JPH01104094A

JPH01104094A - 核酸誘導体の製法及び製剤法

Info

Publication number: JPH01104094A
Application number: JP14623488A
Authority: JP
Inventors: Junichi Yano; 純一矢野; Tadaaki Oki; 忠明大木
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1988-06-14
Publication date: 1989-04-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、医薬品として有用な核酸誘導体の新規な製造
方法に関する。

（従来の技術）核酸はプリン環又はピリミジン環にリボース等の糖が結
合しこれらがリン酸を介在して鎖伏に連なって構成され
ている。

核酸のうちＲＮＡ　（リボヌクレオチドポリマー）は糖
としてリボースを有し、糖部がリン酸のジエステル結合
で結ばれた鎖状の高分子化合物である。二重鎖は、核酸
を構成する塩基（例えば、イノシン、アデノシン、シチ
ジン、ウリジン等）のプリン環又はピリミジン環部分が
いわゆる相補的に水素結合によって結びつき、立体構造
としてらせん状に構成されている。二重鎖を有する核酸
は有用な生理活性を期待できることからこれまで多くの
研究がなされてきた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍ
ｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　　５８．　　（１９７４）等〕
。

本明細書においては、これらのうち、合成二重鎖ＲＮＡ
としてのポリイノシン酸・ポリシチジル＠誘導体を「ポ
リ■・ポリＣ」誘導体といい、これらの構成単位である
ポリイノシン酸を「ボ１月」、ポリシチジル酸を「ポリ
Ｃ」という。

近年、種々の天然又は合成された二重鎖ＲＮＡがインタ
ーフェロン産生能をもつことが知られてきた〔フィール
ドら。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　　Ｕ、　Ｓ、　３１００４　　（１９６７）
。　フィールドら。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、
　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、　Ｓ、　５８２１０２（１９６７
）　、フィールドら。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ
。

Ｓｃｉ、　　Ｕ、　Ｓ、　６１　３４０　　（１９６８
）。　タイチルら。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　υ、　　Ｓ、　　５８１７１９　　（１９６７）。　
　フィールドら。Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　
　５６９０５　　（１９７０）　、デクラークら。Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　７Ｂ、　　
２９１　（１９８１）　）。

これらを整理して表に示せば、以下のようになる。

Ｎ）ホモポリマー・ホモポリマー複合体（ポリＩ・ポリ
Ｃを母体とする二重鎖核酸ポリマー）＋１１塩基修飾ポリイノシン酸・ポリ　（５−ブロモシチジル＠）。

ポリイノシン酸・ポリ　（２−チオシチジル酸）。

ポリ　（７−ゾアザイレシン酸）・ポリシチジル酸。

ポリ　（７−ジアザイノシン酸）・ポリ　（５−ブロモ
シチジル酸）。

（２）糖修飾ポリ（２′−アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸。

（３）リン酸修飾ポリイノシン酸・ポリ　（シチジル−５′−チオリン酸
）。

（ＩＩ）交互変換コポリマーポリ　（アデニル酸−ウリジル酸）。

（ＤＩ）ホモポリマー・コポリマー複合体ポリイノシン
酸・ポリ　（シチジル酸、ウリジン酸）。

ポリイノシン酸・ポリ　（シチジル酸、４−チオウリジ
ン酸）。

（ｒｌ／）合成核酸とポリカチオンとの複合体ポリイノ
シン酸・ポリシチジル酸・ポリーＬ−リジン（「ポリＩ
ＣＬＣＪという）。

（Ｖ）その他ポリイノシン酸・ポリ　（１−ビニルシトシン）。

上記したように、近年数多くの二重鎖ＲＮＡ、特にボリ
トポリＣを母体とする誘導体の報告が行われている。そ
して、これらを含む一連の核酸誘導体とその構造活性相
関については総説がある。〔デクラークら。Ｔｅｘａｓ
　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｏｎＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ　　４１７？　（１９８２）　）。

本発明者らは、上記の従来技術に基づき、ポリＩ・ポリ
Ｃ及びこれを母体とする各種誘導体が、その全体の分子
サイズ分布を沈降定数値にして４Ｓ〜１３Ｓ（塩基数で
は５０〜１０．０００程度）に整えることにより、以下
に述べる生理活性を維持しつつその毒性を極めて低減化
する事実を見いだし、特許出願した（特願昭６２−１６
７４３３号。

及びこれに基づく国内優先権主張出願）。

本発明者らは上記研究と並行して、上記目的物を効率よ
く取得するため、分子サイズ分布を塩基数で５０〜１０
．０００程度に統一する操作（本明細書においては、分
子サイズ分布を一定の範囲内に整える操作を「サイズ化
」と呼ぶこととする。サイズ化はまた、本発明において
は低分子化現象を伴うから「短鎖化」をも意味する）と
、二種類の一重鎖核酸ポリマーを用いて二重鎖核酸ポリ
マーとする操作（本明細書において［アニーリング」と
いう）とを、種々検討した。

核酸の分子サイズを表現する単位として繁用されている
ベース・ペア（以下ｒｂｐＪという）は、核酸の塩基数
によってその分子サイズを表わすものである（１０ｂｐ
は１０個の塩基を持つ二重鎖ポリマーを意味する）。本
明細書においては二重鎖ポリマー以外の核酸ポリマーを
も扱うことから、ｂｐＯ代わりに「塩基数」の言葉を使
用する（例えば「１０塩基数」とは、１０１［１ｉ１の
塩基を持つ核酸ポリマーを意味することとする）。

核酸の分子サイズを特定しようとする場合、通常の沈降
定数値（Ｓ値）が広く用いられているが、本発明者らは
既知の分子サイズを有する二重鎖ＤＮＡ　（Ｍ１３ファ
ージ断片）を対照として、後述するゲル濾過カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は電気
泳動法を使い、その対照と比較換算することによって、
上記した塩基数を求めることができたものである。

従来、核酸高分子の分子量を表示するに際して、Ｓ値が
広く用いられてきた。現在市販されている核酸高分子も
Ｓ値で表示されている。しかしながら、近年の実験技術
の進歩によりゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー法、イオン交換クロマトグラフィー法等を用いて、
より正確に分子量を定める手法が確立され、その鎖長の
測定をすることができるようになった。

そこでＳ値表示と鎖長表示との関係が問題となるが、Ｓ
値表示では各核酸分子が固有の値をとるため、Ｓ値表示
と鎖長表示とが、核酸の分子量を表現する方法として正
確に対応するか否かという意味からは問題点がないわけ
ではなかった。

本発明者らは、本明細書において、分子量を表示するに
あたって、これまでの核酸化学ψ慣例に従ってＳ値表示
をも記載してきた。ただし、Ｓ値は、核酸高分子を全体
の分子のかたまり（又は分子形態）として測定する方法
であるから、今後は分子量分布の境界をより明確に表現
する必要があることから、鎖長（本明細書においては「
塩基数」）測定に基づく表示をも併せて記載することと
した。

これまでは１．ポリ■・ポリＣ及びこれを母体とする各
種誘導体をサイズ化するという観点から、サイズ化され
た二重鎖核酸ポリマーを製造するにあたっては、すでに
存在する二重鎖核酸ポリマーを低分子化するか、又は、
−重鎮核酸ポリマーをアニーリングする前に低分子化す
る方法をとっていた。しかしながら、従来の方法では、
サイズ化に時間がかかり、迅速な処理ができず、工業的
規模での目的物取得に弊害があった。また、収率の上か
らも、必ずしも満足できるものではなかった。

一方、サイズ化後に一重鎖核酸ポリマーを硫化する必要
があるときには、これまで硫化水素によって硫化した後
に、溶媒から硫化水素を揮散させていた。すなわち硫化
後の反応液からピリジンを真空ポンプ等で留去して硫化
水素を併せて除去していたが、この方法では硫化水素が
揮散するため、工業的規模でこの反応を実施するには公
害対策上問題があった。また、ピリジンを留去した後の
水層を透析チューブに入れて流水透析して目的物を取得
していたが、この方法では全体の操作に最低でも３日を
要し、しかも収率は高々８０％程度であり、゛収率、費
用や所要時間の多くの面で技術的困難性があった。

サイズ化の技術そのものにも問題がなかったわけではな
い。

当該技術分野では、従来から核酸ポリマーの低分子化に
はホルムアミドと共存させて加熱する方法をとっており
、その反応時間や反応温度等の調節により適切な鎖長の
目的物を得、その後反応溶液を透析等することにより低
分子化しすぎた不要物を取り除いていた。しかしながら
、この従来法では、原料である核酸ポリマーの性質によ
り同じ反応条件でも異なる分子量分布を有するサイズ化
現象が起こることがあり、再現性の点で問題があった。

これは酵素反応で調製するため原料の大きさが一定に定
まらないことが多いことが原因であると考えられた。ま
た、ここに適用する透析では原理的に目的物より大きい
鎖長の核酸ポリマーを除去することができず、根本的な
解決策が待望されていた。

（発明が解決しようとする課題）本発明者らは、種々検討を続け、■迅速な操作で目的物
であるサイズ化された二重鎖核酸ポリマーを取得できる
こと、■その収率がよいこと、■工業的規模で行っても
、公害問題等の弊害が起こらないこと、■一連の操作が
定量的に、再現性よく実行できること、等を目的として
研究を重ねた結果、ようやく本発明に到達したものであ
る。

（課題を解決するための手段）本発明の要旨は、以下の諸点にある。

＋１１７二−リングの前にそれぞれの一重鎖核酸ポリマ
ーをサイズ化しておくこと。

（２）上記（１）のサイズ化にあたって、゛これまでの
電気泳動法に代わってＨＰＬＣ（ゲル濾過高速液体クロ
マトグラフィー）を使用することにより分子サイズ分布
の数値化を行い、これによって分子サイズ分布変化を容
易に知りえることを利用して、４３〜１３Ｓ（塩基数で
は５０〜１０．’０００程度）という分子サイズ分布範
囲内の目的物を迅速に取得する方法を確立したこと。

（３）サイズ化後の処理において、これまで透析により
目的物を取得していたものを、低級アルコール等を添加
して処理するという、極めて単純な操作によって収率を
上げる方法を確立したこと。

（４）サイズ化後に一重鎖核酸ポリマーを硫化する必要
があるときには、これまで硫化水素によって硫化した後
に、溶媒から硫化水素を直接揮散させていたものを、了
り−ル（Ａｒｙｌ）アルコールを添加し遠心分離処理す
るという、極めて単純な操作によって収率を上げる方法
を確立したこと。

（５）−ｉＪ−イズイ、ヒ後の一重鎖核酸ポリマーの分
子量分布を整え、更にその分布を集合させる（本明細書
においては、この操作を「サイズ限定」という）ための
方法としてイオン交換樹脂を通用したこと。

以下に上記のそれぞれを詳しく説明する。

アニーリングは、相補的な一重鎖核酸ポリマー同士を二
重鎖にする過程であって、本来容易に行いうる操作であ
った。アニーリング後にサイズ化すると、硫化度の変動
等の誤差が生じて定量的な取得が困難であった。そこで
、サイズ化をアニーリングの前にすることを思いたち実
行したところ、極めて良好なる結果を得たものである。

上記（１）はまた、（２）と密接に関係している。電気
泳動法によりその分子量を知るこれまでの手法では、最
低−夜（泳動及び染色等）を要し、迅速な処理を困難に
していた。本発明者らはこれにＨＰＬＣゲル濾過法を適
用することにより、目的とする分子サイズ分布のもの（
即ち、４Ｓ〜１３Ｓで塩基数では５０〜ｉｏ、ｏｏｏ程
度の範囲内のもの）が生じる反応時間を極めて迅速に知
ることができるようになった。

本発明においては、サイズ化反応終了を知った後に反応
を停止させ、その後、低級アルコールを添加して処理す
る。低級アルコールのうちでは、特にエタノールを使用
するのが良い。

エタノール沈澱法を使用した場合には、例えば、ポリＣ
からＬ−ポリＣ（サイズ化されたポリＣ０以下「Ｌ−」
の意味は同様）を得る反応においては９３％、ポリ■か
らＬ−ポリｌを得る反応においては７８％の高収率で目
的物を得ることができる。

これまでは、反応液を透析チューブに入れて透析処理を
していたが、この場合の回収率は６０％程度、ポリＩか
らＬ−ポリ■を得る反応液においては４０％程度しか期
待できず、また操作に３日程度を要していた。エタノー
ル沈澱法（反応液にその２倍量のエタノールを添加し攪
拌して目的物を析出させ、その後遠心分離して沈澱物を
集めて洗浄、乾燥する手法）では、１時間以内に処理す
ることができるようになった。

上記（３）は従って、本発明の根幹をなす重要点である
。

サイズ化後に一重鎖核酸ポリマー中の核酸中の窒素原子
を硫黄原子に置き換えて（例えば、ポリＣ中のシチジン
残基のアミノ基をメルカプト基に一定の割合で王き換え
て）他の核酸に変化させる反応（本明細書において「硫
化」という）は、コポリマーを合成するときによく使用
される方法である。本発明の要旨はまた、この硫化コポ
リマーの合成において、アリールアルコールを添加処理
して目的を達するところにもある（上記（４））。

了り−ルアルコールとしては、例えば、フェノールを使
用することができる。

フェノールを使用する場合、例えばピリジンと水と硫化
水素ガスが混在する反応液に、半分量のフェノールを添
加し、攪拌及び遠心分離をすると、水層とフェノール層
が明白に分離し、反応液の着色や副生放物硫黄等もフェ
ノール層に移行する。その後、水層を分離し、食塩水、
アルコール処理により目的物を析出させて遠心分離、ア
ルコール洗浄をすることにより、純粋な目的物を取得す
ることができる。

この手法によれば、硫化水素はほとんど溶液として沈澱
の上清液中に含まれるので、容易に除去することができ
る。

０　例えば、フェノールを使用する本発明の方法によれ
ば、操作は１時間以内で完了し、収率は殆ど１００％で
あってしかも定量的に目的物を取得することができる。

上記した本発明に係る本発明独自の方法（２）〜（４）
は、アニーリングの前にサイズ化するために重要なもの
であり、かつアニーリング前のサイズ化という手法を充
分に応用するために縦横に駆使しうる手段である。

以下に、本発明のもう一つの特徴である、サイズ化とア
ニーリングとの間におけるサイズ限定の方法を説明する
（上記（５））。

この方法においては、イオン交換樹脂を利用する。核酸
系高分子にイオン交換樹脂を通用した例としては、ｔ−
ＲＮ八にＤＥＡＲ−セルロース、ＤＥ＾Ｅ−セファデッ
クス、ベンゾイル化ＤＥＡＥ−セルロース等を施用した
例があるＣＢＯＡ、　　ｆｌ、　１９３（１９６１）　
、ＢＢＲＣ，■、　２００　　（１９６３）　、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。

Ｊ、　３０４３　（１９６７）　）。この例では、たか
だか塩基数にして８０程度の低分子核酸の精製−にイオ
ン交換樹脂を施用したに過ぎない。

本発明者らはイオン交換樹脂が有する荷電吸着の本来の
性質を、高分子核酸ポリマーの塩基数を指標とした精製
の際に応用することができないか種々検討した結果、本
発明を確立したものである。本発明は、その目的物質が
医薬品として極めて有用であるがゆえに、このイオン交
換樹脂を応用したサイズ限定（本明細書においては「イ
オン交換法ｊともいう）が優れた進歩性を有するもので
あると確信している。

本発明におけるイオン交換法においては、イオン交換樹
脂は核酸ポリマーと同じ容器内に共存させるだけで目的
を達することができるが（バッチ法）、通常はカラムク
ロマトグラフィーを用いて分画を行う（カラム法）。イ
オン交換樹脂をカラム等に詰め、核酸ポリマーを熔解し
た液を流入させてイオン交換樹脂にいったん吸着させ、
その後に食塩トリスバッファ等の溶出液を、リニアに又
はステップワイズにその食塩濃度を変化させなからカラ
ムを通過させて一定量の流出液を得、各フラクションに
含まれる核酸ポリマーの塩基数をこれまでと同様にＨＰ
ＬＣゲル濾過法でマーカーを指標として知ることにより
、目的物の溶出したフラクションを得ることができる。

　　゛上記イオン交換法によって目的を達するためには、カラ
ムに充填すべきイオン交換樹脂の種類や溶出液の種類が
極めて大きな要素となる。

例えば、ポリＩをトリス塩酸バッファに熔解し、ポリＩ
のサイズ限定に用いたＱＡＥ　（第四級アミノエチル）
担体に吸着させてイオン交換法を行おうとしたところ、
溶出液の食塩濃度を極めて濃くしても目的物を得ること
ができなかった。これは、ＱＡＥ担体におけるポリ■の
適正溶出液食塩濃度状態以上においては、ポリＩ自身が
不溶化したためである。ポリＩの構成単位であるイノシ
ン酸は構造的に、より疎水的性質を持つことから説明す
ることができる。ここに、適正溶出液食塩濃度はポリＣ
と比較して想定した。

本発明者らの行った別の実験では、ＱＡＥ担体　３にお
けるポリＩの適正溶出液食塩濃度のバッファ中で、溶解
していたポリＩが白濁し沈澱を生じる現象を観察するこ
とができた。従って・本発明におけるイオン交換法にお
いては、イオン交換樹脂の種類の選択及び溶出塩濃度の
選択が極めて重要な要件となる。

即ち、ポリＩの場合、ＤＥＡＥ担体を用いたところ非常
に良い結果を与えた。ポリＣの場合にはＱＡＥ担体でも
ＤＥＡＥ担体でもいずれも好結果を与えることが判った
。溶出は、食塩の直線的濃度勾配、又は段階的濃度勾配
を用いることにより、ポリマーを鎖長の順に分画溶出す
ることができた。

例えば、ポリＣ（３８ｍｇ、　３２０８．６）を用い、
ＤｆＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０　Ｃ（φ１０
　Ｘ　１３０ｍｍ）に吸着し、線流速１．３２　ａｍ／
ｍｉｎ　、　１７５ｄｒｏｐｓ／フラクシヨン溶出とし
て、Ａ＝　ＯＭ　　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ
　　（ｐＨ７，０）Ｂ　＝０．５Ｍ　　ＮａＣ１／１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）おのおの１
００ｍ１を用い、８％０−１００で直線的濃度勾配を行
ったところ、以下のように鎖長の順に明白に溶出してき
た。

フラクション　　−し」よまた、同じサンプルを段階的濃度勾配で行うと、０．３
　Ｍ　　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（
ｐ）１７．０　）（５０ｍｌ）では５００ｂ、ｐ、以下
、次に０．５　Ｍ　　ＮａＣｌ／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）　　＜５０ｍ１）では５００
〜１５００ｂ、ｐ、のものを分画することができた。

同様に、ポリＩ　　（７，８ｍｇ、３２０　７．３　）
を同条件で直線的濃度勾配を行ったところ、以下のよう
に順次溶出してきた。

一２ｊ」と２」工区　　−ｍまた、同じサンプルを段階的濃度勾配で行うと、０．３
　Ｍ　　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（
ｐ）１７．０　）（５０ｍｌ）では３００ｂ、ｐ、以下
、次に０．５　Ｍ　　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）　　（５０ｍｌ）では３００
〜６００　ｂ、ｐ、のちのを分画することができた。

このように、高分子の核酸でさえ、任意の食塩濃度を選
択することにより、鎖長が限定された核酸を分画するこ
とができた。

上記の２例で示したように、種々の鎖長からなる核酸高
分子混合物の中から医薬品としての薬効に通した性質を
もつ鎖長分布のもの（主成分）を、任意に、かつ大量の
スケールで分画することができる点に、本発明のイオン
交換法の最大の要旨がある。

ところで、注射剤として医薬品を製造する場合には、剤
中に混んしては困るパイロジエン（発熱物質、これはポ
リサッカライドで構成されていることが知られている）
を除去するという操作が不可欠であることは、よく知ら
れている。

本発明に係る核酸誘導体においても、これを注射剤とし
てヒトに投与する場合には、必然的についてまわる必須
解決問題点である。

本発明者らは、上記したイオン交換法を通用することに
より、幸運ではあったが、このパイロジエン除去の方法
番見いだすことができたのである。

本発明者らは偶然見いだした上記現象を更に詳しく検証
する目的で実験を継続したところ、−重鎮核酸誘導体に
おいてはその鎖長にかかわらずイオン交換法によってパ
イロジエンを除去することができる現象を見いだし、本
発明を完成するに至った。

従って、このことも本発明の重要な要旨の一つである。

以下に、−重鎮ＲＮＡ　（市販ポリＣ１及びこれを短鎖
化したもの）の、リムルステストによるエンドトキシン
の定量試験の結果を示す。

表中、ＥＵは（エンドトキシンユニット：　ＵＳＰｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｅｎｄｏｔｏｘｉ
ｎ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　０１１３）によるウサギ発熱性
試験の単位を示す。■は注射用蒸溜水（ブランク）を、
■はポリＣ（市販品−１）を、■はポリＣ（市販品−２
）を、■は後記実施例（５−４）物質を表わす。

イオン交換法によるパイロジエンの除去の効果が明瞭で
ある。

本発明核酸誘導体の生理活性は医薬品として極めて有用
なものである。後述するように、本発明核酸誘導体は強
力な抗癌作用を有する。この作用は、本発明核酸誘導体
の持ついくつかの生理活性作用のひとつに過ぎない。

ポリＩ・ポリＣを母体とする本発明核酸誘導体の生理活
性としてその他に、ＴＮＦ産生能、インターフェロン産
生能、インターロイキン２産生能、マクロファージ活性
化能、ＮＫ細胞への活性化作用、Ｉｔ瘍細胞増殖阻止作
用、ヒト腫瘍細胞担癌ヌードマウスにおける増殖阻止作
用、ｌｉ！瘍細胞の肺転移抑制作用等を挙げることがで
きる。

本発明核酸誘導体はこれまでのポリＩ・ポリＣ等のイン
ターフェロン・インデューサー等に比べて極めて安全性
が高い。従って、本発明化合物は抗ウィルス剤、抗腫瘍
剤等として有用である。

上記した本発明核酸誘導体の生理活“性については、前
述した特許出願（特願昭６２−１６７４３３号。

及びこれに基づく国内優先権主張出願）の明細′書に詳
しく述べられている。

（以下次頁）（実施例）以下に本発明の核酸誘導体の製造法に係る実施例を掲げ
て本発明を更に詳しく説明する。

実施例（１）Ｌ−ポリＩ　（サイズ化されたポリ■）の製造と
精製市販のポリｌ１０ｇに、蒸溜水２００ｍ１とホルムアミ
ド２５０ｍ　ｌ及び５Ｍの゛食塩水５００ｍ１とを加え
、８０℃で約４時間加温する。

ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ｇ−ＤＮＡ−ＰＷカラム　（７，８８
ｍｍＩＤ　Ｘ　　３００ｎ＋ｎ＋）を使用したＨＰＬＣ
（溶出液は５０ＩＩＩＭトリス塩酸バッファ（ｐＨ７，
５）、０．３Ｍ食塩、２ｍＭ　　ＥＤＴＡ。

流速０．５ｍｌ／分）で、ゲル濾過し、リテンションタ
イムが、２１．８６±０．２（分）に最大をもつものを
得たときに反応を終了させる。

反応液に２倍量のエタノールを加え、生じた沈澱物を遠
心分離（３０００ｒｐｍ　、　　４°Ｃ）で集め、７０
％エタノールで洗浄後、真空乾燥すると、Ｌ−ポリ１１
０．２ｇが得られた。

なお、水及び水溶液は、すべて滅菌状態のものを使用し
た。以下の実施例においても同様である。

（２）Ｌ−ポリＣ（サイズ化されたポリＣ）の製造と精
製ポリ０１０ｇに蒸溜水２００ｍ１　、ホルムアミド２５
０＋ａｌ、　５Ｍの食塩水５０ｍ１を加え、８０℃で約
４時間加温する。上記（１）と同様のＨＰＬＣゲル濾過
で反応の終点を確認する〔リテンションタイムが２１．
３３±０．２（分）のとき〕。

２倍量のエタノールを加え、沈澱物を遠心分離（３００
０ｒｐｍ　、　　４℃）して集め、７０％エタノールで
洗浄して真空乾燥すると、Ｌ−ポリＣが９．５ｇ得られ
た。

（３）Ｌ−ポリＣの硫化上記（２）で得られたし一ポリＣ８，Ｏｇを、水２４０
ｍ１に溶解し、５００ｍ１容量のスチールボンベに入れ
、水冷下に硫化水素のピリジン溶液（１２ｇ　／　１２
０ｍ１）を加え、封管した後、５０℃で約１０時間加温
する。冷却後、ＴＥ飽和フェノール（２００ｍｌ）を加
え、攪拌後、遠心分ｉ％！　（３０００ｒｐｒｒＩ、１
５℃、５分）し、水層にその１／１０量の５Ｍ食塩水及
び２倍量のエタノールを加えると沈澱物を生じた。遠心
分離（３０００ｒｐｍ　、　　４℃、１０分）し、７０
％エタノールで洗浄して、真空乾燥すると、Ｌ−ポリ　
（Ｃ２Ｇ、Ｓ’　Ｕ）　　（サイズ化されたポリＣ中の
、シチジル酸２０個に対して、４−チオウリジル酸１個
がシチジル酸と置き換えられたもの、の意）　　８．０
ｇが得られた。

なお、上記ＴＥとは、１０ｍＭ　）リス・塩酸バッフｙ
　　（ｐＨ７，５）にＥＤＴＡを１ｍＭとなるように加
えたものである。

（４）アニーリングの一例上記（３）で得られたし一ポリ　（Ｃ２０，Ｓ４　ｔＪ
）の６．ＯＯｇと上記（１）で得られたポリＩの６．４
４ｇとを、それぞれ１０ｍＭ　）リス塩酸バッファ（ｐ
Ｈ７，５）　　・５０ｍＭ食塩水３００ｍ　ｌに溶解し
、混合する。この溶液を水浴で７０℃まで加温し、１０
分間保つ。その後そのままの状態で終夜かけて放冷する
。フェノール処理、エタノール沈澱後、生じた沈澱物に
水（約２００ｍ　ｌ　）を加えて溶解し、４℃で水で透
析する。透析液を濃縮乾固するとアニーリング化合物１
２．４　ｇが得られた。

（５）イオン交換法によるサイズ販定以下のイオン交換は、段階的溶出（ｓｔｅｐｗｉｓｅｅ
ｌｕｔｉｏｎ）又は直線的勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　ｇ
ｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　）で行うことができ
る。溶出条件を的確に選べばいずれの場合も収率及び目
的とする鎖長はほとんど変わりなかった。し−ポリＣ及
びＬ−ポリ＜ｃ、　　Ｓ４　ｕ）の段階的溶出はともに
０．１５Ｍ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　
　（ｐＨ７，０）　、１０Ｍ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０，）を連続的に用いた
。

Ｌ−ポリＩの段階的溶出は、後記実施例（５，−１）を
参照。

Ｌ−ポリＩの直線的勾配溶出は、Ａ＝　　０ＭＮａＣ１／ｂＢ　＝　０．５Ｍ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｈ
ＣＩ　　（ｐＨ７，０）でＢ液のパーセントがＯから１
００になるグラジェント条件で溶出した。Ｌ−ポリＣ１
及びＬ−ポリ（Ｃ，３４Ｕ）の直線的勾配溶出は、実験
例（５−２）及び（５−４）を参照。

（５−１）Ｌ−ポリＩのサイズ限定上記（１）で得られたし一ポリ■の２１０ｍｇを１１０
１１Ｉのトリス・塩酸バッフｙ　ＣｐＨ７，０）の５ｍ
ｌに熔解し、ＤＨ，ＡＥ７Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　（登録
商標）　６５０Ｃ（φ１０ｍｍＸ１３０　ｍｍ）に吸着
させ、線流速１．３０　ｃｍ／ｍｉｎで、塩濃度が０．
０３　　Ｍ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　　
（ｐＨ７，０）　　（５０ｍｌ）、　　０．５　Ｍ　Ｎ
ａＣｌ　／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐ）１７
．０　）　　（８０ｍｌ）　、の溶出液により段階的溶
出で溶出した。０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出してきたフラ
クションを集め、上記（１）と同様のＩＩＰＬｃゲル濾
過法によりリテンションタイムを測定すると、２１．９
０±０．２（分）であった。

回収率９１％の高収率で目的とする塩基数にして１００
〜１０００のサイズ限定し一ポリエが得られた。

（５−２）Ｌ−ポリＣのサイズ限定上記（２）で得られたし一ポリＣの６１０ｍｇをトリス
・塩酸バッファ（ｐＨ７，０）の１０ｍ１に溶解し、Ｑ
ＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　（登録商標＞　５５０Ｃ（
φ１０ｍｍ　Ｘ　１３０ｍｍ）に吸着させ、線流速１．
３０　ａｎ／ｍｉｎで、塩濃度が、Ａ　＝　０．０　Ｍ
　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐＨ７
，０）　　、Ｂ　＝　　１．ＯＭ　ＮａＣ１／ｌＯ＋ｎ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ７，０）　、おのおの１０
０ｍ１の溶出液により、Ｂ液の％が０−１００となるよ
うに直線的勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ
　ｅｌｕｔｉｏｎ　）により溶出した。メインピークが
溶出してきたフラクションを集め、）ＩＰＬＣゲル濾過
法によりリテンションタイムを測定すると、２１．３５
±０．２（分）であった。回収率９３％の高収率で目的
とする塩基数にして１００〜１０００のサイズ限定し一
ポリＣが得られた。

（５−３）Ｌ−ポリ　（ＣＩ２．Ｕ）のサイズ限定ポリ
　（ＣＩ２．　　Ｕ）　　（シチジル酸１２個に対して
ウリジル酸１個がシチジル酸と置き換えられたもの、の
意）（上記（１）と同様の）ＩＰＬｃでリテンションタ
イムが１８．６７　（分）のもの）の１９ｍｇをトリス
・塩酸バッファ（ｐｌｌ　７．ｏ）の５ｍｌに溶解し、
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　（登録商標）　６５０
Ｃ（φ１０ｍｍＸ１３０　ｍｍ）に吸着させ、線流速１
．３０　ｃｍ／＋ｎｉｎで、塩濃度が、Ａ　＝　０．Ｏ
Ｍ　ＮａＣ１／　１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　　（ｐＨ
７，０）　　、　　Ｂ　＝　　０．５　Ｍ　ＮａＣ１／
１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）　、おの
おの１００ｍ１の溶出液により、Ｂ液の％が０−１００
となるように直線的勾配溶出（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　）により溶出した。メイン
ピークが溶出してきたフラクションを集め、ＨＰＬＣゲ
ル濾過法によりリテンションタイムを測定すると、１８
．９７±０．２（分）であった。回収率８７％の高収率
で目的とする塩基数にして１００〜１０００のサイズ限
定Ｌ−ポリ　（ＣＩ２　。

Ｕ）が得られた。

（５−４）Ｌ−ポリ　（Ｃ２０，５４Ｕ）のサイズ限定
上記（３）で得られたし一ポリ　（Ｃ２０１Ｓ’　Ｕ）
の６００ｍｇをトリス・塩酸バッフｙ　　（ｐＨ７，０
）の１０ｍ１に溶解し、ＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　
（登録商標）５５０Ｃ（φ１０ｍｎ＋Ｘ１３０　ｍｍ）
に吸着させ、線流速１．３０　ａｍ／ｍｉｎで、塩濃度
がＡ　＝　０．ＯＭ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）　、Ｂ　＝　１．ＯＭ　Ｎａ
Ｃ１／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）
　、おのおの１００ｍ１の溶出液により、Ｂ液の％が０
−１００となるようにリニア（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄ
ｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　）により溶出した。上記（
５−２）と同様に）ＩＰＬｃゲル濾過法によりリテンシ
ョンタイムを測定すると、２１．３５±０．２（分）で
あった。

回収率９０％の高収率で目的とする塩基数にして１００
〜１０００のサイズ限定し一ポリ　（Ｃ２０，５４Ｕ）
が得られた。

（６）アニーリング（６−１）Ｌ−ポリＩとＬ−ポリＣ上記（５−２）で得られたサイズ限定し一ポリＣの３．
０ｇと上記（５−１）で得られたサイズ限定し一ポリＩ
の３．２ｇとを、それぞれ１０ｍＭ　）リス塩酸バッフ
ｙ　（ｐ）Ｉ　７．５）　　・５０ｍＭ食塩水１５０ｍ
　ｌに溶解し、混合する。この溶液を水浴で７０℃まで
加温し、１０分間保つ。その後そのままの状態で終夜か
けて放冷する。フェノール処理、エタノール沈澱後、生
じた沈澱物に水（約４００ｍ１）を加えて溶解し、４°
Ｃで水で透析する。透析液を濃縮乾固するとアニーリン
グ化合物６．２ｇが得られた。

（６−２）Ｌ−ポリＩとＬ−ポリ　（Ｃ２０，３’　　
Ｕ）上記（５−４）で得られたサイズ限定し一ポリ　（
Ｃ２０，Ｓ４　Ｕ）の１．４６ｇと上記（５−１）で得
られたサイズ限定ポリｌの１．５７ｇとを、前記（６−
１）と同様に処理すると、アニーリング化合物３．０ｇ
が得られた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ＲＮＡを母体とする二重鎖核酸誘導体であって全
体の分子サイズ分布が沈降定数値にして４Ｓ〜１３Ｓの
範囲内にあるものを製造するにあたって、アニーリング
の前にそれぞれの核酸ポリマーをサイズ化することを特
徴とする核酸誘導体の製法。
（２）ＲＮＡを母体とする二重鎖核酸誘導体であって全
体の分子サイズ分布における最大分布の分子が塩基数に
して５０〜１０，０００の範囲内にあるものを製造する
にあたって、アニーリングの前にそれぞれの核酸ポリマ
ーをサイズ化することを特徴とする核酸誘導体の製法。
（３）特許請求の範囲第１項又は第２項の製法において
、サイズ化した後アニーリングする前に一重鎖核酸ポリ
マーを構成する核酸を硫化するにあたって、アリールア
ルコールを添加して処理することを特徴とする一重鎖核
酸コポリマーの製法。
（４）サイズ化した後アニーリングする前の一重鎖核酸
ポリマーをイオン交換樹脂により処理してその分子サイ
ズ分布を一定範囲内に集合させてサイズ限定することを
特徴とする、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。
（５）核酸誘導体を主成分とする注射剤を製造するにあ
たって、イオン交換樹脂を用いて処理することを特徴と
する、パイロジェンの除去方法。