NL8801664A

NL8801664A - METHOD FOR PREPARING NUCLEIC ACID DERIVATIVES AND METHOD FOR PREPARING A MEDICINAL PREPARATION CONTAINING SUCH DERIVATIVES

Info

Publication number: NL8801664A
Application number: NL8801664A
Authority: NL
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1989-02-01
Also published as: IT1224504B; GB2207138B; ATA169988A; DE3822406A1; FI883163A; AU1864488A; CH676123A5; GB2207138A; FR2617403B1; HU202250B; ZA884698B; AT397658B; GB8815262D0; CN1024556C; FR2617403A1; NO882922D0; PT87903A; SE8802480D0; FI883163A0; DK369088A

Description

φ NL 35.184-dJ/ab £φ NL 35,184-dJ / ab £

Werkwijze voor de bereiding van nucleinezuurderivaten alsmede werkwijze voor de bereiding van een geneeskundig preparaat dat dergelijke derivaten bevatMethod for the preparation of nucleic acid derivatives as well as a method for the preparation of a medical preparation containing such derivatives

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van nucleinezuurderivaten alsmede op een werkwijze voor de bereiding van een geneeskundig preparaat dat deze derivaten bevat.The present invention relates to a method for the preparation of nucleic acid derivatives as well as a method for the preparation of a medical preparation containing these derivatives.

5 Nucleinezuren zijn samengesteld uit purineringen of pyrimidineringen en aan de ringen gebonden ribose of soortgelijke suikers, waarbij deze samenstellende bestanddelen met elkaar zijn verbonden via een fosfaatbrug onder vorming van een ketenstructuur.Nucleic acids are composed of purine rings or pyrimidine rings and ring-bound ribose or similar sugars, these constituents being joined together via a phosphate bridge to form a chain structure.

10 Onder de nucleinezuren is RNA (ribonucleotide-poly- meer) een macromoleculaire verbinding met een ketenstructuur die ribose als een suiker bevat, waarin de suikereenheden met elkaar zijn verbonden via een fosfaatbrug door middel van de diesterbinding. In de dubbelstrengs nucleinezuren zijn de 15 purinering- of pyrimidineringeenheden van het nucleinezuur, welke de basen vormen (bijvoorbeeld inosine, adenosine, cytidine, uridine enz.) gebonden door middel van een zogenaamde complementaire waterstofbinding onder oplevering van een dubbele helix ruimtestructuur. Daar nucleinezuren met 20 een dubbelstrengs structuur geacht worden bruikbare fysiologische functies te hebben, zijn tot op heden talrijke studies uitgevoerd met betrekking tot de nucleinezuren (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, enz.).Among the nucleic acids, RNA (ribonucleotide polymer) is a chain structure macromolecular compound containing ribose as a sugar, in which the sugar units are linked by a phosphate bridge by means of the diester bond. In the double-stranded nucleic acids, the purine or pyrimidine ring units of the nucleic acid, which form the bases (for example, inosine, adenosine, cytidine, uridine, etc.), are bound by so-called complementary hydrogen bonding to yield a double helix space structure. Since nucleic acids with a double-stranded structure are believed to have useful physiological functions, numerous studies have been performed to date on the nucleic acids (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, etc.).

Onder de nucleinezuren van deze soort, wordt een 25 synthetisch dubbelstrengs RNA polyinosinylzuur.polycytidylzuur-derivaat hierna aangeduid als "poly-I.poly-C"-derivaat; terwijl het polyinosinylzuur, dat een samenstellende eenheid is van dit derivaat, wordt aangeduid als "poly-I" en het poly-cytidylzuur als "poly-C".Among the nucleic acids of this species, a synthetic double-stranded RNA polyinosinyl acid, polycytidylic acid derivative is hereinafter referred to as "poly-I.poly-C" derivative; while the polyinosinyl acid, which is a constituent unit of this derivative, is referred to as "poly-I" and the poly-cytidyl acid as "poly-C".

30 Recentelijk is van verscheidene natuurlijke en synthetische dubbelstrengs RNA's bekend geworden dat ze een interferoninducerend vermogen hebben (Field et al, Proc. Nat.Recently, several natural and synthetic double-stranded RNAs have been known to have an interferon-inducing ability (Field et al., Proc. Nat.

Acad. Sci., U.S., 58, 1004, 1967; Field et al, Proc. Nat.Acad. Sci., U.S., 58, 1004, 1967; Field et al., Proc. Wet.

Acad. Sci., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al, Proc. Nat.Acad. Sci., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al., Proc. Wet.

Acad. Sci., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al, Proc. Nat.Acad. Sci., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al., Proc. Wet.

»8801664 - 2 - F ,»8801664-2 - F,

Acad. Sci., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al, J. Gen.Acad. Sci., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al., J. Gen.

Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 1981).Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 1981).

Typische voorbeelden van bekende synthetische 5 nuclelnezuurderivaten zijn hieronder vermeld.Typical examples of known synthetic nucleic acid derivatives are listed below.

Synthetische nuclexnezuurderivaten voor interferon-inducer (I) Homopolymeer.homopolymeer-complexen (dubbelstrengs nucleinezuurpolymeren met poly-I.poly-C als de basisstructuur) 10 (1) base-gemodificeerde derivaten: polyinosinylzuur.poly(5-broomcytidylzuur); polyinosinylzuur.poly(2-thiocytidylzuur); poly(7-deazainosinylzuur).polycytidylzuur; poly(7-deazainosinylzuur).poly(5-broomcytidylzuur).Synthetic nucleic acid derivatives for interferon inducer (I) Homopolymer homopolymer complexes (double-stranded nucleic acid polymers with poly-I.poly-C as the base structure) 10 (1) base-modified derivatives: polyinosinyl acid.poly (5-bromocytidylic acid); polyinosinyl acid, poly (2-thiocytidylic acid); poly (7-deazainosinyl acid). polycytidylic acid; poly (7-deazainosinyl acid) .poly (5-bromocytidylic acid).

15 (2) suiker-gemodificeerde derivaten: poly(2'-azidoinosinylzuur).polycytidylzuur.(2) sugar-modified derivatives: poly (2'-azidoinosinyl acid). Polycytidyl acid.

(3) fosforzuur-gemodificeerde derivaten: polyinosinylzuur.poly(cytidine-5'-thiofosforzuur).(3) phosphoric acid modified derivatives: polyinosinyl acid poly (cytidine-5'-thiophosphoric acid).

(II) Intergemodificeerde copolymeren: 20 poly(adenylzuur-uridylzuur).(II) Intermodified copolymers: poly (adenylic acid uridylic acid).

(III) Homopolymeer.copolymeer-complexen polyinosinylzuur.poly(cytidylzuur, uridylzuur); polyinosinylzuur.poly(cytidylzuur, 4-thiouridylzuur).(III) Homopolymer copolymer complexes polyinosinyl acid poly (cytidyl acid, uridyl acid); polyinosinyl acid. poly (cytidylic acid, 4-thiouridylic acid).

(IV) Synthetische zuur/polykation-complexen: 25 polyinosinylzuur.polycytidylzuur.poly-L-lysine (hierna aangeduid als "poly-ICLC").(IV) Synthetic acid / polycation complexes: polyinosinyl acid, polycytidylic acid, poly-L-lysine (hereinafter referred to as "poly-ICLC").

(V) Andere: polyinosinylzuur.poly(1-vinylcytidylzuur).(V) Other: polyinosinyl acid, poly (1-vinyl cytidylic acid).

Zoals hierboven vermeld zijn in de laatste jaren 30 diverse soorten van dubbelstrengs RNA, in het bijzonder derivaten die poly-I.poly-C als ouderlichaam hebben, gerapporteerd. Er bestaat een gevestigde theorie betreffende een reeks van nucleinezuurderivaten, waaronder deze, ten aanzien van de relatie tussen de structuur van de derivaten en de 35 functies ervan (De Clercq et al, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).As mentioned above, various types of double-stranded RNA, in particular derivatives that have poly-I.poly-C as parent body, have been reported in the last 30's. There is an established theory regarding a range of nucleic acid derivatives, including this one, regarding the relationship between the structure of the derivatives and their functions (De Clercq et al, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).

De onderhavige uitvinders hebben gevonden, op basis van de bovengenoemde stand van de techniek, dat wanneer <8801664 - 3 - * .The present inventors have found, based on the above prior art, that when <8801664-3 *.

poly-I.poly-C en diverse derivaten daarvan die een poly-I.poly-C-eenheid als het ouderlichaam hebben, op een geschikte grootte worden gebracht, zodat de totale moleculaire grootteverdeling van de derivaten zal vallen binnen het gebied 5 van 4S tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedimentatie-constante ervan (of van circa 50 tot ongeveer 10.000, als het aantal basen van de derivaten), de zo op geschikte grootte gebrachte derivaten een opmerkelijk verlaagde toxiciteit hebben en nog steeds de hierna te noemen fysiologische activi-10 teiten zullen hebben. Dienovereenkomstig werden octrooiaanvragen ingediend bij de Japanse Octrooiraad (Japanse octrooiaanvrage nr. 62-167433 en een andere octrooiaanvrage welke prioriteit inroept van deze aanvrage nr. 62-167433).poly-I.poly-C and various derivatives thereof which have a poly-I.poly-C unit as the parent body are sized so that the total molecular size distribution of the derivatives will fall within the range of 4S up to 13S, expressed as the value of its sedimentation constant (or from about 50 to about 10,000, as the number of bases of the derivatives), the so sized derivatives have markedly reduced toxicity and still listed below will have physiological activities. Accordingly, patent applications were filed with the Japanese Patent Council (Japanese Patent Application No. 62-167433 and another patent application which claims priority from this Application No. 62-167433).

Parallel aan de bovengenoemde studie hebben de 15 onderhavige uitvinders verder diverse wijzen onderzocht ten einde de bovengenoemde produkten doelmatig te verkrijgen. In het bijzonder werd uitvoerig onderzocht een wijze voor het op een geschikte grootte brengen van nuclelnezuurderivaten opdat deze een moleculaire grootteverdeling hebben van 50 tot 20 ongeveer 10.000, uitgedrukt in het aantal basen ervan, en een wijze voor het vormen van een dubbelstrengs nuclelnezuurpoly-meer uit twee soorten van enkelstrengs nuclexnezuurpolymeren.In parallel to the above study, the present inventors have further explored various ways to efficiently obtain the above products. In particular, a thorough method for resizing nucleic acid derivatives so that they have a molecular size distribution of from 50 to about 10,000 expressed in their number of bases, and a method for forming a double-stranded nucleic acid polymer from two kinds of single-stranded nucleic acid polymers.

De eerstgenoemde wijze, betreffende de bewerking van het terugbrengen van de moleculaire grootteverdeling van nucleïne-25 zuurder!vaten tot een vastgesteld gebied, wordt hierin aangeduid als "brengen op een geschikte grootte". Aangezien het op een geschikte grootte brengen gepaard gaat met omzetting in laagmoleculaire stoffen volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding, omvat het op een geschikte grootte brengen 30 tevens het "verkorten van de keten". Het vormen van een dubbelstrengs nucleinezuur uit twee soorten van enkelstrengs nucleinezuren wordt hierna aangeduid met "anelleren".The former manner, regarding the operation of reducing the molecular size distribution of nucleic acid vessels to a defined region, is referred to herein as "size adjustment". Since sizing involves conversion to low molecular weight substances according to the method of the present invention, sizing also includes "chain shortening". The formation of a double-stranded nucleic acid from two kinds of single-stranded nucleic acids is hereinafter referred to as "anellating".

Het begrip basepaar (hierna aangeduid als "bp"), dat gewoonlijk wordt gebruikt als de eenheid voor het weergeven 35 van de moleculaire grootte van nucleinezuren, kan worden gebruikt voor het weergeven van de moleculaire grootte van nucleinezuren door middel van het aantal basen waaruit het nucleinezuur bestaat. (Bijvoorbeeld, 10 bp betekent een dubbel- .8801664 * - 4 - strengs polymeer dat 10 basen heeft.) In de onderhavige beschrijving wordt tevens ook naar andere nucleinezuurpoly-meren verwezen dan naar dubbelstrengs nucleïnezuurpolymeren en derhalve wordt de term "basegetal" (aantal basen) hierin 5 gebruikt ter vervanging van "bp" ten einde de moleculaire grootte van nucleinezuren weer te geven. (Bijvoorbeeld, een nucleinezuurpolymeer met een "basegetal van 10" betekent dat het polymeer 10 basen heeft).The term base pair (hereinafter referred to as "bp"), which is commonly used as the unit of molecular size of nucleic acids, can be used to represent the molecular size of nucleic acids by the number of bases from which the nucleic acid exists. (For example, 10 bp means a double .8801664 * - 4 - stranded polymer having 10 bases.) In the present description, reference is also made to nucleic acid polymers other than double stranded nucleic acid polymers, and therefore the term "base number" (number bases) used herein to replace "bp" to represent the molecular size of nucleic acids. (For example, a nucleic acid polymer with a "base number of 10" means that the polymer has 10 bases).

Wanneer de moleculaire grootte van een nucleinezuur 10 wordt bepaald of geïdentificeerd, is hiervoor de waarde van de zogenaamde sedimentatieconstante (S-waarde) algemeen gebruikelijk. De onderhavige uitvinders konden het bovengenoemde basegetal van nucleïnezuren echter verkrijgen met behulp van high performance liquid chromatography (HPLC) 15 onder gebruikmaking van een gelfiltratiekolom of electroforese (hieronder in detail besproken), waarin dubbelstrengs DNA's (M13 faag-DNA-fragmenten) met bekende moleculaire groottes worden gebruikt als een merker en het basegetal van het te bepalen nucleinezuur wordt berekend op basis van het getal van 20 de controle.When the molecular size of a nucleic acid is determined or identified, the value of the so-called sedimentation constant (S value) is generally used for this. However, the present inventors were able to obtain the above nucleic acid base number by high performance liquid chromatography (HPLC) using a gel filtration column or electrophoresis (discussed in detail below), which contains double stranded DNAs (M13 phage DNA fragments) with known molecular sizes are used as a marker and the base number of the nucleic acid to be determined is calculated based on the number of the control.

Tot op heden werd de waarde van de sedimentatieconstante (S-waarde) alom gebruikt voor het uitdrukken van het moleculaire gewicht van macromoleculaire nucleinezuursubstanties. Macromoleculaire nucleinezuursubstanties welke commer-25 cieel verkrijgbaar zijn, worden aangeduid aan de hand van de S-waarde ervan. Vanwege de voortgang van experimentele technieken in de laatste jaren, is echter een middel voor het meer nauwkeurig vaststellen van het moleculaire gewicht van macromoleculaire stoffen tot stand gekomen, namelijk door gebruik 30 van gelelectroforese, gelfiltratie-chromatografie, ionuitwis-selingschromatografie of dergelijke, zodat de bepaling van de ketenlengte van macromoleculaire nucleinezuursubstanties mogelijk is geworden. Onder de omstandigheid zou de relatie tussen de aanduiding met de S-waarde en de aanduiding 35 met de ketenlengte problematisch worden. Vooral wanneer de betreffende nucleïnezuurmoleculen hun intrinsieke waarden in het geval van de aanduiding met de S-waarde hebben, bestaat er niet altijd een probleem betreffende het punt dat de aandui- .8801664 - 5 - **· ding met de S-waarde en de aanduiding met de ketenlengte nauwkeurig met elkaar overeenkomen met betrekking tot het weergeven van het moleculaire gewicht van de nuclexnezuren.To date, the value of the sedimentation constant (S value) has been widely used to express the molecular weight of macromolecular nucleic acid substances. Macromolecular nucleic acid substances which are commercially available are indicated by their S value. However, due to the progress of experimental techniques in recent years, a means of more accurately determining the molecular weight of macromolecular substances has been established, namely, using gel electrophoresis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography or the like, so that the chain length determination of macromolecular nucleic acid substances has become possible. Under the circumstances, the relationship between the S-value designation and the chain-length designation would become problematic. Especially when the nucleic acid molecules in question have their intrinsic values in the case of the designation with the S value, there is not always a problem regarding the point that the designation with the S value and the indication with the chain length accurately match with respect to the representation of the molecular weight of the nucleic acids.

Dienovereenkomstig is voor het weergeven van het 5 moleculaire gewicht van de nucleïnezuurpolymeren volgens de onderhavige uitvinding de S-waarde ook gebruikt in de beschrijving van de onderhavige aanvrage in overeenstemming met de conventionele manier in het gebied van de nuclexnezuur-chemie. Aangezien de "S-waarde" een waarde is die verkregen is 10 door middel van een methode voor het meten van het molecuulge-wicht van macromoleculaire nucleinezuursubstanties in de vorm van een moleculaire massa als een geheel (of in de vorm van een moleculaire toestand van de stof), is de aanduiding op basis van de meting van de ketenlengte van de stof (welke 15 hierin wordt aangeduid als "basegetal") eveneens hierin genoemd te zamen met de "S-waarde". Dit is vooral zo, omdat de grens in de molecuulgewichtsverdeling meer exact moet worden voorgesteld in de uitvoering van de onderhavige uitvinding.Accordingly, to represent the molecular weight of the nucleic acid polymers of the present invention, the S value has also been used in the description of the present application in accordance with the conventional manner in the field of nucleic acid chemistry. Since the "S value" is a value obtained by a method of measuring the molecular weight of macromolecular nucleic acid substances in the form of a molecular mass as a whole (or in the form of a molecular state of the substance), the indication based on the measurement of the chain length of the substance (which is referred to herein as "base number") is also mentioned herein together with the "S value". This is especially so because the limit in the molecular weight distribution must be more precisely represented in the practice of the present invention.

Volgens conventionele werkwijzen voor het op ' 20 geschikte grootte brengen van poly-I.poly-C en diverse derivaten daarvan, welke het genoemde poly-l.poly-C als het ouderlichaam hebben, onder oplevering van op geschikte grootte gebrachte nucleïnezuurpolymeren met dubbele keten, worden reeds bestaande nucleïnezuurpolymeren met dubbele keten 25 afgebroken tot laagmoleculaire verbindingen, of alternatief, worden enkelstrengs nucleïnezuren gehydrolyseerd tot laagmoleculaire verbindingen voorafgaande aan het snelleren.According to conventional methods for size-modifying poly-l. Poly-C and various derivatives thereof, which have said poly-l-poly-C as the parent body, to yield suitably sized double chain nucleic acid polymers , pre-existing double-chain nucleic acid polymers are degraded to low molecular weight compounds, or alternatively, single stranded nucleic acids are hydrolyzed to low molecular weight compounds before accelerating.

De conventionele werkwijzen zijn echter ongeschikt voor het verkrijgen van het beoogde produkt op een industriële 30 schaal, aangezien het op geschikte grootte brengen een lange tijd vergt en de werkwijze niet snel kan worden uitgevoerd.However, the conventional methods are unsuitable for obtaining the intended product on an industrial scale, since the size adjustment takes a long time and the method cannot be carried out quickly.

Bovendien zijn de conventionele werkwijzen niet altijd bevredigend vanuit het oogpunt van de opbrengst van de produkten.Moreover, the conventional methods are not always satisfactory from the viewpoint of the yield of the products.

35 Anderzijds, indien enkelstrengs nuclexnezuurpoly- meren, na op geschikte grootte te zijn gebracht, verzwaveld moeten worden, dan worden de polymeren verzwaveld met water- .8801664 ψ - 6 - * stofsulfide waarna het waterstofsulfide uit het oplosmiddel wordt gedampt, volgens een conventionele methode. Namelijk pyridine wordt uit de reactieoplossing verdampt, na verzwave-ling, bijvoorbeeld met behulp van een vacuümpomp zodat het 5 waterstofsulfide uit de reactieoplossing kan worden verwijderd te zamen met het pyridine door verdamping. Door deze methode verdampt het waterstofsulfide echter in de lucht en derhalve is het toepassen van deze methode op industriële schaal nadelig gezien vanuit het standpunt van milieuverontreiniging.On the other hand, if single-stranded nucleic acid polymers, after being sized, are to be sulfurized, the polymers are sulfurized with water .8801664 ψ - 6 - * dust sulfide after which the hydrogen sulfide is evaporated from the solvent, by a conventional method . Namely, pyridine is evaporated from the reaction solution, after sulfurization, for example, using a vacuum pump so that the hydrogen sulfide can be removed from the reaction solution along with the pyridine by evaporation. However, this method evaporates the hydrogen sulfide in the air, and therefore the use of this method on an industrial scale is disadvantageous from the viewpoint of environmental pollution.

10 Bovendien wordt volgens deze methode de na de verdamping van pyridine afgescheiden waterige laag in een dialysebuis gebracht ten behoeve van dialyse tegen stromend water, ten einde het beoogde produkt te verkrijgen. De methode vereist echter ten minste 3 dagen voor een volledige bewerking en de 15 opbrengst van het produkt is ten hoogste ongeveer 80 %. Bijgevolg heeft de conventionele methode verscheidene technische nadelen ten aanzien van de opbrengst aan produkten, de bereidingskosten en de bewerkingsduur.Moreover, according to this method, the aqueous layer separated after the evaporation of pyridine is introduced into a dialysis tube for dialysis against running water, in order to obtain the intended product. However, the method requires at least 3 days for a complete operation and the yield of the product is at most about 80%. Accordingly, the conventional method has several technical drawbacks in terms of product yield, manufacturing costs and processing time.

De techniek betreffende het op geschikte grootte 20 brengen zelf leverde geen moeilijkheden op in de stand van de techniek.The sizing technique itself did not present any difficulties in the prior art.

In dit technische veld is het gebruikelijk dat een nucleïnezuurpolymeer wordt verhit in aanwezigheid van formaldehyde ten einde het polymeer te hydrolyseren tot laagmole-25 culaire verbindingen. In deze conventionele methode worden produkten met een gewenste ketenlengte verkregen door een geschikte regeling van de reactieduur en de reactietempera-tuur, waarna de reactieoplossing wordt onderworpen aan dialyse ten einde alle te ver ontlede verbindingen met een 30 buitensporige lagere moleculaire grootte te verwijderen.In this technical field, it is common for a nucleic acid polymer to be heated in the presence of formaldehyde in order to hydrolyze the polymer to low molecular weight compounds. In this conventional method, products of a desired chain length are obtained by appropriate control of the reaction time and the reaction temperature, after which the reaction solution is subjected to dialysis to remove any excessively decomposed compounds of an excessively lower molecular size.

Volgens de conventionele methode zouden echter verbindingen met een op variërende wijze verschillende moleculaire gewichtsverdeling worden gevormd door het op geschikte grootte brengen, zelfs wanneer de reactieomstandigheden constant 35 worden gehouden, in afhankelijkheid van de eigenschappen van de gebruikte nucleinezuurpolymeren. Derhalve vertoont de methode een probleem inzake de reproduceerbaarheid. De reden hiervan wordt geacht te zijn dat de uitgangsmaterialen voor .8801664 - 7 - £ gebruik in de werkwijze zijn bereid door middel van een enzymreactie, waardoor de grootte van de uitgangsmaterialen niet op constante wijze kan worden gedefinieerd. Daarnaast is het op grond van de in de methode toegepaste dialyse in 5 principe onmogelijk om nucleinezuurpolymeren met een langere ketenlengte dan die van de gevormde produkten te verwijderen.However, according to the conventional method, compounds of varyingly different molecular weight distributions would be formed by size, even if the reaction conditions are kept constant depending on the properties of the nucleic acid polymers used. Therefore, the method presents a reproducibility problem. The reason for this is believed to be that the starting materials for use in the process have been prepared by an enzyme reaction, so that the size of the starting materials cannot be defined consistently. In addition, due to the dialysis used in the method, it is in principle impossible to remove nucleic acid polymers with a longer chain length than that of the formed products.

Onder deze omstandigheden is een fundamentele werkwijze voor het overwinnen van de bovengenoemde problemen in de stand van de techniek gewenst.Under these conditions, a basic method of overcoming the above problems in the art is desirable.

10 Dienovereenkomstig werden uitvoerige onderzoeken verricht ten einde de volgende doelstellingen te bereiken: (1) Op geschikte grootte gebrachte dubbelstrengs nucleinezuurpolymeren worden verkregen als produkten door middel van een snelle werkwijze.Accordingly, extensive studies have been conducted to achieve the following objectives: (1) Suitably sized double stranded nucleic acid polymers are obtained as products by a rapid method.

15 (2) De opbrengst van de produkten is hoog.(2) The yield of the products is high.

(3) Zelfs wanneer de werkwijze wordt uitgevoerd op een industriële schaal, geeft de werkwijze geen verontreiniging van de omgeving en andere problemen.(3) Even when the process is performed on an industrial scale, the process does not present environmental contamination and other problems.

(4) Een bewerkingsreeks van de werkwijze is voldoende 20 kwantitatief en reproduceerbaar.(4) An operation sequence of the method is sufficiently quantitative and reproducible.

Aldus werd gekomen tot de onderhavige uitvinding, welke verschaft:Thus, the present invention has been achieved, which provides:

Een werkwijze voor de bereiding van dubbelstrengs nuclelnezuurderivaten met RNA als het ouderlichaam, 25 waarvan de totale moleculaire grootteverdeling valt binnen het traject van 4S tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedimentatieconstante ervan, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht alvorens te worden geanelleerd; 30 alsmede,A process for the preparation of double-stranded nucleic acid derivatives with RNA as the parent body, the total molecular size distribution of which falls within the range of 4S to 13S, expressed as the value of its sedimentation constant, whereby nucleic acid polymers are appropriately sized before being fused; 30 as well,

Een werkwijze voor de bereiding van dubbelstrengs nucleinezuurderivaten met RNA als het ouderlichaam, waarin de moleculen voor de maximum verdeling in de totale moleculaire grootteverdeling van de derivaten het aantal 35 basen hebben dat ligt in het traject van 50 tot 10.000, waarbij nucleinezuurpolymeren op geschikte grootte worden gebracht alvorens te worden geanelleerd.A method of preparing double-stranded nucleic acid derivatives with RNA as the parent body, wherein the molecules for the maximum distribution in the total molecular size distribution of the derivatives have the number of 35 bases ranging from 50 to 10,000, nucleic acid polymers being suitably sized before being fused.

In het bijzonder berust de strekking van de e 8 8 0 1 6 6 4In particular, the thrust of the e is 8 8 0 1 6 6 4

- 8 -A- 8 -A

onderhavige uitvinding op de volgende punten: (1) Nucleinezuurpolymeren met een enkele keten worden op geschikte grootte gebracht alvorens te worden geanelleerd.Present invention on the following points: (1) Single chain nucleic acid polymers are sized before being fused.

(2) Voor het op geschikte grootte brengen in stap (1) 5 wordt HPLC (gelfiltratie-high performance liquid chromatography) gebruikt in plaats van de conventionele electro-forese zodat de moleculare grootteverdeling van de produkten numeriek wordt gedefinieerd. Bijgevolg kan de fluctuering van de moleculaire grootteverdeling gemakke-10 lijk worden gecontroleerd, zodat de produkten met het beoogde traject van moleculaire grootteverdeling, dat wil zeggen van 4S tot 13S, uitgedrukt in de waarde van de sedimentatieconstante (of van 50 tot 10.000 of daaromtrent, uitgedrukt in het aantal basen) snel kunnen worden 15 verkregen. De snelle en nauwkeurige werkwijze voor het selecteren van de produkten met de gewenste ketenlengte wordt verschaft door de onderhavige uitvinding.(2) To size in step (1) 5, HPLC (gel filtration high performance liquid chromatography) is used in place of the conventional electrophoresis so that the molecular size distribution of the products is numerically defined. Accordingly, the fluctuation of the molecular size distribution can be easily controlled, so that the products with the intended molecular size distribution range, ie from 4S to 13S, expressed in value of the sedimentation constant (or from 50 to 10,000 or thereabouts, expressed in number of bases) can be obtained quickly. The fast and accurate method of selecting the products of the desired chain length is provided by the present invention.

(3) Na het op geschikte grootte brengen kan een lager alcohol worden toegevoegd aan de reactieoplossing ten 20 einde de produkten te isoleren. (In conventionele methoden worden de produkten verkregen door middel van dialyse.) De onderhavige uitvinding heeft derhalve een zeer eenvoudige isolatietrap tot stand gebracht ter verhoging van de opbrengst aan produkten.(3) After size adjustment, a lower alcohol can be added to the reaction solution in order to isolate the products. (In conventional methods, the products are obtained by dialysis.) The present invention has therefore accomplished a very simple isolation step to increase the yield of products.

25 (4) Indien de op geschikte grootte gebrachte nucleinezuur polymeren met een enkele keten verzwaveld dienen te worden, worden de polymeren na op geschikte grootte te zijn gebracht, eerst verzwaveld met waterstofsulfide en vervolgens, nadat een arylalcohol is toegevoegd aan de 30 verzwavelingsreactieoplossing, wordt de verkregen oplossing onderworpen aan centrifugatie ten einde het waterstofsulfide te verwijderen. (In conventionele methoden wordt het waterstofsulfide rechtststreeks verdampt uit het oplosmiddel.) De onderhavige uitvinding 35 verschaft aldus een zeer eenvoudige waterstofsulfide- verwijderingstrap ter verhoging van de opbrengst van de produkten.(4) If the suitably sized nucleic acid polymers are to be sulfurized, the polymers, after being sized, are first sulfurized with hydrogen sulfide and then, after an aryl alcohol has been added to the sulfurization reaction solution, the resulting solution subjected to centrifugation to remove the hydrogen sulfide. (In conventional methods, the hydrogen sulfide is evaporated directly from the solvent.) Thus, the present invention provides a very simple hydrogen sulfide removal step to increase the yield of the products.

(5) Als een methode voor het controleren en beperken van c 880 1 664 - 9 - de moleculaire gewichtsverdeling van de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren wordt een ion-uitwisselhars gebruikt. (Deze bewerking wordt hierna aangeduid als "grootte-restrictie".) 5 De onderhavige uitvinding zal hieronder gedetail leerd worden toegelicht.(5) As a method for controlling and limiting the molecular weight distribution of the appropriately sized single-stranded nucleic acid polymers, an ion exchange resin is used. (This operation is referred to hereinafter as "size restriction".) The present invention will be explained in detail below.

Het anelleren is een stap inhoudende het binden van complementaire enkelstrengs nucleinezuurpolymeren tot een dubbelstrengs polymeer en dit is een bewerking die natuurlijk 10 met gemak kan worden uitgevoerd. Wanneer het op geschikte grootte brengen wordt uitgevoerd na de anellering, dan zou de verzwavelingsgraad onjuist fluctueren, zodat het moeilijk zou worden om het produkt kwantitatief te verkrijgen. Dienovereenkomstig hebben de onderhavige uitvinders de bewerking 15 van het op geschikte grootte brengen uitgevoerd voorafgaande aan de anelleringstrap met als gevolg dat een zeer uitmuntend resultaat werd verkregen. Het bovengenoemde aspect (1) heeft nauw verband met het aspect (2). Volgens de conventionele wijze ter bepaling van een moleculair gewicht door middel van 20 electroforese, is ten minste één volledige nacht vereist voor migratie, kleuren en andere trappen en derhalve is een snelle procedure moeilijk. Volgens de onderhavige uitvinding, wordt daarentegen HPLC-gelfiltratie toegepast ter bepaling van het moleculaire gewicht van nucleinezuurderivaten, waarbij de 25 reactietijd vóór de elutie van de derivaten met een beoogde moleculaire grootteverdeling (dat wil zeggen, vallend in het traject van 4s tot 13S, uitgedrukt als de waarde van de sedi-mentatieconstante, of 50 tot 10.000 of daaromtrent, uitgedrukt als het aantal basen) opmerkelijk kan worden verkort.Anelating is a step of binding complementary single-stranded nucleic acid polymers into a double-stranded polymer and this is an operation that can of course be performed with ease. If the sizing is performed after the anelation, the degree of sulfurization would fluctuate incorrectly, making it difficult to obtain the product quantitatively. Accordingly, the present inventors performed the resizing operation prior to the aneling step with the result that a very excellent result was obtained. The above aspect (1) is closely related to the aspect (2). According to the conventional molecular weight determination method by electrophoresis, at least one full night is required for migration, staining and other steps and therefore a rapid procedure is difficult. According to the present invention, on the other hand, HPLC gel filtration is used to determine the molecular weight of nucleic acid derivatives, wherein the reaction time before the elution of the derivatives with an intended molecular size distribution (ie, falling in the range of 4s to 13S) is expressed if the value of the sedimentation constant, or 50 to 10,000 or thereabouts, expressed as the number of bases) can be remarkably shortened.

30 Volgens de onderhavige uitvinding wordt de reactie gestopt nadat de voltooiing van de reactie betreffende het op geschikte grootte brengen is gedetecteerd, waarna een lager alcohol wordt toegevoegd ten einde de reactieoplossing verder te verwerken. Onder de lagere alcoholen verdient ethanol 35 speciale voorkeur.According to the present invention, the reaction is stopped after the completion of the size adjustment reaction is detected, and a lower alcohol is added to further process the reaction solution. Among the lower alcohols, ethanol is especially preferred.

In het geval van precipitatie met ethanol volgens de onderhavige uitvinding, is bijvoorbeeld de opbrengst aan L-poly-C (op geschikte grootte gebracht poly-C) (het .8801664 *< - 10 - voorvoegsel "L- . . 11 betekent hierna "op geschikte grootte gebracht . . ") uit poly-C bedraagt 93 % en de opbrengst aan L-poly-I uit poly-I bedraagt 78 %. Derhalve is de opbrengst aan de op geschikte grootte gebrachte produkten hoog.For example, in the case of precipitation with ethanol of the present invention, the yield of L-poly-C (suitably sized poly-C) (the .8801664 * <- 10 prefix "L-. 11 means" below. suitably sized. ") from poly-C is 93% and the yield of L-poly-I from poly-I is 78%. Therefore, the yield of the suitably sized products is high.

5 Daarentegen moet volgens de conventionele werkwijze een reactieoplossing in een dialysebuis worden gebracht ten behoeve van de dialyse. In dit geval is de terugwinning slechts ongeveer 60 % en de opbrengst aan L-poly-I uit poly-I zou slechts ongeveer 40 % zijn. Bovendien vereist de dialyse-10 bewerking 3 dagen of daaromtrent.In contrast, according to the conventional method, a reaction solution must be introduced into a dialysis tube for dialysis. In this case, the recovery is only about 60% and the yield of L-poly-I from poly-I would be only about 40%. In addition, the dialysis operation requires 3 days or more.

Volgens de precipitatiewerkwijze met ethanol van de onderhavige uitvinding, waarbij ethanol wordt toegevoegd aan een reactieoplossing in een hoeveelheid van tweemaal die van de reactieoplossing, waarbij wordt geroerd ten einde het 15 gewenste produkt neer te slaan en vervolgens de verkregen neerslag wordt verzameld door centrifugatie en wordt gewassen en gedroogd, kan de werkwijze echter worden geëindigd binnen één uur.According to the ethanol precipitation method of the present invention, wherein ethanol is added to a reaction solution in an amount twice that of the reaction solution, stirring to precipitate the desired product and then the resulting precipitate is collected by centrifugation and washed and dried, however, the process can be completed within one hour.

Het bovengenoemde aspect (3) is een zeer belang-20 rijk aspect volgens de onderhavige uitvinding.The above aspect (3) is a very important aspect of the present invention.

De reactie van het substitueren van de stikstofatomen in het nuclelnezuurgedeelte in een op een geschikte grootte gebracht enkelstrengs nucleïnezuurpolymeer door zwavelatomen (bijvoorbeeld het substitueren van de amino-25 groep in de cytidine-residu-eenheid in poly-C door een mer-captogroep in een bepaalde verhouding) ten einde het nuclelne-zuurgedeelte om te zetten in een ander nucleïnezuur (welke reactie hierin wordt aangeduid als "verzwaveling") wordt vaak benut in de synthese van copolymeren. Een ander kenmerkend 30 aspect van de onderhavige uitvinding is het toevoegen van een arylalcohol aan de op geschikte grootte gebrachte enkelstrengs nucleinezuurpolymeren ter isolering van verzwavelde copolymeren. Dit is het bovengenoemde aspect (4).The reaction of substituting the nitrogen atoms in the nucleic acid portion in an appropriately sized single-stranded nucleic acid polymer by sulfur atoms (for example, substituting the amino-25 group in the cytidine residue unit in poly-C by an mer-capto group in a certain ratio) in order to convert the nucleic acid portion to another nucleic acid (which reaction is referred to herein as "sulfurization") is often utilized in the synthesis of copolymers. Another characteristic aspect of the present invention is the addition of an aryl alcohol to the suitably sized single-stranded nucleic acid polymers to isolate sulfurized copolymers. This is the above aspect (4).

Als een arylalcohol kan bijvoorbeeld voor dit doel 35 fenol worden gebruikt.For example, phenol can be used as an aryl alcohol for this purpose.

Bijvoorbeeld wordt een halve hoeveelheid fenol eerst toegevoegd aan de reactieoplossing, welke pyridine, water en waterstofsulfidegas in een mengsel bevat, waarna geroerd en .8801664 - 11 - gecentrifugeerd wordt, waardoor de waterige laag scherp wordt afgescheiden van de fenollaag en het kleurmiddel in de reactie-oplossing alsmede het daarbij geproduceerd zwavel en dergelijke overgaan in de fenollaag. Vervolgens wordt de waterige 5 laag geïsoleerd en wordt het beoogde produkt neergeslagen door behandeling met een waterige zoutoplossing en een alcohol. Dan wordt het aldus neergeslagen produkt geïsoleerd door middel van centrifugatie en vervolgens gewassen met een alcohol onder verkrijging van een gezuiverd produkt.For example, half an amount of phenol is first added to the reaction solution, which contains pyridine, water and hydrogen sulfide gas in a mixture, then stirred and centrifuged, sharply separating the aqueous layer from the phenol layer and the colorant in the reaction solution and the sulfur and the like produced thereby pass into the phenolic layer. Then, the aqueous layer is isolated and the target product is precipitated by treatment with an aqueous salt solution and an alcohol. Then the product thus precipitated is isolated by centrifugation and then washed with an alcohol to obtain a purified product.

10 Volgens deze werkwijze wordt nagenoeg al het waterstofsulfide overgebracht in de supernatant in de vorm van een waterstofsulfideoplossing en derhalve kan deze gemakkelijk worden verwijderd van het reactieprodukt.According to this method, substantially all of the hydrogen sulfide is transferred to the supernatant in the form of a hydrogen sulfide solution and therefore it can be easily removed from the reaction product.

Volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding 15 waarbij gebruik wordt gemaakt van fenol, kan de bewerking bijvoorbeeld worden beëindigd binnen één uur en is de opbrengst bijna 100 %. Bovendien kan het produkt kwantitatief worden geïsoleerd.For example, according to the method of the present invention using phenol, the operation can be terminated within one hour and the yield is nearly 100%. In addition, the product can be isolated quantitatively.

De bovengenoemde karakteristieke aspecten (2) tot 20 (4) van de onderhavige uitvinding zijn belangrijk betreffende het op geschikte grootte brengen alvorens te anelleren.The aforementioned characteristic aspects (2) to 20 (4) of the present invention are important with regard to sizing before anellating.

Namelijk deze zijn buitengewoon essentieel voor het op effeciënte wijze uitvoeren van de werkwijze betreffende het op geschikte grootte brengen voorafgaande aan het anelleren.Namely, these are extremely essential to efficiently carry out the sizing process prior to anellization.

25 Het bovengenoemde aspect (5) is nog een ander karakteristiek aspect van de onderhavige uitvinding, waarbij een trap inzake de grootte-definiëring wordt uitgevoerd tussen de stappen van het op geschikte grootte brengen onderscheidenlijk het anelleren. Dit zal hieronder worden toegelicht.The aforementioned aspect (5) is yet another characteristic aspect of the present invention, in which a size definition step is performed between the steps of size adjustment or anellization. This will be explained below.

30 In deze stap wordt een ion-uitwisselingshars gebruikt. Als voorbeeld van het toepassen van een ion-uitwisselingshars op macromoleculaire nuclelnezuren, wordt DEAE-cellu-lose, DEAE-sephadex, gebenzoyleerd DEAE-cellulose of dergelijke toegepast op t-RNA (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 35 200, 1963; Biochem. 6, 3043, 1967). In het voorbeeld wordt de ion-uitwisselingshars echter slechts aangewend voor de zuivering van laagmoleculaire nuclelnezuren die ten hoogste het aantal basen van ongeveer 80 hebben.An ion exchange resin is used in this step. As an example of applying an ion exchange resin to macromolecular nucleic acids, DEAE cellulose, DEAE-sephadex, benzoylated DEAE cellulose or the like is applied to t-RNA (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 35 200, 1963; Biochem. 6, 3043, 1967). However, in the example, the ion exchange resin is used only for the purification of low molecular weight nucleic acids having at most the number of bases of about 80.

.8801664 ·* - 12 -.8801664 * - 12 -

De onderhavige uitvinders hebben uitvoerig onderzocht of de intrinsieke eigenschap van het lading-adsorptievermogen van ion-uitwisselingsharsen kan worden toegepast voor de zuivering van macromoleculaire nucleïnezuur-5 polymeren op basis van de index van het aantal basen van de polymeren, met als gevolg de totstandkoming van de onderhavige uitvinding. Aangezien de met de onderhavige uitvinding te verkrijgen eindprodukten buitengewoon nuttig zijn als geneesmiddelen, wordt gemeend, dat de groottedefiniëring, welke 10 wordt uitgevoerd onder gebruikmaking van een ion-uitwisselings-hars (hetgeen hierna ook zal worden aangeduid als "ion-uitwis-selingsproces"), in het bijzonder een uitstekend inventief aspect vormt in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding.The present inventors have extensively investigated whether the intrinsic property of the charge adsorption capacity of ion exchange resins can be used for the purification of macromolecular nucleic acid-5 polymers based on the base number index of the polymers, resulting in the formation of the present invention. Since the final products to be obtained by the present invention are extremely useful as medicaments, it is believed that the size definition, which is performed using an ion exchange resin (which will also be referred to hereinafter as "ion exchange process") ), in particular, forms an excellent inventive aspect in the method of the present invention.

In het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige 15 uitvinding kan een ion-uitwisselingshars in een houder worden gebracht welke een met de hars te verwerken nucleinezuurpoly-meer bevat, ten einde het doel te bereiken (ladingsgewijze proces), doch in het algemeen wordt kolomchromatografie benut voor de fractionering (kolomproces). In het bijzonder wordt 20 een ion-uitwisselingshars in een kolom gebracht en wordt een oplossing van een nucleïnezuurpolymeer op de kolom gebracht, zodat het polymeer in eerste instantie wordt geadsorbeerd aan de ion-uitwisselingshars. Vervolgens wordt een eluens zoals een zout-trisbuffer of dergelijke lineair of stapsgewijze over 25 de kolom gevoerd waarbij de zoutconcentratie wordt gevarieerd, zodat een constante hoeveelheid van een eluaat wordt verkregen. Het aantal basen van het nucleïnezuurpolymeer, zoals aanwezig in elke geëlueerde fractie, wordt bepaald door dezelfde HPLC-gelfiltratie als eerdergenoemd onder gebruik-30 making van een merker als index, en bijgevolg kunnen de fracties welke het beoogde eindprodukt bevatten, worden verzameld.In the ion-exchange process of the present invention, an ion-exchange resin may be placed in a container containing a nucleic acid polymer to be processed with the resin, in order to achieve its purpose (batch process), but column chromatography is generally used for the fractionation (column process). In particular, an ion exchange resin is placed in a column and a solution of a nucleic acid polymer is applied to the column, so that the polymer is initially adsorbed on the ion exchange resin. Then, an eluent such as a salt-tris buffer or the like is passed linearly or stepwise over the column varying the salt concentration to obtain a constant amount of an eluate. The number of bases of the nucleic acid polymer, as present in each eluted fraction, is determined by the same HPLC gel filtration as mentioned previously using a marker as an index, and thus the fractions containing the intended final product can be collected.

Ten einde het doel van de onderhavige uitvinding door het bovengenoemde ion-uitwisselingsproces te bereiken, is 35 de soort van de in een kolom te vullen ion-uitwisselingshars alsmede de soort van het voor de elutie te gebruiken eluens een bijzonder belangrijke factor.In order to achieve the object of the present invention by the above-mentioned ion exchange process, the type of the ion exchange resin to be filled in a column as well as the type of the eluent to be used for the elution is a particularly important factor.

Wanneer bijvoorbeeld poly-I werd opgelost in tris-HCL-buffer en werd geadsorbeerd aan QAE (quaternair .8801064 - 13 - aminoethyl), gebruikt voor de grootte-definiëring van poly-I, voor ion-uitwisseling, dan kon het beoogde produkt niet worden verkregen zelfs wanneer de zoutconcentratie in het eluens buitengewoon hoog werd gemaakt. Dit is omdat poly-I zelf onop-5 losbaar werd daar de zoutconcentratie in het eluens hoger was dan die van een geschikt eluens voor poly-I op de QAE-hars.For example, when poly-I was dissolved in tris-HCL buffer and adsorbed on QAE (quaternary .8801064 - 13-aminoethyl), used for size definition of poly-I, for ion exchange, the intended product could not obtained even when the salt concentration in the eluent was made extremely high. This is because poly-I itself became insoluble since the salt concentration in the eluent was higher than that of a suitable poly-I eluent on the QAE resin.

Dit blijkt duidelijk uit het feit, dat het inosinylzuur, hetgeen de samenstellende eenheid van poly-I is, structureel meer hydrofoob is. In dit geval kan de zoutconcentratie in een 10 geschikt eluens voor poly-I worden bepaald in vergelijking met het geval voor poly-C.This is evident from the fact that the inosinyl acid, which is the constituent unit of poly-I, is structurally more hydrophobic. In this case, the salt concentration in a suitable eluent for poly-I can be determined as compared to the case for poly-C.

In een ander experiment zoals dat werd uitgevoerd door de onderhavige uitvinders, werd waargenomen, dat een oplossing van poly-I wit en troebelig werd onder vorming van 15 een precipitaat in een buffer met een geschikte eluens-zout-concentratie voor poly-I in een QAE-hars. Dienovereenkomstig dient te worden opgemerkt, dat in het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding de keuze van de soort van de te gebruiken ion-uitwisselingshars alsmede de keuze van de elue-20 rende zoutconcentratie een buitengewoon belangrijke factor is.In another experiment such as that conducted by the present inventors, it was observed that a solution of poly-I became white and cloudy to form a precipitate in a buffer with an appropriate eluent salt concentration for poly-I in a QAE resin. Accordingly, it should be noted that in the ion exchange process of the present invention, the choice of the type of the ion exchange resin to be used as well as the choice of the eluting salt concentration is an extremely important factor.

Bijvoorbeeld in het geval van poly-I, gaf DEAE-hars een buitengewoon goed resultaat. In het geval van poly-C werd gevonden, dat zowel QAE-hars als ook DEAE-hars een gunstig resultaat konden opleveren. Voor de elutie kan ofwel een 25 elutie met een lineaire zoutgradiënt ofwel een elutie met een stapsgewijze zoutgradiënt worden benut, waarbij de polymeren gefractioneerd en geëlueerd kunnen worden met betrekking tot de lengte van de ketens van de polymeren.For example, in the case of poly-I, DEAE resin gave an extremely good result. In the case of poly-C, it was found that both QAE resin and DEAE resin could yield a favorable result. Either an elution with a linear salt gradient or an elution with a stepwise salt gradient can be used for the elution, whereby the polymers can be fractionated and eluted with respect to the length of the chains of the polymers.

Wanneer bijvoorbeeld poly-C (38 mg, SO^q, 8,6) werd 30 geadsorbeerd aan DEAE-Toyopearl 650 C ( φ 10 x 130 mm) en vervolgens geëlueerd door middel van een elutie met lineaire gradiënt onder gebruikmaking van de volgende eluentia (A) en (B), elk in een hoeveelheid van 100 ml.For example, when poly-C (38 mg, SO ^ q, 8.6) was adsorbed on DEAE-Toyopearl 650 C (φ 10 x 130 mm) and then eluted by linear gradient elution using the following eluents (A) and (B), each in an amount of 100 ml.

(A) - 0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 35 (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(A) - 0 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) 35 (B) = 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0)

De lineaire gradiënt was voor (B) (van 0 % tot 100 %); en de elutie-omstandigheden waren als volgt: lineaire stroomsnelheid: 1,32 cm/min .8801664 - 14 - elutiesnelheid: 175 druppels/fractie.The linear gradient was for (B) (from 0% to 100%); and the elution conditions were as follows: linear flow rate: 1.32 cm / min. 8801664-14 elution rate: 175 drops / fraction.

Als resultaat werden de volgende fracties met elk de aangegeven ketenlengte in volgorde geëlueerd.As a result, the following fractions, each with the indicated chain length, were eluted in order.

Fractie b.p.Fraction b.p.

5 33 340 34 470 35 740 36 1000 37 1500 10 Daarnaast werd hetzelfde monster geëlueerd door een elutie met stapsgewijze gradiënt, waardoor een fractie van minder dan 500 b.p. eerst werd geëlueerd met 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml) en vervolgens een fractie van 500 tot1500 b.p. werd geëlueerd met 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl 15 (pH 7,0) (50 ml).5 33 340 34 470 35 740 36 1000 37 1500 10 In addition, the same sample was eluted by a stepwise gradient elution, yielding a fraction of less than 500 b.p. first eluting with 0.3 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (50 ml) and then a fraction of 500 to 1500 b.p. eluted with 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl 15 (pH 7.0) (50 ml).

Op dezelfde wijze werd poly-I (7,8 mg, S2g, 7,3) geëlueerd door middel van een elutie met lineaire gradiënt onder dezelfde omstandigheden als hierboven. Als resultaat werden de volgende fracties op rij geëlueerd.Likewise, poly-I (7.8 mg, S2g, 7.3) was eluted by a linear gradient elution under the same conditions as above. As a result, the following fractions were eluted in a row.

20 Fractie b.p.20 Fraction b.p.

35 30 36 140 37 230 38 350 25 39 460 40 54035 30 36 140 37 230 38 350 25 39 460 40 540

Daarnaast werd hetzelfde monster geëlueerd door middel van een elutie met stapsgewijze gradiënt, waarbij een fractie van minder dan 300 b.p. eerst werd geëlueerd met 0,3 M 30 NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml) en vervolgens een fractie van 300 tot 600 b.p. werd geëlueerd met 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (50 ml).In addition, the same sample was eluted by a stepwise gradient elution, with a fraction less than 300 b.p. eluting first with 0.3 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (50 ml) and then a fraction of 300 to 600 b.p. was eluted with 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (50 ml).

Zoals eerder vermeld, kunnen zelfs macromoleculaire nucleinezuren worden gefractioneerd met behulp van de werk-35 wijze volgens de onderhavige uitvinding tot door ketenlengte gedefinieerde nucleïnezuurfracties (grootte-definiëring) door een geschikte keuze van de zoutconcentratie in de elutie.As mentioned previously, even macromolecular nucleic acids can be fractionated using the method of the present invention to chain length defined nucleic acid fractions (size definition) by an appropriate selection of the salt concentration in the elution.

Zoals toegelicht in de bovengenoemde twee voorbeelden, kunnen fracties (hoofdcomponenten) met een .8801664 - 15 - geschikte ketenlengteverdeling, welke vanwege hun farmaceutische eigenschappen geschikt zijn als geneesmiddelen, vrijelijk worden gefractioneerd uit een mengsel dat verscheidene macromoleculaire nucleinezuren bevat met 5 verschillende ketenlengteverdelingen, en de fractionering kan worden uitgevoerd op een industriële massaproduktieschaal. Dit kenmerk betreffende de fractionering is het meest belangrijke aspect in het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding.As illustrated in the above two examples, fractions (major components) with an .8801664-15 suitable chain length distribution, which due to their pharmaceutical properties are suitable as drugs, can be freely fractionated from a mixture containing several macromolecular nucleic acids with 5 different chain length distributions, and the fractionation can be performed on an industrial mass production scale. This fractionation feature is the most important aspect in the ion exchange process of the present invention.

10 Wanneer een farmaceutisch preparaat wordt bereid in de vorm van een injectie, is het alom bekend, dat een bewerking ter verwijdering van een pyrogeen uit de injectie onvermijdbaar is. Van het pyrogeen is bekend dat het is samengesteld uit lipopolysacchariden en deze moeten niet 15 worden opgenomen in geneeskundige preparaten. Indien de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt als een injectiepreparaat voor toediening aan mensen, is de verwijdering van alle pyrogenen essentieel.When a pharmaceutical preparation is prepared in the form of an injection, it is well known that an operation to remove a pyrogen from the injection is unavoidable. The pyrogen is known to be composed of lipopolysaccharides and should not be included in medicinal preparations. When the nucleic acid derivatives of the present invention are used as an injection preparation for administration to humans, the removal of all pyrogens is essential.

Gelukkigerwijze werd gevonden, dat de toepassing van 20 het bovengenoemde ion-uitwisselingsproces op de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding geschikt is voor het verwijderen van pyrogenen uit de derivaten.Fortunately, it has been found that the application of the above ion exchange process to the nucleic acid derivatives of the present invention is suitable for removing pyrogens from the derivatives.

Derhalve hebben de onderhavige uitvinders verder uitvoerige experimenten uitgevoerd ten einde het bovengenoemde 25 gunstige verschijnsel nauwkeuriger te onderzoeken, met als resultaat, dat verder werd gevonden, dat pyrogenen kunnen worden verwijderd uit elk enkelstrengs nucleinezuurderivaat, onverschillig de ketenlengte daarvan, door het ion-uitwisselingsproces van de onderhavige uitvinding. Dit is weer een 30 ander kenmerkend aspect van de onderhavige uitvinding.Therefore, the present inventors have conducted further extensive experiments to investigate the above-mentioned favorable phenomenon more closely, with the result that it was further found that pyrogens can be removed from any single-stranded nucleic acid derivative, regardless of the chain length thereof, by the ion exchange process of the present invention. This is yet another characteristic aspect of the present invention.

Dienovereenkomstig omvat de onderhavige uitvinding tevens een uitvoeringsvorm betreffende het behandelen van de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding met een ion-uitwisselingshars ten einde pyrogenen daaruit te 35 verwijderen, voor de bereiding van een injectiepreparaat welk het derivaat bevat.Accordingly, the present invention also includes an embodiment of treating the nucleic acid derivatives of the present invention with an ion exchange resin to remove pyrogens therefrom, for the preparation of an injection composition containing the derivative.

De resultaten die verkregen zijn door een limulus-test voor het kwantitatief bepalen van de hoeveelheid van .8801664 > - 16 - ΐ endotoxine in diverse enkelstrengs RNA's (commercieel poly-C en derivaten met verkorte keten daarvan) zijn vermeld in de onderstaande tabel.The results obtained by a limulus assay for quantitatively determining the amount of .8801664> - 16 - ΐ endotoxin in various single-stranded RNAs (commercial poly-C and short chain derivatives thereof) are shown in the table below.

In de tabel betekent EU (endotoxine-eenheid) een 5 eenheid in een konijnen-koortstest met USP-referentiestandaard endotoxine (E. coli 0113). (1) geeft aan dat gedestilleerd water werd gebruikt voor injectie (blanco); (2) verwijst naarIn the table, EU (endotoxin unit) means a 5 unit in a rabbit fever test with USP reference standard endotoxin (E. coli 0113). (1) indicates that distilled water was used for injection (blank); (2) refers to

poly-C (commercieel produkt-1); (3) verwijst naar poly-Cpoly-C (commercial product-1); (3) refers to poly-C

(commercieel produkt-2); en (4) verwijst naar het produkt 10 verkregen in het volgende voorbeeld (V-d).(commercial product-2); and (4) refers to the product 10 obtained in the following example (V-d).

Voor of na uitwis-Before or after erase

Test- selings- Concentratie stof_kolom_yg/ml_EU/ml_pg/mg EU/mg 15 (1) - 29,92 0,0868 (2) voor 308,29 0,8941 548,07 1,5895 na 18,68 0,0542 33,96 0,0985 (3) voor 93,89 0,2723 166,18 0,4891 na 19,45 0,0564 34,12 0,0989 20 (4) voor 89,63 0,2599 155,98 0,4520 na 57,45 0,1666 114,90 0,3332Testing Concentration Substance_column_yg / ml_EU / ml_pg / mg EU / mg 15 (1) - 29.92 0.0868 (2) before 308.29 0.8941 548.07 1.5895 after 18.68 0.0542 33 .96 0.0985 (3) before 93.89 0.2723 166.18 0.4891 after 19.45 0.0564 34.12 0.0989 20 (4) before 89.63 0.2599 155.98 0, 4520 after 57.45 0.1666 114.90 0.3332

Uit de resultaten van de bovenstaande tabel blijkt duidelijk het pyrogeen-verwijderende effect van de ion-uitwis-seling.The results of the above table clearly demonstrate the pyrogen removing effect of the ion exchange.

25 De fysiologische activiteit van de nucleinezuurderi- vaten volgens de onderhavige uitvinding is buitengewoon nuttig voor medicijnen. De nucleinezuurderivaten volgens de onderhavige uitvinding hebben een sterke carcinostatische activiteit, hetgeen hierna gedetailleerd zal worden toegelicht. Deze 30 activiteit is slechts één van een aantal verschillende fysiologische activiteiten van de nucleinezuurderivaten volgens de onderhavige uitvinding.The physiological activity of the nucleic acid derivatives of the present invention is extremely useful for drugs. The nucleic acid derivatives of the present invention have a strong carcinostatic activity, which will be explained in detail below. This activity is only one of a number of different physiological activities of the nucleic acid derivatives of the present invention.

Als andere fysiologische activiteiten van de nucleinezuurderivaten van de onderhavige uitvinding, welke 35 poly-I.poly-C als ouderlichaam hebben, kunnen verder worden genoemd: TNF-producerend vermogen, interferon-producerend vermogen, interleukin 2-producerend vermogen, macrofaag-activerend vermogen, NK cel-activerend vermogen, remmende werking op de proliferatie van tumorcellen, remmende werking .8801664 - 17 - * op de proliferatie van tumorcellen in naakte muizen die een menselijke tumorcel dragen, remmende werking op de metastase van tumorcellen in de long, enz.As other physiological activities of the nucleic acid derivatives of the present invention, which have poly-I.poly-C as parent body, may be further mentioned: TNF-producing ability, interferon-producing ability, interleukin 2-producing ability, macrophage-activating ability , NK cell activating capacity, inhibitory effect on the proliferation of tumor cells, inhibitory effect. 8801664 - 17 - * on the proliferation of tumor cells in nude mice bearing a human tumor cell, inhibitory effect on the metastasis of tumor cells in the lung, etc.

De nuclelnezuurderivaten van de onderhavige 5 uitvinding hebben een veiligheid die zeer veel hoger is dan het conventionele poly-I.poly-C en soortgelijke interferon-inducers. Bijgevolg zijn de verbindingen volgens de onderhavige uitvinding bruikbaar als een antiviraal middel, anti-tumormiddel enz.The nucleic acid derivatives of the present invention have a safety very much higher than the conventional poly-I.poly-C and similar interferon inducers. Accordingly, the compounds of the present invention are useful as an antiviral, anti-tumor agent, etc.

10 De fysiologische activiteiten van de nuclelnezuur derivaten van de onderhavige uitvinding, zoals hierboven vermeld, zijn in detail beschreven in de voornoemde octrooi-publicaties (Japanse octrooiaanvrage nr. 62-167433 en andere Japanse octrooiaanvrage welke prioriteit heeft ingeroepen van 15 deze aanvrage nr. 62-157433.)The physiological activities of the nucleic acid derivatives of the present invention, as noted above, are described in detail in the aforementioned patent publications (Japanese Patent Application No. 62-167433 and other Japanese Patent Application which has claimed priority of this Application No. 62 -157433.)

De volgende voorbeelden zijn bestemd om de bereiding van de nucleïnezuurderivaten van de onderhavige uitvinding meer gedetailleerd toe te lichten, doch niet ter beperking van de reikwijdte van de onderhavige uitvinding.The following examples are intended to illustrate the preparation of the nucleic acid derivatives of the present invention in more detail, but not to limit the scope of the present invention.

20 Voorbeeld I: Bereiding en zuivering van L-poly-I (op geschikte grootte gebrachte poly-ï) 200 ml gedestilleerd water, 250 ml formamide en 500 ml van een 5 M NaCl-oplossing werden toegevoegd aan 10 g vanExample I: Preparation and purification of L-poly-I (suitably sized poly-I) 200 ml of distilled water, 250 ml of formamide and 500 ml of a 5 M NaCl solution were added to 10 g of

OO

een commercieel poly-I en verhit tot 80 C gedurende circa 25 4 uur.a commercial poly-I and heated to 80 ° C for about 25 hours.

De reactieoplossing werd onderworpen aan gelfil-tratie door HPLC onder gebruikmaking van een gel G-DNA-PW kolom (7,88 mm ID x 300 mm) (eluens: 50 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5), 0,3 M NaCl-oplossing, 2 mM EDTA; stroomsnelheid: 0,5 30 ml/min) waarna de reactie werd beëindigd op het tijdstip waarbij een fractie met een maximum piek voor een retentie-tijd van 21,86 + 0,2 minuten werd verkregen.The reaction solution was subjected to gel filtration by HPLC using a gel G-DNA-PW column (7.88 mm ID x 300 mm) (eluent: 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). 3 M NaCl solution, 2 mM EDTA; flow rate: 0.5 (30 ml / min) after which the reaction was terminated at the time when a fraction with a maximum peak for a retention time of 21.86 + 0.2 minutes obtained.

Een tweevoudige hoeveelheid ethanol werd toegevoegd aan de reactieoplossing en het verkregen gevormde precipitaat 35 werd verzameld door centrifugatie (3000 omwentelingen perA two-fold amount of ethanol was added to the reaction solution and the resulting precipitate formed was collected by centrifugation (3000 revolutions per

OO

minuut, 4 C). Dit werd gewassen met 70 % ethanol en gedroogd in vacuüm onder verkrijging van 10,2 g L-poly-I.minute, 4 C). This was washed with 70% ethanol and dried in vacuo to give 10.2 g of L-poly-I.

.8801664 *· - 18 -.8801664 * - - 18 -

Het in de bovenstaande werkwijze gebruikte water en de oplossingen waren alle gesteriliseerd. Datzelfde geldt tevens hieronder.The water used in the above method and the solutions were all sterilized. The same also applies below.

Voorbeeld II: Bereiding en zuivering van L-poly-C 5 (op geschikte grootte gebracht poly-C) 200 ml gedestilleerd water, 250 ml formamide en 50 ml van een 5 M NaCl-oplossing werden toegevoegd aan 10 gExample II: Preparation and purification of L-poly-C 5 (suitably sized poly-C) 200 ml of distilled water, 250 ml of formamide and 50 ml of a 5 M NaCl solution were added to 10 g

OO

poly-C en verhit tot 80 C gedurende circa 4 uur. Door dezelfde HPLC-gelfiltratie als hierboven, werd het eindpunt van de 10 reactie bevestigd (retentietijd: 21,33± 0,2 min).poly-C and heated to 80 C for about 4 hours. By the same HPLC gel filtration as above, the end point of the reaction was confirmed (retention time: 21.33 ± 0.2 min).

Een tweevoudige hoeveelheid ethanol werd toegevoegd aan de reactieoplossing en het gevormde precipitaat werdA two-fold amount of ethanol was added to the reaction solution and the precipitate formed

OO

verzameld door centrifugtie (3000 omwentelingen per min, 4 C). Dit precipitaat werd gewassen met 70 % ethanol en vervolgens 15 gedroogd in vacuüm onder verkrijging van 9,5 g L-poly-C.collected by centrifugation (3000 rpm, 4 C). This precipitate was washed with 70% ethanol and then dried in vacuo to give 9.5 g of L-poly-C.

Voorbeeld III: Verzwaveling van L-poly-CExample III: Sulfurization of L-poly-C

8.0 g van het in de bovenstaande stap (II) verkregen L-poly-C werd opgelost in 240 ml water en overgebracht in een 500 ml stalen vat. Een waterstofsulfide bevattende pyridine- 20 oplossing (12 g/120 ml) werd daaraan toegevoegd onder koeling8.0 g of the L-poly-C obtained in the above step (II) was dissolved in 240 ml of water and transferred to a 500 ml steel vessel. A hydrogen sulfide containing pyridine solution (12 g / 120 ml) was added thereto under cooling

OO

met ijs. Nadat het vat was verzegeld, werd het verhit op 50 C gedurende circa 10 uur. Na afkoeling werd een TE-verzadigd fenol (200 ml) toegevoegd, geroerd en gecentrifugeerd (3000with ice. After the vessel was sealed, it was heated at 50 ° C for about 10 hours. After cooling, a TE-saturated phenol (200 ml) was added, stirred and centrifuged (3000

OO

omwentelingen per min, 15 C, 5 min). Een 1/10 hoeveelheid van 25 een 5 M NaCl-oplossing en een tweevoudige hoeveelheid ethanol werden toegevoegd aan de afgescheiden waterige fase onder oplevering van een precipitaat daarin. Het precipitaat werd 0 verzameld door centrifugtie (3000 omwentelingen per min, 4 C, 10 min), gewassen met 70 % ethanol en gedroogd in vacuüm onder 4 30 oplevering van 8,0 g L-poly(C20, S U) (namelijk, op geschikte grootte gebracht poly-C-derivaat waarin de cytidylzuren zijn gesubstitueerd door 4-thiouridylzuur in een hoeveelheid van één 4-thiouridylzuur voor 20 cytidylzuren).revolutions per min, 15 C, 5 min). A 1/10 aliquot of a 5 M NaCl solution and a two-fold amount of ethanol were added to the separated aqueous phase to yield a precipitate therein. The precipitate was collected by centrifugation (3000 rpm, 4 C, 10 min), washed with 70% ethanol and dried in vacuo to give 8.0 g of L-poly (C20, SU) (i.e., on suitable sized poly-C derivative in which the cytidyl acids are substituted by 4-thiouridylic acid in an amount of one 4-thiouridylic acid for cytidyl acids).

De bovengenoemde term TE betekent 10 mM Tris-HCl-35 buffer (pH 7,5) welke EDTA bevat in een hoeveelheid van 1 mM. Voorbeeld IV: Uitvoering van het anelleren 6.00 g van het in de bovengenoemde stap (III) 4 verkregen L-poly(C2Q, S U) en 6,44 g van het in de bovenge- .8801664 - 19 - noemde stap (I) verkregen poly-I werden opgelost in 300 ml 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5)/50 mM NaCl-oplossing en daarinThe above term TE means 10 mM Tris-HCl-35 buffer (pH 7.5) containing EDTA in an amount of 1 mM. Example IV: Carrying out anellization 6.00 g of the L-poly (C2Q, SU) obtained in the above step (III) 4 and 6.44 g of the step (I) mentioned in the above 8801664 - 19 - poly-I were dissolved in 300 ml 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) / 50 mM NaCl solution and therein

OO

gemengd. De verkregen oplossing werd verhit tot 70 C in een waterbad en op die temperatuur gehouden gedurende 10 minuten.mixed. The resulting solution was heated to 70 ° C in a water bath and kept at that temperature for 10 minutes.

5 Daarna liet men de oplossing afkoelen gedurende de nacht. Na behandeling met fenol en een precipitatie met ethanol, werd water (circa 200 ml) toegevoegd aan het gevormde precipitaat ten einde dit op te lossen. Dan werd de verkregen oplossingThe solution was then allowed to cool overnight. After phenol treatment and ethanol precipitation, water (about 200 ml) was added to the precipitate formed to dissolve it. Then the solution obtained was

OO

gedialyseerd tegenover water bij 4 C. Het dialysaat werd 10 geconcentreerd tot droogte onder oplevering van 12,4 g van een geanelleerde verbinding.dialyzed against water at 4 ° C. The dialysate was concentrated to dryness to give 12.4 g of a fused compound.

Voorbeeld V: Grootte-definiëring door ion-uitwisse-lingsprocesExample V: Size definition by ion exchange process

De lon-uitwisseling werd uitgevoerd door een staps- 15 gewijze elutie of elutie met lineaire gradiënt. In beide gevallen waren de opbrengst en de ketenlengte van de produkten bijna hetzelfde, mits de elutieomstandigheden geschikt waren uitgekozen. Voor de stapsgewijze elutie van L-poly-C en 4 L-poly(C, S U), werden 0,15 M NaCl/10 mM Tris-HCl 20 (pH 7,0) en 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) continu gebruikt.The lon exchange was performed by a stepwise elution or linear gradient elution. In both cases, the yield and chain length of the products were almost the same, provided the elution conditions were appropriately selected. For the stepwise elution of L-poly-C and 4 L-poly (C, SU), 0.15 M NaCl / 10 mM Tris-HCl 20 (pH 7.0) and 1.0 M NaCl / 10 mM Tris -HCl (pH 7.0) used continuously.

Met betrekking tot de stapsgewijze elutie van L-poly-I wordt verwezen naar het volgende voorbeeld V-a.With regard to the stepwise elution of L-poly-I, reference is made to the following example V-a.

Voor de elutie met lineaire gradiënt van L-poly-I 25 werden (A) en (B) gebruikt en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.For the linear gradient elution of L-poly-I, (A) and (B) were used and the elution was performed under the gradient conditions of the solution (B) from 0 to 100%.

(A) = OM NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).(A) = OM NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (B) = 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0).

Met betrekking tot de elutie met lineaire gradiënt 4 30 van L-poly-C en L-poly(C, S U) wordt verwezen naar voorbeeld V-b en V-d.Regarding the linear gradient elution of L-poly-C and L-poly (C, S U), reference is made to Examples V-b and V-d.

V-a: Grootte-definiëring van L-poly-IQ-a: Size definition of L-poly-I

210 mg van het in de bovengenoemde stap (I) verkregen L-poly-I werd opgelost in 5 ml van een 10 mM210 mg of the L-poly-I obtained in the above step (I) was dissolved in 5 ml of a 10 mM

RTMRTM

35 Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsorbeerd aan DEAE-Toyopear1 650 C ( φ 10 mm x 130 mm). Het geheel werd vervolgens stapsgewijze geëlueerd met een lineaire stromingssnelheid van 1,30 cm/min, met de eluentia 0,03 M NaCl/10 mM Tris-HCl . 880 1 664' * - 20 - '3 i (pH 7,0) (50 ml) en 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (80 ml). De met 0,5 M NaCl geëlueerde fractie werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door middel van dezelfde HPLC-gelfiltratie als in de bovengenoemde stap (I), welke 5 retentietijd 21,90± 0,2 (min) bedroeg.35 Tris-HCl buffer (pH 7.0) and adsorbed on DEAE-Toyopear1 650 C (φ 10 mm x 130 mm). The whole was then eluted stepwise at a linear flow rate of 1.30 cm / min, with the eluents 0.03 M NaCl / 10 mM Tris-HCl. 880 1 664 '- 20 - 3 l (pH 7.0) (50 ml) and 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (80 ml). The fraction eluted with 0.5 M NaCl was collected and its retention time was measured by the same HPLC gel filtration as in the above step (I), which retention time was 21.90 ± 0.2 (min).

Het beoogde eindprodukt L-poly-I (grootte-gede- finieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen in een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 91 %.The intended final product L-poly-I (size-defined) with a base number of 100 to 1000 was obtained in a high yield. The yield recovered was 91%.

V-b: Grootte-definiëring van L-poly-CV-b: Size definition of L-poly-C

10 610 mg van het in de bovengenoemde stap (II)10 610 mg of the in the above step (II)

verkregen L-poly-C werd opgelost in 10 ml Tris-HCl-buffer (pHL-poly-C obtained was dissolved in 10 ml Tris-HCl buffer (pH

RTMRTM

7,0) en geadsorbeerd aan QAE-Toyopearl 550 C (φ 10 mm x 130 mm). Daarna werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire gradiënt bij een lineaire stroomsnelheid van 1,30 15 cm/min, waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheid van de oplossing (B) lopende van 0 tot 100 %.7.0) and adsorbed on QAE-Toyopearl 550 C (φ 10 mm x 130 mm). Then it was eluted by a linear gradient elution at a linear flow rate of 1.30 cm / min, whereupon the following solutions (A) and (B) were used, each in an amount of 100 ml, and the elution was performed under the gradient condition of the solution (B) ranging from 0 to 100%.

(A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) 20 (B) = 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(A) = 0.0 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) 20 (B) = 1.0 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0)

De fractie, zoals geëlueerd bij de hoofdpiek, werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door middel van HPLC-gelfiltratie, welke 21,35± 0,2 min bedroeg. Het beoogde eindprodukt L-poly-C (grootte-gedefinieerd) met een basegetal van 25 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst was 93 %.The fraction, as eluted at the main peak, was collected and its retention time was measured by HPLC gel filtration, which was 21.35 ± 0.2 min. The intended final product L-poly-C (size-defined) with a base number of 100 to 1000 was obtained in high yield. The yield recovered was 93%.

V-c: Grootte-definiëring van L-poly(C^^, U) 19 mg polyiC^, U) (waarin de cytidylzuren werden gesubstitueerd door uridylzuur in een hoeveelheid van één 30 uridylzuur voor 12 cytidylzuren) (dit had een retentietijd van 18,67 minuten in dezelfde HPLC als in de bovengenoemde stap (I)) werd opgelost in 5 ml Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsor-Vc: Size definition of L-poly (C ^ ^, U) 19 mg polyiC ^, U) (in which the cytidyl acids were substituted by uridic acid in an amount of one uridic acid for 12 cytidyl acids) (this had a retention time of 18, 67 minutes in the same HPLC as in the above step (I)) was dissolved in 5 ml Tris-HCl buffer (pH 7.0) and adsorbent

RTMRTM

beerd aan DEAE-Toyopearl 650 C ( φ10 mm x 130 mm).bear to DEAE-Toyopearl 650 C (φ10 mm x 130 mm).

Vervolgens werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire 35 gradiënt met een lineaire stroomsnelheid 1,30 cm/min, waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.Then it was eluted by a linear gradient elution with a linear flow rate of 1.30 cm / min, whereupon the following solutions (A) and (B) were used, each in an amount of 100 ml, and the elution was carried out under the gradient conditions of the solution (B) from 0 to 100%.

.88 0 1 664 3 - 21 - (A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).88 0 1 664 3 - 21 - (A) = 0.0 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0) (B) = 0.5 M NaCl / 10 mM Tris-HCl (pH 7.0 )

De fractie zoals geëlueerd bij de hoofdpiek, werd verzameld en de retentietijd daarvan werd gemeten door HPLC-gelfiltratie, 5 welke tijd 18,97± 0,2 min bedroeg. Het beoogde eindprodukt L-poly-(C.j2 / U) (grootte-gedefinieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 87 %.The fraction eluted at the main peak was collected and its retention time was measured by HPLC gel filtration, which time was 18.97 ± 0.2 min. The intended final product L-poly- (C 12 / U) (size-defined) with a base number of 100 to 1000 was obtained in high yield. The yield recovered was 87%.

V-d: Grootte-definiëring van L-poly(C2Q, S^U) 10 600 mg van het in de bovengenoemde stap (III) 4 verkregen L-poly(C2Q, S U) werd opgelost in 10 ml Tris-HCl-buffer (pH 7,0) en geadsorbeerd aan QAE-Toyopeari™ 550C (Φ10 mm x 130 mm). Daarna werd dit geëlueerd door een elutie met lineaire gradiënt met een lineaire stroomsneldheid cm/min, 15 waarna de volgende oplossingen (A) en (B) werden gebruikt, elk in een hoeveelheid van 100 ml, en de elutie werd uitgevoerd onder de gradiëntomstandigheden van de oplossing (B) van 0 tot 100 %.Vd: Size definition of L-poly (C2Q, S ^ U) 600 mg of the L-poly (C2Q, SU) obtained in the above step (III) 4 was dissolved in 10 ml Tris-HCl buffer (pH 7.0) and adsorbed on QAE-Toyopeari ™ 550C (Φ10 mm x 130 mm). Then it was eluted by a linear gradient elution with a linear flow rate cm / min, whereupon the following solutions (A) and (B) were used, each in an amount of 100 ml, and the elution was performed under the gradient conditions of the solution (B) from 0 to 100%.

De retentietijd werd gemeten door HPLC-gelfiltratie op dezelfde wijze als in de bovengenoemde stap V-b, welke tijd 21,35± 0,2 min bedroeg.The retention time was measured by HPLC gel filtration in the same manner as in the above step V-b, which time was 21.35 ± 0.2 min.

44

Het beoogde eindprodukt L-poly(C2Q, S U) (grootte-25 gedefinieerd) met een basegetal van 100 tot 1000 werd verkregen met een hoge opbrengst. De gewonnen opbrengst bedroeg 90 %.The intended end product L-poly (C2Q, SU) (size 25 defined) with a base number of 100 to 1000 was obtained in high yield. The yield recovered was 90%.

Voorbeeld VI: Anellering:Example VI: Aneling:

VI-a: L-poly-I en L-poly-CVI-a: L-poly-I and L-poly-C

30 3,0 g van het grootte-gedefinieerde L-poly-C3.0 g of the size-defined L-poly-C

(verkregen in de bovengenoemde stap V-b) en 3,2 g van het grootte-gedefinieerd L-poly-I (verkregen in de bovengenoemde stap V-a) werden afzonderlijk opgelost in 150 ml 10 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,5)/50 mM NaCl en werden vermengd. De(obtained in the above step Vb) and 3.2 g of the size-defined L-poly-I (obtained in the above step Va) were separately dissolved in 150 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) / 50 mM NaCl and were mixed. The

OO

35 verkregen oplossing werd verhit tot 70 C in een waterbad en werd op deze temperatuur gehouden gedurende 10 minuten. Daarna liet men de oplossing gedurende de nacht afkoeien. Na een behandeling met fenol en een precipitatie met ethanol werd .8801664 * , - 22 - water (circa 400 ml) toegevoegd aan het gevormde precipitaat ten einde dit op te lossen. Daarna werd de verkregen oplossingThe resulting solution was heated to 70 ° C in a water bath and kept at this temperature for 10 minutes. The solution was then allowed to cool overnight. After treatment with phenol and precipitation with ethanol, .8801664 * 22 water (about 400 ml) was added to the precipitate formed to dissolve it. The resulting solution was then removed

OO

gedialyseerd tegen water bij 4 C. Het dialysaat werd geconcentreerd tot droogte onder oplevering van 6,2 g van een geanel-5 leerde verbinding.dialyzed against water at 4 ° C. The dialysate was concentrated to dryness to yield 6.2 g of an fused 5 compound.

Vl-b: L-poly-I en L-polyCCpg, S U) 1,46 g van het grootte gedefinieerde L-poly( C20's u) (verkregen in de bovenstaande stap V-d) en 1,57 g van het grootte-gedefinieerde L-poly-I (verkregen in de bovenstaande 10 stap V-a) werden verwerkt op dezelfde wijze als in de bovengenoemde stap Vl-a, en 3,0 g van een geanelleerde verbinding werd verkregen in elk geval.Vl-b: L-poly-I and L-polyCCpg, SU) 1.46 g of the size-defined L-poly (C20's u) (obtained in step Vd above) and 1.57 g of the size-defined L -poly-I (obtained in the above step Va) were processed in the same manner as in the above step Vl-a, and 3.0 g of an fused compound was obtained in each case.

De uitvinding is thans in detail en onder verwijzing naar specifieke uitvoeringsvormen ervan beschreven, doch het 15 zal duidelijk zijn aan deskundigen op het vakgebied, dat diverse veranderingen en modificaties daarin kunnen worden gemaakt zonder af te wijken van de geest en reikwijdte van de uitvinding.The invention has now been described in detail and with reference to specific embodiments thereof, but it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made therein without departing from the spirit and scope of the invention.

.8801664.8801664

Claims

A method for preparing double-stranded nucleic acid derivatives having RNA as the lower body, characterized in that its entire molecular size distribution falls within the range of 4S to 5 13S, expressed in the value of its sedimentation constant, with nucleic acid polymers of appropriate size be brought and subsequently fused.

2. Method for the preparation of double-stranded nucleic acid derivatives having RNA as the parent body, characterized in that the molecules for the maximum distribution in the total molecular size distribution of the derivatives therein have the number of bases falling in the range of 50 to 10,000 , whereby nucleic acid polymers are sized and subsequently fused.

A process according to claim 1 or 2, characterized in that a lower alcohol is added to the reaction solution containing the appropriately sized nucleic acid polymer prior to anellization.

Process according to claim 3, characterized in that the lower alcohol is ethanol.

4 - 23 - 5

5. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the nucleic acid portions in the appropriately sized single-stranded nucleic acid polymers are sulfurized in the presence of an aryl alcohol prior to anellization.

A method according to claim 5, characterized in that the aryl alcohol is a phenol,

7. A method according to claim 1 or 2, characterized in that the suitably sized single-stranded nucleic acid polymers are treated with an ion exchange resin prior to anellization, in order to collect the polymers with a molecular size distribution within a predetermined range for size definition of the appropriately sized polymers. .8801664 * - 24 -

8. Process for the preparation of an injection preparation containing essentially nucleic acid derivatives, characterized in that pyrogens in the derivatives, if present, are removed using an ion exchange resin,> 8 8 0 1 6 6 4 '