苷酸缀合物的液体样品；
b)在包括溶液中至少一种环糊精存在的条件下，通过分析方法从所述液体样品中分离出所述所关注的寡核苷酸缀合物；
c)借助于定性或定量分析检测所述所关注的寡核苷酸缀合物。
在本发明的情境中使用的术语“核酸实体”或“寡核苷酸”通常是指由脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)或两者构成的任何类型的寡聚物或聚合物。也就是说，根据本发明的核酸实体或寡核苷酸是指由DNA寡核苷酸构成的DNA分子或由RNA寡核苷酸构成的RNA分子或由DNA和RNA核苷酸两者构成的寡核苷酸。核酸实体或寡核苷酸可以是单链的，或者是由互补核酸链构成的双链体形式。核酸实体或寡核苷酸还可包括但不限于所有种类的合成设计和/或合成制备的DNA寡核苷酸，例如诱骗寡核苷酸。原则上，根据本发明的核酸实体或寡核苷酸可以包括由以下构成的所有种类的结构：核碱基(即含氮碱基)、可以是核糖、2'-脱氧核糖或其任何衍生物的五碳糖，和磷酸基。核碱基和糖构成称为核苷的单元。磷酸基可以与糖的2碳、3碳或5碳形成键，特别是与糖的3碳和5碳形成键。核糖核苷酸含有核糖作为糖部分，而脱氧核糖核苷酸含有脱氧核糖作为糖部分。本发明的核酸实体可以含有嘌呤或嘧啶碱基或其任何衍生物。由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其任何组合构成的根据本发明的核酸实体或寡核苷酸还可包括一个或多个经修饰的核苷酸。任选地，核酸实体或寡核苷酸可以仅包含经修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的核糖形式和脱氧形式可以例如包括但不限于5-丙炔基-尿苷、5-丙炔基-胞苷、5-甲基-胞苷、2-氨基-腺苷、4-硫尿苷、5-碘尿苷、N-6-甲基-腺苷、5-氟尿苷、肌苷、7-丙炔基-8-氮杂-7-脱氮嘌呤核苷和7-卤代-8-氮杂-7-脱氮嘌呤核苷。在本发明的情境中所提到的核酸实体或寡核苷酸还可包含糖或核糖修饰，如2'-O-甲基(2'-OMe)RNA或2'-氟(2'-F)RNA。任选地，本发明的核酸实体或寡核苷酸还可或替代地在磷酸主链上包含一个或多个修饰，例如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，或本领域中已知的任何其他修饰。
核酸实体还可来源于所有种类的天然、非天然或人工来源，包括但不限于病毒、细菌和真核DNA或RNA。或者，核酸实体可来源于合成来源，包括用于研究、用于诊断或用作治疗剂的寡核苷酸的制备和/或化学合成。如本文所使用，术语“合成”优选是指借助于化学合成的方式来制备DNA或RNA寡核苷酸，所述化学合成包括但不限于自动化DNA和/或RNA合成器和/或亚磷酰胺化学法的使用。自动DNA或RNA合成器由本领域技术人员常规使用，并且可购自不同供应商，例如，Applied Biosystems(达姆施塔特，德国)、Biolytic(纽瓦克，加利福尼亚，美国)、GE Healthcare或BioAutomation(普莱诺，德克萨斯州，美国)。
在优选实施例中，寡核苷酸缀合物的核酸实体由DNA或RNA核苷酸或其任何组合构成。更优选地，核酸实体是化学合成的寡核苷酸，甚至更优选地，包含经修饰的DNA核苷酸和/或经修饰的RNA核苷酸或由经修饰的DNA核苷酸和/或经修饰的RNA核苷酸组成的化学合成的寡核苷酸。
根据本发明的“寡核苷酸缀合物”是指核酸实体或本文所定义的寡核苷酸，其中所述核酸实体或所述寡核苷酸化学连接至另一种物质或另一种化学实体，优选地化学连接至任何种类的非极性实体。在本发明的情境中，寡核苷酸缀合物优选由核酸实体和非极性实体构成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体。核酸分子与如任何种类的非极性实体的其它化学实体的化学连接是本领域的常规方法并且是技术人员众所周知的。
本文所提到的“非极性实体”可以是任何种类的非极性物质，包括但不限于适合于化学连接至核酸实体的任何种类的亲脂性、疏水性或脂质结构。这意味着，在本发明的情境中，非极性实体选自以下的群组：本领域技术人员已知的能够化学连接至核酸实体的那些非极性物质、非极性化学实体或非极性分子。因此，术语“非极性实体”不扩展到由于其性质或结构特征而不能用于本发明目的的那些非极性分子或脂质结构。
在优选实施例中，非极性实体是亲脂性或疏水性实体。非极性实体优选选自由以下组成的群组：胆固醇、生育酚和氟喹诺酮。更优选地，非极性实体是胆固醇。
在本发明的情境中使用的特征“液体样品”是指在溶液中含有所关注的目标分子或目标分子群体的所有种类的液体样品。液体样品可以通过包括但不限于适合于制备细胞或组织提取物的标准生化和/或细胞生物学程序的程序来产生，其中所述细胞和/或组织可以来自任何种类的生物体。根据本发明的液体样品可以是任何类型的缓冲液、在分析方法的情境中使用的洗脱液，或者是来源于细胞或来源于细胞培养物中生长的细胞的细胞提取物或组织提取物，或者通过解剖和/或手术从生物体获得。特别地，根据本发明的生物样品可以从一个或多个患者的一个或多个组织或从任何种类的活体人类或非人类受试者获得。优选地，本发明的液体样品是针对分析方法制备的样品，并且因此，没有样品直接来源于人类或非人类生物活体。由细胞、由细胞提取物或者由组织提供液体样品可以包括一个或多个生化纯化步骤，例如离心和/或分馏、借助于包括例如多次冷冻和/或解冻循环的机械或化学破坏步骤的细胞裂解、盐处理、苯酚-氯仿提取、十二烷基硫酸钠(SDS)处理和蛋白酶K消化，或其任何组合。同样优选地，不使用本文描述的任何沉淀和/或纯化步骤即提供本发明的液体样品。
应理解，如本文所使用，术语“液体样品”通常是指允许悬浮所关注的目标分子，特别是允许悬浮待检测的寡核苷酸缀合物的任何种类的水溶液、缓冲液或液体溶液。
在优选实施例中，第一方面的方法的特征在于步骤b)的分析方法选自由以下组成的群组：阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)、尺寸排阻液相色谱法(SEC-LC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、离子对反相高效液相色谱法(IP-RP-HPLC)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
在本发明的方法的情境中应用的且如上文所阐述的分析方法是在生化分析领域中的本领域中通常使用的常规方法，并且是技术人员众所周知的。在本申请的实例部分中进一步例示了根据本发明的各种分析方法的应用。
通常，在本发明的情境中，待检测的寡核苷酸缀合物，特别是其核酸实体，可以具有6至150个核苷酸，或10至100个核苷酸，或10至50个核苷酸的总长度，或优选10至25个核苷酸的长度。同样优选的是，所关注的寡核苷酸缀合物具有在10至80个核苷酸的范围内、更优选在12至50个核苷酸的范围内、最优选在10至40个核苷酸的范围内的长度。然而，对于技术人员显而易知的是，也可以组合上述上限和下限以达到不同的范围。此外，含有所关注的寡核苷酸缀合物的本发明的液体样品还可含有具有这种可变长度的寡核苷酸分子群体。也就是说，在本发明的情境中提供的样品可包含相同长度的寡核苷酸缀合物，或可包含不同长度的寡核苷酸缀合物，或可包含两者。然而，不同长度的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物的存在不损害通过本发明的方法对寡核苷酸缀合物的定性或定量检测。
在另一个优选实施例中，核酸实体具有6至150个核苷酸的长度，优选10至80个核苷酸的长度，更优选12至50个核苷酸的长度。
在优选实施例中，第一方面的方法的特征在于步骤c)中的检测包括检测所关注的寡核苷酸缀合物本身以及检测寡核苷酸缀合物的杂质。优选地，这些杂质由一种或多种非全长核酸实体构成，优选地，呈一种或多种非全长合成产物的形式，其可以来自化学寡核苷酸合成过程。甚至更优选的是，杂质由一种或多种核酸实体，或其任何组合构成，所述核酸实体呈长度或结构与全长合成产物不同的一种或多种合成产物的形式。
在本发明的情境中，术语“检测(detection/detecting)”通常是指可视化、分析和/或量化所关注的目标分子。特别地，术语“检测”是指本领域和技术人员已知的任何方法，其适合于借助于UV吸收或者借助于荧光读数来检测和分析寡核苷酸。UV吸收常规地在254nm至260nm的波长下进行。用于寡核苷酸的定性或定量检测的方法是技术人员众所周知的，并且在本领域中已详尽描述。本发明的实例进一步例示了在存在和不存在至少一种环糊精的情况下根据本发明的寡核苷酸缀合物的检测。
如本文所使用，术语“杂质”通常是指任何种类的非全长寡核苷酸缀合物，包括其任何种类的具有相同、相似、较小或增加数量的核苷酸的核酸实体的衍生物，从而产生相等但不一定相同长度的寡核苷酸缀合物。然而，术语“相等长度”还可包括寡核苷酸缀合物具有相同的长度。同样优选的是，寡核苷酸缀合物，特别是其核酸实体，具有相似的长度，也就是说所述长度与全长产物的长度略有不同。因此，根据本发明的“相等长度”还包括，各个核酸实体的长度彼此相差几个核苷酸，优选地相差一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个核苷酸。或者，寡核苷酸缀合物还可含有任何种类的添加剂、修饰或加合物，或由任何种类的添加剂、修饰或加合物构成，所述任何种类的添加剂、修饰或加合物可以或可以不由化学寡核苷酸合成的过程产生。
优选地，根据本发明的杂质包括但不限于具有相似长度的核酸实体的寡核苷酸缀合物，其长度相差仅少量核苷酸，优选长度相差不超过25个核苷酸，更优选长度相差不超过15个核苷酸，甚至更优选长度相差不超过10或5个核苷酸。如本文所使用的术语“杂质”还包括所关注的寡核苷酸缀合物，并且其衍生物可包括、包含或涵盖一个或多个相同或不同的化学修饰。关于数量和/或同一性两者，化学修饰可以相同或不同。
在本发明的情境中，进一步发现在特定温度下进行阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)等分析方法产生改进的分离谱。还可将特定的温度范围应用于已经发现适合于本发明方法的各种其它分析方法。进一步发现，当在含有甲基-β-环糊精(MbCD)的缓冲液的存在下进行时，本发明的方法即使在环境温度下也允许通过洗脱获得高分辨率的结果和胆固醇缀合的寡核苷酸的不同峰。
在优选实施例中，第一方面的方法的特征在于步骤b)的分析方法选自由以下组成的群组：阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)、尺寸排阻液相色谱法(SEC-LC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，离子对反相高效液相色谱法(IP-RP-HPLC)和毛细管凝胶电泳(CGE)，其中
i)阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)在10℃至90℃的温度下、优选在30℃至75℃的温度下、更优选在环境温度下进行；
ii)尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)在10℃至50℃的温度下、优选在20℃至40℃的温度下进行；
iii)反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在10℃至100℃的温度下、优选在40℃至70℃的温度下进行；
iv)离子对反相高效液相色谱法(IP-RP-HPLC)在10℃至100℃的温度下、优选在30℃至85℃的温度下进行；
v)毛细管凝胶电泳(CGE)在10℃到60℃的温度下、优选在30℃到50℃的温度下进行。
在另一个优选实施例中，在本发明的方法的情境下使用的至少一种环糊精选自由以下组成的群组：环糊精的α、β、γ或δ变体。优选地，至少一种环糊精选自β环糊精的群组。甚至更优选的是至少一种环糊精为甲基-β-环糊精。
在本发明的情境中，已发现溶液中至少一种环糊精的存在有利于检测和分析在本文所限定的各种分析方法的情境下的所关注的寡核苷酸缀合物。当进行检测根据本发明的寡核苷酸缀合物的方法时，由溶液中至少一种环糊精的存在产生的有利效果由本发明的实例进一步例示。
特别地，已发现溶液中环糊精的特定最终浓度范围优选地适合于获得高峰值分辨率，并且因此适合于获得最优分析结果。
优选地，本发明的方法的特征在于使得溶液中至少一种环糊精以0.01mM到50mM的最终浓度、优选0.5mM到25mM的最终浓度，并且更优选1mM到15mM的最终浓度存在。
同样优选的是，溶液中至少一种环糊精以5mM、10mM或20mM的最终浓度存在。
优选地，将至少一种环糊精在进行步骤b)之前添加到液体样品中。
优选地，步骤c)中的检测借助于UV读数、借助于荧光读数或借助于质谱(MS)或类似的任何方法进行。
在另一个优选实施例中，所述方法用于分析或制备目的。
在一个实施例中，如果所述方法用于分析目的，那么在步骤c)中优选通过确定杂质的程度来确定合成产物的质量。
在同样优选的替代实施例中，如果所述方法用于制备目的，那么在步骤c)中优化全长合成产物的产率，其中收集了含有所关注的寡核苷酸缀合物的液体级分。优选地，收集的至少一种或多种液体级分含有高含量的所关注的寡核苷酸缀合物，更优选地，其特征在于收集的级分中所关注的寡核苷酸缀合物包含全尺寸长度的核酸实体。
在本发明的情境中使用的术语“制备目的”通常是指任何种类的实验装置，其中将纯化和/或处理大量的输入材料。通常，大量的输入材料可以是任何种类的浓度范围，优选在1mg至10kg输入材料之间的任何种类的浓度范围。同样优选的是，考虑到实验装置，特别是纯化系统的能力适合于处理如此大量的输入材料，浓度范围甚至更低或更高，更优选地达到20kg、30kg、50kg或100kg的输入材料。
根据本发明的输入材料通常是指在本发明的情境中待检测和/或分析的任何种类的所关注的合成产物，优选所关注的寡核苷酸缀合物。如本文所使用，术语“高含量”或“高数量”应理解为表示用于应用于本发明情境中的分析方法的寡核苷酸浓度的灵活范围，优选反映用作起始材料的大量所关注的寡核苷酸缀合物输入材料的浓度范围。
如本文所使用，术语“液体级分”通常是指可以作为在本发明的情境中应用的分析方法的结果而得到的任何种类的液体样品，优选呈从洗脱谱收集的液体样品的形式，更优选来自色谱洗脱谱的液体样品。本发明的液体级分可以具有对从业者方便的任何大小和/或可以通过本领域技术人员可用的和已知的任何实验或实践方法来收集。
优选地，在本发明的情境中，合成产物的质量由全长合成产物的量和/或比率与非全长合成产物的量和/或比率限定。
优选地，所述非全长合成产物是中间和/或不规律合成产物或两者的组合，更优选地，所述中间合成产物在5'-或3'-端或在两端不具有一个或多个核苷酸。甚至更优选的是所述中间合成产物由相对于预期全长呈n-1、n-2、n-3、n-4、n-5、n-6、n-7、n-8、n-9、n-10等形式的核酸实体组成。
在另一方面，本发明涉及一种用于评估化学寡核苷酸合成产物的质量的方法，其中所述方法包含以下步骤：
a)提供含有或怀疑含有至少一种所关注的寡核苷酸缀合物的液体样品，其中所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物由核酸实体和非极性实体构成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体，并且其中所述核酸实体是化学寡核苷酸合成产物；
b)在包括溶液中至少一种环糊精存在的条件下，通过分析方法从所述液体样品中分离出所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物；
c)借助于定性或定量分析检测所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物；
d)收集液体级分；
e)通过分析方法分析含有或怀疑含有所述所关注的寡核苷酸缀合物的所述收集的级分，其特征在于所述所关注的寡核苷酸缀合物的所述核酸实体由所述至少一种全长合成产物构成。
评估根据本发明的化学寡核苷酸合成产物的质量通常包括但不限于对合成产物的纯度的分析，其中纯度可以通过但不限于本文所描述的分析方法测定。评估化学寡核苷酸合成产物的质量还意味着确定液体样品中杂质的程度和/或数量，例如任何种类的非全长合成产物和/或其它合成产物，例如任何种类的产物添加剂或人工制品。通常，纯度越高，检测到的杂质越少。优选地，如果至少一种或多种收集的级分含有全长合成产物的至少75％，更优选至少85％，并且甚至更优选至少90％，那么合成产物的纯度是最优的。最优地，所述至少一种或多种收集的级分含有全长合成产物的至少95％或甚至100％。
本发明方法的优点在于，峰宽显著减小，所述峰宽减小使得刚好在主峰之前和之后洗脱的峰的分辨率显著增加，并且所述峰在存在至少一种环糊精的情况下是对称的，而其在不存在作为溶液中的添加剂的环糊精的情况下不对称。在本申请的实例和附图中进一步例示了在本发明的情境中采用的方法的改进技术效果。
本发明第二方面的方法优选地以本文中定义的实施例中的任一个为特征，并且优选地以在本发明的第一方面的情境中定义的实施例中的任一个为特征。通过本申请的实例和附图进一步概述了所述方法的实施例。
术语“定量读数”通常是指本领域已知的适合于可视化、检测、分析和/或量化来自样品的所关注的寡核苷酸的所有种类的成像方法。
同样优选的是，寡核苷酸缀合物的检测借助于定性分析进行。根据本发明的定性分析例如通过本发明的实例例示。
此外，寡核苷酸缀合物的检测可以通过定量读数进行。根据本发明的定量读数涉及内标或外标的使用。在本发明的情境中已经描述了通过使用内标进行的定量读数。或者，同样优选的是，定量读数涉及以与外部校准曲线比较的形式使用外标。
优选地，外部校准曲线来源于与所关注的样品相同的条件下处理的已知浓度或已知分子量的目标分子的稀释系列。
以下附图和实例旨在说明本发明的各种实施例。因此，其中讨论的具体修改不应理解为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将显而易知的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以做出各种等效、改变和修改，并且因此应理解，本文将包括这些等效实施例。
附图说明
图1：SEC-HPLC柱：GE Healthcare Superdex 75Increase 10/300GL。温度：室温25℃(非变性：色谱分析期间双链体保持完整)。洗脱液：含1mM甲基-β-环糊精的15％ACN中的1x PBS或不含甲基-β-环糊精的15％ACN中的1x PBS。流动速率：0.9毫升/分钟。黑色迹线：在存在甲基-β-环糊精的情况下分析的双链体。蓝色迹线：在不存在甲基-β-环糊精的情况下分析的双链体(双链体峰未从柱中洗脱，没有峰)。
图2：通过AEX-HPLC：柱：ThermoFisher Scientific DNA Pac PA200；4x 250mm温度：85℃对X32755K1的单链分析。洗脱液A：25mM TRIS；pH＝8时在25％乙腈中的1mM EDTA；洗脱液B在洗脱液A中的500mM高氯酸钠；在存在或不存在5mM甲基-β-环糊精的情况下制备洗脱液。流动速率：1.0毫升/分钟。通过以下梯度洗脱化合物：洗脱液B 24.5％，在一分钟后开始增加，在33分钟时增加到37％的梯度。黑色迹线：在洗脱液A和洗脱液B中在5mM甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1。蓝色迹线：在洗脱液A和洗脱液B中在无甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1。
在存在甲基-β-环糊精的情况下，主峰更加对称，其在基线处的峰宽小得多(0.92vs.0.62分钟)，产生更大的峰高。峰高越大对应的主峰检测的灵敏度越高。主峰中的杂质峰的分辨率得到了改进，例如，根据USP(美国药典)，随后洗脱液中洗脱的杂质峰相对于主峰的分辨率从无甲基-β-环糊精存在的1.48增加到存在5mM甲基-β-环糊精的3.63。
图3：通过CGE：毛细管-eCAP DNA Capillary(65cm总长；100μm I.D.)，BeckmanCoulter对X32755K1的单链分析，No.:477477；温度：35℃。运行缓冲液：含10mM甲基-β-环糊精的1x TRIS硼酸盐缓冲液或不含10mM甲基-β-环糊精的1x TRIS硼酸盐缓冲液。分离电压：30kV。蓝色迹线：在10mM甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1。黑色迹线：在无甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1(单链峰未从毛细管中洗脱，没有峰)。
图4：通过CGE：毛细管-eCAP DNA Capillary(65cm总长；100μm I.D.)，BeckmanCoulter对X32755K1的单链分析，No.:477477；温度：35℃。运行缓冲液：含10mM甲基-β-环糊精的1x TRIS硼酸盐缓冲液或含20mM甲基-β-环糊精的1x TRIS硼酸盐缓冲液或不含10mM甲基-β-环糊精的1x TRIS硼酸盐缓冲液。分离电压：30kV。粉色迹线：在10mM甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1；蓝色迹线：在10mM甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1。黑色迹线：在无甲基-β-环糊精存在下分析的X32755K1(单链峰未从毛细管中洗脱，没有峰)。
图5：固定化胆固醇的结构。
图6：在环境温度下使用Source 15Q树脂通过HPLC纯化约1mg原材料。缓冲液含有30％乙腈(ACN)。
图7：在环境温度下使用Source 15Q树脂通过HPLC纯化约1mg原材料。缓冲液含有25％ACN和20mM甲基-β-环糊精(MbCD)。
图8：在60℃下使用Source 15Q树脂通过HPLC纯化约100μg原材料。缓冲液仅含有30％ACN，不添加MbCD。
图9：在环境温度下使用TSK Gel树脂HPLC纯化约8mg原材料。梯度NaBr，20mM Na-磷酸盐，在含有20mM MbCD的15％ACN中pH为7.8。流动速率为1毫升/分钟，并且梯度经计划以在60分钟内从0％缓冲液B开始到达到40％缓冲液B。
图10：在环境温度下使用Source 15Q树脂HPLC纯化约8mg原材料。梯度NaBr，20mMNa-磷酸盐，在含有20mM MbCD的15％ACN中pH为7.8。流动速率为1毫升/分钟，并且梯度经计划以在60分钟内从0％缓冲液B开始到达到40％缓冲液B。
图11：在60℃下使用TSK Gel树脂HPLC纯化约8mg原材料。使用梯度NaBr，20mM Na-磷酸盐，pH为7.8的含有20mM MbCD的15％ACN洗脱材料。流动速率为1毫升/分钟，且梯度经计划以在5分钟内从0％缓冲液B开始到达到10％缓冲液B，并且随后梯度的倾斜值在60分钟内改变到40％B。
图12：在60℃下使用Source 15Q树脂HPLC纯化约8mg原材料。梯度NaBr，20mM Na-磷酸盐，pH为7.8的含有20mM MbCD的15％ACN。流动速率为1毫升/分钟，且梯度经计划以在5分钟内从0％缓冲液B开始到达到10％缓冲液B，并且随后梯度的倾斜值在60分钟内改变到40％B。
图13：示出分析结果。收集的级分分别对应于图9到12中用双向箭头
Figure BDA0002802649820000131
标记的FLP峰的区域。
实例
实例1：在SEC-LC中作为添加剂的甲基-β-环糊精
目标：开发一种用于分析胆固醇缀合的寡核苷酸双链体的SEC-LC方法。
背景：通常，胆固醇修饰的寡核苷酸不从SEC柱中洗脱。将甲基-β-环糊精添加到SEC缓冲液中掩盖了寡核苷酸的胆固醇，并且因此允许化合物作为峰从SEC色谱柱中洗脱。
测试样品：siRNA双链体CD-10452K1：
Figure BDA0002802649820000141
SEC-HPLC柱：GE Healthcare Superdex 75Increase 10/300GL。SEC-LC在室温下进行以实现非变性条件，因此siRNA双链体在色谱分析期间保持完整。洗脱液由含1mM甲基-β-环糊精的15％ACN中的1x PBS或不含甲基-β-环糊精的15％ACN中的1x PBS组成，并且应用0.9毫升/分钟的流动速率。图1中的结果表明，只有在存在1mM甲基-β-环糊精的情况下才能观察到双链体峰(黑色迹线)，而在不存在1mM甲基-β-环糊精的情况下观察不到双链体峰(蓝色迹线)，因为此时没有峰洗脱，并且材料牢固地结合于SEC柱表面。
实施例2：在AEX-HPLC中作为添加剂的甲基-β-环糊精
目标：开发一种用于分析胆固醇缀合的寡核苷酸的AEX-HPLC方法。
背景：将甲基-β-环糊精添加到不同的HPLC缓冲液中掩盖了寡核苷酸的胆固醇，并且因此改变与柱材料相互作用的特性。
测试样品：X32755K1单链寡核苷酸：
Figure BDA0002802649820000142
Figure BDA0002802649820000151
表1：梯度
Figure BDA0002802649820000152
表2：Y32755K1的AEX-HPLC分析结果
Figure BDA0002802649820000153
当在AEX-HPLC缓冲液中含5mMβ-环糊精时，观察到以下现象(图2)。基线处的峰宽从0.92分钟减小到0.52分钟。峰宽的减小使得刚好在主峰之前和之后洗脱的峰的分辨率显著增加。在5mMβ-环糊精存在下，峰是对称的，而在无此添加剂存在下，峰是不对称的。图2的结果显示以下内容：
A)3号峰仅在5mMβ-环糊精存在下进行分析时才会检测到，并且在无β-环糊精存在下与主峰共洗脱。
B)与无分辨率相比，根据USP解析2号峰的分辨率为2.46，因为所述峰只会使得主峰上的肩很小，但没有分离。
C)在5mMβ-环糊精存在下，分离5号峰的分辨率为3.68，并且在无β-环糊精存在下分辨率仅为1.48。
实施例3：在CGE中作为添加剂的甲基-β-环糊精
目标：开发一种用于分析胆固醇缀合的寡核苷酸的毛细管凝胶电泳方法(CGE)。所有工作都是在Beckman Coulter的PA800plus CE仪器上进行的。背景：CGE不适用于胆固醇修饰的寡核苷酸，因为化合物被CGE凝胶牢固地保留，并且没有峰从毛细管中洗脱。向分离凝胶和CGE系统的分离缓冲液中添加10mM或更多的甲基-β-环糊精使胆固醇修饰的链松动，并观察到尖峰。
测试样品：单链X32755K1(AHA1-双链体XD-10452K1中的有义链)：
缩写 轴ID 序列
FLP X32755K1 5'-(胆固醇4)GGAUGAAGUGGAGAUUAGUdTdT-3'
表3：毛细管凝胶电泳(CGE)的条件
Figure BDA0002802649820000161
图3和4显示X32755K1仅在10mM或20mM甲基-β-环糊精存在下才能进行分析(图3中蓝色迹线和图4中蓝色和粉色迹线)，而在无甲基-β-环糊精存在下，无法检测到峰。
实施例4：用于IEX HPCL纯化的甲基-β-环糊精
序列：由交替的RNA核苷酸和2'-O-甲基核苷酸组成的20聚体在3'-端通过DNA核苷酸和胆固醇配体延伸。序列在载有胆固醇的可控孔度玻璃(CPG)固体载体上组装。孔径为500A，并且胆固醇负载为85μmol/g。固体载体获自Prime Synthesis(Aston，PA 19014，美国)。固定化胆固醇的结构显示于图5中。
使用完善的基于亚磷酰胺的低聚化学法制备寡核苷酸序列。RNA亚磷酰胺、2'-O-甲基亚磷酰胺以及辅助试剂购自SAFC Proligo(汉堡，德国)。确切地说，使用以下酰胺化物：(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2'-O-叔-丁基二甲基硅烷基-腺苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5'-O-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰基)-2'-O-叔-丁基二甲基硅烷基-胞苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5'-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2'-O-叔-丁基二甲基硅烷基-鸟苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5'-O-二甲氧基三苯甲基-2'-O-叔-丁基二甲基硅烷基-尿苷-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2'-O-甲基亚磷酰胺携带与常规RNA酰胺化物相同的保护基。将所有酰胺化物溶解在无水乙腈(100mM)中，并且加入分子筛
Figure BDA0002802649820000171
使用5-乙基硫代四唑(ETT，乙腈中500mM)作为活化剂溶液。对于RNA残基，偶联时间为8分钟，对于2'-O-甲基残基，偶联时间为6分钟。
根据公开的程序(Wincott,F.等人，《RNA和核酶的合成、脱除保护、分析和纯化(Synthesis,deprotection,analysis and purification of RNA and ribozymes)》(《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》23，2677-2684，1995)，结合载体的胆固醇缀合的寡核苷酸从固相上裂解并脱除保护。典型的原材料含有在70-80％的范围内的所需的全长产物(FLP)。
为了研究粗胆固醇缀合的寡核苷酸的不同HPLC纯化条件，使用直径为5mm并且床高为50mm的小型柱。这些1mL柱中装有通常用于纯化寡核苷酸的阴离子交换树脂。具体来说，对两种不同的AEX珠子进行测试。选择可从GE Healthcare获得的Source 15Q(15μm珠子)和可从Tosoh获得的TSKgel SuperQ-5PW(20μm珠子)。在AKTA Purifier 100(GEHealthcare)上进行纯化。
使用以下缓冲液进行洗脱：缓冲液A由pH为8的20mM Tris制成。缓冲液B具有与缓冲液A相同的组成，但另外含有500mM高氯酸钠(NaClO4)或1.4M的溴化钠(NaBr)。此外，由于胆固醇配体的疏水性(每一失效序列由3'-胆固醇构成，由于化学合成从3'-端开始)，缓冲液也含有20-30％乙腈(ACN)。
为了在升高的温度下纯化，使用柱烘箱(CO30，来自Torrey Pines Scientific，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)和流动相预热器(TL-600，购自Timberlein Instruments，博尔德，科罗拉多州，美国)。将两个设备设置为相同的温度(例如60℃)。
已证实将MbCD添加到洗脱缓冲液以可预测方式改变洗脱谱并且使得能够在环境温度下当(截短的)胆固醇缀合的寡核苷酸在不同峰中洗脱时进行纯化(参见图6和7)当未添加MbCD时，需要60℃的温度才能获得胆固醇缀合的寡核苷酸的明显峰(参见图8)。
综上所述，将MbCD添加到洗脱缓冲液允许在环境温度下IEX HPLC纯化胆固醇缀合的寡核苷酸(参见图9至12)。另外，可以显著减少流动相中ACN修饰剂的量。
这些特征使得资本投资到流动相预热器和柱烘箱或有夹套的柱上。此外，有机溶剂/废料可以减少至少一半。
序列表
<110> AXO实验室股份有限公司
<120> 用于检测寡核苷酸缀合物的方法
<130> A71620PC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FLPs
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<400> 1
ggaugaagug gagauuagut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FLPas
<400> 2
acuaaucucc acuucaucct t 21

Claims (15)

1.一种用于检测溶液中至少一种所关注的寡核苷酸缀合物的方法，其中所述所关注的寡核苷酸缀合物由核酸实体和非极性实体组成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体，并且其中所述方法包含以下步骤：
a)提供包含所述所关注的寡核苷酸缀合物的液体样品；
b)在包括溶液中至少一种环糊精存在的条件下，通过分析方法从所述液体样品中分离出所述所关注的寡核苷酸缀合物；
c)借助于定性或定量分析检测所述所关注的寡核苷酸缀合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述分析方法选自由以下组成的群组：阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)、尺寸排阻液相色谱法(SEC-LC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、离子对反相高效液相色谱法(IP-RP-HPLC)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述寡核苷酸缀合物的所述核酸实体由DNA或RNA核苷酸或其任意组合构成，优选地，其中所述核酸实体是化学合成的寡核苷酸，更优选地，包含经修饰的DNA核苷酸和/或经修饰的RNA核苷酸或由经修饰的DNA核苷酸和/或经修饰的RNA核苷酸组成的化学合成的寡核苷酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸实体具有6至150个核苷酸、优选10至80个核苷酸、更优选12至50个核苷酸的长度。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤c)还包括检测所述所关注的寡核苷酸缀合物的杂质，优选地，其中所述杂质由至少一种非全长核酸实体构成或组成，更优选地，呈一种或多种非全长合成产物的形式，甚至更优选地，具有与全长合成产物不同的长度或结构，或其任何组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述非极性实体是亲脂性或疏水性实体，优选地，其中所述非极性实体选自由以下组成的群组：胆固醇，生育酚和氟喹诺酮，更优选地，其中所述非极性实体是胆固醇。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中
i)阴离子交换高效液相色谱法(AEX-HPLC)在10℃至90℃的温度下、优选在30℃至75℃的温度下、优选在环境温度下进行；
ii)尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)在10℃至50℃的温度下、优选在20℃至40℃的温度下进行；
iii)反相高效液相色谱法(RP-HPLC)在10℃至100℃的温度下、优选在40℃至70℃的温度下进行；
iv)离子对反相高效液相色谱法(IP-RP-HPLC)在10℃至100℃的温度下、优选在30℃至85℃的温度下进行；
v)毛细管凝胶电泳(CGE)在10℃至60℃的温度下、优选在30℃至50℃的温度下进行。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种环糊精选自由以下组成的群组：环糊精的α、β、γ或δ变体，优选地，其中所述至少一种环糊精呈甲基-β环糊精形式。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中溶液中的所述至少一种环糊精以0.01mM至50mM的最终浓度存在，优选以0.5mM至25mM的最终浓度存在，更优选以10mM至25mM的最终浓度存在，最优选以20mM的最终浓度存在。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在进行步骤b)之前将所述至少一种环糊精添加到所述液体样品中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤c)中的所述检测借助于UV读数，借助于荧光读数或借助于质谱(MS)或任何类似方法来进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法用于分析或制备目的，优选地，
i)其中，如果所述方法用于分析目的，那么在步骤c)中优选通过测定杂质的程度来确定所述合成产物的质量；或
ii)其中，如果所述方法用于制备目的，那么在步骤c)中优化所述全长合成产物的产率，其中收集了含有所述所关注的寡核苷酸缀合物的液体级分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，如果所述方法用于分析目的，那么所述合成产物的质量由所述全长合成产物的量和/或比率与所述非全长合成产物的量和/或比率限定，优选地，其中所述非全长合成产物是中间和/或不规律合成产物或其任何组合，更优选地，其中所述中间合成产物在任一端或两端缺少一个或多个核苷酸，最优选地，其中所述中间合成产物具有以下形式：n-1、n-2、n-3、n-4、n-5、n-6、n-7、n-8、n-9、n-10等。
14.一种评估化学合成的寡核苷酸质量的方法，其中所述方法包含以下步骤：
a)提供含有或怀疑含有至少一种所关注的寡核苷酸缀合物的液体样品，其中所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物由核酸实体和非极性实体组成，其中所述核酸实体化学连接至所述非极性实体，并且其中所述核酸实体是化学寡核苷酸合成产物；
b)在包括溶液中至少一种环糊精存在的条件下，通过分析方法从所述液体样品中分离出所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物；
c)借助于定性或定量分析检测所述至少一种所关注的寡核苷酸缀合物；
d)收集液体级分；
e)分析含有或怀疑含有所述所关注的寡核苷酸缀合物的所述收集的级分，其特征在于所述所关注的寡核苷酸缀合物的所述核酸实体由所述至少一种全长合成产物组成。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法的特征还在于如权利要求2至13中任一项所定义的实施例中的任一个。
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