JP2005508196A - 核酸分析の汎用ヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、１つ以上の汎用塩基を組み込むプライマー伸長産物を作製および分析するための方法およびキットを包含し、これは、核酸配列決定およびマイクロサテライト分析のための方法およびキットを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定する方法を提供する。そのような特定の実施形態は、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、ならびに標識を含む少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む反応組成物の形成を含む。反応組成物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するため、インキュベートされる。
Description
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸合成間にポリヌクレオチド鎖に取り込まれ得る汎用ヌクレオチドに一般的に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プライマー伸長反応は、現在の分子生物学において広く使用されている。例えば、サンガー配列決定において、オリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートの５’末端にアニールされ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、ポリメラーゼ、および４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターが反応組成物を形成するため加えられ（４つのターミネーターは、別個の反応または一つの反応に一緒に、どちらかで加えられる）、そして反応組成物は、プライマー伸長および終結が達成される適切な条件下でインキュベートされる。
【０００３】
可変性縦列反復配列数（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＶＮＴＲｓ）および短縦列反復（Ｓｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＳＴＲｓ）を含むマイクロサテライトの解析は、プライマー伸長反応を利用する別の広く使用される方法である。ＳＴＲは、ゲノムの１つ以上の位置で直列に反復する２〜７個のヌクレオチド配列である。縦列反復の数は、個体間で変化する。特定の遺伝子解析技術のため、ＳＴＲｓは、反復領域に隣接する特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され反復数が決定される。特定の技術において、その決定は、例えば電気泳動、質量分析、またはクロマトグラフィーによるサイズ区別を用いてなされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定する方法を提供する。そのような特定の実施形態は、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、ならびに標識を含む少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む反応組成物の形成を含む。反応組成物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するため、インキュベートされる。１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を使用して分離される。次に、１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は検出される。
【０００５】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートの配列決定方法は、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、標識を含む少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つの反応組成物の形成を含む。この反応組成物は、１つ以上の少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するため、インキュベートされる。１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を使用して分離される。次に、１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は検出される。
【０００６】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートの配列決定方法は、少なくとも１つの標的核酸テンプレートから少なくとも１つのプライマー伸長産物を放出する工程ならびに少なくとも１回、インキュベートおよび放出を繰り返す工程をさらに含む。
【０００７】
本発明の特定の実施形態は、複数個のプライマー伸長産物の検出方法を提供する。特定の実施形態に従って、その方法は、少なくとも１つのテンプレート、標識を含む少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む、反応組成物の形成を含む。この反応組成物は、適切な条件下で、１つ以上の少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するためにインキュベートされる。プライマー伸長産物は、少なくとも１つの核酸テンプレートから放出され、インキュベーションおよび放出の手順は複数のプライマー伸長産物を生成するために繰り返される。１つ以上の複数のプライマー伸長産物は、ＭＤＡＴを用いて分離される。次に、１つ以上の複数のプライマー伸長産物は、検出される。
【０００８】
特定の実施形態に従って、複数の２次プライマー伸長産物の検出方法が提供される。特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つの核酸テンプレート、少なくとも１つの第１プライマー、少なくとも１つの特異的ヌクレオチド、および少なくとも１つの第１ポリメラーゼを含む第１反応組成物の形成を含み、ここではこの第１反応組成物は、汎用ヌクレオチドを含まない。第１反応組成物は、適切な条件下で、少なくとも１つの第１プライマー伸長産物を生成するためにインキュベートされる。少なくとも１つの第１プライマー伸長産物は、少なくとも１つの標的核酸テンプレートから放出され、インキュベーションおよび放出の手順は、複数の第１プライマー伸長産物の生成のために繰り返される。特定の実施形態において、この方法は、１つ以上の少なくとも１つの第１プライマー伸長産物、標識を含む少なくとも１つの第２プライマー、少なくとも１つの第２ポリメラーゼおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む第２反応組成物の形成をさらに含む。第２反応組成物は、適切な条件下で、少なくとも１つの第２プライマー伸長産物を生成するためにインキュベーションされる。少なくとも１つの第２プライマー伸長産物は、少なくとも１つの第１プライマー伸長産物から放出され、インキュベーションおよび放出の手順は複数の第２プライマー伸長産物を生成するために繰り返される。特定の実施形態において、その方法は、ＭＤＡＴを用いた１つ以上の複数の第２プライマー伸長産物の分離を含む。次に、１つ以上の複数の第２プライマー伸長産物は検出される。
【０００９】
特定の実施形態に従って、標的核酸テンプレートの配列決定のためのキットが提供される。特定の実施形態において、そのキットは、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つの特異的なターミネーターを含む。
【００１０】
特定の実施形態において、標的核酸テンプレートの短縦列反復の検出のためのキットが提供される。特定の実施形態において、そのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および標的核酸テンプレート内の短縦列反復に隣接した配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む。
【００１１】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
上記一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であるのみであり、そして本発明を限定しないことが理解されるべきである。本願において、単数形の使用は、他に特にそうでないと言及されない限り、複数を包含する。本願において、「または（ｏｒ）」は、他に言及されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および他の形態の使用（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）は、非限定的である。
【００１２】
本明細書中で使用される節の見出しは、系統立ての目的のみのためであり、そして記載される主題を限定するとは解釈されない。本願において引用される全ての文献、または文献の一部（特許、特許出願、記事、書籍および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、任意の目的でその全体が本明細書中に参考として明白に援用される。
【００１３】
（定義）
用語「ヌクレオチド塩基」とは、本明細書中において使用される場合、置換または非置換の芳香族環をいう。特定の実施形態において、この芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含む。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基と、ワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーンの水素結合を形成し得る。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、天然に存在するヌクレオチド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、ならびに天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／３８５８４を参照のこと）、エテノアデニン、インドール（例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール）、およびピロール（例えば、ニトロピロール）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、汎用ヌクレオチド塩基である。特定の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５−３９４頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．およびそこに引用される参考文献において見出され得る。
【００１４】
用語「ヌクレオチド」とは、本明細書中において使用される場合、糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース、ならびにこれらの糖アナログ）のＣ−１’炭素に結合したヌクレオチド塩基を含む化合物をいう。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチドアナログを包含する。糖は、置換または非置換であり得る。置換リボース糖としては、１つ以上の炭素原子（例えば、２’−炭素原子）が１つ以上の同じかまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基（ここで、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである）で置換されているリボースが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なリボースとしては、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース，２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド，１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−および３’−４’−で連結しそして他の「ロックされた」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９８／２２４８９、同ＷＯ９８／３９３５２；および同ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。ポリヌクレオチドにおける例示的なＬＮＡ糖アナログとしては、以下の構造：
【００１５】
【化１】
が挙げられるが、これらに限定されない。ここで、Ｂは、任意のヌクレオチド塩基である。
【００１６】
リボースの２’位置または３’位置における修飾として、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドとしては、天然のＤ光学異性体形態、およびＬ光学異性体形態が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０を参照のこと）。ヌクレオチド塩基がプリンである場合（例えば、ＡまたはＧ）、リボース糖が、このヌクレオチド塩基のＮ９位置に結合される。ヌクレオチド塩基がピリミジンである場合（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）、ペントース糖が、このヌクレオチド塩基のＮ１位置に結合される（プソイドウリジンを除く。プソイドウリジンにおいて、ペントース糖は、ウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位置に結合される）（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと）。
【００１７】
ヌクレオチドのペントース炭素の１つ以上は、以下の式：
【００１８】
【化２】
を有するリン酸エステルで置換され得る。ここで、αは、０〜４の整数である。特定の実施形態において、αは２であり、そしてこのリン酸エステルは、ペントースの３’炭素または５’炭素に結合される。特定の実施形態において、このヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、汎用ヌクレオチド塩基、特異的ヌクレオチド塩基、またはこれらのアナログである、ヌクレオチドである。「ヌクレオチド５’−三リン酸」とは、５’位置に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、そして時々、リボース糖の構造的特徴を特に示すために、「ＮＴＰ」、または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と記載される。三リン酸エステル基は、種々の酸素を置換する硫黄を含み得る（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸）。ヌクレオチドの化学についての概説については、例えば、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと。
【００１９】
用語「ヌクレオチドアナログ」とは、本明細書中において使用される場合、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオチドの１つ以上のリン酸エステルが、そのそれぞれのアナログと置き換えられ得る実施形態をいう。特定の実施形態において、例示的なペントース糖アナログは、上記のものである。特定の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上記のようなヌクレオチド塩基アナログを有する。特定の実施形態において、例示的なリン酸エステルアナログとしては、アルカリホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そして会合する対イオンを含み得る。
【００２０】
「ヌクレオチドアナログ」の定義にはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステルの骨格が、異なるタイプのヌクレオチド間結合で置き換えられている、ポリヌクレオチドアナログに重合し得るヌクレオチドアナログモノマーが含まれる。例示的なポリヌクレオチドアナログとしては、ポリヌクレオチドの糖リン酸骨格がペプチド骨格で置き換えられている、ペプチド核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「伸長可能なヌクレオチド」とは、以下のヌクレオチドである：（ｉ）ポリヌクレオチド鎖の末端に酵素的にかまたは合成的に取り込まれ得るヌクレオチド、および（ｉｉ）さらなる酵素的または合成的な伸長を支持し得るヌクレオチド。伸長可能なヌクレオチドとしては、ポリヌクレオチド鎖に既に酵素的にかまたは合成的に取り込まれたヌクレオチド、ならびにさらなる酵素的または合成的な伸長を支持されているか、あるいはさらなる酵素的または合成的な伸長を支持し得るヌクレオチドが挙げられる。伸長可能なヌクレオチドとしては、ヌクレオチド５’−三リン酸（例えば、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ）、ポリヌクレオチドの化学合成に適切なホスホロアミダイト、ならびに酵素的にかもしくは化学的に既に取り込まれた、ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位が挙げられるが、これらに限定されない。伸長可能なヌクレオチドとしては、特異的ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および汎用ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定さない。
【００２２】
ヌクレオチドに関して本明細書で用いられる用語「タイプ」は、構造的に別個のヌクレオチドをいう。例えば、ＡとＧとは、異なるタイプのヌクレオチドである。同様に、ＧとＩとは、両者がＣと対形成し得るけれども、異なるタイプのヌクレオチドである。本明細書で用いられる、異なる「対形成タイプ」であるヌクレオチドは、両者が構造的に別個であり、そして異なる対形成特異性を有している。例えば、ＡとＧとは、異なる対形成タイプのヌクレオチドである。なぜなら、それらは構造的に別個であり、そしてそれらは異なる対形成特異性（Ｔ対Ｃ）を有しているからである。ＧとＩとは、互いに比較されるとき、異なる対形成タイプのヌクレオチドではない。なぜなら、構造的に別個であるが、それらは、両方ともＣと特異的に結合するからである。以下に規定されるような、汎用ヌクレオチドの対形成タイプはそれが対形成するヌクレオチドの組み合わせにより決定される。例えば、仮想の汎用ヌクレオチドＹが、Ａ、Ｃ、およびＴと対形成し、そして構造的にＹと異なる、仮想の汎用ヌクレオチドＸが、ＣおよびＧと対形成する。それゆえ、ＸとＹとは異なるタイプの汎用ヌクレオチドであり、そしてＸとＹとはまた、それらは両方ともＣと対形成し得るが、異なる対形成タイプの汎用ヌクレオチドである。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「特異的ヌクレオチド」は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖中に取り込まれ得、そしてテンプレート鎖中の１つより多くの異なる対形成タイプのヌクレオチドと対形成しない（ここで、テンプレート鎖中のヌクレオチドは汎用ヌクレオチドではない）、伸長可能なヌクレオチドをいう。例えば、Ｃは、たとえそれが、ＧとＩとの両方と特異的に対形成するとしても特異的ヌクレオチドである。なぜなら、ＧとＩとは異なる対形成タイプのヌクレオチドではないからである。同様に、Ｃは、たとえそれがＧと汎用ヌクレオチドの両方と対形成するとしても、特異的ヌクレオチドである。特異的ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルであり得る。特異的ヌクレオチドはまた、テンプレート配列特異的様式で対形成するヌクレオチドアナログであり得る。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「汎用ヌクレオチド」は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖中に取り込まれ得、そして１つより多くの対形成タイプの特異的ヌクレオチドと対形成する伸長可能なヌクレオチドをいう。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、任意の特異的ヌクレオチドと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、４つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、３つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、２つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。汎用ヌクレオチドの２つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドとの対形成は、非テンプレート配列特異的対形成と称される。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、用語「汎用ヌクレオチド塩基」および「汎用塩基」は交換可能に用いられ、そして汎用ヌクレオチドの塩基部分をいう。この汎用ヌクレオチド塩基は、窒素原子を含み得るか、または含まなくてもよい芳香族環部分を含み得る。特定の実施形態では、汎用塩基は、ペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合し得、汎用ヌクレオチドを形成する。特定の実施形態では、汎用ヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。特定の実施形態では、汎用ヌクレオチド塩基は、疎水的スタッキングにより同じ核酸鎖上の隣接ヌクレオチド塩基と相互作用し得る。汎用ヌクレオチドは、限定されないで、２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イミジゾピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、２’−デオキシ−ピロールピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、または２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）を含む。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチドターミネーター」または「ターミネーター」は、プライマー伸長反応で次のヌクレオチドの取り込みを支持しない、酵素により取り込み可能なヌクレオチドをいう。それ故、ターミネーターは、伸長可能なヌクレオチドではない。特定の実施形態では、ターミネーターは、ヌクレオチドが、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、特異的ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり、そして、糖部分は、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）のように、さらなる合成をブロックする３’−置換基を含むペントースであるようなものである。特定の実施形態では、さらなる合成をブロックする置換基は、限定されないで、アミノ基、デオキシ基、ハロゲン基、アルコキシ基およびアリールオキシ基を含む。例示のターミネーターは、限定されないで、糖−リン酸エステル部分が３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシリボース−５’−トリホスフェートまたは２’、３’−ジデヒドロリボース−５’−トリホスフェートであるようなものを含む。特定の実施形態では、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰのような、ｄｄＮＴＰが鎖終了のために用いられ得る。
【００２７】
特定の実施形態では、ターミネーターは、ポリメラーゼによって、テンプレート中の特定のヌクレオチドに対向するプライマー伸長産物中に取り込まれる「特異的ターミネーター」である。特異的ターミネーターは、限定されないで、テンプレート中にアデニンまたはアデニンアナログに対向して取り込まれるｄｄＴＴＰを含むＴターミネーター；テンプレート中にチミン、ウラシル、またはチミンまたはウラシルのアナログに対向して取り込まれるｄｄＡＴＰを含む、Ａターミネーター；テンプレート中にグアニンまたはグアニンアナログに対向して取り込まれるｄｄＣＴＰを含むＣターミネーター；およびテンプレート中にシトシンまたはシトシンのアナログに対向して取り込まれるｄｄＧＴＰを含む、Ｇターミネーターを含む。
【００２８】
用語「標識」は、分子に付着され得、そして：（ｉ）検出可能な信号を提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第２の標識により提供される検出可能な信号を改変する（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動））；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、二重鎖形成を安定化する；または（ｉｖ）結合複合体またはアフィニティーセットのメンバーを提供する（例えば、親和性、抗体／抗原、イオン的複合体化、ハプテン／リガンド（例えば、ビオチン／アビジン））、任意の部分をいう。標識化は、既知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、および分析方法および精製方法を採用する多数の公知の技法を用いて達成され得る。標識は、限定されないで、検出可能な蛍光信号、化学発光信号、または生物発光信号を発生またはクエンチする光発出または光吸収化合物を含む（例えば、Ｋｒｉｃｋａ、Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｅｉｇｏ、３〜２８頁を参照のこと）。生体分子を標識するために有用な蛍光レボーター色素は、限定されないで、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；および同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；および同第６，１９１，２８７号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、ドナーおよびアクセプターの対を含むエネルギー移動蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照のこと）、およびシアニン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９を参照のこと）、ならびに検出可能な信号を生成し得る任意のその他の蛍光標識を含む。フルオレセイン色素の例は、限定されないで、６−カルボキシフルオロセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインを含む。標識もまた、限定されないで、半導体ナノクリスタル、または量子ドット（例えば、米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２Ｂ１号；Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３１〜６３５を参照のこと）を含む。
【００２９】
１つのクラスの標識は、二本鎖のハイブリダイゼーションを増大し、安定化し、または影響するために供されるハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、および架橋性官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｇ．およびＧａｉｔ、Ｍ．編「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１５〜８１頁を参照のこと）。なお別のクラスの標識は、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびその他のハプテンのように、特異的または非特異的捕獲により分子の分離または固定化を行う（例えば、Ａｎｄｒｕｓ、Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５） ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３９〜５４頁を参照のこと）。非放射活性標識方法、技法、および試薬は：Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒｍａｎ、Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに総説がある。
【００３０】
標識は、「検出可能に異なり得」、これは、それらが、少なくとも１つの検出方法により互いから区別可能であることを意味する。検出可能に異なる標識は、限定されないで、異なる波長の光を発する標識、異なる波長の光を吸収する標識、異なる蛍光減衰寿命を有する標識、異なるスペクトル特徴を有する標識、異なる放射活性減衰性質を有する標識、異なる電荷の標識、および異なるサイズの標識を含む。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「標識されたターミネーター」は、標識に物理的に連結されているターミネーターをいう。標識への連結は、ポリメラーゼによるポリヌクレオチド中へのターミネーターの取り込みを妨げないターミネーター上の部位（単数または複数）にある。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「標的核酸テンプレート」は、プライマー伸長反応のためのテンプレートとして供される核酸配列をいう。標的核酸テンプレートは、限定されないで、ミトコンドリアＤＮＡおよび核ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ＤＮＡ（ＢＡＣ）、およびその他の染色体外ＤＮＡ、およびプライマー伸長産物を含む。標的核酸テンプレートはまた、限定されないで、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなＲＮＡおよびＤＮＡ両方のアナログを含む。特定の実施形態では、標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドを含まない。
【００３３】
異なる標的核酸テンプレートは、一本鎖連続核酸の異なる部分であり得るか、または異なる核酸上に存在し得る。一本鎖連続核酸の異なる部分は重複し得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「プライマー」は、ポリメラーゼで触媒されるプライマー伸長反応において、少なくとも１つのヌクレオチドで伸長され得る遊離の３’−ＯＨ（またはその機能的等価物）を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。特定の実施形態では、プライマーは、汎用ヌクレオチドを含まない。特定の実施形態では、プライマーは、それらが、プライマー伸長反応が生じる環境中で目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするに十分長いという条件で、実質的に任意の長さであり得る。特定の実施形態では、プライマーは、長さが少なくとも１４ヌクレオチドである。プライマーは、特定の配列に特異的であり得るか、または、あるいは、例えば、配列のセットに特定的な、縮重であり得る。
【００３５】
用語「プライマー伸長」および「プライマー伸長反応」は交換可能に用いられ、そして、ポリメラーゼ、テンプレート、および１つ以上のヌクレオチドを用い、核酸プライマー、またはプライマー伸長産物に１つ以上のヌクレオチドを付加するプロセスをいう。特定の実施形態では、プライマー伸長反応は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。換言すれば、それは、各タイプの汎用ヌクレオチドの多くの分子を含み得るけれども、少なくとも１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長反応は、それは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドの多くの分子を含み得るが、そのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。
【００３６】
「プライマー伸長産物」は、１つ以上のヌクレオチドが、プライマー伸長反応においてプライマーに付加されたとき生成される。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つ以上の汎用ヌクレオチドが続く特異的ヌクレオチドの５’配列から構成される。特定の実施形態では、この特異的ヌクレオチドの５’配列は、長さが少なくとも１４ヌクレオチドである。プライマー伸長産物は、次の伸長反応における標的核酸テンプレートとして供され得る。プライマー伸長産物は、ターミネーターを含み得る。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は交換可能に用いられ、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味し、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合リンケージ、またはヌクレオチド間アナログ、および会合する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）により連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチド、完全にリポヌクレオチド、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。ヌクレオチドモノマー単位は、本明細書に記載の任意のヌクレオチドを含み得、限定されないで、特異的ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および汎用ヌクレオチドを含む。代表的には、ポリヌクレオチドは、少数のモノマー単位、例えば、それらがしばしばオリゴヌクレオチドと当該技術分野で称されるときの５〜４０から、数千のモノマーヌクレオチド単位までの範囲である。他であることが示されなければ、ポリヌクレオチド配列が提示されるときはいつも、他であることが注記されなければ、ヌクレオチドは左から右に５’から３’の順序であり、そして「Ａ」は、デオキシアデノシンまたはそのアナログを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンまたはそのアナログを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンまたはそのアナログを示し、および「Ｔ」は、チミジンまたはそのアナログを示すことが理解される。
【００３８】
ポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合のように、単一のタイプの糖部分から、またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合のように、異なる糖部分の混合物から構成され得る。特定の実施形態では、核酸は、以下の構造式による、リボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドである：
【００３９】
【化３】
ここで、各Ｂは、独立して、例えば、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、特異的ヌクレオチド、汎用ヌクレオチドであるヌクレオチドの塩基部分であり；各ｍは、個々の核酸の長さを規定し、そしてゼロから数千、数万、またはそれ以上の範囲であり得；各Ｒは、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、−Ｒ’’、−ＯＲ’’、および−ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここで、各Ｒ’’は、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ５−Ｃ１４）アリールであるか、または２つの隣接するＲが一緒になって、リボース糖が２’，３’−ジデヒドロリボースであるような結合を形成し、そして各Ｒ’は、独立して、ヒドロキシルまたは
【００４０】
【化４】
であり得、ここでαはゼロ、１または２である。
【００４１】
上記に図示した、リボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドの特定の実施形態では、ヌクレオチド塩基Ｂは、先に記載のように、糖部分のＣ１’炭素に共有結合している。
【００４２】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」はまた、核酸アナログ、ポリヌクレオチドアナログ、およびオリゴヌクレオチドアナログを含み得る。本明細書で用いられる用語「核酸アナログ」、「ポリヌクレオチドアナログ」、および「オリゴヌクレオチドアナログ」は交換可能に用いられ、少なくとも１つのヌクレオチドアナログおよび／または少なくとも１つのリン酸エステルアナログおよび／または少なくとも１つのペントース糖アナログを含むポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドアナログの定義内にまた、リン酸ジエステル結合および／または糖リン酸エステル結合が、他のタイプの結合、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよびその他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００；ＷＯ９２／２０７０２；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）；モルホリノ（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号を参照のこと）；カルバメート（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ＆Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、１９８７、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）；３’−チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）；スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）；２−アミノエチルグリシン、通常、ＰＮＡと称される（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ、ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００を参照のこと）；およびその他（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；Ｆｒｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎ、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９およびその中で引用されている文献を参照のこと）で置換されたポリヌクレオチドが含まれる。リン酸エステルアナログは、限定されないで、（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート、例えば、メチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホルアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートを含む。
【００４３】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は交換可能に用いられ、そして、二重鎖、三重鎖、またはその他のより高いオーダーの構造の形成を生じる、１つの核酸の別の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。汎用ヌクレオチドが含まれないとき、特定の実施形態では、主な相互作用は、Ｗａｔｓｏｎ／ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎタイプの水素結合による、塩基特異的、例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃである。塩基スタッキング、および疎水性相互作用もまた、二重鎖安定性に寄与し得る。
【００４４】
本明細書で用いる用語「改変体」は、タンパク質の任意の改変をいい、制限されずに、アミノ酸配列における変化、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の欠失、およびアミノ酸それ自身に対する改変を含む。特定の実施形態では、これらの変化は、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、例えば、類似の疎水性、親水性、電荷、または芳香族性を有する他で置換することを含み得る。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、類似のヒドロパシー指数を基礎になされ得る。ヒドロパシー指数は、アミノ酸の疎水性および電荷特徴を考慮し、そして、特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換を選択するための指針して用いられ得る。このヒドロパシー指数は、例えば、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３１（１９８２）中で論議されている。保存的アミノ酸置換は、任意の前記の特徴を基になされ得ることが理解される。
【００４５】
アミノ酸に対する改変は、限定されないで、グリコシル化、メチル化、リン酸化、ビオチン化、およびアミノ酸配列における変化を生じないタンパク質への任意の共有結合的および非共有結合的付加を含む。本明細書で用いられる「アミノ酸」は、ポリペプチドまたはタンパク質中に酵素的または合成によるいずれかで取り込まれ得る、天然または非天然である任意のアミノ酸をいう。
【００４６】
本明細書で用いられる「移動度依存性分析技術」または「ＭＤＡＴ」は、異なる分析物タイプ間の異なる移動速度に基づく分析技法を意味する。例示の移動度依存性分析技法は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量スペクトル分析、沈降（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー分画法、多段抽出技法などを含む。
【００４７】
本明細書で用いられる「アフィニティーセット」は、互いに特異的に結合する分子のセットである。アフィニティーセットは、限定されないで、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、レセプターおよびリガンド、抗体およびリガンド、抗体および抗原、およびポリヌクレオチド配列およびその相補物を含む。アフィニティーセットの１つ以上のメンバーは、固体支持体に結合され得る。例示の固体支持体は、限定されないで、アガロース、セファロース、磁気ビーズ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、メンブレン、シリカ、半導体材料、シリコン、および有機ポリマーを含む。
【００４８】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーションを基礎にしたプルアウト」または「ＨＢＰ」は、上記アフィニティーセットがポリヌクレオチド配列およびその相補物である１つのタイプの親和性分離である。ＨＢＰは、ヌクレオチド配列が固体支持体に結合または固定化され、そしてその相補的配列を選択的に吸着するために用いられるプロセスである（例えば、１９９７年６月１２日に出願されたＯ’Ｎｅｉｌｌらによる米国特許出願第０８／８７３，４３７号を参照のこと）。
【００４９】
（本発明の特定の例示の実施形態）
本発明は、プライマー伸長産物を生成および分析するための方法およびキットに関する。このようなプライマー伸長産物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を、プライマー伸長を行うために適した適切な条件下でインキュベートすることにより生成される。特定の実施形態によれば、この反応組成物は、少なくとも１つのターミネーター、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を用いて核酸を配列決定するための方法およびキットを提供する。
【００５０】
（例示の成分）
本発明の特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡ中に効率的に詰め（ｐａｃｋ）得る、非天然の、優勢的に疎水性の塩基を含む（例えば、Ｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２０００）３９：２９４０〜４２；Ｗｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：７６２１〜３２；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０００）２８：２９１１〜１４、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９８）１７：５４１〜５５４、Ｏｇａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：３２７４〜８７を参照のこと）。特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、ＤＮＡ中に見出される天然塩基の２つ以上と対形成し得る。本発明の特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、天然の塩基対の特異的水素結合相互作用を欠如し得、そしてそれ故、立体的および疎水的相互作用により、ＤＮＡ鎖中の２つ以上の塩基を置換し得る。
【００５１】
本発明の特定の実施形態によれば、上記汎用ヌクレオチドは、限定されないで、２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イミジゾピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、２’−デオキシ−ピロールピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）、または２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）を含む。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより、特定のヌクレオチドが取り込まれる速度にほぼ等しい速度で利用される。
【００５２】
本発明の特定の実施形態は、汎用ヌクレオチドとともに使用するために最適化されたポリメラーゼを使用する。特定の実施形態に従って、ポリメラーゼを最適化する方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：部位特異的変異誘発、非特異的変異誘発、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の置換、および翻訳後の改変（タンパク質分解、炭水化物基またはホスフェートの欠失、および炭水化物基またはホスフェートの付加を含むが、これらに限定されない）。従って、ポリメラーゼとしては、天然に存在するポリメラーゼおよび改変ポリメラーゼまたは改変体ポリメラーゼ（汎用ヌクレオチドの最適な組み込みのために改変されたポリメラーゼを含む）が挙げられる。
【００５３】
特定の実施形態に従って、ポリメラーゼは、特異的ヌクレオチドが同じポリメラーゼによって組み込まれる速度の少なくとも１０％の速度である速度で、プライマー伸長産物中に、汎用ヌクレオチドを組み込む。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが同じポリメラーゼによって組み込まれる速度の少なくとも２５％の速度である速度で、ポリメラーゼによって組み込まれる。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度の少なくとも５０％の速度である速度で、組み込まれる。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度の少なくとも７５％の速度である速度で、組み込まれる。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度に等しいかまたは実質的に等しい速度で、汎用ヌクレオチドをプライマー伸長産物に組み込む。特定の実施形態に従って、ポリメラーゼは、早すぎる鎖の停止を減少させるのに十分な速度で汎用ヌクレオチドを組み込む。
【００５４】
本発明において使用するためのポリメラーゼは、熱安定であってもなくても良い。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、ヌクレオチドトリホスフェートと比較して、３’−ジデオキシヌクレオチドである鎖ターミネーターの組み込みに対する識別を減少させる変異を有する。特定の実施形態において、位置６６７にＴｙｒ残基を有する変異体を使用し得る（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを基準として番号を付けられる）。このような変異体の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，６１４，３６５号に見出され得る。このような変異ポリメラーゼは、簡便に、Ｙ６６７変異体として総称的に呼ばれ得る。
【００５５】
特定の実施形態に従って、ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ、最小の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するかまたは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上記ポリメラーゼのいずれかの酵素活性改変体またはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態に従って、２つ以上のポリメラーゼの混合物が使用される。
【００５６】
（プライマー伸長）
特定の実施形態に従うプライマー伸長反応を使用して、標的核酸テンプレートの少なくとも一部の相補的なコピーを作製する。特異的なプライマー伸長反応において、標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つのポリメラーゼを含む伸長反応組成物を使用する。少なくとも１つのプライマーは、標的テンプレートにアニールする。ポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを、標的核酸テンプレートにアニールするプライマーの３’末端に酵素的に付加する場合、プライマー伸長産物が作製される。
【００５７】
プライマー伸長反応は、特異的ヌクレオチドおよび汎用ヌクレオチドの組み合わせを含み得るか、または排他的に汎用ヌクレオチドを含み得る。ポリメラーゼによってプライマーの３’末端（またはプライマーから伸長されるプライマー伸長産物の３’末端）に付加されるヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドであり得、その結果、これは、テンプレート配列特異的様式で付加され、そして、それに対向するテンプレートヌクレオチドと特異的に対を形成する。あるいは、ポリメラーゼによって付加されるヌクレオチドは、汎用ヌクレオチドであり得、これは、非テンプレート配列特異的様式で付加される。ポリメラーゼは、標的核酸テンプレートの末端に達するまで、あるいは標的核酸テンプレートの末端の前に、例えば、テンプレートを落とす（ｆａｌｌｉｎｇ ｏｆｆ）ことによってまたはターミネーター（存在する場合）の組み込みによって早すぎる停止を行うまで、ヌクレオチドを成長するプライマー伸長産物の３’末端に付加する。
【００５８】
プライマー伸長反応の結果は、プライマー伸長産物であり、これは、５’末端において、ポリメラーゼによって組み込まれたヌクレオチドのストリングに共有結合されたプライマーを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、排他的に１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得るか、または排他的に１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧと対を形成する汎用ヌクレオチドの１つのタイプを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、ＣおよびＧと対を形成する１つのタイプの汎用ヌクレオチド、ならびにＡおよびＴと対を形成する別のタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧと対を形成する２つの異なるタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、テンプレートのＣおよびＧと対を形成する汎用ヌクレオチド、ならびにテンプレートのＴおよびＡと対を形成する、特異的ヌクレオチドＡおよびＴをそれぞれ含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。例示的な場合において、ヌクレオチドのストリングは、２つのタイプの汎用ヌクレオチド（ＣおよびＧと対を形成するヌクレオチドおよびＧおよびＡと対を形成する他のヌクレオチド）ならびにテンプレートのＴと対を形成する特異的ヌクレオチドＡを含み得る。
【００５９】
特定の実施形態に従って、プライマー伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一部である。ＰＣＲの一般的な説明は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）；およびＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９５）に提供される。ＰＣＲにおいて、反応組成物は、少なくとも１つのテンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、および伸長可能なヌクレオチドを含む。少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、反応組成物に含まれる。反応組成物は、標的テンプレートの少なくとも一部に相補的なプライマー伸長産物を生成するプライマー伸長反応、テンプレートからのプライマー伸長反応産物の分離、テンプレートの少なくとも一部および／またはプライマー伸長産物への新たなプライマーのアニーリング、ならびにテンプレートの少なくとも一部に相補的であり、そして／または先に産生されたプライマー伸長産物の少なくとも一部に相補的であるプライマー伸長産物を産生する引き続くプライマー伸長反応を生じる、温度変化のサイクルに供される。
【００６０】
特定の実施形態において、反応組成物は、１つ以上の「プライマーセット」を含み、これは、同じ２本鎖テンプレートの対向する鎖にアニールする順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。順方向プライマーは、テンプレートの一本の鎖にアニールし、そして逆方向プライマーは、テンプレートの他の鎖にアニールし、その結果、順方向プライマーからのプライマー伸長産物は、逆方向プライマーからプライマー伸長産物の少なくとも一部に相補的である配列を含む。引き続くプライマー伸長反応において、順方向プライマーは、逆方向プライマーからのプライマー伸長産物にアニールし得、そして逆方向プライマーは、順方向プライマーからのプライマー伸長産物にアニールし得る。
【００６１】
本発明に従う非対称ＰＣＲ（Ａ−ＰＣＲ）は、増幅反応組成物を含み、ここで、（ｉ）少なくとも１つのプライマーセットは、順方向プライマーのみまたは逆方向プライマーのみを含むか；（ｉｉ）過剰の１つのプライマー（プライマーセットの他のプライマーと比較して）が存在するか；または（ｉｉｉ）第１のプライマーのＴｍ５０が、第２のプライマーのＴｍ５０とは少なくとも６〜８℃異なる少なくとも１つのプライマーセットが存在する。特定の実施形態において、第１のプライマーのＴｍ５０は、第２のプライマーＴｍ５０と少なくとも１０〜１２℃異なる。結果として、プライマー伸長反応の後に、テンプレートの１つの鎖の少なくとも一部に相補的な過剰な産物が、テンプレートの他の鎖の少なくとも一部に相補的である産物に対して作製される。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、非対称ＰＣＲ反応組成物は、少なくとも１つの順方向プライマー、または少なくとも１つの逆方向プライマーを有するが、代表的には両方を有さない少なくとも１つのプライマーセットを含む。このような実施形態において、プライマー伸長反応は、代表的に、テンプレートの１つの鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー伸長産物を産生するが、他の鎖の少なくとも一部に相補的な産物を産生しない。プライマー伸長反応の各々の引き続く回において、新規なプライマーは、プライマー伸長産物を産生するためにテンプレートにアニールする。特定の実施形態において、プライマー伸長産物ではなく、テンプレートのみが、非対称ＰＣＲの各々引き続く回において増幅される。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、非同期性（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）ＰＣＲの方法を提供する。（例えば、２００１年６月５日に出願された、米国特許出願第０９／８７５，２１１号を参照のこと）。
【００６４】
特定の実施形態において、標的配列の各々に特異的な１つ以上のプライマーの複数のセットを同時に使用して、複数の標的配列を増幅し得、これは、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲと呼ばれ得る。（例えば、Ｈ．Ｇｅａｄａら、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．１０８：３１−３７（２０００）およびＤ．Ｇ．Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７−８２（１９９８）を参照のこと）。
【００６５】
マイクロサテライト（ＳＴＲおよびＶＮＴＲを含む）は、繰り返された配列のタンデムなアレイを含むゲノムの領域である。繰り返しの数は、個々に変化し得るか、疾患に対するマーカーであり得、従って、これらの領域は、診断目的のために使用され得る。繰り返された配列は、２〜約８０ヌクレオチドの長さであり得、そして繰り返しの数は、数百の範囲である。マイクロサテライト（ＳＴＲを含む）の分析は、代表的に、繰り返しの数の正確な決定を必要とし、そして２つの標的核酸テンプレート間の繰り返しの数の差は、１つまたは２つほどであり得る。
【００６６】
特定の実施形態において、ＳＴＲは、繰り返し領域に隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを使用して繰り返し領域を最初に増幅することによって分析される。次いで、増幅されたプライマー伸長産物は、サイズに基づいて分離される。産物のサイズを分析することによって、分析されるＳＴＲの繰り返しの数を決定し得る。特定の実施形態において、各々異なるＳＴＲ領域について異なって標識されたプライマーを使用することによって、同じ反応組成物における１つより多くのＳＴＲ領域を分析し得る。
【００６７】
特定の実施形態において、反応組成物は、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマーセット、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。特定の実施形態において、各々のプライマーセットの少なくとも１つのプライマーは、標識を含む。特定の実施形態において、異なるテンプレートに対する異なるプライマーは、異なる標識を有する。
【００６８】
プライマー伸長反応において、ポリメラーゼは、プライマーまたはプライマー伸長産物の３’末端にヌクレオチドを付加する。特定の実施形態において、特異的ヌクレオチドは、テンプレートの配列に従って、プライマー伸長産物の３’末端に付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的に付加される。特定の実施形態において、得られるプライマー伸長産物は、その５’末端に、ポリメラーゼによって組み込まれたヌクレオチドのストリングに共有結合されたプライマー配列を含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、排他的に１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得るか、または排他的に１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得るか、または１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。
【００６９】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、移動度依存性分析技術（またはＭＤＡＴ）によって分離され得る。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、分子量、長さ、配列、および／または電荷に基づいて分離され得る。混合物中の２つ以上の核酸配列が、例えば、移動度、長さ、分子量、配列および／または電荷に基づいて識別され得る任意の方法は、本発明の範囲内である。例示的なＭＤＡＴ技術としては、限定しないが、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）、ＨＰＬＣ、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）、およびゲル濾過が挙げられる。特定の実施形態において、ＭＤＡＴは、電気泳動またはクロマトグラフィーである。
【００７０】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物に結合される標識の同一性は、プライマーの同一性と相関し、従って、アニールするテンプレートの同一性と相関し、従って、分析される領域の同一性と相関する。また、プライマー伸長産物を分離することによって、所定のＳＴＲにおける繰り返しの数を決定し得る。この方法において、いくつかの異なるプライマーセットおよび標的核酸テンプレートのプライマー伸長産物は、単一のプライマー伸長反応において比較され得る。
【００７１】
種々の実施形態において、異なる数の対形成タイプの特異的ヌクレオチドが、使用され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、４つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、３つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、１つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。
【００７２】
特定のこのような実施形態において、ポリメラーゼは、特定の伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを、プライマー伸長産物に組み込む。現在の少なくともいくつかの特定の実施形態において、特異的ヌクレオチドよりも少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、テンプレート配列における１つ以上の特異的ヌクレオチドに対向するポリメラーゼによって組み込まれる。
【００７３】
特定の実施形態において、反応組成物は、特異的な伸長可能なヌクレオチドを含まず、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、テンプレートの特異的ヌクレオチドの全てに対向するプライマー伸長産物中に、ポリメラーゼによって組み込まれる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、ＳＴＲは、非対称ＰＣＲによって分析される。本発明の特定の実施形態において、反応組成物は、１つ以上のプライマーセット（その各々が、順方向プライマーのみまたは逆方向プライマーのみを含む）を含む。特定の実施形態において、各々の異なるプライマーが、異なる標識を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマーセットに対するプライマー伸長反応は、テンプレートの１つの鎖のみに相補的であるプライマー伸長産物を生じる。
【００７５】
本発明の特定の実施形態において、プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーであり、そして分析のためのポリヌクレオチド分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。特定の実施形態において、プライマーおよびテンプレートのアニーリング、または二重鎖形成は、ハイブリダイゼーションによって行われ得る。プライマー／テンプレート二重鎖は、ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を有意に妨害せず、プライマーの３’末端ヌクレオチド塩基が標的核酸テンプレートの所定の位置のすぐ隣にハイブリダイズする能力を有意に妨害しない、１つ以上のミスマッチを含み得る。
【００７６】
特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下で増幅される前に、処理される。特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、ＳＴＲおよびＳＴＲの一端または両端における一定の長さの隣接領域を含む核酸を作製するように処理される。特定の実施形態において、このように処理された核酸は、引き続く伸長反応において標的核酸テンプレートとして使用されて、ＳＴＲの両端に一定の長さの隣接領域を有し、ＳＴＲ内のヌクレオチドの数によって長さの異なる伸長産物を作製する。
【００７７】
特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、特異的ヌクレオチドを含み、汎用ヌクレオチドを含まない第１反応組成物で、ＰＣＲの初期サイクルに供することによって、処理される。次いで、得られる第１プライマー伸長産物を、汎用ヌクレオチドの存在下で増幅する。特定の実施形態において、ＰＣＲの１つ以上の初期サイクルが、特異的ヌクレオチド、ならびに各ＳＴＲ領域に隣接する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を含むが、汎用ヌクレオチドを含まない第１反応組成物を用いて実施される。このような初期サイクルは、所定の長さの隣接領域およびＳＴＲ領域を含む種々の第１プライマー伸長産物を産生する。特定の実施形態において、このような第１プライマー伸長産物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーを含む第２反応組成物を用いるＰＣＲの引き続くサイクルのための標的核酸テンプレートとして役立つ。このような引き続くサイクルおよびＳＴＲを検出するための方法の残り（第２の反応産物の分離および検出を含む）は、上記のように実施され得る。
【００７８】
特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートの大部分または全ては、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を用いるＰＣＲの引き続くサイクルの前に、除去され、そして第１のプライマー伸長産物は、このような引き続くサイクルのＰＣＲにおけるテンプレートとして役立つ。特定の実施形態において、初期核酸テンプレートは、アフィニティーセットの第１メンバーを用いて改変される。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドを含まないＰＣＲの初期サイクルの前、その間、またはその後にアフィニティーセットの第２メンバーに結合する。特定の実施形態において、アフィニティーセットの第２メンバーは、固体支持体に結合されて、その結果、初期標的核酸テンプレートの大部分または全てが、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを用いるＰＣＲの引き続くサイクルの前に、反応組成物から分離され得る。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートの大部分または全てが、ハイブリダイゼーションベースのプルアウト（ＨＢＰ）を用いて除去される。
【００７９】
特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下での増幅の前に、制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によって処理される。特定の実施形態において、１つ以上の初期標的核酸テンプレートは、１つ以上のＳＴＲ領域を含む。この初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下でのＰＣＲによるＳＴＲ領域の増幅の前に、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、ＳＴＲの一方の末端または両方の末端に一定の長さの隣接領域を有する標的核酸テンプレートを得るために増幅される各々のＳＴＲ領域に隣接する一方の領域または両方の領域で消化される。次いで、このように消化された標的核酸テンプレートは、ＳＴＲの両端に一定の長さの隣接領域を有するプライマー伸長産物を得るために、伸長反応において使用され得る。ＳＴＲを検出するための方法の残り（プライマー伸長産物の分離および検出を含む）は、上記のように実施され得る。
【００８０】
マイクロサテライトの分析は、ＭＤＡＴ（例えば、電気泳動、質量分析、またはクロマトグラフィー）の間に存在する、増幅された産物の異常な移動度をもたらし得る２次構造が存在する場合、困難であり得る。特定の実施形態に従って、プライマー伸長反応における１つ以上の伸長可能なヌクレオチドを、１つ以上の汎用ヌクレオチドに置き換えることによって、分離の間の２次構造の形成は、減少し得る。特定の実施形態に従って、ゲノム内のマイクロサテライト領域より長い繰り返し領域を、例えば、ＰＣＲ反応の一部として、プライマー伸長反応における汎用ヌクレオチドを使用して分析し得る。ＳＴＲおよびこれを分析する方法は、例えば、米国特許第５，３６４，７５９号、同第５，０７５，２１７号、同第６，０９０，５５８号および同第６，２２１，５９８号に記載され、これらは、本明細書中において任意の目的について参考として援用される。
【００８１】
核酸の配列は、例えば、Ｓａｎｇｅｒの方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ７４：５４６３−５４６７（１９７７）を参照のこと）によって、プライマー伸長産物の作製によって決定し得る。特定の実施形態に従って、本発明は、反応組成物中で汎用ヌクレオチドを使用して核酸を配列決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、二重鎖（２本鎖ポリヌクレオチド）は、標的核酸テンプレートとプライマーとの間に形成される。プライマーは、標的核酸テンプレートの所定の位置にハイブリダイズする。特定の実施形態において、１つ以上の伸長可能なヌクレオチド（少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の特異的ターミネーターを含む）は、プライマーとともに反応組成物に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。
【００８２】
反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、プライマーの３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。存在する場合、特異的ヌクレオチドは、テンプレート配列特異的様式でポリメラーゼによって付加されるが、一方、汎用ヌクレオチドは、非テンプレート配列特異的様式で付加される。特異的ターミネーターは、プライマー伸長産物内に組み込まれ得、そして一旦組み込まれると、ポリメラーゼによるプライマー伸長産物の３’末端へのヌクレオチドのさらなる組み込みを妨げる。次いで、プライマー伸長反応によって作製されたプライマー伸長産物は、サイズに基づいて分離され得、そして核酸テンプレートの配列は、産物の特定のサイズおよび各産物における特異的ターミネーターの同一性から決定され得る。
【００８３】
特定の実施形態において、反応組成物は、４つの異なる特異的ターミネーター（例えば、Ａターミネーター、Ｔターミネーター、Ｇターミネーター、およびＣターミネーター）を含み、これらの各々は、異なる標識に結合される。従って、生成されるプライマー伸長産物の各々は、３’末端に４つの特異的ターミネーターのうちの１つを含み、そしてこのターミネーターの同一性は、標識の同一性と相関する。さらに、ターミネーターに対向するテンプレート鎖上のヌクレオチドの同一性は、ターミネーターの同一性（従って、標識の同一性）によって決定され得る。例えば、プライマー伸長産物がその３’末端にＣターミネーターを有する場合、テンプレートは、ターミネーターに対向するＧを含む。プライマー伸長産物の長さは、テンプレート配列において、Ｇが配置される場所を決定する。
【００８４】
少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを使用する特定の実施形態において、反応組成物中のプライマーは、さらに、標識を含み、そしてターミネーターは、標識されない。特定の実施形態において、４つの異なる反応組成物の各々は、テンプレート上の同じ位置にアニールするプライマーを含むが、異なる反応組成物の各々のプライマーは、異なる標識を含む。プライマーは、標的核酸テンプレート上の所定の位置にハイブリダイズする。
【００８５】
特定の実施形態において、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む１つ以上の伸長可能なヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の特異的ターミネーターは、反応組成物内に含まれる。特定の実施形態において、異なる非標識ターミネーターは、４つの反応組成物の各々に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、プライマーの３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。特異的ヌクレオチドは、存在する場合、テンプレート配列特異的様式でポリメラーゼによって付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的様式で付加される。
【００８６】
これらの実施形態の特定の実施形態において、各々のプライマー伸長反応は、それらの３’末端にターミネーターの１つのタイプのみを有するプライマー伸長産物を生成する。プライマーに結合される標識の同一性は、ターミネーターの同一性、従って、テンプレート上のターミネーターに対向するヌクレオチドの同一性に関連する。特定の実施形態において、４つの別々の反応からのプライマー伸長産物は、組み合わせられ得る。次いで、この産物は、ＭＤＡＴ（例えば、サイズに基づいて分離される）によって分析され得る。次いで、テンプレートの配列は、産物の特定のサイズおよび各々の産物のターミネーターの同一性から決定され得る。
【００８７】
特定の実施形態において、１つより多くのテンプレートが、同じ反応組成物内で配列決定され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの異なるテンプレートにアニールする２つの異なるプライマーを含み得、異なるプライマーの各々は、異なる標識を含む。特定の実施形態において、反応組成物は、さらに、４つの異なるテンプレートを含み得、各々が、異なる標識を含む。特定の実施形態において、１つ以上の伸長可能なヌクレオチド（少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む）および１つ以上のポリメラーゼがまた、反応組成物に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、各々のプライマーがアニールするテンプレート配列に従って、異なるプライマーの各々の３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。特異的ヌクレオチドは、存在する場合、テンプレート配列特異的な様式でポリメラーゼによって付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的な様式で付加される。
【００８８】
従って、プライマー伸長反応は、各々が、伸長されたプライマーを同定する標識、および３’末端においてターミネーターを同定する別の標識を有する、プライマー伸長産物を生成する。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、分離され得る。テンプレートの配列は、産物の特定のサイズ、プライマーの同一性、および各々の産物のターミネーターの同一性から決定され得る。従って、２つのテンプレートの各々の配列は、同時に決定され得る。
【００８９】
特定の実施形態において、反応組成物は、異なるテンプレートにアニールする２つより多くの異なるプライマー（各々が異なる標識を含む）を含み得る。特定の実施形態において、反応組成物は、異なる標識のプライマーおよび４つの異なるターミネーター（各々が、異なる標識を含む）を含む。特定の実施形態において、反応は、２つの異なるプライマーについて実質的に上記されるように実施される。
【００９０】
特定の実施形態において、反応組成物は、１つのタイプの非標識ターミネーターおよび２つ以上の異なる標識プライマー（２つ以上の異なるテンプレートに特異的である）を含み得る。特定の実施形態において、４つの異なる反応組成物は、各々、異なる標識されないターミネーターおよび２つ以上の異なって標識されたプライマーを含む。特定の実施形態において、次いで、各々の反応組成物は、プライマー伸長反応に供される。次いで、各々の反応組成物の伸長産物が分離される。標識は、どのテンプレートが伸長産物に相関するかを示す。末端ヌクレオチドの同一性、従って、それに対向するテンプレートヌクレオチドの同一性は、プライマー伸長産物が生成された反応組成物に基づいて決定され得る。産物の長さは、ヌクレオチドがテンプレート内に含まれる場所を示す。
【００９１】
種々の実施形態において、異なる数の対形成タイプの特異的ヌクレオチドが、使用され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、４つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、３つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、１つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。
【００９２】
特定のこのような実施形態において、ポリメラーゼは、特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを、プライマー伸長産物に組み込む。特定の実施形態において、少なくともある時点で、特異的ヌクレオチドよりも、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって、テンプレート配列中の１つ以上の特異的ヌクレオチドに対向して組み込まれる。
【００９３】
特定の実施形態において、反応組成物は、特異的に伸長可能なヌクレオチドを含まず、そして少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。この少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、テンプレート中の特異的ヌクレオチドの全てに対向して、プライマー伸長産物中にポリメラーゼによって組み込まれる。
【００９４】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、移動度依存性分析技術（またはＭＤＡＴ）によって分離され得る。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、分子量、長さ、配列、および／または電荷に基づいて分離され得る。混合物中の２つ以上の核酸配列が区別され得る任意の方法（例えば、移動度、長さ、分子量、配列、および／または電荷に基づく）は、本発明の範囲内である。例示的な分離技術としては、限定しないが、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）、ＨＰＬＣ、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）、およびゲル濾過が挙げられる。特定の実施形態において、ＭＤＡＴは、電気泳動またはクロマトグラフィーである。プライマー伸長産物を分離することによって、各々の産物のサイズおよびその３’末端におけるターミネーターの同一性に基づいて、テンプレート核酸の配列を決定し得る。
【００９５】
本発明の特定の実施形態において、プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーであり、そして分析のためのポリヌクレオチド分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。特定の実施形態において、プライマーおよびテンプレートのアニーリング、または二重鎖形成は、ハイブリダイゼーションによって行われ得る。プライマー／テンプレート二重鎖は、ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を有意に妨害しないか、またはプライマーの３’末端ヌクレオチド塩基が標的核酸テンプレートの所定の位置のすぐ隣にハイブリダイズする能力を有意に妨害しない、１つ以上のミスマッチを含み得る。
【００９６】
特定の実施形態において、この方法は、サイクル配列決定を包含し、ここで、プライマー伸長反応および停止に続いて、プライマー伸長産物が、標的核酸テンプレートから放出され、そして新規なプライマーが、同じ様式でアニールされ、伸長され、そして停止される。サイクル配列決定によって、プライマー伸長産物の増幅が可能になる。特定の実施形態において、サイクル配列決定は、サーモサイクラー装置を使用して実施される。
【００９７】
特定の実施形態において、プライマーおよび／またはターミネーターは、標識される。特定の実施形態において、標識は、蛍光色素を含む。特定の実施形態において、反応物は、４つの異なるターミネーターを含み、各々が、異なる蛍光色素で標識される。特定の実施形態において、４つの反応組成物は、各々、異なる蛍光色素で標識されたプライマーを含む。特定の実施形態において、４つのプライマーは、同じ配列を有する。特定の実施形態において、１つの反応組成物は、１つより多くの異なるプライマーを含み、そして各異なるプライマーは、異なる蛍光色素で標識される。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、電気泳動、質量分光法、またはクロマトグラフィーによって分離される。
【００９８】
ＤＮＡ配列決定技術は、ＤＮＡの４つの特定の塩基間の違いから生じ得る変動性によって制限され得る。例えば、配列決定産物の分離の間、高いＧ−Ｃ含有量の領域において生じる２次構造から圧縮が生じ得る。これらの圧縮は、複数の産物を同じサイズで行動（ｒｕｎ）させ、電気泳動、質量分光法、またはクロマトグラフィー後に、重なるいくつかのプライマー伸長産物ピークを生じる。特定の実施形態において、本発明は、配列決定反応において１つ以上のｄＮＴＰを少なくとも１つの汎用ヌクレオチドに置き換えることによって、プライマー伸長産物における二次構造を減少させ得、これによって、圧縮を減少させる方法を提供する。
【００９９】
また、特定の実施形態に従う少なくとも１つの汎用ヌクレオチドの使用は、伸長反応における早すぎる鎖の停止を減少させ得る。早すぎる鎖の停止は、伸長産物におけるターミネーターの組み込み前の、伸長反応の停止である。
【０１００】
（キット）
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、この方法を実施するために使用される２つ以上の構成要素を集めることによって、目的の方法の実行を早めるために役立つ。特定の実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小にするために、予め測定された単位量で構成要素を含む。特定の実施形態において、キットは、本発明の１つ以上の方法を実施するための説明書を含む。特定の実施形態において、キットの構成要素は、互いに一緒に操作するために最適化されている。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定するために使用され得る。特定の実施形態において、標的核酸テンプレートを配列決定するためのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む。特定の実施形態において、標的核酸テンプレートを配列決定するためのキットは、さらなる構成要素（限定しないが、少なくとも１つのプライマーが挙げられる）を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも１つの特異的ターミネーターおよび／または少なくとも１つのプライマーは、さらに標識を含み得る。キットはまた、コントロール反応を実施するための試薬を含み得、これは、１つ以上の上記成分、および少なくとも１つの標的核酸テンプレートを含み得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明のキットは、複数のプライマー伸長産物を生成するために使用され得る。特定の実施形態において、キットは、ＳＴＲ分析のために使用され得る。特定の実施形態において、ＳＴＲ分析のためのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリメラーゼを含む。特定の実施形態において、ＳＴＲ分析のためのキットは、少なくとも１つのプライマーを含み得る。特定の実施形態において、この少なくとも１つのプライマーは、さらに標識を含み得る。ＳＴＲ分析のためのキットはまた、コントロール反応を実施するための試薬を含み得、これは、１つ以上の上記成分および少なくとも１つの標的核酸テンプレートを含み得る。
【０１０３】
本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示される本発明の詳細および実施を考慮することにより、当業者に明らかである。明細書および実施例は、単なる例示とみなされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１Ａは、テトラヌクレオチドプライマー（斜線付きの棒）を有する天然のヌクレオチド（例えば、Ａ（ｄＡＴＰ）、Ｔ（ｄＴＴＰ）、Ｇ（ｄＧＴＰ）、およびＣ（ｄＣＴＰ））の存在下で進行するプライマー伸長を概略的に図示する。各ヌクレオチドは、テンプレート配列依存性の様式で（例えば、ワトソン−クリック塩基対合（ここで、ＡはＴと対合し、そしてＧはＣと対合する）に基づいて）、プライマー伸長産物に付加する。図１Ｂに示される特定の例示的な実施形態において、汎用ヌクレオチド「Ｘ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、テンプレート配列非依存性の様式で、この汎用ヌクレオチドがプライマー伸長産物に取り込まれる。従って、汎用ヌクレオチド「Ｘ」は、このテンプレート中に存在する任意のヌクレオチドと対合し得る。図１Ｃに示される特定の例示的な実施形態において、仮定的汎用ヌクレオチド「Ｚ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、この汎用ヌクレオチドが、このテンプレートにおける特定のヌクレオチドに対向するが他のヌクレオチドには対向しない、プライマー伸長産物に取り込まれる。ここで、例えば、Ｚは、このテンプレートにおけるＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドと対合するが、Ｚは、ＡにもＴにも対合しない。従って、Ｚは、ＧおよびＣに関しては汎用ヌクレオチドであるが、ＡまたはＴに関しては汎用ヌクレオチドではない。図１Ｄに示される特定の例示的な実施形態において、仮定的汎用ヌクレオチド「Ｙ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、この汎用ヌクレオチドが、このテンプレートにおいてＡ、Ｔ、およびＣに対向するプライマー伸長産物に取り込まれるが、Ｇに対向するプライマー伸長産物には取り込まれない。
【図２】図２は、いくつかの非限定的な例示的な汎用ヌクレオチドの構造を示す。（Ａ）２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、（Ｂ）２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、（Ｃ）２’−デオキシ−ピロロピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、（Ｄ）２’−デオキシーイミダゾピリジンー５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、（Ｅ）２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、（Ｆ）２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、（Ｇ）２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、および（Ｈ）２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）。この図において使用される場合、「Ｒ」は、ヌクレオチドのデオキシリボース部分である。
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸合成間にポリヌクレオチド鎖に取り込まれ得る汎用ヌクレオチドに一般的に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
プライマー伸長反応は、現在の分子生物学において広く使用されている。例えば、サンガー配列決定において、オリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートの５’末端にアニールされ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、ポリメラーゼ、および４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターが反応組成物を形成するため加えられ（４つのターミネーターは、別個の反応または一つの反応に一緒に、どちらかで加えられる）、そして反応組成物は、プライマー伸長および終結が達成される適切な条件下でインキュベートされる。
【０００３】
可変性縦列反復配列数（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＶＮＴＲｓ）および短縦列反復（Ｓｈｏｒｔ Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＳＴＲｓ）を含むマイクロサテライトの解析は、プライマー伸長反応を利用する別の広く使用される方法である。ＳＴＲは、ゲノムの１つ以上の位置で直列に反復する２〜７個のヌクレオチド配列である。縦列反復の数は、個体間で変化する。特定の遺伝子解析技術のため、ＳＴＲｓは、反復領域に隣接する特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅され反復数が決定される。特定の技術において、その決定は、例えば電気泳動、質量分析、またはクロマトグラフィーによるサイズ区別を用いてなされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定する方法を提供する。そのような特定の実施形態は、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、ならびに標識を含む少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む反応組成物の形成を含む。反応組成物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するため、インキュベートされる。１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を使用して分離される。次に、１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は検出される。
【０００５】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートの配列決定方法は、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、標識を含む少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つの反応組成物の形成を含む。この反応組成物は、１つ以上の少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するため、インキュベートされる。１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を使用して分離される。次に、１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物は検出される。
【０００６】
特定の実施形態において、少なくとも１つの標的核酸テンプレートの配列決定方法は、少なくとも１つの標的核酸テンプレートから少なくとも１つのプライマー伸長産物を放出する工程ならびに少なくとも１回、インキュベートおよび放出を繰り返す工程をさらに含む。
【０００７】
本発明の特定の実施形態は、複数個のプライマー伸長産物の検出方法を提供する。特定の実施形態に従って、その方法は、少なくとも１つのテンプレート、標識を含む少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む、反応組成物の形成を含む。この反応組成物は、適切な条件下で、１つ以上の少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するためにインキュベートされる。プライマー伸長産物は、少なくとも１つの核酸テンプレートから放出され、インキュベーションおよび放出の手順は複数のプライマー伸長産物を生成するために繰り返される。１つ以上の複数のプライマー伸長産物は、ＭＤＡＴを用いて分離される。次に、１つ以上の複数のプライマー伸長産物は、検出される。
【０００８】
特定の実施形態に従って、複数の２次プライマー伸長産物の検出方法が提供される。特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つの核酸テンプレート、少なくとも１つの第１プライマー、少なくとも１つの特異的ヌクレオチド、および少なくとも１つの第１ポリメラーゼを含む第１反応組成物の形成を含み、ここではこの第１反応組成物は、汎用ヌクレオチドを含まない。第１反応組成物は、適切な条件下で、少なくとも１つの第１プライマー伸長産物を生成するためにインキュベートされる。少なくとも１つの第１プライマー伸長産物は、少なくとも１つの標的核酸テンプレートから放出され、インキュベーションおよび放出の手順は、複数の第１プライマー伸長産物の生成のために繰り返される。特定の実施形態において、この方法は、１つ以上の少なくとも１つの第１プライマー伸長産物、標識を含む少なくとも１つの第２プライマー、少なくとも１つの第２ポリメラーゼおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む第２反応組成物の形成をさらに含む。第２反応組成物は、適切な条件下で、少なくとも１つの第２プライマー伸長産物を生成するためにインキュベーションされる。少なくとも１つの第２プライマー伸長産物は、少なくとも１つの第１プライマー伸長産物から放出され、インキュベーションおよび放出の手順は複数の第２プライマー伸長産物を生成するために繰り返される。特定の実施形態において、その方法は、ＭＤＡＴを用いた１つ以上の複数の第２プライマー伸長産物の分離を含む。次に、１つ以上の複数の第２プライマー伸長産物は検出される。
【０００９】
特定の実施形態に従って、標的核酸テンプレートの配列決定のためのキットが提供される。特定の実施形態において、そのキットは、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つの特異的なターミネーターを含む。
【００１０】
特定の実施形態において、標的核酸テンプレートの短縦列反復の検出のためのキットが提供される。特定の実施形態において、そのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および標的核酸テンプレート内の短縦列反復に隣接した配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む。
【００１１】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
上記一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的であるのみであり、そして本発明を限定しないことが理解されるべきである。本願において、単数形の使用は、他に特にそうでないと言及されない限り、複数を包含する。本願において、「または（ｏｒ）」は、他に言及されない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および他の形態の使用（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）は、非限定的である。
【００１２】
本明細書中で使用される節の見出しは、系統立ての目的のみのためであり、そして記載される主題を限定するとは解釈されない。本願において引用される全ての文献、または文献の一部（特許、特許出願、記事、書籍および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、任意の目的でその全体が本明細書中に参考として明白に援用される。
【００１３】
（定義）
用語「ヌクレオチド塩基」とは、本明細書中において使用される場合、置換または非置換の芳香族環をいう。特定の実施形態において、この芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含む。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基と、ワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーンの水素結合を形成し得る。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、天然に存在するヌクレオチド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、ならびに天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号ならびにＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／３８５８４を参照のこと）、エテノアデニン、インドール（例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール）、およびピロール（例えば、ニトロピロール）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、汎用ヌクレオチド塩基である。特定の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３８５−３９４頁，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．およびそこに引用される参考文献において見出され得る。
【００１４】
用語「ヌクレオチド」とは、本明細書中において使用される場合、糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびピラノース、ならびにこれらの糖アナログ）のＣ−１’炭素に結合したヌクレオチド塩基を含む化合物をいう。用語ヌクレオチドはまた、ヌクレオチドアナログを包含する。糖は、置換または非置換であり得る。置換リボース糖としては、１つ以上の炭素原子（例えば、２’−炭素原子）が１つ以上の同じかまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基（ここで、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである）で置換されているリボースが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なリボースとしては、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース，２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、および２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル，４’−α−アノマーヌクレオチド，１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−および３’−４’−で連結しそして他の「ロックされた」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９８／２２４８９、同ＷＯ９８／３９３５２；および同ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。ポリヌクレオチドにおける例示的なＬＮＡ糖アナログとしては、以下の構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】
リボースの２’位置または３’位置における修飾として、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドとしては、天然のＤ光学異性体形態、およびＬ光学異性体形態が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０を参照のこと）。ヌクレオチド塩基がプリンである場合（例えば、ＡまたはＧ）、リボース糖が、このヌクレオチド塩基のＮ９位置に結合される。ヌクレオチド塩基がピリミジンである場合（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）、ペントース糖が、このヌクレオチド塩基のＮ１位置に結合される（プソイドウリジンを除く。プソイドウリジンにおいて、ペントース糖は、ウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位置に結合される）（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと）。
【００１７】
ヌクレオチドのペントース炭素の１つ以上は、以下の式：
【００１８】
【化２】
【００１９】
用語「ヌクレオチドアナログ」とは、本明細書中において使用される場合、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオチドの１つ以上のリン酸エステルが、そのそれぞれのアナログと置き換えられ得る実施形態をいう。特定の実施形態において、例示的なペントース糖アナログは、上記のものである。特定の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上記のようなヌクレオチド塩基アナログを有する。特定の実施形態において、例示的なリン酸エステルアナログとしては、アルカリホスホネート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどが挙げられるが、これらに限定されず、そして会合する対イオンを含み得る。
【００２０】
「ヌクレオチドアナログ」の定義にはまた、ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステルの骨格が、異なるタイプのヌクレオチド間結合で置き換えられている、ポリヌクレオチドアナログに重合し得るヌクレオチドアナログモノマーが含まれる。例示的なポリヌクレオチドアナログとしては、ポリヌクレオチドの糖リン酸骨格がペプチド骨格で置き換えられている、ペプチド核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
「伸長可能なヌクレオチド」とは、以下のヌクレオチドである：（ｉ）ポリヌクレオチド鎖の末端に酵素的にかまたは合成的に取り込まれ得るヌクレオチド、および（ｉｉ）さらなる酵素的または合成的な伸長を支持し得るヌクレオチド。伸長可能なヌクレオチドとしては、ポリヌクレオチド鎖に既に酵素的にかまたは合成的に取り込まれたヌクレオチド、ならびにさらなる酵素的または合成的な伸長を支持されているか、あるいはさらなる酵素的または合成的な伸長を支持し得るヌクレオチドが挙げられる。伸長可能なヌクレオチドとしては、ヌクレオチド５’−三リン酸（例えば、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ）、ポリヌクレオチドの化学合成に適切なホスホロアミダイト、ならびに酵素的にかもしくは化学的に既に取り込まれた、ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位が挙げられるが、これらに限定されない。伸長可能なヌクレオチドとしては、特異的ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および汎用ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定さない。
【００２２】
ヌクレオチドに関して本明細書で用いられる用語「タイプ」は、構造的に別個のヌクレオチドをいう。例えば、ＡとＧとは、異なるタイプのヌクレオチドである。同様に、ＧとＩとは、両者がＣと対形成し得るけれども、異なるタイプのヌクレオチドである。本明細書で用いられる、異なる「対形成タイプ」であるヌクレオチドは、両者が構造的に別個であり、そして異なる対形成特異性を有している。例えば、ＡとＧとは、異なる対形成タイプのヌクレオチドである。なぜなら、それらは構造的に別個であり、そしてそれらは異なる対形成特異性（Ｔ対Ｃ）を有しているからである。ＧとＩとは、互いに比較されるとき、異なる対形成タイプのヌクレオチドではない。なぜなら、構造的に別個であるが、それらは、両方ともＣと特異的に結合するからである。以下に規定されるような、汎用ヌクレオチドの対形成タイプはそれが対形成するヌクレオチドの組み合わせにより決定される。例えば、仮想の汎用ヌクレオチドＹが、Ａ、Ｃ、およびＴと対形成し、そして構造的にＹと異なる、仮想の汎用ヌクレオチドＸが、ＣおよびＧと対形成する。それゆえ、ＸとＹとは異なるタイプの汎用ヌクレオチドであり、そしてＸとＹとはまた、それらは両方ともＣと対形成し得るが、異なる対形成タイプの汎用ヌクレオチドである。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「特異的ヌクレオチド」は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖中に取り込まれ得、そしてテンプレート鎖中の１つより多くの異なる対形成タイプのヌクレオチドと対形成しない（ここで、テンプレート鎖中のヌクレオチドは汎用ヌクレオチドではない）、伸長可能なヌクレオチドをいう。例えば、Ｃは、たとえそれが、ＧとＩとの両方と特異的に対形成するとしても特異的ヌクレオチドである。なぜなら、ＧとＩとは異なる対形成タイプのヌクレオチドではないからである。同様に、Ｃは、たとえそれがＧと汎用ヌクレオチドの両方と対形成するとしても、特異的ヌクレオチドである。特異的ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミンまたはウラシルであり得る。特異的ヌクレオチドはまた、テンプレート配列特異的様式で対形成するヌクレオチドアナログであり得る。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「汎用ヌクレオチド」は、プライマー伸長反応の間にポリメラーゼによってポリヌクレオチド鎖中に取り込まれ得、そして１つより多くの対形成タイプの特異的ヌクレオチドと対形成する伸長可能なヌクレオチドをいう。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、任意の特異的ヌクレオチドと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、４つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、３つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、２つの対形成タイプの特異的ヌクレオチドまたはそれらのアナログと対形成する。汎用ヌクレオチドの２つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドとの対形成は、非テンプレート配列特異的対形成と称される。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、用語「汎用ヌクレオチド塩基」および「汎用塩基」は交換可能に用いられ、そして汎用ヌクレオチドの塩基部分をいう。この汎用ヌクレオチド塩基は、窒素原子を含み得るか、または含まなくてもよい芳香族環部分を含み得る。特定の実施形態では、汎用塩基は、ペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合し得、汎用ヌクレオチドを形成する。特定の実施形態では、汎用ヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。特定の実施形態では、汎用ヌクレオチド塩基は、疎水的スタッキングにより同じ核酸鎖上の隣接ヌクレオチド塩基と相互作用し得る。汎用ヌクレオチドは、限定されないで、２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イミジゾピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、２’−デオキシ−ピロールピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、または２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）を含む。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ヌクレオチドターミネーター」または「ターミネーター」は、プライマー伸長反応で次のヌクレオチドの取り込みを支持しない、酵素により取り込み可能なヌクレオチドをいう。それ故、ターミネーターは、伸長可能なヌクレオチドではない。特定の実施形態では、ターミネーターは、ヌクレオチドが、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、特異的ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであり、そして、糖部分は、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）のように、さらなる合成をブロックする３’−置換基を含むペントースであるようなものである。特定の実施形態では、さらなる合成をブロックする置換基は、限定されないで、アミノ基、デオキシ基、ハロゲン基、アルコキシ基およびアリールオキシ基を含む。例示のターミネーターは、限定されないで、糖−リン酸エステル部分が３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース−５−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’−トリホスフェート、２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシリボース−５’−トリホスフェートまたは２’、３’−ジデヒドロリボース−５’−トリホスフェートであるようなものを含む。特定の実施形態では、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰのような、ｄｄＮＴＰが鎖終了のために用いられ得る。
【００２７】
特定の実施形態では、ターミネーターは、ポリメラーゼによって、テンプレート中の特定のヌクレオチドに対向するプライマー伸長産物中に取り込まれる「特異的ターミネーター」である。特異的ターミネーターは、限定されないで、テンプレート中にアデニンまたはアデニンアナログに対向して取り込まれるｄｄＴＴＰを含むＴターミネーター；テンプレート中にチミン、ウラシル、またはチミンまたはウラシルのアナログに対向して取り込まれるｄｄＡＴＰを含む、Ａターミネーター；テンプレート中にグアニンまたはグアニンアナログに対向して取り込まれるｄｄＣＴＰを含むＣターミネーター；およびテンプレート中にシトシンまたはシトシンのアナログに対向して取り込まれるｄｄＧＴＰを含む、Ｇターミネーターを含む。
【００２８】
用語「標識」は、分子に付着され得、そして：（ｉ）検出可能な信号を提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第２の標識により提供される検出可能な信号を改変する（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動））；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、二重鎖形成を安定化する；または（ｉｖ）結合複合体またはアフィニティーセットのメンバーを提供する（例えば、親和性、抗体／抗原、イオン的複合体化、ハプテン／リガンド（例えば、ビオチン／アビジン））、任意の部分をいう。標識化は、既知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、および分析方法および精製方法を採用する多数の公知の技法を用いて達成され得る。標識は、限定されないで、検出可能な蛍光信号、化学発光信号、または生物発光信号を発生またはクエンチする光発出または光吸収化合物を含む（例えば、Ｋｒｉｃｋａ、Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｅｉｇｏ、３〜２８頁を参照のこと）。生体分子を標識するために有用な蛍光レボーター色素は、限定されないで、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号；同第６，００８，３７９号；および同第６，０２０，４８１号を参照のこと）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，８４７，１６２号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号；および同第６，１９１，２８７号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、ドナーおよびアクセプターの対を含むエネルギー移動蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照のこと）、およびシアニン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ、ＷＯ９７／４５５３９を参照のこと）、ならびに検出可能な信号を生成し得る任意のその他の蛍光標識を含む。フルオレセイン色素の例は、限定されないで、６−カルボキシフルオロセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインを含む。標識もまた、限定されないで、半導体ナノクリスタル、または量子ドット（例えば、米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２Ｂ１号；Ｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３１〜６３５を参照のこと）を含む。
【００２９】
１つのクラスの標識は、二本鎖のハイブリダイゼーションを増大し、安定化し、または影響するために供されるハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、および架橋性官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、Ｇ．およびＧａｉｔ、Ｍ．編「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１５〜８１頁を参照のこと）。なお別のクラスの標識は、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびその他のハプテンのように、特異的または非特異的捕獲により分子の分離または固定化を行う（例えば、Ａｎｄｒｕｓ、Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５） ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、３９〜５４頁を参照のこと）。非放射活性標識方法、技法、および試薬は：Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒｍａｎ、Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏに総説がある。
【００３０】
標識は、「検出可能に異なり得」、これは、それらが、少なくとも１つの検出方法により互いから区別可能であることを意味する。検出可能に異なる標識は、限定されないで、異なる波長の光を発する標識、異なる波長の光を吸収する標識、異なる蛍光減衰寿命を有する標識、異なるスペクトル特徴を有する標識、異なる放射活性減衰性質を有する標識、異なる電荷の標識、および異なるサイズの標識を含む。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「標識されたターミネーター」は、標識に物理的に連結されているターミネーターをいう。標識への連結は、ポリメラーゼによるポリヌクレオチド中へのターミネーターの取り込みを妨げないターミネーター上の部位（単数または複数）にある。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「標的核酸テンプレート」は、プライマー伸長反応のためのテンプレートとして供される核酸配列をいう。標的核酸テンプレートは、限定されないで、ミトコンドリアＤＮＡおよび核ＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ＤＮＡ（ＢＡＣ）、およびその他の染色体外ＤＮＡ、およびプライマー伸長産物を含む。標的核酸テンプレートはまた、限定されないで、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）のようなＲＮＡおよびＤＮＡ両方のアナログを含む。特定の実施形態では、標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドを含まない。
【００３３】
異なる標的核酸テンプレートは、一本鎖連続核酸の異なる部分であり得るか、または異なる核酸上に存在し得る。一本鎖連続核酸の異なる部分は重複し得る。
【００３４】
本明細書で用いられる「プライマー」は、ポリメラーゼで触媒されるプライマー伸長反応において、少なくとも１つのヌクレオチドで伸長され得る遊離の３’−ＯＨ（またはその機能的等価物）を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。特定の実施形態では、プライマーは、汎用ヌクレオチドを含まない。特定の実施形態では、プライマーは、それらが、プライマー伸長反応が生じる環境中で目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするに十分長いという条件で、実質的に任意の長さであり得る。特定の実施形態では、プライマーは、長さが少なくとも１４ヌクレオチドである。プライマーは、特定の配列に特異的であり得るか、または、あるいは、例えば、配列のセットに特定的な、縮重であり得る。
【００３５】
用語「プライマー伸長」および「プライマー伸長反応」は交換可能に用いられ、そして、ポリメラーゼ、テンプレート、および１つ以上のヌクレオチドを用い、核酸プライマー、またはプライマー伸長産物に１つ以上のヌクレオチドを付加するプロセスをいう。特定の実施形態では、プライマー伸長反応は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。換言すれば、それは、各タイプの汎用ヌクレオチドの多くの分子を含み得るけれども、少なくとも１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長反応は、それは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドの多くの分子を含み得るが、そのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。
【００３６】
「プライマー伸長産物」は、１つ以上のヌクレオチドが、プライマー伸長反応においてプライマーに付加されたとき生成される。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プライマー伸長産物は、１つ以上の汎用ヌクレオチドが続く特異的ヌクレオチドの５’配列から構成される。特定の実施形態では、この特異的ヌクレオチドの５’配列は、長さが少なくとも１４ヌクレオチドである。プライマー伸長産物は、次の伸長反応における標的核酸テンプレートとして供され得る。プライマー伸長産物は、ターミネーターを含み得る。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は交換可能に用いられ、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味し、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合リンケージ、またはヌクレオチド間アナログ、および会合する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）により連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチド、完全にリポヌクレオチド、またはそれらのキメラ混合物から構成され得る。ヌクレオチドモノマー単位は、本明細書に記載の任意のヌクレオチドを含み得、限定されないで、特異的ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および汎用ヌクレオチドを含む。代表的には、ポリヌクレオチドは、少数のモノマー単位、例えば、それらがしばしばオリゴヌクレオチドと当該技術分野で称されるときの５〜４０から、数千のモノマーヌクレオチド単位までの範囲である。他であることが示されなければ、ポリヌクレオチド配列が提示されるときはいつも、他であることが注記されなければ、ヌクレオチドは左から右に５’から３’の順序であり、そして「Ａ」は、デオキシアデノシンまたはそのアナログを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンまたはそのアナログを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンまたはそのアナログを示し、および「Ｔ」は、チミジンまたはそのアナログを示すことが理解される。
【００３８】
ポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合のように、単一のタイプの糖部分から、またはＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合のように、異なる糖部分の混合物から構成され得る。特定の実施形態では、核酸は、以下の構造式による、リボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドである：
【００３９】
【化３】
【００４０】
【化４】
【００４１】
上記に図示した、リボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドの特定の実施形態では、ヌクレオチド塩基Ｂは、先に記載のように、糖部分のＣ１’炭素に共有結合している。
【００４２】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」はまた、核酸アナログ、ポリヌクレオチドアナログ、およびオリゴヌクレオチドアナログを含み得る。本明細書で用いられる用語「核酸アナログ」、「ポリヌクレオチドアナログ」、および「オリゴヌクレオチドアナログ」は交換可能に用いられ、少なくとも１つのヌクレオチドアナログおよび／または少なくとも１つのリン酸エステルアナログおよび／または少なくとも１つのペントース糖アナログを含むポリヌクレオチドをいう。ポリヌクレオチドアナログの定義内にまた、リン酸ジエステル結合および／または糖リン酸エステル結合が、他のタイプの結合、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよびその他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００；ＷＯ９２／２０７０２；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）；モルホリノ（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号を参照のこと）；カルバメート（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ＆Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、１９８７、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）；３’−チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）；スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）；２−アミノエチルグリシン、通常、ＰＮＡと称される（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ、ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７〜１５００を参照のこと）；およびその他（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；Ｆｒｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎ、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９およびその中で引用されている文献を参照のこと）で置換されたポリヌクレオチドが含まれる。リン酸エステルアナログは、限定されないで、（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホネート、例えば、メチルホスホネート；（ｉｉ）ホスホルアミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエートを含む。
【００４３】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は交換可能に用いられ、そして、二重鎖、三重鎖、またはその他のより高いオーダーの構造の形成を生じる、１つの核酸の別の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。汎用ヌクレオチドが含まれないとき、特定の実施形態では、主な相互作用は、Ｗａｔｓｏｎ／ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎタイプの水素結合による、塩基特異的、例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃである。塩基スタッキング、および疎水性相互作用もまた、二重鎖安定性に寄与し得る。
【００４４】
本明細書で用いる用語「改変体」は、タンパク質の任意の改変をいい、制限されずに、アミノ酸配列における変化、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の欠失、およびアミノ酸それ自身に対する改変を含む。特定の実施形態では、これらの変化は、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、例えば、類似の疎水性、親水性、電荷、または芳香族性を有する他で置換することを含み得る。特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、類似のヒドロパシー指数を基礎になされ得る。ヒドロパシー指数は、アミノ酸の疎水性および電荷特徴を考慮し、そして、特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換を選択するための指針して用いられ得る。このヒドロパシー指数は、例えば、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３１（１９８２）中で論議されている。保存的アミノ酸置換は、任意の前記の特徴を基になされ得ることが理解される。
【００４５】
アミノ酸に対する改変は、限定されないで、グリコシル化、メチル化、リン酸化、ビオチン化、およびアミノ酸配列における変化を生じないタンパク質への任意の共有結合的および非共有結合的付加を含む。本明細書で用いられる「アミノ酸」は、ポリペプチドまたはタンパク質中に酵素的または合成によるいずれかで取り込まれ得る、天然または非天然である任意のアミノ酸をいう。
【００４６】
本明細書で用いられる「移動度依存性分析技術」または「ＭＤＡＴ」は、異なる分析物タイプ間の異なる移動速度に基づく分析技法を意味する。例示の移動度依存性分析技法は、電気泳動、クロマトグラフィー、質量スペクトル分析、沈降（例えば、勾配遠心分離）、フィールドフロー分画法、多段抽出技法などを含む。
【００４７】
本明細書で用いられる「アフィニティーセット」は、互いに特異的に結合する分子のセットである。アフィニティーセットは、限定されないで、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、レセプターおよびリガンド、抗体およびリガンド、抗体および抗原、およびポリヌクレオチド配列およびその相補物を含む。アフィニティーセットの１つ以上のメンバーは、固体支持体に結合され得る。例示の固体支持体は、限定されないで、アガロース、セファロース、磁気ビーズ、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、メンブレン、シリカ、半導体材料、シリコン、および有機ポリマーを含む。
【００４８】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーションを基礎にしたプルアウト」または「ＨＢＰ」は、上記アフィニティーセットがポリヌクレオチド配列およびその相補物である１つのタイプの親和性分離である。ＨＢＰは、ヌクレオチド配列が固体支持体に結合または固定化され、そしてその相補的配列を選択的に吸着するために用いられるプロセスである（例えば、１９９７年６月１２日に出願されたＯ’Ｎｅｉｌｌらによる米国特許出願第０８／８７３，４３７号を参照のこと）。
【００４９】
（本発明の特定の例示の実施形態）
本発明は、プライマー伸長産物を生成および分析するための方法およびキットに関する。このようなプライマー伸長産物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を、プライマー伸長を行うために適した適切な条件下でインキュベートすることにより生成される。特定の実施形態によれば、この反応組成物は、少なくとも１つのターミネーター、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を用いて核酸を配列決定するための方法およびキットを提供する。
【００５０】
（例示の成分）
本発明の特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、二重鎖ＤＮＡ中に効率的に詰め（ｐａｃｋ）得る、非天然の、優勢的に疎水性の塩基を含む（例えば、Ｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２０００）３９：２９４０〜４２；Ｗｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：７６２１〜３２；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０００）２８：２９１１〜１４、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９８）１７：５４１〜５５４、Ｏｇａｗａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：３２７４〜８７を参照のこと）。特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、ＤＮＡ中に見出される天然塩基の２つ以上と対形成し得る。本発明の特定の実施形態によれば、汎用ヌクレオチドは、天然の塩基対の特異的水素結合相互作用を欠如し得、そしてそれ故、立体的および疎水的相互作用により、ＤＮＡ鎖中の２つ以上の塩基を置換し得る。
【００５１】
本発明の特定の実施形態によれば、上記汎用ヌクレオチドは、限定されないで、２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イミジゾピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、２’−デオキシ−ピロールピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）、または２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）を含む。特定の実施形態では、この汎用ヌクレオチドは、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより、特定のヌクレオチドが取り込まれる速度にほぼ等しい速度で利用される。
【００５２】
本発明の特定の実施形態は、汎用ヌクレオチドとともに使用するために最適化されたポリメラーゼを使用する。特定の実施形態に従って、ポリメラーゼを最適化する方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：部位特異的変異誘発、非特異的変異誘発、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の置換、および翻訳後の改変（タンパク質分解、炭水化物基またはホスフェートの欠失、および炭水化物基またはホスフェートの付加を含むが、これらに限定されない）。従って、ポリメラーゼとしては、天然に存在するポリメラーゼおよび改変ポリメラーゼまたは改変体ポリメラーゼ（汎用ヌクレオチドの最適な組み込みのために改変されたポリメラーゼを含む）が挙げられる。
【００５３】
特定の実施形態に従って、ポリメラーゼは、特異的ヌクレオチドが同じポリメラーゼによって組み込まれる速度の少なくとも１０％の速度である速度で、プライマー伸長産物中に、汎用ヌクレオチドを組み込む。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが同じポリメラーゼによって組み込まれる速度の少なくとも２５％の速度である速度で、ポリメラーゼによって組み込まれる。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度の少なくとも５０％の速度である速度で、組み込まれる。特定の実施形態において、汎用ヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度の少なくとも７５％の速度である速度で、組み込まれる。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、特異的ヌクレオチドが組み込まれる速度に等しいかまたは実質的に等しい速度で、汎用ヌクレオチドをプライマー伸長産物に組み込む。特定の実施形態に従って、ポリメラーゼは、早すぎる鎖の停止を減少させるのに十分な速度で汎用ヌクレオチドを組み込む。
【００５４】
本発明において使用するためのポリメラーゼは、熱安定であってもなくても良い。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、ヌクレオチドトリホスフェートと比較して、３’−ジデオキシヌクレオチドである鎖ターミネーターの組み込みに対する識別を減少させる変異を有する。特定の実施形態において、位置６６７にＴｙｒ残基を有する変異体を使用し得る（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを基準として番号を付けられる）。このような変異体の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，６１４，３６５号に見出され得る。このような変異ポリメラーゼは、簡便に、Ｙ６６７変異体として総称的に呼ばれ得る。
【００５５】
特定の実施形態に従って、ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＦＳ、最小の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するかまたは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは上記ポリメラーゼのいずれかの酵素活性改変体またはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態に従って、２つ以上のポリメラーゼの混合物が使用される。
【００５６】
（プライマー伸長）
特定の実施形態に従うプライマー伸長反応を使用して、標的核酸テンプレートの少なくとも一部の相補的なコピーを作製する。特異的なプライマー伸長反応において、標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つのポリメラーゼを含む伸長反応組成物を使用する。少なくとも１つのプライマーは、標的テンプレートにアニールする。ポリメラーゼが、１つ以上のヌクレオチドを、標的核酸テンプレートにアニールするプライマーの３’末端に酵素的に付加する場合、プライマー伸長産物が作製される。
【００５７】
プライマー伸長反応は、特異的ヌクレオチドおよび汎用ヌクレオチドの組み合わせを含み得るか、または排他的に汎用ヌクレオチドを含み得る。ポリメラーゼによってプライマーの３’末端（またはプライマーから伸長されるプライマー伸長産物の３’末端）に付加されるヌクレオチドは、特異的ヌクレオチドであり得、その結果、これは、テンプレート配列特異的様式で付加され、そして、それに対向するテンプレートヌクレオチドと特異的に対を形成する。あるいは、ポリメラーゼによって付加されるヌクレオチドは、汎用ヌクレオチドであり得、これは、非テンプレート配列特異的様式で付加される。ポリメラーゼは、標的核酸テンプレートの末端に達するまで、あるいは標的核酸テンプレートの末端の前に、例えば、テンプレートを落とす（ｆａｌｌｉｎｇ ｏｆｆ）ことによってまたはターミネーター（存在する場合）の組み込みによって早すぎる停止を行うまで、ヌクレオチドを成長するプライマー伸長産物の３’末端に付加する。
【００５８】
プライマー伸長反応の結果は、プライマー伸長産物であり、これは、５’末端において、ポリメラーゼによって組み込まれたヌクレオチドのストリングに共有結合されたプライマーを含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、排他的に１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得るか、または排他的に１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧと対を形成する汎用ヌクレオチドの１つのタイプを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、ＣおよびＧと対を形成する１つのタイプの汎用ヌクレオチド、ならびにＡおよびＴと対を形成する別のタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧと対を形成する２つの異なるタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、テンプレートのＣおよびＧと対を形成する汎用ヌクレオチド、ならびにテンプレートのＴおよびＡと対を形成する、特異的ヌクレオチドＡおよびＴをそれぞれ含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。例示的な場合において、ヌクレオチドのストリングは、２つのタイプの汎用ヌクレオチド（ＣおよびＧと対を形成するヌクレオチドおよびＧおよびＡと対を形成する他のヌクレオチド）ならびにテンプレートのＴと対を形成する特異的ヌクレオチドＡを含み得る。
【００５９】
特定の実施形態に従って、プライマー伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一部である。ＰＣＲの一般的な説明は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）；およびＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９５）に提供される。ＰＣＲにおいて、反応組成物は、少なくとも１つのテンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、および伸長可能なヌクレオチドを含む。少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、反応組成物に含まれる。反応組成物は、標的テンプレートの少なくとも一部に相補的なプライマー伸長産物を生成するプライマー伸長反応、テンプレートからのプライマー伸長反応産物の分離、テンプレートの少なくとも一部および／またはプライマー伸長産物への新たなプライマーのアニーリング、ならびにテンプレートの少なくとも一部に相補的であり、そして／または先に産生されたプライマー伸長産物の少なくとも一部に相補的であるプライマー伸長産物を産生する引き続くプライマー伸長反応を生じる、温度変化のサイクルに供される。
【００６０】
特定の実施形態において、反応組成物は、１つ以上の「プライマーセット」を含み、これは、同じ２本鎖テンプレートの対向する鎖にアニールする順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。順方向プライマーは、テンプレートの一本の鎖にアニールし、そして逆方向プライマーは、テンプレートの他の鎖にアニールし、その結果、順方向プライマーからのプライマー伸長産物は、逆方向プライマーからプライマー伸長産物の少なくとも一部に相補的である配列を含む。引き続くプライマー伸長反応において、順方向プライマーは、逆方向プライマーからのプライマー伸長産物にアニールし得、そして逆方向プライマーは、順方向プライマーからのプライマー伸長産物にアニールし得る。
【００６１】
本発明に従う非対称ＰＣＲ（Ａ−ＰＣＲ）は、増幅反応組成物を含み、ここで、（ｉ）少なくとも１つのプライマーセットは、順方向プライマーのみまたは逆方向プライマーのみを含むか；（ｉｉ）過剰の１つのプライマー（プライマーセットの他のプライマーと比較して）が存在するか；または（ｉｉｉ）第１のプライマーのＴｍ５０が、第２のプライマーのＴｍ５０とは少なくとも６〜８℃異なる少なくとも１つのプライマーセットが存在する。特定の実施形態において、第１のプライマーのＴｍ５０は、第２のプライマーＴｍ５０と少なくとも１０〜１２℃異なる。結果として、プライマー伸長反応の後に、テンプレートの１つの鎖の少なくとも一部に相補的な過剰な産物が、テンプレートの他の鎖の少なくとも一部に相補的である産物に対して作製される。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、非対称ＰＣＲ反応組成物は、少なくとも１つの順方向プライマー、または少なくとも１つの逆方向プライマーを有するが、代表的には両方を有さない少なくとも１つのプライマーセットを含む。このような実施形態において、プライマー伸長反応は、代表的に、テンプレートの１つの鎖の少なくとも一部に相補的なプライマー伸長産物を産生するが、他の鎖の少なくとも一部に相補的な産物を産生しない。プライマー伸長反応の各々の引き続く回において、新規なプライマーは、プライマー伸長産物を産生するためにテンプレートにアニールする。特定の実施形態において、プライマー伸長産物ではなく、テンプレートのみが、非対称ＰＣＲの各々引き続く回において増幅される。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、非同期性（ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）ＰＣＲの方法を提供する。（例えば、２００１年６月５日に出願された、米国特許出願第０９／８７５，２１１号を参照のこと）。
【００６４】
特定の実施形態において、標的配列の各々に特異的な１つ以上のプライマーの複数のセットを同時に使用して、複数の標的配列を増幅し得、これは、多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲと呼ばれ得る。（例えば、Ｈ．Ｇｅａｄａら、Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．１０８：３１−３７（２０００）およびＤ．Ｇ．Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０７７−８２（１９９８）を参照のこと）。
【００６５】
マイクロサテライト（ＳＴＲおよびＶＮＴＲを含む）は、繰り返された配列のタンデムなアレイを含むゲノムの領域である。繰り返しの数は、個々に変化し得るか、疾患に対するマーカーであり得、従って、これらの領域は、診断目的のために使用され得る。繰り返された配列は、２〜約８０ヌクレオチドの長さであり得、そして繰り返しの数は、数百の範囲である。マイクロサテライト（ＳＴＲを含む）の分析は、代表的に、繰り返しの数の正確な決定を必要とし、そして２つの標的核酸テンプレート間の繰り返しの数の差は、１つまたは２つほどであり得る。
【００６６】
特定の実施形態において、ＳＴＲは、繰り返し領域に隣接するプライマーを用いて、ＰＣＲを使用して繰り返し領域を最初に増幅することによって分析される。次いで、増幅されたプライマー伸長産物は、サイズに基づいて分離される。産物のサイズを分析することによって、分析されるＳＴＲの繰り返しの数を決定し得る。特定の実施形態において、各々異なるＳＴＲ領域について異なって標識されたプライマーを使用することによって、同じ反応組成物における１つより多くのＳＴＲ領域を分析し得る。
【００６７】
特定の実施形態において、反応組成物は、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマーセット、少なくとも１つの標的核酸テンプレート、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。特定の実施形態において、各々のプライマーセットの少なくとも１つのプライマーは、標識を含む。特定の実施形態において、異なるテンプレートに対する異なるプライマーは、異なる標識を有する。
【００６８】
プライマー伸長反応において、ポリメラーゼは、プライマーまたはプライマー伸長産物の３’末端にヌクレオチドを付加する。特定の実施形態において、特異的ヌクレオチドは、テンプレートの配列に従って、プライマー伸長産物の３’末端に付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的に付加される。特定の実施形態において、得られるプライマー伸長産物は、その５’末端に、ポリメラーゼによって組み込まれたヌクレオチドのストリングに共有結合されたプライマー配列を含む。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、排他的に１つのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得るか、または排他的に１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態において、ヌクレオチドのストリングは、１つのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得るか、または１つより多くのタイプの汎用ヌクレオチドおよび１つ以上の対形成タイプの特異的ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。
【００６９】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、移動度依存性分析技術（またはＭＤＡＴ）によって分離され得る。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、分子量、長さ、配列、および／または電荷に基づいて分離され得る。混合物中の２つ以上の核酸配列が、例えば、移動度、長さ、分子量、配列および／または電荷に基づいて識別され得る任意の方法は、本発明の範囲内である。例示的なＭＤＡＴ技術としては、限定しないが、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）、ＨＰＬＣ、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）、およびゲル濾過が挙げられる。特定の実施形態において、ＭＤＡＴは、電気泳動またはクロマトグラフィーである。
【００７０】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物に結合される標識の同一性は、プライマーの同一性と相関し、従って、アニールするテンプレートの同一性と相関し、従って、分析される領域の同一性と相関する。また、プライマー伸長産物を分離することによって、所定のＳＴＲにおける繰り返しの数を決定し得る。この方法において、いくつかの異なるプライマーセットおよび標的核酸テンプレートのプライマー伸長産物は、単一のプライマー伸長反応において比較され得る。
【００７１】
種々の実施形態において、異なる数の対形成タイプの特異的ヌクレオチドが、使用され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、４つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、３つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、１つの特異的な伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。
【００７２】
特定のこのような実施形態において、ポリメラーゼは、特定の伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを、プライマー伸長産物に組み込む。現在の少なくともいくつかの特定の実施形態において、特異的ヌクレオチドよりも少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、テンプレート配列における１つ以上の特異的ヌクレオチドに対向するポリメラーゼによって組み込まれる。
【００７３】
特定の実施形態において、反応組成物は、特異的な伸長可能なヌクレオチドを含まず、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、テンプレートの特異的ヌクレオチドの全てに対向するプライマー伸長産物中に、ポリメラーゼによって組み込まれる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、ＳＴＲは、非対称ＰＣＲによって分析される。本発明の特定の実施形態において、反応組成物は、１つ以上のプライマーセット（その各々が、順方向プライマーのみまたは逆方向プライマーのみを含む）を含む。特定の実施形態において、各々の異なるプライマーが、異なる標識を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマーセットに対するプライマー伸長反応は、テンプレートの１つの鎖のみに相補的であるプライマー伸長産物を生じる。
【００７５】
本発明の特定の実施形態において、プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーであり、そして分析のためのポリヌクレオチド分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。特定の実施形態において、プライマーおよびテンプレートのアニーリング、または二重鎖形成は、ハイブリダイゼーションによって行われ得る。プライマー／テンプレート二重鎖は、ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を有意に妨害せず、プライマーの３’末端ヌクレオチド塩基が標的核酸テンプレートの所定の位置のすぐ隣にハイブリダイズする能力を有意に妨害しない、１つ以上のミスマッチを含み得る。
【００７６】
特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下で増幅される前に、処理される。特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、ＳＴＲおよびＳＴＲの一端または両端における一定の長さの隣接領域を含む核酸を作製するように処理される。特定の実施形態において、このように処理された核酸は、引き続く伸長反応において標的核酸テンプレートとして使用されて、ＳＴＲの両端に一定の長さの隣接領域を有し、ＳＴＲ内のヌクレオチドの数によって長さの異なる伸長産物を作製する。
【００７７】
特定の実施形態において、初期の標的核酸テンプレートは、特異的ヌクレオチドを含み、汎用ヌクレオチドを含まない第１反応組成物で、ＰＣＲの初期サイクルに供することによって、処理される。次いで、得られる第１プライマー伸長産物を、汎用ヌクレオチドの存在下で増幅する。特定の実施形態において、ＰＣＲの１つ以上の初期サイクルが、特異的ヌクレオチド、ならびに各ＳＴＲ領域に隣接する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を含むが、汎用ヌクレオチドを含まない第１反応組成物を用いて実施される。このような初期サイクルは、所定の長さの隣接領域およびＳＴＲ領域を含む種々の第１プライマー伸長産物を産生する。特定の実施形態において、このような第１プライマー伸長産物は、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つのプライマーを含む第２反応組成物を用いるＰＣＲの引き続くサイクルのための標的核酸テンプレートとして役立つ。このような引き続くサイクルおよびＳＴＲを検出するための方法の残り（第２の反応産物の分離および検出を含む）は、上記のように実施され得る。
【００７８】
特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートの大部分または全ては、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む反応組成物を用いるＰＣＲの引き続くサイクルの前に、除去され、そして第１のプライマー伸長産物は、このような引き続くサイクルのＰＣＲにおけるテンプレートとして役立つ。特定の実施形態において、初期核酸テンプレートは、アフィニティーセットの第１メンバーを用いて改変される。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドを含まないＰＣＲの初期サイクルの前、その間、またはその後にアフィニティーセットの第２メンバーに結合する。特定の実施形態において、アフィニティーセットの第２メンバーは、固体支持体に結合されて、その結果、初期標的核酸テンプレートの大部分または全てが、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを用いるＰＣＲの引き続くサイクルの前に、反応組成物から分離され得る。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートの大部分または全てが、ハイブリダイゼーションベースのプルアウト（ＨＢＰ）を用いて除去される。
【００７９】
特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下での増幅の前に、制限エンドヌクレアーゼを用いる消化によって処理される。特定の実施形態において、１つ以上の初期標的核酸テンプレートは、１つ以上のＳＴＲ領域を含む。この初期標的核酸テンプレートは、汎用ヌクレオチドの存在下でのＰＣＲによるＳＴＲ領域の増幅の前に、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化される。特定の実施形態において、初期標的核酸テンプレートは、ＳＴＲの一方の末端または両方の末端に一定の長さの隣接領域を有する標的核酸テンプレートを得るために増幅される各々のＳＴＲ領域に隣接する一方の領域または両方の領域で消化される。次いで、このように消化された標的核酸テンプレートは、ＳＴＲの両端に一定の長さの隣接領域を有するプライマー伸長産物を得るために、伸長反応において使用され得る。ＳＴＲを検出するための方法の残り（プライマー伸長産物の分離および検出を含む）は、上記のように実施され得る。
【００８０】
マイクロサテライトの分析は、ＭＤＡＴ（例えば、電気泳動、質量分析、またはクロマトグラフィー）の間に存在する、増幅された産物の異常な移動度をもたらし得る２次構造が存在する場合、困難であり得る。特定の実施形態に従って、プライマー伸長反応における１つ以上の伸長可能なヌクレオチドを、１つ以上の汎用ヌクレオチドに置き換えることによって、分離の間の２次構造の形成は、減少し得る。特定の実施形態に従って、ゲノム内のマイクロサテライト領域より長い繰り返し領域を、例えば、ＰＣＲ反応の一部として、プライマー伸長反応における汎用ヌクレオチドを使用して分析し得る。ＳＴＲおよびこれを分析する方法は、例えば、米国特許第５，３６４，７５９号、同第５，０７５，２１７号、同第６，０９０，５５８号および同第６，２２１，５９８号に記載され、これらは、本明細書中において任意の目的について参考として援用される。
【００８１】
核酸の配列は、例えば、Ｓａｎｇｅｒの方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ７４：５４６３−５４６７（１９７７）を参照のこと）によって、プライマー伸長産物の作製によって決定し得る。特定の実施形態に従って、本発明は、反応組成物中で汎用ヌクレオチドを使用して核酸を配列決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、二重鎖（２本鎖ポリヌクレオチド）は、標的核酸テンプレートとプライマーとの間に形成される。プライマーは、標的核酸テンプレートの所定の位置にハイブリダイズする。特定の実施形態において、１つ以上の伸長可能なヌクレオチド（少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の特異的ターミネーターを含む）は、プライマーとともに反応組成物に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。
【００８２】
反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、プライマーの３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。存在する場合、特異的ヌクレオチドは、テンプレート配列特異的様式でポリメラーゼによって付加されるが、一方、汎用ヌクレオチドは、非テンプレート配列特異的様式で付加される。特異的ターミネーターは、プライマー伸長産物内に組み込まれ得、そして一旦組み込まれると、ポリメラーゼによるプライマー伸長産物の３’末端へのヌクレオチドのさらなる組み込みを妨げる。次いで、プライマー伸長反応によって作製されたプライマー伸長産物は、サイズに基づいて分離され得、そして核酸テンプレートの配列は、産物の特定のサイズおよび各産物における特異的ターミネーターの同一性から決定され得る。
【００８３】
特定の実施形態において、反応組成物は、４つの異なる特異的ターミネーター（例えば、Ａターミネーター、Ｔターミネーター、Ｇターミネーター、およびＣターミネーター）を含み、これらの各々は、異なる標識に結合される。従って、生成されるプライマー伸長産物の各々は、３’末端に４つの特異的ターミネーターのうちの１つを含み、そしてこのターミネーターの同一性は、標識の同一性と相関する。さらに、ターミネーターに対向するテンプレート鎖上のヌクレオチドの同一性は、ターミネーターの同一性（従って、標識の同一性）によって決定され得る。例えば、プライマー伸長産物がその３’末端にＣターミネーターを有する場合、テンプレートは、ターミネーターに対向するＧを含む。プライマー伸長産物の長さは、テンプレート配列において、Ｇが配置される場所を決定する。
【００８４】
少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを使用する特定の実施形態において、反応組成物中のプライマーは、さらに、標識を含み、そしてターミネーターは、標識されない。特定の実施形態において、４つの異なる反応組成物の各々は、テンプレート上の同じ位置にアニールするプライマーを含むが、異なる反応組成物の各々のプライマーは、異なる標識を含む。プライマーは、標的核酸テンプレート上の所定の位置にハイブリダイズする。
【００８５】
特定の実施形態において、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む１つ以上の伸長可能なヌクレオチド、１つ以上のポリメラーゼ、および１つ以上の特異的ターミネーターは、反応組成物内に含まれる。特定の実施形態において、異なる非標識ターミネーターは、４つの反応組成物の各々に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、プライマーの３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。特異的ヌクレオチドは、存在する場合、テンプレート配列特異的様式でポリメラーゼによって付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的様式で付加される。
【００８６】
これらの実施形態の特定の実施形態において、各々のプライマー伸長反応は、それらの３’末端にターミネーターの１つのタイプのみを有するプライマー伸長産物を生成する。プライマーに結合される標識の同一性は、ターミネーターの同一性、従って、テンプレート上のターミネーターに対向するヌクレオチドの同一性に関連する。特定の実施形態において、４つの別々の反応からのプライマー伸長産物は、組み合わせられ得る。次いで、この産物は、ＭＤＡＴ（例えば、サイズに基づいて分離される）によって分析され得る。次いで、テンプレートの配列は、産物の特定のサイズおよび各々の産物のターミネーターの同一性から決定され得る。
【００８７】
特定の実施形態において、１つより多くのテンプレートが、同じ反応組成物内で配列決定され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの異なるテンプレートにアニールする２つの異なるプライマーを含み得、異なるプライマーの各々は、異なる標識を含む。特定の実施形態において、反応組成物は、さらに、４つの異なるテンプレートを含み得、各々が、異なる標識を含む。特定の実施形態において、１つ以上の伸長可能なヌクレオチド（少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む）および１つ以上のポリメラーゼがまた、反応組成物に含まれる。反応組成物は、特異的ヌクレオチドを含んでも含まなくても良い。反応組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドが、各々のプライマーがアニールするテンプレート配列に従って、異なるプライマーの各々の３’末端上にポリメラーゼによって連続的に組み込まれる。特異的ヌクレオチドは、存在する場合、テンプレート配列特異的な様式でポリメラーゼによって付加され、一方、汎用ヌクレオチドは、非特異的な様式で付加される。
【００８８】
従って、プライマー伸長反応は、各々が、伸長されたプライマーを同定する標識、および３’末端においてターミネーターを同定する別の標識を有する、プライマー伸長産物を生成する。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、分離され得る。テンプレートの配列は、産物の特定のサイズ、プライマーの同一性、および各々の産物のターミネーターの同一性から決定され得る。従って、２つのテンプレートの各々の配列は、同時に決定され得る。
【００８９】
特定の実施形態において、反応組成物は、異なるテンプレートにアニールする２つより多くの異なるプライマー（各々が異なる標識を含む）を含み得る。特定の実施形態において、反応組成物は、異なる標識のプライマーおよび４つの異なるターミネーター（各々が、異なる標識を含む）を含む。特定の実施形態において、反応は、２つの異なるプライマーについて実質的に上記されるように実施される。
【００９０】
特定の実施形態において、反応組成物は、１つのタイプの非標識ターミネーターおよび２つ以上の異なる標識プライマー（２つ以上の異なるテンプレートに特異的である）を含み得る。特定の実施形態において、４つの異なる反応組成物は、各々、異なる標識されないターミネーターおよび２つ以上の異なって標識されたプライマーを含む。特定の実施形態において、次いで、各々の反応組成物は、プライマー伸長反応に供される。次いで、各々の反応組成物の伸長産物が分離される。標識は、どのテンプレートが伸長産物に相関するかを示す。末端ヌクレオチドの同一性、従って、それに対向するテンプレートヌクレオチドの同一性は、プライマー伸長産物が生成された反応組成物に基づいて決定され得る。産物の長さは、ヌクレオチドがテンプレート内に含まれる場所を示す。
【００９１】
種々の実施形態において、異なる数の対形成タイプの特異的ヌクレオチドが、使用され得る。特定の実施形態において、反応組成物は、４つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、３つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、２つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、反応組成物は、１つの特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。
【００９２】
特定のこのような実施形態において、ポリメラーゼは、特異的に伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを、プライマー伸長産物に組み込む。特定の実施形態において、少なくともある時点で、特異的ヌクレオチドよりも、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、ポリメラーゼによって、テンプレート配列中の１つ以上の特異的ヌクレオチドに対向して組み込まれる。
【００９３】
特定の実施形態において、反応組成物は、特異的に伸長可能なヌクレオチドを含まず、そして少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む。この少なくとも１つの汎用ヌクレオチドは、テンプレート中の特異的ヌクレオチドの全てに対向して、プライマー伸長産物中にポリメラーゼによって組み込まれる。
【００９４】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、移動度依存性分析技術（またはＭＤＡＴ）によって分離され得る。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、分子量、長さ、配列、および／または電荷に基づいて分離され得る。混合物中の２つ以上の核酸配列が区別され得る任意の方法（例えば、移動度、長さ、分子量、配列、および／または電荷に基づく）は、本発明の範囲内である。例示的な分離技術としては、限定しないが、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）、ＨＰＬＣ、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）、およびゲル濾過が挙げられる。特定の実施形態において、ＭＤＡＴは、電気泳動またはクロマトグラフィーである。プライマー伸長産物を分離することによって、各々の産物のサイズおよびその３’末端におけるターミネーターの同一性に基づいて、テンプレート核酸の配列を決定し得る。
【００９５】
本発明の特定の実施形態において、プライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーであり、そして分析のためのポリヌクレオチド分子は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。特定の実施形態において、プライマーおよびテンプレートのアニーリング、または二重鎖形成は、ハイブリダイゼーションによって行われ得る。プライマー／テンプレート二重鎖は、ポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を有意に妨害しないか、またはプライマーの３’末端ヌクレオチド塩基が標的核酸テンプレートの所定の位置のすぐ隣にハイブリダイズする能力を有意に妨害しない、１つ以上のミスマッチを含み得る。
【００９６】
特定の実施形態において、この方法は、サイクル配列決定を包含し、ここで、プライマー伸長反応および停止に続いて、プライマー伸長産物が、標的核酸テンプレートから放出され、そして新規なプライマーが、同じ様式でアニールされ、伸長され、そして停止される。サイクル配列決定によって、プライマー伸長産物の増幅が可能になる。特定の実施形態において、サイクル配列決定は、サーモサイクラー装置を使用して実施される。
【００９７】
特定の実施形態において、プライマーおよび／またはターミネーターは、標識される。特定の実施形態において、標識は、蛍光色素を含む。特定の実施形態において、反応物は、４つの異なるターミネーターを含み、各々が、異なる蛍光色素で標識される。特定の実施形態において、４つの反応組成物は、各々、異なる蛍光色素で標識されたプライマーを含む。特定の実施形態において、４つのプライマーは、同じ配列を有する。特定の実施形態において、１つの反応組成物は、１つより多くの異なるプライマーを含み、そして各異なるプライマーは、異なる蛍光色素で標識される。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、電気泳動、質量分光法、またはクロマトグラフィーによって分離される。
【００９８】
ＤＮＡ配列決定技術は、ＤＮＡの４つの特定の塩基間の違いから生じ得る変動性によって制限され得る。例えば、配列決定産物の分離の間、高いＧ−Ｃ含有量の領域において生じる２次構造から圧縮が生じ得る。これらの圧縮は、複数の産物を同じサイズで行動（ｒｕｎ）させ、電気泳動、質量分光法、またはクロマトグラフィー後に、重なるいくつかのプライマー伸長産物ピークを生じる。特定の実施形態において、本発明は、配列決定反応において１つ以上のｄＮＴＰを少なくとも１つの汎用ヌクレオチドに置き換えることによって、プライマー伸長産物における二次構造を減少させ得、これによって、圧縮を減少させる方法を提供する。
【００９９】
また、特定の実施形態に従う少なくとも１つの汎用ヌクレオチドの使用は、伸長反応における早すぎる鎖の停止を減少させ得る。早すぎる鎖の停止は、伸長産物におけるターミネーターの組み込み前の、伸長反応の停止である。
【０１００】
（キット）
本発明はまた、上記方法を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、この方法を実施するために使用される２つ以上の構成要素を集めることによって、目的の方法の実行を早めるために役立つ。特定の実施形態において、キットは、エンドユーザーによる測定の必要性を最小にするために、予め測定された単位量で構成要素を含む。特定の実施形態において、キットは、本発明の１つ以上の方法を実施するための説明書を含む。特定の実施形態において、キットの構成要素は、互いに一緒に操作するために最適化されている。
【０１０１】
特定の実施形態において、本発明のキットは、少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定するために使用され得る。特定の実施形態において、標的核酸テンプレートを配列決定するためのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む。特定の実施形態において、標的核酸テンプレートを配列決定するためのキットは、さらなる構成要素（限定しないが、少なくとも１つのプライマーが挙げられる）を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも１つの特異的ターミネーターおよび／または少なくとも１つのプライマーは、さらに標識を含み得る。キットはまた、コントロール反応を実施するための試薬を含み得、これは、１つ以上の上記成分、および少なくとも１つの標的核酸テンプレートを含み得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明のキットは、複数のプライマー伸長産物を生成するために使用され得る。特定の実施形態において、キットは、ＳＴＲ分析のために使用され得る。特定の実施形態において、ＳＴＲ分析のためのキットは、少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび少なくとも１つのポリメラーゼを含む。特定の実施形態において、ＳＴＲ分析のためのキットは、少なくとも１つのプライマーを含み得る。特定の実施形態において、この少なくとも１つのプライマーは、さらに標識を含み得る。ＳＴＲ分析のためのキットはまた、コントロール反応を実施するための試薬を含み得、これは、１つ以上の上記成分および少なくとも１つの標的核酸テンプレートを含み得る。
【０１０３】
本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示される本発明の詳細および実施を考慮することにより、当業者に明らかである。明細書および実施例は、単なる例示とみなされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１Ａは、テトラヌクレオチドプライマー（斜線付きの棒）を有する天然のヌクレオチド（例えば、Ａ（ｄＡＴＰ）、Ｔ（ｄＴＴＰ）、Ｇ（ｄＧＴＰ）、およびＣ（ｄＣＴＰ））の存在下で進行するプライマー伸長を概略的に図示する。各ヌクレオチドは、テンプレート配列依存性の様式で（例えば、ワトソン−クリック塩基対合（ここで、ＡはＴと対合し、そしてＧはＣと対合する）に基づいて）、プライマー伸長産物に付加する。図１Ｂに示される特定の例示的な実施形態において、汎用ヌクレオチド「Ｘ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、テンプレート配列非依存性の様式で、この汎用ヌクレオチドがプライマー伸長産物に取り込まれる。従って、汎用ヌクレオチド「Ｘ」は、このテンプレート中に存在する任意のヌクレオチドと対合し得る。図１Ｃに示される特定の例示的な実施形態において、仮定的汎用ヌクレオチド「Ｚ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、この汎用ヌクレオチドが、このテンプレートにおける特定のヌクレオチドに対向するが他のヌクレオチドには対向しない、プライマー伸長産物に取り込まれる。ここで、例えば、Ｚは、このテンプレートにおけるＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドと対合するが、Ｚは、ＡにもＴにも対合しない。従って、Ｚは、ＧおよびＣに関しては汎用ヌクレオチドであるが、ＡまたはＴに関しては汎用ヌクレオチドではない。図１Ｄに示される特定の例示的な実施形態において、仮定的汎用ヌクレオチド「Ｙ」の存在下でのプライマー伸長の結果として、この汎用ヌクレオチドが、このテンプレートにおいてＡ、Ｔ、およびＣに対向するプライマー伸長産物に取り込まれるが、Ｇに対向するプライマー伸長産物には取り込まれない。
【図２】図２は、いくつかの非限定的な例示的な汎用ヌクレオチドの構造を示す。（Ａ）２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、（Ｂ）２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、（Ｃ）２’−デオキシ−ピロロピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、（Ｄ）２’−デオキシーイミダゾピリジンー５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、（Ｅ）２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、（Ｆ）２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、（Ｇ）２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、および（Ｈ）２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）。この図において使用される場合、「Ｒ」は、ヌクレオチドのデオキシリボース部分である。
Claims (30)
- 少なくとも１つの標的核酸テンプレートを配列決定する方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの標的核酸テンプレート、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つのポリメラーゼ、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む、反応組成物を形成する工程；
（ｂ）該反応組成物を適切な条件下でインキュベートして、１つ以上の該少なくとも１つの汎用ヌクレオチドおよび該１つ以上の少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程；
（ｃ）１つ以上の該少なくとも１つのプライマー伸長産物を分離する工程であって、該分離する工程が、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を含む、工程；および
（ｄ）１つ以上の該少なくとも１つのプライマー伸長産物を検出する工程、
を包含する、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記（ｂ）が、前記１つ以上の少なくとも１つの標的核酸テンプレートから、前記１つ以上の少なくとも１つのプライマー伸長産物を放出する工程を包含し、そして前記インキュベートする工程および該放出する工程を、少なくともさらに１回繰り返す、方法。
- 請求項２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの標的核酸テンプレートが、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いて切断された少なくとも１つの標的核酸である、方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記１つ以上の少なくとも１つの特異的ターミネーターが、標識を含む、方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの特異的ターミネーターが、第１標識を含むＡターミネーター、第２標識を含むＴターミネーター、第３標識を含むＧターミネーター、および第４標識を含むＣターミネーターを含み、ここで、第１標識、第２標識、第３標識、および第４標識が、検出可能に異なっている、方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、前記１つ以上の少なくとも１つのプライマーが、各々標識を含む、方法。
- 請求項２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの標的核酸テンプレートが、第１標的核酸テンプレートおよび第２標的核酸テンプレートを含み、前記第１の標的核酸テンプレートおよび第２標的核酸テンプレートが異なり、そして前記少なくとも１つのプライマーが、（ｉ）第１標的核酸テンプレートに特異的であり、しかも第１標識を含む第１プライマー、および（ｉｉ）第２標的核酸テンプレートに特異的であり、しかも第２標識を含む第２プライマーを含み、そして該第１標識および第２標識が、検出可能に異なる、方法。
- 複数の第２プライマー伸長産物を検出する方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの標的核酸テンプレート、少なくとも１つの第１プライマー、少なくとも１つの特異的ヌクレオチド、および少なくとも１つの第１ポリメラーゼを含む第１反応組成物を形成する工程であって、ここで、該第１反応組成物が、汎用ヌクレオチドを含まない、工程；
（ｂ）該反応組成物を適切な条件下でインキュベートして、少なくとも１つの第１プライマー伸長産物を生成する工程；
（ｃ）該少なくとも１つの第１プライマー伸長産物を、該少なくとも１つの標的核酸テンプレートから放出する工程；
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を繰り返して、複数の第１プライマー伸長産物を生成する工程；
（ｅ）少なくとも１つの第１プライマー伸長産物、標識を含む少なくとも１つの第２プライマー、少なくとも１つの第２ポリメラーゼ、および少なくとも１つの汎用ヌクレオチドを含む第２反応組成物を形成する工程；
（ｆ）該反応組成物を、適切な条件下でインキュベートして、少なくとも１つの第２プライマー伸長産物を生成する工程；
（ｇ）該少なくとも１つの第２プライマー伸長産物を、該少なくとも１つの第１プライマー伸長産物から放出する工程；
（ｈ）（ｆ）および（ｇ）を繰り返して、複数の第２プライマー伸長産物を生成する工程；
（ｉ）１つ以上の該複数の第２プライマー伸長産物を分離する工程であって、ここで、該分離する工程が、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を含む、工程；および
（ｊ）１つ以上の該複数の第２プライマー伸長産物を検出する工程、
を包含する、方法。 - 請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法であって、１つ以上の前記少なくとも１つの標的核酸テンプレートが、短いタンデムの繰り返しを含む、方法。
- 請求項８に記載の方法であって、１つ以上の前記少なくとも１つの標的核酸テンプレートが、短いタンデムの繰り返しを含み、そして該方法が、さらに、前記第２反応組成物を形成する前に、１つ以上の該標的核酸テンプレートを除去する工程を包含する、方法。
- 請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの標識が、蛍光色素を含む、方法。
- 請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法であって、少なくとも１つの標識が、エネルギー移動蛍光色素を含む、方法。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記反応組成物が、さらに、少なくとも１つの特異的に伸長可能なヌクレオチドを含む、方法。
- 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記反応組成物が、特異的に伸長可能なヌクレオチドを含まない、方法。
- 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、１つのタイプの汎用ヌクレオチドである、方法。
- 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、２つのタイプの汎用ヌクレオチドである、方法。
- 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、３つのタイプの汎用ヌクレオチドである、方法。
- 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法であって、１つ以上の前記少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、個々に、２’−デオキシ−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−プロピニルイソカルボスチリル−５’−トリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、２’−デオキシ−６−メチル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、２’−デオキシ−イミジゾピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、２’−デオキシ−ピロールピリジン−５’−トリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、２’−デオキシ−アレニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＡ７ＡＩＴＰ）、または２’−デオキシ−プロピニル−７−アザインドール−５’−トリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）を含む、方法。
- 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法であって、前記ＭＤＡＴが、電気泳動、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、質量分光法、沈降、フィールドフローフラクショネーション、または多段階フラクショネーションのうちの少なくとも１つを含む、方法。
- 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法であって、前記ＭＤＡＴが、電気泳動を含む、方法。
- 標的核酸テンプレートを配列決定するためのキットであって、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および少なくとも１つの特異的ターミネーターを含む、キット。
- 請求項２１に記載のキットであって、さらに、少なくとも１つのプライマーを含む、キット。
- 標的核酸テンプレート中の短いタンデムの繰り返しを検出するためのキットであって、少なくとも１つの汎用ヌクレオチド、少なくとも１つのポリメラーゼ、および該標的核酸テンプレート中の短いタンデムの繰り返しに隣接する配列に相補的である配列を含む少なくとも１つのプライマーを含む、キット。
- 請求項２１または２２に記載のキットであって、１つ以上の前記少なくとも１つの汎用ヌクレオチドが、ｄ７ＡＩＴＰ、ｄＩＣＳＴＰ、ｄＰＩＣＳＴＰ、ｄＭ７ＡＩＴＰ、ｄＩｍＰｙＴＰ、ｄＰＰＴＰ、ｄＡ７ＡＩＴＰ、またはｄＰ７ＡＩＴＰを含む、キット。
- 請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のキットであって、１つ以上の前記少なくとも１つのプライマーが、各々、標識を含む、キット。
- 請求項２１に記載のキットであって、４つのプライマーを含み、各々のプライマーが、他の３つのプライマーの標識とは異なる標識を含む、キット。
- 請求項２１に記載のキットであって、前記少なくとも１つの特異的ターミネーターが、さらに標識を含む、キット。
- 請求項２７に記載のキットであって、前記キットが、第１標識を含むＡターミネーター、第２標識を含むＴターミネーター、第３標識を含むＧターミネーター、および第４標識を含むＣターミネーターを含み、第１標識、第２標識、第３標識、および第４標識が、検出可能に異なっている、キット。
- 請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のキットであって、少なくとも１つの標識が、蛍光色素を含む、キット。
- 請求項２５〜２８のいずれか一項に記載のキットであって、少なくとも１つの標識が、エネルギー移動蛍光色素を含む、キット。
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