DE60021354T2

DE60021354T2 - Polynukleotide mit gekürzter kette und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE60021354T2
Application number: DE60021354T
Authority: DE
Inventors: Shinji Matsuyama; Kouichi Tsukuba-shi ISHIYAMA; Junzo Seki; Tadaaki Ohgi
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1999-02-15
Filing date: 2000-02-14
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2020-02-15
Also published as: ATE299885T1; RU2238279C2; ID29546A; EP1153931A1; NO20013941L; US6780429B1; CN1340055A; EP1153931B1; US20040235044A1; CN1194002C; BR0008227A; US7223857B2; KR20020013500A; CA2359674A1; KR100455814B1; NO20013941D0; ZA200106701B; WO2000047601A1; DE60021354D1; AU2460900A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polynukleotid mit gekürzter Kette, das insbesondere als Arzneimittel verwendbar ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Polypeptids. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein synthetisches Polynukleotid oder Salze davon mit gekürzter Kette und ein Verfahren zu dessen Herstellung, wobei der Anteil einer 2'-5'-Phosphodiesterbindung bis zu 3% beträgt, basierend auf den gesamten Phosphodiesterbindungen. Das heißt, dass die Menge von Phosphatgruppen (die Phosphatumlagerungsrate), die sich von der 3'-Position an die 2'-Position umgelagert haben, basierend auf den gesamten Phosphatgruppen der Phosphodiesterbindungen bis zu 3% beträgt.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Polynukleotide, die durch Polyinosin-/Polycytidylsäure, d.h. Poly(I)/Poly(C), charakterisiert sind, sind auf dem Gebiet bekannte Verbindungen und ihr Potential als Arzneimittel zur Behandlung von Hepatitis oder Krebs wurde angesichts ihrer Interferon-induzierenden Wirkungen, immunaktivierenden Wirkung und dergleichen untersucht.
Die pharmakologische Wirkung von diesen Polynukleotiden weist eine hohe Korrelation mit der Kettenlänge auf und je länger die Kettenlänge ist, umso stärker ist die Interferon-induzierende Wirkung und umgekehrt. Andererseits ist bei einer längeren Kettenlänge eine höhere Toxizität feststellbar.
Kürzlich gab es einen Versuch bei dem die nützliche pharmakologische Wirkung eines Polynukleotids durch ein Verfahren erhalten wurde, bei dem ein synthetisches Polynukleotid mit einer relativ kürzeren Kette durch die Hydrolyse eines Polynukleotids in einem Träger, wie einem Kationenliposom, das zur Einführung eines Arzneimittels in eine Zelle wirksam ist (z.B. PCT WO 99/20283, PCT WO 99/48531), hergestellt wird.
Es ist hinreichend bekannt, dass, wenn ein Polynukleotid hydrolysiert wird, um die Kettenlänge, wie oben beschrieben, zu verkürzen, einige Phosphatgruppen eine intramolekulare Umlagerung von der 3'-Position zur 2'-Position über einen Mechanismus bewirken, der als Pseudorotation bezeichnet wird. Dieser verläuft gleichzeitig mit der Kettenverkürzung (siehe z.B. "Protein Nucleic acid Enzyme", Band 40, Nr. 10, Seiten 1323 bis 1332 (1995)). Als Folge wird ein Teil der 3'-5'-Phosphodiesterbindungen in dem Polynukleotidmolekül mit gekürzter Kette durch 2'-5'-Phosphodiesterbindungen ersetzt. Es war bis jetzt nicht bekannt, ob ein solches Phosphatumlagerungsphänomen die pharmakologische Wirkung beeinflussen würde oder nicht.
DE-A-3,822,406 und US-A-3,692,899 offenbaren Polynukleotide, behandelten jedoch nicht die Bedeutung von 2'-5'-Oligomeren in Polynukleotidpräparationen oder die von ihnen verursachten pharmakologischen Wirkungen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es zum einen ein Polynukleotid mit gekürzter Kette oder Salze davon und ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette oder Salze davon bereitzustellen, die sicher und wirksam als ein Arzneimittel sind.
Die Erfinder haben intensive Forschung betrieben und festgestellt, dass die oben beschriebenen Probleme durch ein Polynukleotid mit gekürzter Kette oder ein Salz davon gelöst werden können, das eine 2'-5'-Phosphodiesterbindung enthält, die hauptsächlich in einer Kettenverkürzungsreaktion zu einem bestimmten Anteil oder weniger erzeugt wird und haben auf diese Art die vorliegende Erfindung entwickelt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polynukleotid mit gekürzter Kette mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 0,1 k Basen bis 1 k Basen oder ein Salz davon bereit, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der 2'-5'-Phosphodiesterbindung in einem Bereich von 0,1% bis 3% liegt, basierend auf der Gesamtheit der Phosphodiesterbindungen.
Vorzugsweise beträgt der Anteil der 2'-5'-Phosphodiesterbindung 2% oder weniger, basierend auf der Gesamtheit der Phosphodiesterbindungen.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch in einer Ausführungsform ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette oder ein Salz davon, das aus zwei Polynukleotiden mit gekürzter Kette oder Salzen davon gebildet ist und in der Lage ist, einen Doppelstrang zu bilden. Bei dieser Ausführungsform enthalten die Polynukleotide mit gekürzter Kette vorzugsweise eine 2'-5'-Phosphodiesterbindung in einem Anteil von 2% oder weniger.
Weiter stellt die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung bereit, die einen Komplex umfasst, der aus einem Träger, der wirksam ist, ein Medikament in eine Zelle einzuführen, und dem oben beschriebenen Polynukleotid mit gekürzter Kette oder Salz davon oder dem doppelsträngigen Polynukleotid mit gekürzter Kette oder Salz davon gebildet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Polynukleotids mit gekürzter Kette oder ein Salz davon bereit, bei dem ein Polynukleotid oder Salz davon in einer wässrigen Lösung bei einem pH von 7 bis 10 bei einer Temperatur von 20 bis 110°C hydrolysiert wird, um die Kette zu verkürzen, und bei dem die Phosphatumlagerungsrate gemessen wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Herstellung eines wie oben definierten Polynukleotids mit gekürzter Kette oder ein Salz davon bereit, bei dem ein Polynukleotid oder Salz davon in einer wässrigen Lösung bei einem pH von 4 bis 9 und einer Temperatur von 20 bis 60°C mit einer Phosphodiesterase behandelt wird, um die Kette zu verkürzen, und bei dem die Phosphatumlagerungsrate gemessen wird.
Das Polynukleotid, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Verbindung, die mindestens 20 Nukleotide umfasst, die durch eine lineare Polymerisierung über eine Phosphodiesterbindung gebildet wird und synthetische und natürliche Verbindungen einschließt. Spezifische Beispiele umfassen Polyinosinsäure (als Poly(I) bezeichnet) oder Analoga davon, Polycytidylsäure (als Poly(C) bezeichnet) oder Analoga davon, Polyadenylsäure (als Poly(A) bezeichnet) oder Analoga davon und Polyuridylsäure (als Poly(U) bezeichnet) oder Analoga davon.
Das Polyinosinsäureanalog ist ein Homopolymer, bei dem die gesamte oder ein Teil der Inosinsäure chemisch modifiziert ist oder ein Copolymer einer Inosinsäure mit einem anderen Nukleotid, z.B. Poly(7-deazainosinsäure) und Poly(2'-azidoinosinsäu re). Das Polycytidylsäureanalog ist ein Homopolymer, bei dem die gesamte oder ein Teil der Cytidinsäure chemisch modifiziert ist oder ein Copolymer einer Cytidylsäure mit einem anderen Nukleotid (z.B. Poly(5-bromcytidylsäure), Poly(2-thiocytidylsäure), Poly(Cytidin-5'-thiophosphorsäure), Poly(cytidylsäure/uridylsäure), Poly(cytidylsäure/4-thiouridylsäure) und Poly(1-vinylcytidylsäure). Das Polyadenylsäureanalog und das Polyuridylsäureanalog sind gleichermaßen definiert. Von diesen sind Polyinosinsäure und Polycytidylsäure für die vorliegende Erfindung geeignet.
Die durchschnittliche Kettenlänge des erfindungsgemäßen Polynukleotids mit gekürzter Kette liegt in einem Bereich von 0,1 k Basen bis 1 k Basen. Der Ausdruck "Basen" bezeichnet die Anzahl von Basen und "1 k Basen" bezeichnet eine Basenanzahl von 1000. Im Folgenden wird "Base(n)" als "b" abgekürzt. Die durchschnittliche Kettenlänge liegt im Bereich von vorzugsweise 200 b bis 800 b und bevorzugter von 300 b bis 600 b. Die durchschnittliche Kettenlänge kann leicht bestimmt werden, beispielsweise durch Gelpermeationschromatographie (hier als "GPC" bezeichnet), wie hier in Beispiel 5 beschrieben.
Bei dem erfindungsgemäßen Polynukleotid mit gekürzter Kette beträgt die Phosphatumlagerungsrate 3% oder weniger, vorzugsweise 2% oder weniger oder zwischen 0,1% und 2% und bevorzugter 1% oder weniger oder zwischen 0,1% und 1%.
Die Umlagerung der Phosphatgruppe von einer 3'-Position an eine 2'-Position in einem Polynukleotid kann leicht bestimmt werden, beispielsweise durch das im Beispiel 6 beschriebene Verfahren. Dabei wird ein Polynukleotid mit Nuklease-P₁ abgebaut, die spezifisch eine 3'-5'-Phosphodiesterbindung auf solche Spiegel in einem Nukleosid, Nukleotid und Oligonukleotid hydrolysiert und dann mit einer alkalinen Phosphatase behandelt, die spezifisch eine terminale Phosphatgruppe hydrolysiert, um so die gesamten Nukleotide in Nukleoside umzuwandeln. Andererseits wird ein Oligonukleotid mit einer 2'-5'-Phosphodiesterbindung, die nicht durch die Nuklease-P₁ hydrolysiert wird, selbst bei der Behandlung mit einer alkalinen Phosphatase nicht zu einem Nukleosid abgebaut, da eine intramolekulare 2'-5'-Phosphodiesterbindung nicht hydrolysiert wird. Die Phosphatumlagerungsrate kann berechnet werden, indem die Nukleoside und Oligonukleotide (die meisten von ihnen sind Dimere) durch Flüssigkeits-Chromatographie oder dergleichen analysiert werden.
Beispiele eines Paares von Polynukleotiden mit gekürzter Kette, die zur Bildung eines Doppelstrangs im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung fähig sind, umfassen Polyinosinsäure und Polycytidylsäure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäure, Polyinosinsäureanalog und Polycytidylsäure, Polyinosinsäure und Polycytidylsäureanalog, Polyinosinsäureanalog und Polycytidylsäureanalog, Polyadenylsäureanalog und Polyuridylsäure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäureanalog, und Polyadenylsäureanalog und Polyuridylsäureanalog. Daher umfassen Beispiele des doppelsträngigen Polynukleotids mit gekürzter Kette, das zwischen zwei Polynukleotiden mit gekürzter Kette gebildet wird, die zur Bildung eines Doppelstrangs in der Lage sind, Polyinosin-/Polycytidylsäure, Polyadenyl-/Polyuridylsäure, Polyinosinanalog/Polycytidylsäure, Polyinosin-/Polycytidylsäureanalog, Polyinosinanalog-/Polycytidylsäureanalog, Polyadenylanalog-/Polyuridylsäure, Polyadenyl-/Polyuridylsäureanalog, und Polyadenylanalog-/Polyuridylsäureanalog. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist Polyinosin-/Polycytidylsäure ein bevorzugtes doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette.
Die durchschnittliche Kettenlänge des oben beschrieben doppelsträngigen Polynukleotids mit gekürzter Kette entspricht der durchschnittlichen Kettenlänge der gesamten Polynukleotide mit gekürzter Kette. Daher kann das letztere verwendet werden, um die tatsächliche durchschnittliche Kettenlänge des doppelsträngigen Polynukleotids mit gekürzter Kette anhand der Anzahl von Basenpaaren (bp) anzugeben. Folglich beträgt die durchschnittliche Kettenlänge der oben beschriebenen doppelsträngigen Polynukleotide mit gekürzter Kette von 0,1 k bp bis 1 k bp. Der Ausdruck "bp" bezeichnet die Anzahl von Basenpaaren und " 1 k bp" entspricht einer Anzahl von 1000 Basenpaaren. Die durchschnittliche Kettenlänge des doppelsträngigen Polynukleotids beträgt vorzugsweise von 200 bp bis 800 bp und bevorzugter von 300 bp bis 600 bp.
Das Salz eines Polynukleotids mit gekürzter Kette und das eines erfindungsgemäßen doppelsträngigen Polynukleotids mit gekürzter Kette ist insofern nicht besonders beschränkt, dass es sich um ein pharmazeutisch annehmbares Salz handelt. Beispiele davon umfassen ein Natriumsalz und Kaliumsalz.
Als ein Träger, der zur Einführung eines Medikaments in eine Zelle wirksam ist, sind solche mit einer positiven Ladung beispielhaft genannt und spezifische Beispiele umfassen Kationenpolymere, wie Poly-L-Lysin, Kationenliposomen wie Lipofectin^®, Lipofectamin^®, Lipofectace^®, DMRIE-C^®, etc. und Träger, die von derselben Art sind, wie sie in PCT WO 94/19314 offenbart sind. Die Träger zur Aufnahme ei nes Medikaments werden beispielsweise aus 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin der Formel (I) gebildet:
und ein Phospholipid (z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Eigelb-Lecithin, Sojabohnen-Lecithin, hydriertes Phospholipid davon) als wesentliche strukturelle Bestandteile.
Es wird angenommen, dass das oben beschriebene Kationenliposom positiv geladen ist und einen elektrostatischen Komplex mit einem negativ geladenen Polynukleotid oder Oligonukleotid bildet. Wenn der entstehende Komplex mit der Zellmembran fusioniert, wird das Polynukleotid oder Oligonukleotid umgehend in die Zelle eingeführt. Ein solcher Komplex wird manchmal als "Lipoplex" bezeichnet.
Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polynukleotids mit gekürzter Kette wird im Folgenden genauer beschrieben. Das erfindungsgemäße Polynukleotid mit gekürzter Kette kann beispielsweise durch Hydrolyse des Ausgangspolynukleotids in Lösung bei einem geeigneten pH-Bereich bei gleichzeitigem Erhitzen bei einem geeigneten Temperaturbereich hergestellt werden. Der geeignete pH der wässrigen Lösung in diesem Verfahren ist basisch, d.h. pH 7 oder mehr, vorzugsweise ist der pH 7 bis 10. Unter Berücksichtigung der Reaktionsrate der Kettenverkürzungsreaktion und der Stabilität des Basenrestes beträgt der bevorzugtere pH der Lösung zwischen 8 und 9. Die Reaktionstemperatur liegt zweckmäßiger Weise in einem Bereich von 20 bis 110°C, vorzugsweise 40 bis 100°C, im Hinblick auf die Stabilität einer Base, wird jedoch die ausreichende Hydrolyserate und die Stabilität des Basenrestes berücksichtigt, liegt eine bevorzugtere Reaktionstemperatur zwischen 50 und 90°C.
Insbesondere wird beispielsweise ein Polynukleotid in Wasser, wie injizierbares Wasser, destilliertes Injektionswasser oder physiologischer Kochsalzlösung unter Rühren gelöst und der pH der Lösung wird auf 8 bis 9 mit einem Puffer oder einem pH-Regulator eingestellt. Wenn die Hydrolyse durch Erhitzen der Lösung bei einer Reaktionstemperatur im Bereich von 50 bis 90°C für 0,5 bis 60 Stunden erhitzt wird, während die durchschnittliche Kettenlänge und die Phosphatumlagerungsrate kontrolliert wird, kann ein Polynukleotid mit gekürzter Kette, das weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthält und eine durchschnittliche Kettenlänge zwischen 0,1 kb und 1 kb aufweist, hergestellt werden.
Es können pharmazeutisch annehmbare Zusätze wie Puffer oder ein pH-Regulator verwendet werden, um den pH einzustellen. Spezifische Beispiele umfassen Puffer und pH-Regulatoren wie Aminoessigsäure (Synonym: Glycin), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Synonym: Tris), Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat (Synonym: Natriumbicarbonat), Natriumhydroxid, Diethanolamin, Triethanolamin und dergleichen. Es gibt hinsichtlich der Art, Kombination, Konzentration und dergleichen von diesen Zusätzen keine Beschränkungen.
Monomere und nicht erforderliche Salze, Unreinheiten, Zwischenprodukte, die durch die Kettenverkürzungsreaktion entstehen und dergleichen können von dem System durch Behandlung der Reaktionslösung durch Dialyse oder mit aktiviertem Kohlenstoff entfernt werden.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid mit gekürzter Kette kann auch hergestellt werden, indem das Ausgangspolynukleotid in der Lösung mit einer Phosphodiesterase bei einem geeigneten pH-Bereich während des Erhitzens bei einem geeigneten Temperaturbereich behandelt wird. Der geeignete pH der wässrigen Lösung in diesem Verfahren beträgt zwischen 4 und 9, vorzugsweise zwischen 5 und 8. Unter Berücksichtigung der Phosphatumlagerung während der Kettenverkürzungsreaktion beträgt der bevorzugtere pH der Lösung zwischen 6 und 7. Die Reaktionstemperatur liegt in geeigneter Weise innerhalb eines Bereichs von 20 bis 60°C, vorzugsweise 25 bis 50°C, im Hinblick auf die Eigenschaften des Enzyms. Jedoch kann eine bevorzugtere Reaktionstemperatur zwischen 30 und 40°C liegen unter Berücksichtigung der ausreichenden Hydrolyserate, der Vermeidung einer Beeinflussung einer nicht-enzymatischen Hydrolyse, wie Hydrolyse mit Hitze, und die Vorbeugung einer Phosphatgruppenumlagerung.
Insbesondere wird beispielsweise ein Polynukleotid in Wasser, wie injizierbares Wasser, destilliertes Injektionswasser oder physiologischer Kochsalzlösung unter Rühren gelöst. Der pH der Lösung wird gegebenenfalls durch Zusatz eines Puffers oder eines pH-Regulators, wenn notwendig, angepasst. Zu der Lösung wird eine Phosphodiesterase, wie Nuklease-P₁, zugegeben und das entstehende Gemisch wird der Kettenverkürzungsreaktion bei einer Temperatur von 30 bis 40°C ausgesetzt, während die durchschnittliche Kettenlänge und die Phosphatumlagerungslage kontrolliert werden, um ein Polynukleotid mit gekürzter Kette zu erhalten, das weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthält und eine durchschnittliche Kettenlänge zwischen 0,1 kb und 1 kb aufweist. Es gibt bezüglich der Enzymkonzentration oder den Reaktionsbedingungen keine Beschränkungen.
Monomere und nicht erforderliche Salze, Unreinheiten, Zwischenprodukte, die durch die Kettenverkürzungsreaktion entstehen und dergleichen können von dem System durch Behandlung der Reaktionslösung mit dem Ethanolpräzipitationsverfahren, Dialyse oder mit aktiviertem Kohlenstoff entfernt werden.
Das Polynukleotid mit gekürzter Kette kann durch ein geeignetes Auftrennungsverfahren mit einer Membran gereinigt werden. Beispielsweise ist eine Membranultrafiltration für die Zwecke der Fraktionierung von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden mit einer durchschnittlichen Kettenlänge zwischen 0,1 kb und 1 kb geeignet. Es gibt bezüglich der Beschaffenheit des Materials oder der Porengröße der Membran keine Beschränkungen.
Als Ausgangsmaterial kann ein beliebiges Polynukleotid verwendet werden, unabhängig von dessen Ursprung, d.h. natürlichen oder synthetischen Ursprung, der Art des Salzes oder der Kettenlänge. Beispiele für ein natürliches Polynukleotid umfassen tRNA und Polyadenylsäure. Andererseits kann ein synthetisches Polynukleotid von einer RNA-Synthetase, wie Polynukleotidphosphorylase oder immobilisierte Enzyme davon hergestellt werden. Weiter sind Natriumpolyinosinat, Natriumpolycytidylat, etc., die kommerziell als Interferon-induzierende Reagenzien erhältlich sind, auch als Ausgangsmaterial verwendbar.
Das erfindungsgemäße doppelsträngige Polynukleotid mit gekürzter Kette kann hergestellt werden, indem in einer geeigneten Lösung (z.B. 0,15 M NaCl-enthaltender 10 mM Tris-Salzsäurepuffer (Tris-HCl-Puffer, pH 7)) zwei Polynukleotide mit gekürzter Kette, die zur Bildung eines Doppelstrangs zwischen Polynukleotiden, die weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthalten und wie oben hergestellt werden, fähig sind, gemischt werden oder alternativ, indem es ihnen ermöglicht wird, sich auf konventionelle Weise anzulagern. Das Anlagerungsverfahren ist hierbei beispielsweise ein Verfahren, bei dem eine Lösung, die zwei Polynukleotide mit gekürzter Kette enthält, die zur Bildung eines Doppelstrangs fähig sind, auf 70 bis 80°C erhitzt wird und dann graduell abgekühlt wird.
Ein Polynukleotid mit gekürzter Kette mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen oder ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen, die wie oben beschrieben erhalten wurden, können durch Lyophilisierung behandelt werden, um ein lyophilisiertes Produkt zu ergeben, das für einen langen Zeitraum lagerbar ist. Die Lyophilisierungsbehandlung kann auf konventionelle Weise durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein lyophilisiertes Produkt wie folgt erhalten werden: eine Lösung eines Polynukleotids mit gekürzter Kette, das unter den oben genannten Bedingungen erhalten wurde, wird durch Filtration sterilisiert, das Filtrat wird dann in einen Metallbehälter, der zuvor durch Hitzetrocknungssterilisation behandelt wurde, gegossen, eine Prä-Gefrierung wird bei einer Eigentemperatur von –40 bis –20°C für ungefähr 1 bis 4 Stunden durchgeführt und die primäre Trocknung wird vor der sekundären Trocknung durchgeführt, die unter einem reduzierten Druck bei einer Eigentemperatur von 15 bis 30°C (für ungefähr 10 bis 50 Stunden) durchgeführt wird. Im Allgemeinen kann ein solches lyophilisiertes Produkt nach einer Wiederherstellung (erneutes Lösen) durch den Zusatz einer geeigneten Lösung wie injizierbares Wasser, destilliertes Injektionswasser, physiologischer Kochsalzlösung, Maltoselösung, Glucoselösung oder dergleichen verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf Arten hergestellt werden, die denen ähnlich sind, die allgemein für die Herstellung von Liposomen verwendet werden, wobei die Zusammensetzung einen Komplex (hier als der vorliegende Komplex bezeichnet), der aus einem Träger, der zur Einführung eines Arzneimittels in eine Zelle wirksam ist, und einem Polynukleotid mit zwei gekürzten Ketten, das 2'-5'-Phosphodiesterbindungen bei einem Anteil von 3% oder weniger, basierend auf den gesamten Phosphodiesterbindungen und das zur Bildung eines Doppelstrangs fähig ist, gebildet wird, umfasst, oder ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette, das zwischen den beiden Polynukleotiden mit gekürzter Kette gebildet ist und zur Bildung eines Doppelstrangs als ein essentieller Inhaltsstoff fähig ist, umfasst. Insbesondere kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Injektion durch die folgenden Schritte hergestellt werden, die den Zusatz von Wasser (injizierbares Wasser, destilliertes Injektionswasser, physiologischer Kochsalzlösung und dergleichen) zu einem Träger, der zur Einführung eines Arzneimittels in eine Zelle wirksam ist, z.B. einem kanonischen Liposom oder Grundstoffe davon (z.B. Glycerinderivate wie 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin und dergleichen und Phospholipid); Rühren des Gemisches; Behandlung des Gemisches mit einer geeigneten Vorrichtung zur Dispersion, z.B. einem Homomischer, einem Homogenisierer, einer Ultraschalldispersionsvorrichtung, einem Ultraschallhomogenisierer, einer Hochdruckemulsionsdispersionsvorrichtung, Microfluidizer (Markenname), Nanomizer (Markenname), De Bee 2000 (Markenname), Ultimizer (Markenname) oder Hochdruckhomogenisierer des Manton-Gaulin-Typs; Zusatz eines erfmdungsgemäßen Polynukleotids mit gekürzter Kette oder eines doppelsträngigen Polynukleotids mit gekürzter Kette zu der entstehenden Lipid-Dispersion; erneutes Dispergieren des Gemisches durch Behandlung mit einer geeigneten Dispersionsvorrichtung und anschließende Sterilisation der entstehenden Zusammensetzung durch Filtration oder dergleichen umfassen. Es können beliebige andere Zusätze in einer zweckmäßigen Stufe während der Herstellung ohne eine bestimmte Beschränkung dazugegeben werden. Alternativ kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung, die den vorliegenden Komplex enthält, wie folgt hergestellt werden. Ein Gemisch eines Trägers, der zur Einführung eines Arzneimittels in eine Zelle wirksam ist, z.B. ein kationisches Liposom oder eine Grundsubstanz davon (z.B. Glycerinderivate wie 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin und dergleichen sowie Phospholipide), und ein erfindungsgemäßes Polynukleotid mit gekürzter Kette oder ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette wird als erstes hergestellt. Zu dem vorstehend hergestellten Gemisch wird Wasser dazugegeben, während gleichzeitig die Dispersionsbehandlung durchgeführt wird. Es kann auch eine erfindungsgemäße Zusammensetzung über einen geeigneten groben Dispersionsschritt während der oben beschrieben Verfahren durchgeführt werden.
Die entstehende erfindungsgemäße Zusammensetzung kann lyophilisiert werden, wodurch eine lyophilisierte Präparation einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung erhalten wird, die für einen langen Zeitraum lagerbar ist. Die Lyophilisierung kann auf konventionelle Weise durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine bestimmte Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die durch die oben genannte Dispersion erhalten worden ist und durch Filtration sterilisiert wurde, in ein Gefäß überführt werden. Die Lyophilisierung wird durchgeführt, indem das Gefäß einer Prä-Gefrierung bei einer Temperatur von ungefähr –40 bis –20°C für 2 bis 3 Stunden ausgesetzt wird und die Primärtrocknung bei einer Temperatur zwischen 0 und 10°C unter reduziertem Druck und die Sekundärtrocknung bei einer Temperatur zwischen 15 und 25°C unter reduziertem Druck durchgeführt wird. Im Allge meinen wird das Gefäß, nachdem der Innenraum mit einem inerten Gas, wie Stickstoffgas, gefüllt wurde, verschlossen, um eine lyophilisierte Präparation einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zu ergeben.
Die lyophilisierte Präparation von einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann nach der Rekonstitution verwendet werden, indem eine geeignete Lösung vor der Verwendung dazugegeben wird. Beispiele für eine solche Lösung zur Rekonstitution umfassen injizierbares Wasser, destillierbares Injektionswasser, physiologische Kochsalzlösung, Maltoselösung, Glucoselösung und andere allgemeine Infusionslösungen und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und die lyophilisierte Präparation davon kann in Form einer pharmazeutischen Präparation als ein Arzneimittel verwendet werden. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und die lyophilisierte Präparation besitzen als Arzneimittel eine pharmakologische Aktivität, die auf das aktive Polynukleotid zurückzuführen ist. Die spezifischen Beispiele des Arzneimittels umfassen Interferon-induzierende Agenzien, immunaktivierende Agenzien, intrazelluläre Nuklease-aktivierende Agenzien, Krebsbehandlungs- oder -vorbeugungsagenzien und Hepatitisbehandlungs- oder -vorbeugungsagenzien.
BESTER MODUS ZUR DURCHFÜHRUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die folgenden Beispiele und Experimente veranschaulichen die vorliegende Erfindung im weiteren Detail. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele und Experimente beschränkt.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Zu 8 g von Trinatriuminosin-5'-diphosphat und 1 g Magnesiumchlorid wurden 500 ml eines 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Puffers zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Nachdem der pH durch Zusatz von 6 N Natriumhydroxid auf 9,3 eingestellt wurde, wurde das Gemisch für eine Stunde bei 38°C stehen gelassen. Zu dem Gemisch wurden 1 ml einer Polynukleotidphosphorylaselösung zugegeben und die Reaktion wurde bei 38°C für 18 Stunden durchgeführt. Nachdem die Reaktion durch Zusatz von 25 ml 0,2 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gestoppt wurde, wurden 10 ml gesättigte Kochsalzlösung und 500 ml reines Ethanol zugegeben, um Polyinosinsäure zu präzipitieren (1973 b).
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Zu 10 g Trinatriumcytidin-5'-diphosphat und 3 g Manganchlorid wurden ungefähr 1 Liter 0,2 M Natriumhydrogencarbonat-Natriumhydroxid-Puffer zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Nachdem der pH durch Zusatz von 6 N Natriumhydroxid auf 9,8 eingestellt wurde, wurde das Gemisch für ungefähr eine Stunde bei 36°C stehen gelassen. Zu dem Gemisch wurden 2 ml einer gereinigten Polynukleotidphosphorylaselösung zugegeben und die Reaktion wurde bei 36°C für 24 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 50 ml 0,2 M EDTA gestoppt. Zu dem Gemisch wurden dann 20 ml gesättigte Kochsalzlösung und 1 l reines Ethanol zugegeben, um Polycytidylsäure zu präzipitieren (3300 b).
BEISPIEL 1
Die in Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Polyinosinsäure wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Präzipitat wurde in 500 ml injizierbares Wasser neu gelöst und einer Dialyse ausgesetzt. Die innere Lösung wurde nach der Dialyse mit einem aktivierten Kohlenstoff behandelt und filtriert, um den aktivierten Kohlenstoff zu entfernen. Zu dem Filtrat wurden 6 N Natriumhydroxid zugegeben, um den pH auf 8,5 einzustellen. Die Hydrolyse wurde durch Erhitzen auf 70°C für 8 Stunden durchgeführt, um die Polyinosinsäurekette zu verkürzen. Die entstehende Lösung von Polynukleotid mit gekürzter Kette wurde mit einem aktivierten Kohlenstoff behandelt, filtriert, um den aktivierten Kohlenstoff zu entfernen und dialysiert. Die innere Lösung wurde nach der Dialyse durch Filtration sterilisiert. Das Filtrat wurde einer Lyophilisierung auf konventionelle Weise durchgeführt, um 1,9 g eines lyophilisierten Produkts von erfindungsgemäßem Polynukleotid mit gekürzter Kette (Polyinosinat, Natriumsalz) mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen zu erhalten (Phosphatumlagerungsrate: 0,2%, durchschnittliche Kettenlänge: 360 b).
BEISPIEL 2
Die in Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Polycytidylsäure wurde durch Zentrifugation aufgetrennt. Das Präzipitat wurde in 500 ml injizierbares Wasser neu gelöst und einer Dialyse ausgesetzt. Die innere Lösung wurde nach der Dialyse mit einem aktivierten Kohlenstoff behandelt und filtriert, um den aktivierten Kohlenstoff zu entfernen. Zu dem Filtrat wurden 6 N Natriumhydroxid zugegeben, um den pH auf 9,0 anzupassen. Die Hydrolyse wurde durch Erhitzen auf 80°C für 4 Stunden durchgeführt, um die Polycytidylsäurekette zu verkürzen. Die entstehende Lösung von Polynukleotid mit gekürzter Kette wurde mit einem aktivierten Kohlenstoff behandelt, filtriert, um den aktivierten Kohlenstoff zu entfernen, und dialysiert. Die innere Lösung wurde nach der Dialyse durch Filtration sterilisiert. Das Filtrat wurde auf konventionelle Weise lyophilisiert, um 2,7 g eines lyophilisierten Produkts des erfindungsgemäßen Polynukleotids mit gekürzter Kette (Polycytidylat, Natriumsalz) mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen zu erhalten (Phosphatumlagerungsrate: 0,1%, durchschnittliche Kettenlänge: 318 b).
BEISPIEL 3
Zu 1 g Natriumpolyadenylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 7,2, Seikagaku Corporation) wurden 200 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Die Hydrolyse wurde durch Erhitzen auf 60°C für 48 Stunden durchgeführt, um die Polyadenylsäurekette zu verkürzen, während die durchschnittliche Kettenlänge entsprechend dem in Experiment 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Die Lösung von Polynukleotid mit gekürzter Kette wurde einer Dialyse unterzogen. Die innere Lösung wurde nach der Dialyse auf konventionelle Weise einer Lyophilisierung unterzogen, um 0,3 g eines lyophilisierten Produkts von dem erfindungsgemäßen Polynukleotid mit gekürzter Kette (Polyadenylat, Natriumsalz) mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen zu erhalten (Phosphatumlagerungsrate: 1,9%, durchschnittliche Kettenlänge: 154 b).
BEISPIEL 4
Zu 1 g Natrium Polyuridylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante: 6,5, Seikagaku Corporation) wurden 200 ml 0,2 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Die Hydrolyse wurde durch Erhitzen auf 60°C für 25 Stunden durchgeführt, um die Polyadenylsäurekette zu verkürzen, während die durchschnittliche Kettenlänge entsprechend dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Die entstehende Lösung von Polynukleotid mit gekürzter Kette wurde einer Dialyse unterzogen. Die innere Lösung wurde auf konventionelle Weise einer Lyophilisierung unterzogen, um 0,2 g eines lyophilisierten Produkts von dem erfmdungsgemäßen Polynukleotid mit gekürzter Kette (Polyuridylat, Natriumsalz) mit weniger umgelagerten Phosphatgruppen zu erhalten (Phosphatumlagerungsrate: 1,2%, durchschnittliche Kettenlänge: 108 b).
BEISPIEL 5
Zu 250 mg Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) wurden 50 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Die Lösung wurde auf eine Temperatur zwi schen 50 und 120°C erhitzt, die für eine Kettenverkürzung geeignet ist. Polyinosinsäuren, die eine ausreichende Kettenlänge haben, wurden als Proben genommen, während die durchschnittliche molekulare Länge durch das in Experiment 5 beschriebene Verfahren bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die entstehenden Proben wurden dialysiert und auf konventionelle Weise lyophilisiert, um lyophilisierte Produkte zu erhalten.
Tabelle 1
BEISPIEL 6
Zu 250 mg Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) wurden 50 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) zugegeben, und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Die Lösung wurde auf eine Temperatur zwischen 55 und 120°C erhitzt, die zur Kettenverkürzung geeignet ist. Polycytidylsäuren, die eine ausreichende Kettenlänge besitzen, wurden als Proben genommen, während die durchschnittliche molekulare Länge durch das in Experiment 5 beschriebene Verfahren bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die entstehenden Probenlösungen wurden dialysiert und auf konventionelle Weise lyophilisiert, um lyophilisierte Produkte zu erhalten.
Tabelle 2
Aus den Ergebnissen, die in den Beispielen 5 und 6 erhalten wurden, geht hervor, dass in dem Kettenverkürzungsprozess von kommerziell erhältlichem Natriumpolyinosinat oder Natriumpolycytidylat eine ausreichende Hydrolyse nicht erreicht werden konnte, wenn die Kettenverkürzung bei 55°C oder weniger durchgeführt wurde. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Kettenlänge mehr als 1 kb betrug, selbst nach ungefähr 50 Stunden einer Kettenverkürzungsreaktion. Andererseits war in Proben, in denen die Kettenverkürzung bei 120°C oder 90°C durchgeführt wurde, die Kontrolle der Kettenverkürzung aufgrund der zu schnellen Hydrolyserate schwierig. Insbesondere in der Probe, bei der die Kettenverkürzung bei 120°C durchgeführt wurde, war die Kette bis nahezu auf die Länge von Oligonukleotiden stark verkürzt, selbst nach 1 bis 1,5 Stunden einer Kettenverkürzung. In dieser Probe war die Phosphatumlagerungsrate hoch und es wurde auch ein Abbau des Basenrestes festgestellt.
BEISPIEL 7
100 mg Natriumpolyadenylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 7,2, Seikagaku Corporation) wurden in 100 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) aufgelöst. Zu der Lösung wurde Nuklease-P₁ zugegeben (abgeleitet von Penicillium citrinum, Seikagaku Corporation). Das Gemisch wurde bei 25°C für 3 Stunden inkubiert, während die durchschnittliche Kettenlänge entsprechend dem in Experiment 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, um die Polyadenylsäurekette zu verkürzen (Phosphatumlagerungsrate: 0,1%, durchschnittliche Kettenlänge: 287 b).
BEISPIEL 8
Zu 1 g Trinatriumuridin-5'-diphosphat und 0,3 g Magnesiumchlorid wurden zu 100 ml eines 0,2 M Natriumhydrogencarbonat-Natriumhydroxid-Puffers zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Nach dem Einstellen des pHs auf 9,5 mit 1 N Natriumhydroxid, wurden 0,2 ml Polynukleotidphosphorylase zugegeben. Das Gemisch wurde dann für 10 Stunden bei 25°C reagieren gelassen, während die durchschnittliche Kettenlänge entsprechend dem in Experiment 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Nachdem die Reaktion durch Zusatz von 5 ml 0,2 M EDTA abgestoppt wurde, wurden 2 ml gesättigte Kochsalzlösung und 100 ml Ethanol zugegeben, um Polyuridylsäure zu präzipitieren (549 b). Die Polyuridylsäure wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Präzipitat wurde in 50 ml injizierbares Wasser neu gelöst und dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde auf einen pH von 8,5 mit 1 N Natriumhydroxid eingestellt und bei 80°C für 30 Minuten hydrolysiert, um die Kettenlänge der Polyuridylsäure zu regulieren. Die entstehende Lösung von Polynukleotid mit gekürzter Kette wurde einer Membranauftrennung durch Ultrafiltration unterzogen, um so die Verteilung der Kettenlänge anzupassen und um nicht benötigtes Salz, Zwischenprodukte während der Kettenverkürzungsreaktion oder dergleichen zu entfernen (Phosphatumlagerungsrate: 0,1%, durchschnittliche Kettenlänge: 485 b).
BEISPIEL 9
Zu 1 g 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin und 2 g gereinigtem Dotter-Lecithin wurden 40 g Maltose zugegeben, das in 100 ml injizierbarem Wasser gelöst war. Das Gemisch wurde gerührt und 5 Minuten mit einem Homogenisierer verteilt, um eine Rohdispersion eines kationischen Liposoms (Träger) zu erhalten. Die Rohdispersion wurde weiter für eine Stunde mit einer kleinen Emulgator-Dispersionslaborvorrichtung verteilt, um eine kationische Liposomenlösung zu erhalten. Zu der kationischen Liposomenlösung wurden 50 ml einer wässrigen Lösung, die 200 mg von jeweils dem Natriumpolyinosinat mit gekürzter Kette und Natriumpolycytidylat, die jeweils weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten und die in den Beispielen 1 und 2 gewonnen wurden, enthielten, unter Rühren graduell dazugegeben. Das Gemisch wurde dann mit einer kleinen Emulgator-Dispersionslaborvorrichtung für weitere 2 Stunden behandelt und schließlich auf ein Volumen von 400 ml mit injizierbarem Wasser eingestellt, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die den vorliegenden Komplex enthält. Die Zusammensetzung, die den vorliegenden Komplex enthält, wurde durch Filtration sterilisiert, in 1 ml Aliquote in Gefäße aufgeteilt und auf konventionelle Weise in eine lyophilisierte Präparation umgewandelt. Wenn die lyophilisierte Präparation durch den Zusatz von injizierbarem Wasser auf ein Volumen von 1 ml rekonstituiert wurde, betrug der durchschnittliche Teilchendurchmesser des vorliegenden Komplexes 133 nm, wenn er anhand des Photonenkorrelationsverfahrens bestimmt wurde.
BEISPIEL 10
Zu 50 g 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-dioleoylglycerin und 25 g Sojabohnen-Lecithin wurden 1 kg Saccharose, die in 3 l injizierbarem Wasser gelöst war, zugegeben. Das Gemisch wurde gerührt und für 30 Minuten mit einem Hochdruckhomogenisierers des Manton-Gaulin-Typs verteilt und das Volumen wurde auf 5 l mit injizierbarem Wasser eingestellt, um eine Dispersion von kationischem Liposom (Träger) zu erhalten. Zu der Träger-Dispersion wurden ungefähr 2 l an wässriger Lösung, die 1 g von jeweils dem Natriumpolyinosinat mit gekürzter Kette und dem Natriumpolycytidylat, die jeweils weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten, und in den Beispielen 1 und 2 gewonnen wurden, enthielten, unter Rühren dazugegeben. Die Dispersion wurde auf einen pH von 5,5 mit 1 N Salzsäure eingestellt und mit einem Hochdruckhomogenisierer des Manton-Gaulin-Typs für eine weitere Stunde verteilt, und schließlich wurde das Volumen auf 10 l mit injizierbarem Wasser eingestellt, um eine Zusammensetzung mit dem vorliegenden Komplex zu erhalten. Die Zusammensetzung, die den vorliegenden Komplex enthält, wurde dann in 20 ml Aliquote in Gefäße aufgeteilt und in eine lyophilisierte Präparation auf konventionelle Weise umgewandelt. Wenn die lyophilisierte Präparation durch den Zusatz von injizierbarem Wasser rekonstituiert wurde, um das Volumen auf 20 ml zu bringen, betrug der durchschnittliche Teilchendurchmesser des vorliegenden Komplexes 158 nm, wenn er anhand des Photonenkorrelationsverfahrens bestimmt wurde.
BEISPIEL 11
Zu 1 g 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin und 2 g Dotter-Phosphatid wurden 40 g Glucose zugegeben, die in 100 ml injizierbarem Wasser gelöst war. Das Gemisch wurde gerührt und für 5 Minuten mit einem Homogenisierer verteilt und das Volumen wurde auf 500 ml eingestellt, um eine Rohdispersion von einem kationischen Liposom (Träger) zu erhalten. Die Rohdispersion wurde weiter für eine Stunde mit einer kleinen Emulgator-Labordispersionvorrichtung verteilt, um eine kationische Liposomenlösung zu erhalten. Die Lösung wurde in 10 ml Aliquote in Gefäßen verteilt und auf konventionelle Weise lyophilisiert. Zu dem lyophilisierten Produkt wurden 10 ml einer wässrigen Lösung, die jeweils 5 mg des gekürzten Natriumpolyinosinats und Natriumpolycytidylats, die jeweils weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten und in den Beispielen 1, 2 oder 5, 6 gewonnen wurden und 5 mg von jeweils dem kommerziell erhältlichen Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) und Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) enthielt, zugegeben. Das Gemisch wurde einer Dispersionsbehandlung für 10 Minuten mit einer Ultraschalldispersionsvorrichtung des Sondentyps unterzogen, um eine Zusammensetzung, die den vorliegenden Komplex enthält, zu erhalten.
BEISPIEL 12
Eine wässrige Lösung (1 ml), die jeweils 100 μg des Natriumpolyadenylats mit gekürzter Kette und Natriumpolyuridylats, die jeweils weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten, und in den Beispielen 3 und 4 gewonnen wurden und 2 ml einer wässrigen Lösung, die 2 mg eines kommerziell erhältlichen Lipofectins (Marken name) enthielt, wurden unter Rühren gemischt. Das Gemisch wurde für 15 Minuten mit einer Ultraschalldispersionsvorrichtung des Sondentyps verteilt, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die den vorliegenden Komplex enthält.
BEISPIEL 13
Zu ungefähr 200 mg Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) wurden 0,2 M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Das Gemisch wurde auf 80°C erhitzt und es wurden Proben von Polyinosinsäuren, die eine ausreichende Phosphatumlagerungsrate haben, entnommen, während die Phosphatumlagerungsrate durch das in Experiment 6 beschriebene Verfahren bestimmt wurde. Polyinosinsäure wurde von jeder Phosphatumlagerungsrate auf 60°C in einem Borat-Puffer erhitzt (pH 8,5), bis die durchschnittliche Kettenlänge 200 ± 50 b betrug, während die Kettenlänge entsprechend dem in Experiment 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die jeweiligen Lösungen mit Polyinosinsäure mit gekürzter Kette, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden dialysiert und auf konventionelle Weise lyophilisiert, um ein lyophilisiertes Produkt zu erhalten.
Tabelle 3
BEISPIEL 14
Zu ungefähr 200 mg Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) wurden 0,2 M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Das Gemisch wurde auf 80°C erhitzt und es wurden Proben von Polycytidylsäuren, die eine ausreichende Phosphatumlagerungsrate haben, entnommen, während die Phosphatumlagerungsrate durch das in Experiment 6 beschriebene Verfahren kontrolliert wurde. Polycytidylsäure von jeder Phosphatumlagerungsrate wurde auf 70°C in einem Borat-Puffer (pH 8,5) erhitzt, um die Kettenlänge zu verkürzen, bis die durchschnittliche Kettenlänge 200 ± 50 b betrug, während die Kettenlänge entsprechend dem in Expe riment 5 beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die jeweiligen Lösungen von Polyinosinsäure mit gekürzter Kette, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden dialysiert und auf konventionelle Weise lyophilisiert, um ein lyophilisiertes Produkt zu erhalten.
Tabelle 4
BEISPIEL 15 Doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette
Doppelsträngige Polynukleotide mit gekürzter Kette (doppelsträngige RNAs) wurden ausgehend von den folgenden Kombinationen hergestellt: Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 0,7%) und Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 1,2%); Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,0%) und Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 1,9%); Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,8%) und Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,7%), die entsprechend den Verfahren der Beispiele 1, 2, 11 oder 12 erhalten wurden. Jedes der doppelsträngigen Polynukleotide mit gekürzter Kette wurde hergestellt, indem Natriumpolyinosinat und Natriumpolycytidylat in Tris-HCl-Puffer (pH 7, enthaltend 0,15 M NaCl) gelöst wurde, die Lösung auf 80°C für 5 Minuten erhitzt wurde und die Lösung graduell abgekühlt wurde.
VERGLEICHSBEISPIEL 1
Dieses Vergleichsbeispiel entspricht Beispiel 1 oben, wobei die Präparation durch ein konventionelles Verfahren durchgeführt wird (Präparation-1).
Zu 5 mg Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) wurden 10 ml injizierbares Wasser zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Formamid zugegeben und das Gemisch wurde auf 80°C für 5 Stunden erhitzt (Phosphatumlagerungsrate: 8,9%, durchschnittliche Kettenlänge: 628 b).
VERGLEICHSBEISPIEL 2
Dieses Vergleichsbeispiel entspricht Beispiel 2 oben, wobei die Präparation durch ein konventionelles Verfahren durchgeführt wurde (Präparation-1).
Zu 5 mg Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) wurden 10 ml injizierbares Wasser zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Formamid zugegeben und das Gemisch wurde auf 80°C für 5 Stunden erhitzt (Phosphatumlagerungsrate: 4,2%, durchschnittliche Kettenlänge: 751 b).
VERGLEICHSBEISPIEL 3
Dieses Vergleichsbeispiel entspricht Beispiel 1 oben, wobei die Präparation durch ein konventionelles Verfahren durchgeführt wurde (Präparation-2).
Zu 5 mg Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) wurden 10 ml injizierbares Wasser zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Die Lösung wurde auf 90°C für 8 Stunden erhitzt (Phosphatumlagerungsrate: 7,1%, durchschnittliche Kettenlänge: 213 b).
VERGLEICHSBEISPIEL 4
Dieses Vergleichsbeispiel entspricht Beispiel 2 oben, wobei die Präparation durch ein konventionelles Verfahren durchgeführt wurde (Präparation-2).
Zu 5 mg Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) wurden 10 ml injizierbares Wasser zugegeben und das Gemisch wurde zur Auflösung gerührt. Diese Lösung wurde auf 90°C für 12 Stunden erhitzt (Phosphatumlagerungsrate: 4,2%, durchschnittliche Kettenlänge: 289 b).
VERGLEICHSBEISPIEL 5
Ein doppelsträngiges Polynukleotid mit gekürzter Kette (doppelsträngige RNA) wurde hergestellt, indem Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 4,2%) mit Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 3,8%), die in den Beispielen 11 bzw. 12 hergestellt worden sind, miteinander kombiniert. Die doppelsträngigen Polynukleotide mit gekürzter Kette wurden hergestellt, indem Natriumpolyinosinat und Natriumpolycytidylat in Tris-HCl-Puffer (pH 7, enthaltend 0,15 M NaCl) gelöst wurden, die Lösung auf 80°C für 5 Minuten erhitzt wurde und die Lösung graduell abgekühlt wurde.
EXPERIMENT 1 Einfluss der durchschnittlichen Kettenlänge auf die pharmakologische Aktivität
Die pharmakologische Aktivität der Zusammensetzung von Beispiel 9 wurde in vitro entsprechend der Wachstums-inhibierenden Wirkung auf HeLa-S3-Krebszellen bestimmt. HeLa-S3-Krebszellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung angeimpft und für 24 Stunden oder länger kultiviert, bis die ausreichende Adhäsion der Zelle an die Platte bestätigt wurde. Zu der Platte wurde eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zugegeben und die Kultivierung wurde fortgesetzt. Nach einer dreitägigen Kultivierung in einem CO₂-Inkubator wurde die Anzahl von lebenden Zellen durch ein MTT-Verfahren gezählt. Die Inhibitionsrate des Zellwachstums wurde gemäß der folgenden Formel (I) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5

*: Poly(I) = Polyinosinsäure Poly(I), Na = Polyinosinat, Natriumsalz
**: Poly(C) = Polycytidylsäure Poly(C), Na = Polycytidylat, Natriumsalz
(a): Polyinosinat, Natriumsalz (Yamasa Corporation)
(b): Polycytidylat, Natriumsalz (Yamasa Corporation)

Aus Tabelle 5 geht hervor, dass die Zellwachstums-inhibierende Wirkung von jeder Zusammensetzung auf HeLa-S3, einem Krebszellstamm, mit der durchschnittlichen Kettenlänge sehr stark korreliert. Tabelle 5 zeigt, dass Polyinosin-/Polycytidylsäuren mit einer langen Kettenlänge von mehr als 1000 b, die im Allgemeinen als Interferon-induzierende Agenzien verwendet werden, die stärkste Wachstums-inhibierende Wirkung zeigen. Die erfindungsgemäße Polyinosin-/Polycytidylsäuren mit gekürzter Kette, die eine durchschnittliche Kettenlänge im Bereich von 0,1 kb bis 1 kb besitzen und weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthalten, besitzen noch eine ausreichend hohe Wachstums-inhibierende Aktivität, obwohl diese etwas schwächer ist. Eine solche Wachstums-inhibierende Wirkung nahm bei einem Polynukleotid, das eine durchschnittliche Kettenlänge von weniger als 100 b aufwies, stark ab und solche, die die durchschnittliche Kettenlänge aufwiesen, die ähnlich der von Oligonukleotiden war, zeigten nur eine kleine Wirkung.
EXPERIMENT 2 Einfluss auf Knochenmarkszellen
Die Bewertung der Toxizität wurde auf der Basis der Toxizität auf Knochenmark durchgeführt. Männlichen ddY-Mäusen (männlich, 8 Wochen alt) wurden jeweils die folgenden Proben durch intravenöse Injektion verabreicht: kommerziell erhältliches Natriumpolyinosinat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,8, Yamasa Corporation) und Natriumpolycytidylat (S°_20,w (Sedimentationskonstante): 8,6, Yamasa Corporation) und Polyinosinsäure und Polycytidylsäure, die weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten, und die eine durchschnittliche Kettenlänge von 982 b bzw. 907 b aufwiesen und die in den Beispielen 5 und 6 hergestellt wurden. Am nächsten Tag wurden Knochenmarkszellen vom Oberschenkel gesammelt, mit New-Methylenblau und Giemsa gefärbt und untersucht, um die Anzahl von Reticulocyten und gereiften Erythrocyten zu zählen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt, wobei die Knochenmarkstoxizität als Verhältnis der Anzahl von Reticulocyten gegenüber der Gesamtzahl von gereiften Erythrocyten ausgedrückt wird und durch die folgende Formel definiert wird. Die Kennzeichnung * bedeutet, dass es einen signifikanten Unterschied gibt, basierend auf dem Multi-Vergleichsverfahren von Dunnett bei einem signifikanten Spiegel von p < 0,01 zwischen der Testgruppe und der Kontrollgruppe, die eine intravenöse Verabreichung von einem Vehikel ohne Polynukleotid erhielt.
Tabelle 6

1): Poly(I) = Polyinosinsäure
2): Poly(C) = Polycytidylsäure
(a): Polyinosinat, Natriumsalz (Yamasa Corporation)
(b): Polycytidylat, Natriumsalz (Yamasa Corporation)

Aus Tabelle 6 geht hervor, dass die Veränderung bei der Knochenmarkstoxizität, basierend auf der der Kontrolle, bis zu 39% bei der Dosierung von 1 mg/kg in den Fällen von Polyinosin-/Polycytidylsäure, die eine Kettenlänge von über 1000 b besitzt und im Allgemeinen als ein Interferon-induzierendes Agens verwendet wird, erreichte, während es keinen signifikanten Unterschied in den Fällen der Polyinosin-/Polycytidylsäure mit gekürzter Kette, die eine durchschnittliche Kettenlänge zwischen 0,1 kb und 1 kb aufwies und weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielt im Vergleich zur Kontrolle gab, selbst bei einer 25-fachen Dosierung. Die Ergebnisse oben veranschaulichen, dass die Toxizität von Polyinosinsäure und Polycytidylsäure stark mit der durchschnittlichen Kettenlänge korrelierte, ähnlich wie deren pharmakologischen Aktivität. Es war unerwartet überraschend festzustellen, dass das erfindungsgemäße Polynukleotid mit gekürzter Kette eine solche Toxizität in signifikanter Weise verbessern konnte.
EXPERIMENT 3 Zellwachstums-inhibierende Wirkung (in vitro) auf A431-Krebszellen (durchschnittliche Kettenlänge: 200 ± 50 b)
Es wurde eine Zusammensetzung auf die gleiche Weise wie die in Beispiel 9 beschriebene hergestellt, unter Verwendung der Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 0,7–4,2%) und Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 1,2– 3,8%), die in den Beispielen 11 und 12 erhalten wurden und die Polyinosinsäure mit gekürzter Kette und Polycytidylsäure, die in den Beispielen 1 und 2 erhalten wurden. A431-Krebszellen wurden in eine Platte mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 10⁴ Zellen/Vertiefung angeimpft und für 5 Stunden oder länger kultiviert, bis eine ausreichende Adhäsion der Zellen an die Platte festzustellen war. Zu der Platte wurde jede der Zusammensetzungen dazugegeben und die Kultivierung wurde fortgeführt. Nach einer dreitägigen Kultivierung in einem CO₂-Inkubator wurde die Anzahl der lebenden Zellen durch ein MTT-Verfahren gezählt. Die Inhibitionsrate des Zellwachstums wurde entsprechend der Formel (I) berechnet und die Gesamtkonzentration von Natriumpolyinosinat und Natriumpolycytidylat, die 50% der Inhibitionsrate des Zellwachstums (IC₅₀) entspricht, wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 hervorgeht, korrelierte die Zellwachstums-inhibierende Wirkung der Zusammensetzung auf A431-Krebszellen stark mit der Phosphatumlagerungsrate. Das bedeutet, dass mit der Zunahme von Phosphatgruppen, die sich von einer 3'-Position an eine 2'-Position umgelagert haben, die Wachstums-inhibierende Wirkung schwächer wird, unabhängig davon, ob es sich um Polyinosinsäure oder Polycytidylsäure handelt. Es ist dabei anzumerken, dass die Wachstums-inhibierende Wirkung bei einer Kombination der erfindungsgemäßen Polyinosinsäure mit gekürzter Kette und Polycytidylsäure mit gekürzter Kette, die jeweils weniger umgelagerte Phosphatgruppen enthielten (Phosphatumlagerungsrate 3% oder weniger, bevorzugt 2% oder weniger) bemerkenswert stark war. Andererseits wurde bei einer Kombination von Polyinosinsäure mit Polycytidylsäure, die jeweils eine Phosphatumlagerungsrate von mehr als 2%, bevorzugt 3% oder mehr aufwiesen, die Wirkung in synergistischer Weise schwächer. Zum Beispiel wird in Tabelle 7 gezeigt, dass eine Kombination von Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,0%) mit Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 1,9%), eine verbesserte IC₅₀-Rate um das 12-fache oder 47-fache zeigte im Vergleich zu Kombinationen von Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,8%) mit Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 2,7%) bzw. Polyinosinsäure (Phosphatumlagerungsrate: 4,2%) mit Polycytidylsäure (Phosphatumlagerungsrate: 3,8%). Es war höchst unerwartet, dass die pharmakologische Aktivität sich im gleichen Maße erhöhte, wie sich die Umlagerungsrate von Phosphatgruppen von einer 3'-Position zu einer 2'-Position um 3%, bevorzugter 2%, gegenüber dem Grenzwert erniedrigte.
EXPERIMENT 4 Einfluss einer Phosphatumlagerung auf die Schmelztemperatur (Tm) und pharmakologische Aktivität
Eine doppelsträngige RNA dissoziiert in zwei einzelsträngige RNAs, wenn die Temperatur auf eine bestimmte Höhe erhöht wird. Die Temperatur variiert in Abhängigkeit von der Art der Basen, aus denen eine RNA aufgebaut ist und die für diese spezifisch sind. Daher wird diese Temperatur als Schmelztemperatur einer doppelsträngigen RNA definiert und wird im Allgemeinen als "Tm-Wert" bezeichnet. Es gibt verschiedene Verfahren, um den Tm-Wert zu messen. In dem vorliegenden Experiment wurde der Tm-Wert von doppelsträngigen RNAs, die in Beispiel 13 und in Vergleichsbeispiel 5 gezeigt sind, durch das üblichste Verfahren gemessen, d.h. durch Absorptionsmessung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Die IC₅₀-Werte, die in Tabelle 8 gezeigt sind, wurden von dem Experiment 3 erhalten.
Tabelle 8
Als Ergebnis der Messung des Tm-Wertes in Polyinosin-/Polycytidylsäure, die eine Phosphatumlagerungsrate im Bereich von ungefähr 0 bis 4% besitzen, wurde kein nennenswerter Unterschied in jeder der Kombinationen festgestellt. (Für Polyinosin-/Polycytidylsäure mit einer langen Kettenlänge, die im Allgemeinen als Interferon-induzierende Agenzien verwendet werden, beträgt der Tm-Wert 61°C). Es wurde festgestellt, dass Polyinosin-/Polycytidylsäure mit einer Phosphatumlagerungsrate von ungefähr 0 bis 4% eine für doppelsträngige RNA charakteristische Doppel-Helix-Struktur bilden kann. Es wurde aber auch festgestellt, dass die immunaktivierende Wirkung und die krebshemmende Wirkung, welche die hauptsächlichen medizinischen Wirkungen von Polyinosin-/Polycytidylsäure darstellen, nicht nur durch die Doppel-Helix-Struktur einer doppelsträngigen RNA beeinflusst werden, sondern auch durch die Umlagerungsrate der Phosphatgruppen, da die pharmakologische Aktivität um das bis zu 40- bis 50-fache oder mehr variiert, wenn die Phosphatumlagerungsrate sich von 2 bis 3% gegenüber dem Grenzwert, wie in Experiment 3 gezeigt, verändert. Zusätzlich wurde überraschend festgestellt, dass die pharmakologische Aktivität stark zunimmt, wenn die Umlagerungsrate der Phosphatgruppen von der 3'-Position zu der 2'-Position sich um 2% bis 3% gegenüber dem Grenzwert verändert.
EXPERIMENT 5 Messung der durchschnittlichen Kettenlänge von Polynukleotiden mit gekürzter Kette (GPC-Verfahren)

Die durchschnittliche Kettenlänge wurde unter Verwendung einer wässrigen Lösung von 1 mg/ml Polynukleotid durch Gelpermeabilitäts-Chromatographie (GPC) unter den folgenden Bedingungen gemessen. Arbeitsbedingungen von GPC:

Detektion:	UV bei 260 nm
Säule:	Tosoh TSK-Gel G5000PWXL ⌀ 7,8 mm × 300 mm
Mobile Phase:	50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 7 M Harnstoff
Durchflussrate:	0,5 ml/Min.
Größenmarker:	RNA-Leiter (1770 b, 1520 b, 1280 b, 780 b, 530 b, 400 b, 280 b, 155 b) (Gibco BRL)

EXPERIMENT 6 Messung der Phosphatumlagerungsrate

Zu 1 ml einer wässrigen Lösung von 1 mg/ml Polynukleotid wurden 3,2 ml wässrige Lösung aus 500 U/ml Nuklease-P₁ (abgeleitet von Penicillium citrinum, Seikagaku Corporation) zugegeben und mit Wasser verdünnt, um das Volumen auf 5 ml zu bringen. Die wässrige Lösung wurde für eine Stunde in einem Wasserbad bei 37°C reagieren gelassen. Es wurde Wasser zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um das Volumen auf 10 ml zu bringen und es wurde ein Teil von 3,2 ml davon abgezweigt. Zu der abgezweigten Lösung wurden 0,8 ml einer wässrigen Lösung aus 0,1 U/ml alkaliner Phosphatase (abgeleitet von Kälberdarm, Seikagaku Corporation) zugegeben und in einem Wasserbad bei 37°C für 30 Minuten reagieren gelassen. Die Lösung wurde in zweckmäßiger Weise verdünnt, durch eine Flüssigkeits-Chromatographie untersucht, und zwar unter den Bedingungen, dass ein Dimer mit einer 2'-5'-Phosphodiesterbindung und die Phosphatumlagerungsrate bestimmt werden können. Arbeitsbedingungen der Flüssigkeitschromatographie:

Detektion:	UV bei 260 nm
Säule:	Shiseido Capcell-Pack C₁₈ UG120 5 μm ⌀ 4,6 mm × 250 mm
Mobile Phase:	Gemischte Lösung (95:5) von 50 mM Phosphatpuffer (pH 8), enthaltend 5 mM Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und Methanol
Durchflussrate:	1 ml/Min.

Claims

Polynucleotid mit gekürzter Kette, das eine mittlere Kettenlänge von 0,1 kBasen bis 1 kBase aufweist, oder ein Salz davon, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der 2'-5'-Phosphodiesterbindung im Bereich von 0,1% bis 3% bezüglich der gesamten Phosphodiesterbindungen liegt.
Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids mit gekürzter Kette oder eines Salzes davon gemäß Anspruch 1, wobei ein Polynucleotid oder Salz davon in einer wässrigen Lösung bei pH 7 bis 10 und bei einer Temperatur von 20 bis 110°C hydrolysiert wird, um die Kette zu verkürzen, und die Phosphatumlagerungsrate gemessen wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids mit gekürzter Kette oder eines Salzes davon gemäß Anspruch 1, wobei ein Polynucleotid oder Salz davon in einer wässrigen Lösung bei pH 4 bis 9 und bei einer Temperatur von 20 bis 60°C mit einer Phosphodiesterase behandelt wird, um die Kette zu verkürzen, und die Phosphatumlagerungsrate gemessen wird.
Polynucleotid oder Salz davon gemäß Anspruch 1, wobei das Polynucleotid Polyinosinsäure oder ein Analog davon, Polycytidylsäure oder ein Analog davon, Polyadenylsäure oder ein Analog davon, Polyuridylsäure oder ein Analog davon ist.
Polynucleotid oder Salz davon gemäß Anspruch 1 oder 4, das in der Form eines Doppelstrangpolynucleotids oder Salzes davon ist, das aus zwei Polynucleotiden oder Salzen davon gebildet ist, die befähigt sind, einen Doppelstrang zu bilden.
Doppelstrangpolynucleotid oder Salz davon gemäß Anspruch 5, wobei die zwei Polynucleotide, welche befähigt sind, einen Doppelstrang zu bilden, ausgewählt sind aus einer Kombination von Polyinosinsäure und Polycytidylsäure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäure, Polyinosinsäureanalog und Polycytidylsäure, Polyinosinsäure und Polycytidylsäureanalog, Polyinosinsäureanalog und Polycytidylsäureanalog, Polyadenylsäureanalog und Polyuridylsäure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäureanalog, und Polyadenylsäureanalog und Polyuridylsäureanalog.
Zusammensetzung, umfassend einen Komplex, der aus einem Träger, der wirksam ist, ein Medikament in eine Zelle einzuführen, und aus einem Polynucleotid oder Salz davon gemäß Anspruch 1 oder 4 oder einem Doppelstrangpolynucleotid oder Salz davon gemäß Anspruch 5 oder 6 als einen wesentlichen Bestandteil gebildet ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Träger, der wirksam ist, ein Medikament in eine Zelle einzuführen, ein positiv geladener Träger ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei der positiv geladene Träger ein kationisches Liposom ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Träger, der wirksam ist, ein Medikament in eine Zelle einzuführen, ein Träger ist, der aus 2-O-(2-Diethylaminoethyl)carbamoyl-1,3-O-dioleoylglycerin und einem Phospholipid als wesentliche aufbauende Komponenten gebildet ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, die in Form einer pharmazeutischen Zubereitung ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei die pharmazeutische Zubereitung ein Interferon induzierendes Mittel, ein immunaktivierendes Mittel, ein intrazellulare Nuclease aktivierendes Mittel, ein Mittel zur Behandlung oder Vorbeugung von Krebs, oder ein Mittel zur Behandlung oder Vorbeugung von Hepatitis ist.