KR20020013500A - 단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 제법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약물로서 유용한 단쇄화 폴리뉴클레이티드 및 이것을 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 전체 인산 디에스테르 결합를 기준으로 하여 2'-5' 인산 디에스테르 결합의 함량이 3% 이하인 것을 특징으로 하는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염, 그리고 이것들을 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 제법{SHORTENED-CHAIN POLYNUCLEOTIDES AND PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF}
폴리이노신산·폴리시티딜산, 즉 poly(I)·poly(C)로 대표되는 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 주지의 화합물이며, 인터페론 유도 작용, 면역 부활(賦活) 작용 등을 지니므로, 간염 치료제나 암 치료제로서의 가능성이 검토되어 왔다.
이러한 폴리뉴클레오티드의 약리 작용은 그 쇄 길이와 높은 상관이 있어서, 쇄 길이가 길어질수록 인터페론 유도 작용 등이 강하게 된다. 그러나, 그 반면 쇄 길이가 길어질수록 독성이 강하게 나타난다.
최근, 폴리뉴클레오티드를 가수분해에 의해 단쇄화한 비교적 짧은 합성 폴리뉴클레오티드를 양이온성 리포솜과 같은, 약물을 세포 내로 이입(移入)하는 데 유효한 담체에 봉입한다고 하는 수법에 의해, 폴리뉴클레오티드의 유용한 약리 작용을 유지하면서, 독성을 경감시키는 시도가 이루어지고 있다(예컨대, PCT WO 99/20283호, PCT WO 99/48531호).
그런데, 상기한 바와 같이 폴리뉴클레오티드를 가수분해에 의해 단쇄화하면, 단쇄화와 동시에 슈우도 로테이션(pseudo rotation)이라는 메카니즘을 통해 일부의 인산기가 3'위에서 2'위로 분자내 전위하는 것이 알려져 있다(예컨대, 「단백질 핵산 효소」 Vol. 40, No.10, pp. 1323-1332(1995) 참조). 그 결과, 단쇄화 폴리뉴클레오티드 분자 내의 3'-5' 인산 디에스테르 결합의 일부가 2'-5' 인산 디에스테르 결합으로 치환되게 된다. 이러한 인산기의 전위 현상이 약리 작용에 어떠한 영향을 미치는지는 알려져 있지 않다.
본 발명은 특히 의약으로서 유용한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 제법에 관한 것이다. 상세하게 말하면, 본 발명은 단쇄화된 합성 폴리뉴클레오티드 또는 그 염에 있어서, 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하, 즉 전체 인산 디에스테르 결합의 인산기에 대하여 3'위(位)에서 2'위로 전위(轉位)한 인산기의 비율(인산 전위율)이 3% 이하인 것을 특징으로 하는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염, 및 이들의 제법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 첫째로 의약으로서 보다 유효하고 보다 안전한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 염, 그리고 그 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 염을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 주로 단쇄화 반응시에 생기는 2'-5' 인산 디에스테르 결합을 일정 비율 이하밖에 갖지 않은 단쇄화 폴리뉴클레오티드 및 그 염이 상기 과제를 해결할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 하나는 단쇄화된 폴리뉴클레오티드 또는 그 염에 있어서, 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하, 바람직하게는 2% 이하인 것을 특징으로 하는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염이다.
또한, 상기 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하, 바람직하게는 2% 이하인 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염에 있어서, 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염으로 형성되는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염도 본 발명으로서 포함된다. 나아가서는, 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체와, 상기 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하인 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염, 또는 그 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염으로 형성되는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 복합체를 함유하는 조성물도 본 발명으로서 포함된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오티드가 인산 디에스테르 결합을 통해 직쇄형으로 중합된 화합물로서, 중합되는 뉴클레오티드의 수가 대개 20개 이상인 것을 말하고, 합성 또는 천연인 것을 들 수 있다. 구체예로는, 폴리이노신산(즉, poly(I)) 또는 그 유사체, 폴리시티딜산(즉, poly(C)) 또는 그 유사체, 폴리아데닐산(즉, poly(A)) 또는 그 유사체, 또는 폴리우리딜산(즉, poly(U)) 또는 그 유사체를 들 수 있다.
폴리이노신산 유사체는 이노신산의 전부 또는 일부가 화학 수식된 단독중합체이거나, 또는 이노신산과 다른 뉴클레오티드와의 공중합체로서, 예컨대 폴리(7-데아자이노신산), 폴리(2'-아지도이노신산)을 들 수 있다. 폴리시티딜산 유사체는 시티딜산의 전부 또는 일부가 화학 수식된 단독중합체이거나, 또는 시티딜산과 다른 뉴클레오티드와의 공중합체로서, 예컨대 폴리(5-브로모시티딜산), 폴리(2-티오시티딜산), 폴리(시티딘-5'-티오인산), 폴리(시티딜산, 우리딜산), 폴리(시티딜산, 4-티오우리딜산), 폴리(1-비닐시티딜산)을 들 수 있다. 폴리아데닐산 유사체, 폴리우리딜산 유사체도 마찬가지이다. 이들 중, 폴리이노신산, 폴리시티딜산이 본 발명에 있어서 적당하다.
본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 평균 쇄 길이로는, 0.1 k bases∼1k bases(base : 염기수, 1 k bases는 1000 염기수, 이후에는 'base(s)'를 단순히 'b'라 칭함)가 적당하고, 바람직하게는 200 b∼800 b이며, 더욱 바람직하게는 300 b∼600 b이다. 해당 평균 쇄 길이는, 예컨대 후술하는 시험예 5와 같은 겔 투과 크로마토그래피법(이후에는 'GPC법'이라고 칭함)에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드는 인산 전위율이 3% 이하이지만, 바람직하게는 2% 이하 또는 0.1%∼2%, 더욱 바람직하게는 1% 이하 또는 0.1%∼1%이다.
폴리뉴클레오티드의 인산기의 3'위에서 2'위로의 전위는, 예컨대 후술하는 시험예 6과 같은 방법에 의해, 용이하게 확인할 수 있다. 즉, 3'-5' 인산 디에스테르 결합을 특이적으로 가수분해하는 뉴클레아제 P1효소에 의해 폴리뉴클레오티드를 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 수준까지 분해한 후, 말단의 인산기를 특이적으로 가수분해하는 알칼리 포스파타아제 효소로 처리함으로써 전체 뉴클레오티드를 뉴클레오시드로 변환시킨다. 한편, 뉴클레아제 P1효소에 의해 분해되지 않는 2'-5' 인산 디에스테르 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드는 알칼리 포스파타아제 효소로 처리하더라도, 분자 내의 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 가수분해되지 않기 때문에 뉴클레오시드로까지 분해되지 않는다. 액체 크로마토그래피 등을 이용하여, 뉴클레오시드와 올리고뉴클레오티드(대부분은 이량체임)를 정량함으로써, 인산 전위율을 구할 수 있다.
본 발명에 있어서의 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드로는, 예컨대 폴리이노신산과 폴리시티딜산, 폴리아데닐산과 폴리우리딜산, 폴리이노신산 유사체와 폴리시티딜산, 폴리이노신산과 폴리시티딜산 유사체, 폴리이노신산 유사체와 폴리시티딜산 유사체, 폴리아데닐산 유사체와 폴리우리딜산, 폴리아데닐산과 폴리우리딜산 유사체, 폴리아데닐산 유사체와 폴리우리딜산 유사체를 들 수 있다. 따라서, 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드로 형성되는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드로는, 예컨대 폴리이노신산·폴리시티딜산, 폴리아데닐산·폴리우리딜산, 폴리이노신산 유사체·폴리시티딜산, 폴리이노신산·폴리시티딜산 유사체, 폴리이노신산 유사체·폴리시티딜산 유사체, 폴리아데닐산 유사체·폴리우리딜산, 폴리아데닐산·폴리우리딜산 유사체, 폴리아데닐산 유사체·폴리우리딜산 유사체를 들 수 있다. 이들 중, 폴리이노신산·폴리시티딜산을 본 발명에 있어서 적당한 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레이티드로서 들 수 있다.
상기 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 평균 쇄 길이는 전체 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 평균 쇄 길이라고 생각하는 것이 적당하며, 이 평균 쇄 길이는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 외관상의 평균 쇄 길이로서 염기쌍 수로 표현할 수있다. 따라서, 상기 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 평균 쇄 길이로는 0.1 k bp∼1 k bp(bp: 염기쌍 수, 1 k bp는 1000 염기쌍 수)를 들 수 있고, 200 bp∼800 bp이 바람직하고, 300 bp∼600 bp이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 염 및 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 염으로는, 의약상 허용되는 염이면 특별히 제한은 없고, 예컨대 나트륨염, 칼륨염을 들 수 있다.
약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체로는, 예컨대 정전하를 갖는 담체를 들 수 있고, 그 구체예로는 폴리-L-리진과 같은 양이온성 중합체나 리포펙틴(Lipofectin: 등록 상표), 리포펙타민(Lipofectamine: 등록 상표), 리포펙테이스(Lipofectace: 등록 상표), DMRIE-C(등록 상표) 등의 양이온성 리포솜, 또는 그 일종이라 생각되며, PCT WO 94/19314호 공보에 개시되어 있는, 예컨대 하기 화학식(Ⅰ)을 갖는 2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤과 인지질(예컨대, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 이들의 수소 첨가 인지질)을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 약물 담체를 들 수 있다.
상기 양이온성 리포솜은 양전하를 지니고, 음전하를 갖는 폴리뉴클레오티드또는 올리고뉴클레오티드와 정전적인 복합체를 형성하며, 이것이 세포막과 융합함과 동시에, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 세포 내로 이입된다고 생각되고 있다. 이러한 복합체는 리포플렉스(lipoplex)라 불리는 경우가 있다.
본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관해서 상술한다. 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 출발 물질인 폴리뉴클레오티드 용액을, 적당한 pH 범위, 적당한 온도 범위에서 가열 가수분해함으로써 제조할 수 있다. 그 때 수용액의 pH는 pH 7 이상의 염기성이 적당하며, pH 7∼10이 바람직하다. 또한, 단쇄화 반응의 속도 및 염기 부분의 안정성을 고려하면, pH 8∼9가 보다 바람직하다. 한편, 반응 온도는 염기의 안정성을 고려하면 20∼110℃의 범위 이내가 적당하며, 40∼100℃의 범위 이내가 바람직하다. 그러나, 충분한 가수분해 속도와 염기 부분의 안정성을 고려하면, 50∼90℃의 범위 이내가 보다 바람직하다.
보다 구체적으로는, 예컨대 폴리뉴클레오티드에 물(주사용 수, 주사용 증류수, 생리 식염수 등)을 가하여 교반 용해하고, 완충제나 pH 조절제를 사용하여 pH 8∼9로 조정한다. 그리고, 반응 온도 50∼90℃의 범위 이내에서, 평균 쇄 길이와 인산 전위율을 모니터링하면서, 0.5∼60 시간, 가열 가수분해함으로써, 인산 전위가 적은 0.1 kb∼1 kb의 평균 쇄 길이를 갖는 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
pH의 조정에는 의약상 허용되는 첨가제, 예컨대 완충제나 pH 조절제를 사용해도 좋다. 구체적으로는 아미노초산(별명, 글리신), 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(별명, 트리스), 탄산나트륨, 탄산수소나트륨(별명, 중탄산나트륨), 수산화나트륨, 디에탄올아민, 트리에탄올아민 등의 완충제나 pH 조절제를 들 수 있다. 이들의 종류, 조합 및 농도 등은 하등 한정되지 않는다.
반응액을 투석 처리나 활성탄 처리 등을 하면, 단량체나 불필요한 염, 불순물, 단쇄화에 의해 생성된 반응 부생성물 등을 계(系) 밖으로 제거할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 출발 물질인 폴리뉴클레오티드 용액을, 적당한 pH 범위, 적당한 온도 범위에서, 포스포디에스테라아제를 사용하여 제조할 수도 있다. 그 때의 반응액의 pH는 pH 4∼9가 적당하고, pH 5∼8이 바람직하다. 또한, 반응시의 인산 전위를 고려하면, pH 6∼7이 보다 바람직하다. 한편, 반응 온도는 효소의 성질을 고려하면 20∼60℃의 범위가 적당하고, 25∼50℃의 범위가 바람직하다. 그러나, 충분한 가수분해 속도를 얻을 수 있다는 점, 효소 반응 이외의 열에 의한 가수분해의 영향이 적다는 점, 또는 인산기의 전위가 발생하지 않는다는 점 등을 고려하면, 30∼40℃의 범위 이내가 보다 바람직하다.
보다 구체적으로는, 예컨대 폴리뉴클레오티드에 물(주사용 수, 주사용 증류수, 생리 식염수 등)을 가하여 교반 용해시킨다. 필요하면 완충제나 pH 조정제를 가하여 pH를 조정한다. 이 액을, 예컨대 뉴클레아제 P1과 같은 포스포디에스테라아제를 가하여, 반응 온도 30∼40℃의 범위 이내에서, 평균 쇄 길이와 인산 전위율을 모니터링하면서 단쇄화함으로써 인산 전위가 적은 0.1 kb∼1 kb의 평균 쇄 길이를 갖는 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 효소의 농도나 반응 조건 등은 하등 한정되지 않는다.
반응액을 에탄올 침전, 투석 처리, 활성탄 처리 등을 하면, 효소나 단량체,불필요한 염, 불순물, 단쇄화에 의해 생성된 반응 부생성물 등을 계 밖으로 제거할 수 있다.
단쇄화된 폴리뉴클레오티드는 적당한 막 분리에 의해 정제할 수 있다. 본 발명에 따른 0.1 kb∼1 kb의 평균 쇄 길이의 범위를 분획할 목적으로는, 예컨대 한외 여과 막 등이 적당하다. 상기 막의 재질이나 구멍 직경 등은 하등 한정되지 않는다.
출발 원료인 폴리뉴클레오티드는 천연, 합성의 기원, 염의 종류, 쇄 길이와 무관하게 어떠한 것도 사용할 수 있다. 천연 폴리뉴클레오티드로는, 예컨대 tRNA나 폴리아데닐산을 들 수 있다. 한편, 합성 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제로 대표되는 RNA 합성 효소나 그 고정화 효소로부터 제조할 수 있다. 또한, 인터페론 유도 시약으로서 시판되고 있는 폴리이노신산나트륨염이나 폴리시티딜산나트륨염 등을 출발 원료로 할 수도 있다.
본 발명에 따른 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같이 하여 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리뉴클레오티드 중 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드를, 적당한 용액(예, 0.15 M NaCl 함유 10 mM 트리스-염산 완충액(pH 7)) 중에서 혼합함으로써 얻을 수 있고, 또한 통상의 방법에 따라 어닐링함으로써 얻을 수 있다. 어닐링 방법으로는, 예컨대 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 용액을 70∼80℃까지 온도를 올리고 서서히 냉각시키는 방법을 들 수 있다.
상기한 바와 같이 하여 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리뉴클레오티드또는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드는 동결 건조 처리할 수 있고, 그렇게 함으로써 장기간 보존 가능한 동결 건조품을 조제할 수 있다. 동결 건조 처리는 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, 상기 조건으로 얻어진 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 여과 멸균한 후, 여과액을 건열 멸균 처리한 금속 배트에 부어 넣고, -40∼-20℃의 선반 온도에서 예비 동결을 1∼4 시간 정도 행하며, 1차 건조 후, 선반 온도 15∼30℃에서 감압 하에 2차 건조(10∼50 시간 정도)를 행하여 동결 건조품을 얻을 수 있다. 이러한 동결 건조품은 일반적으로 임의의 적당한 용액(주사용 수, 주사용 증류수, 생리 식염수, 말토스 용액, 글루코스 용액 등)의 첨가에 의해 재용해시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 즉 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체와, 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하인 단쇄화 폴리뉴클레오티드로서, 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드로부터 형성되는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 복합체(이후에는 '본 복합체'라고 칭함)를 함유하는 조성물은 리포솜의 일반적인 제조 방법과 동일한 방식으로 제조할 수 있다. 구체적으로는, 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체, 예컨대 양이온성 리포솜 또는 그 원료(예, 2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 등의 글리세롤 유도체 및 인지질)에 물(주사용 수, 주사용 증류수, 생리 식염수 등)을 가하여 이들을 교반 혼합하고, 이 혼합물을 적당한 분산기, 예컨대, 호모믹서, 호모게나이저, 초음파 분산기, 초음파 호모게나이저, 고압 유화 분산기, 마이크로플루이다이저(Microfluidizer: 상품명), 나노마이저(Nanomizer: 상품명), 데 비(De Bee) 2000(상품명), 울티마이저(Ultimizer: 상품명), 맨톤-가울린(Manton-Gaulin)형 고압 호모게나이저를 사용하여 분산 처리하고, 이 지질 분산액에 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 가하고, 재차 적당한 분산기로 분산 처리하여 본 복합체를 얻은 후, 여과 멸균 등의 멸균 처리를 함으로써 주사제로서의 본 발명 조성물을 제조할 수 있다. 그 밖의 임의 첨가제는 제조시의 적당한 공정에서 첨가할 수 있고 특별히 제한은 없다. 또한, 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체, 예컨대 양이온성 리포솜 또는 그 원료(예, 2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 등의 글리세롤 유도체 및 인지질) 및 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드를 미리 혼합하고, 이 혼합물에 물을 가하며, 동시에 분산 처리하여 본 복합체를 함유하는 본 발명 조성물을 제조할 수도 있다. 또한, 상기 각 제법에 있어서, 적당한 조분산(粗分散) 공정을 거쳐 제조할 수도 있다.
얻어진 본 발명 조성물은 동결 건조 처리할 수 있다. 동결 건조 처리함으로써 장기간 보존 가능한 본 발명 조성물의 동결 건조 제제를 조제할 수 있다. 동결 건조 처리는 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대, 상기 분산 처리 후, 여과 멸균 처리하여 얻어진 본 발명 조성물을 소정량 바이알병에 나누어 넣는다. 약 -40∼-20℃의 조건에서 예비 동결을 약 2∼3 시간 정도 행하며, 약 0∼10℃에서 감압 하에 1차 건조를 행하고, 계속해서 약 15∼25℃에서 감압 하에 2차 건조를 행하여동결 건조한다. 그리고, 일반적으로는 바이알병 내부를 질소 가스 등의 불활성 가스로 치환하고, 마개를 덮어 본 발명 조성물의 동결 건조 제제를 얻을 수 있다.
본 발명 조성물의 동결 건조 제제는 일반적으로 임의의 적당한 용액의 첨가에 의해 재용해시켜 사용할 수 있다. 이러한 재용해액으로는 주사용 수, 주사용 증류수, 생리 식염수, 말토스 용액, 글루코스 용액, 기타 일반적인 수액 등을 들 수 있다.
본 발명 조성물 및 그 동결 건조 제제는 약제로서 사용할 수 있다. 약제로서의 본 발명 조성물 및 그 동결 건조 제제는 폴리뉴클레오티드가 갖는 약리 작용을 발휘할 수 있다. 따라서, 상기 약제의 구체예로는, 예컨대 인터페론 유도화제, 면역 부활제, 세포내 뉴클레아제 활성화제, 암 치료제 또는 예방제, 또는 간염 치료제 또는 예방제를 들 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예 및 시험예를 들어 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 이들 실시예 및 시험예에 의해 하등 한정되지 않는다.
참고예 1
이노신-5'-이인산삼나트륨염 8 g 및 염화마그네슘 1 g에, 0.1 M 글리신-수산화나트륨 완충액 500 mL를 가하여, 교반 용해시켰다. 6 N 수산화나트륨을 가하여 pH 9.3으로 조정한 후, 38℃에서 1 시간 정치하였다. 또한, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제 용액 1 mL를 첨가하고 38℃에서 18 시간 반응시켰다. 이러한 반응액에 0.2 M 에틸렌디아민사초산 25 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 포화 식염수 10 mL및 무수 에탄올 500 mL를 가하여 폴리이노신산(1973 b)을 침전시켰다.
참고예 2
시티딘-5-이인산삼나트륨염 10 g 및 염화망간 3 g에, 0.2 M 탄산수소나트륨-수산화나트륨 완충액 약 1 L를 가하여 교반 용해시켰다. 6 N 수산화나트륨을 가하여 pH 9.8로 조정한 후, 36℃에서 약 1 시간 정치하였다. 또한, 정제한 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제 용액 2 mL를 첨가하고 36℃에서 24 시간 반응시켰다. 0.2 M 에틸렌디아민사초산 50 mL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이러한 반응액에 포화 식염수 20 mL 및 무수 에탄올 1 L를 가하여 폴리시티딜산(3300 b)을 침전시켰다.
실시예 1
참고예 1에서 얻은 폴리이노신산을 원심 분리하여, 그 침전물을 주사용 수 500 mL에 재용해시키고 투석 처리하였다. 투석 내액을 활성탄 처리하고, 여과 조작에 의해 활성탄을 제거한 후, 여과액에 6 N 수산화나트륨을 가해 pH 8.5로 조정하고, 70℃에서 8 시간, 가열 가수분해하여 그 폴리이노신산을 단쇄화하였다. 이러한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 활성탄 처리하고, 여과 조작에 의해 활성탄을 제거한 후, 투석 처리를 하였다. 투석 내액을 여과 멸균한 후, 여과액을 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여, 인산 전위가 적은 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드(폴리이노신산의 나트륨염)의 동결 건조품 1.9 g을 얻었다(인산 전위율 0.2%, 평균 쇄 길이 360 b).
실시예 2
참고예 2에서 얻은 폴리시티딜산을 원심 분리하고, 그 침전물을 주사용 수500 mL에 재용해시켜 투석 처리하였다. 투석 내액을 활성탄 처리하고, 여과 조작에 의해 활성탄을 제거한 후, 여과액에 6 N 수산화나트륨을 가하여 pH 9.0로 조정하고, 80℃에서 4 시간, 가열 가수분해하여 그 폴리시티딜산을 단쇄화하였다. 이러한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 활성탄 처리하고, 여과 조작에 의해 활성탄을 제거한 후, 투석 처리를 하였다. 투석 내액을 여과 멸균한 후, 여과액을 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여, 인산 전위가 적은 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드(폴리시티딜산의 나트륨염)의 동결 건조품 2.7 g을 얻었다(인산 전위율 0.1%, 평균 쇄 길이 318 b).
실시예 3
폴리아데닐산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 7.2, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품) 1 g에, 0.1 M 트리스-염산 완충액(pH 8.0) 200 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 60℃에서 48 시간, 가열 가수분해함으로써 그 폴리아데닐산을 단쇄화하였다. 이러한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 투석 처리한 후, 투석 내액을 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여, 인산 전위가 적은 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드(폴리아데닐산의 나트륨염)의 동결 건조품 0.3 g을 얻었다(인산 전위율 1.9%, 평균 쇄 길이 154 b).
실시예 4
폴리우리딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 6.5, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품) 1 g에, 0.2 M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.0) 200 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 60℃에서 25 시간, 가열 가수분해함으로써 그 폴리우리딜산을 단쇄화하였다. 이러한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 투석 처리한 후, 투석 내액을 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여, 인산 전위가 적은 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드(폴리우리딜산의 나트륨염)의 동결 건조품 0.2 g을 얻었다(인산 전위율 1.2%, 평균 쇄 길이 108 b).
실시예 5
폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 250 mg에, 50 mL 0.1 M 트리스-염산 완충액(pH 8.0)을 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액을 50∼120℃의 적당한 단쇄화 온도에서 가열하여, 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 임의의 쇄 길이의 폴리이노신산을 샘플링하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 얻어진 샘플 용액은 각각 투석한 후, 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여 각 동결 건조품을 얻었다.
단쇄화 온도 단쇄화 시간 평균 쇄 길이 인산 전위율
50℃ 50 시간 1419 b 0.1%
60℃ 27 시간 982 b 0.1%
70℃ 12 시간 524 b 0.4%
80℃ 8 시간 118 b 1.2%
90℃ 3 시간 84 b 1.8%
120℃ 1 시간 32 b 6.8%
실시예 6
폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 250 mg에, 50 mL 0.1 M 트리스-염산 완충액(pH 9.0)을 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액을 55∼120℃의 적당한 단쇄화 온도에서 가열하여, 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 임의의 쇄 길이의 폴리시티딜산을 샘플링하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 얻어진 샘플 용액은 각각 투석한 후, 통상의 방법에 의해 동결 건조 처리하여 각 동결 건조품을 얻었다.
단쇄화 온도 단쇄화 시간 평균 쇄 길이 인산 전위율
55℃ 52 시간 1923 b 0.1%
65℃ 48 시간 907 b 0.1%
75℃ 23 시간 489 b 0.3%
80℃ 12 시간 139 b 0.8%
90℃ 8 시간 76 b 1.2%
120℃ 1.5 시간 27 b 4.2%
상기 실시예 5 및 6의 결과로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, 시판되는 폴리이노신산나트륨염 및 폴리시티딜산나트륨염을 단쇄화하는 경우, 단쇄화 온도가 55℃ 이하이면 충분한 가수분해가 이루어지지 않았다. 그 때문에, 단쇄화 시간 약 50 시간 후에도 1 kb를 넘는 평균 쇄 길이를 나타내었다. 한편, 단쇄화 온도를 120℃로 한 샘플 및 단쇄화 온도를 90℃로 설정한 샘플에서는 가수분해의 반응 속도가 지나치게 크기 때문에, 단쇄화를 제어하는 것은 곤란하였다. 특히 단쇄화 온도가 120℃인 경우에는 단쇄화 1∼1.5 시간으로 올리고뉴클레오티드에 가까운 영역까지단쇄화되었다. 또한, 이 샘플에서는 인산 전위율도 높았고, 염기 부분의 분해도 확인되었다.
실시예 7
폴리아데닐산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 7.2, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품) 100 mg에, 0.1 M 트리스-염산 완충액(pH 7.0) 100 mL를 가하여 용해시켰다. 이 용액에 뉴클레아제 P1(푸른 곰팡이 유래, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품)을 가하여, 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 25℃에서 3 시간 배양하여, 그 폴리아데닐산을 단쇄화하였다(인산 전위율 0.1%, 평균 쇄 길이 287 b).
실시예 8
우리딘-5'-이인산삼나트륨염 1 g 및 염화망간 0.3 g에, 0.2 M 탄산수소나트륨-수산화나트륨 완충액 약 100 mL를 가하여, 교반 용해시켰다. 1 N 수산화나트륨을 가하여 pH 9.5로 조정한 후, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라아제 용액 0.2 mL를 첨가하여, 시험예 5에 기재된 방법에 의해 평균 쇄 길이를 모니터링하면서, 25℃에서 10 시간 반응시켰다. 이러한 반응액에 0.2 M 에틸렌디아민사초산 5 mL를 가하여 반응을 정지시키고, 포화 식염수 2 mL 및 에탄올 100 mL를 가하여 폴리우리딜산(549 b)을 침전시켰다. 상기 폴리우리딜산을 원심 분리하고, 그 침전물을 주사용 수 50 mL에 재용해시켜 투석 처리하였다. 투석 내액에 1 N 수산화나트륨을 가하여 pH 8.5로 조정하고, 80℃에서 30 분간, 가열 가수분해하여 그 폴리우리딜산의 쇄 길이를 조절하였다. 이러한 단쇄화 폴리뉴클레오티드 용액을 한외 여과막을 사용하여 막 분리하고, 쇄 길이 분포를 조정함과 동시에, 불필요한 염, 단쇄화 반응시의 부생성물 등을 제거하였다(인산 전위율 0.1%, 평균 쇄 길이 485 b).
실시예 9
2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 1 g과 정제 난황 레시틴 2 g에, 100 mL의 주사용 수에 용해시킨 말토스 40 g을 가하여 교반 혼합하고, 호모게나이저를 사용하여 5 분간 분산 처리하여 양이온성 리포솜(담체)의 조분산액을 얻었다. 이러한 조분산액을 추가로 실험실용 소형 유화 분산기를 사용하여 1 시간 분산 처리하여, 양이온성 리포솜 용액을 얻었다. 이 양이온성 리포솜 용액에 실시예 1 및 2에서 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산나트륨염 및 폴리시티딜산나트륨염 각각 200 mg을 포함하는 약 50 mL의 수용액을 교반하면서 천천히 첨가하고, 또한 2 시간 실험실용 소형 유화 분산기를 사용하여 분산 처리하고, 마지막으로 주사용 수에 의해 400 mL로 정용(定容)하여, 본 복합체를 함유하는 조성물을 얻었다. 또한 이 본 복합체를 함유하는 조성물을 여과 멸균한 후, 1 mL씩 바이알병에 나누어 붓고 통상의 방법에 따라 동결 건조 제제로 만들었다. 이 동결 건조 제제를 1 mL가 되도록 주사용 수로 복수(復水)했을 때 본 복합체의 평균 입자경은 133 nm(광자 상관법에 의함)이었다.
실시예 10
2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 50 g과 대두 레시틴 25 g에, 3 L의 주사용 수에 용해시킨 수크로스 1 kg을 가하여 교반 혼합하고, 맨톤-가우린형 고압 호모게나이저를 사용하여 30 분간 분산 처리하고, 주사용 수에 의해 5 L로 정용하여 양이온성 리포솜(담체)의 분산액을 얻었다. 이러한 담체 분산액에 실시예 1 및 2에서 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산나트륨염 및 폴리시티딜산나트륨염 각각 1 g을 포함하는 약 2 L의 수용액을 교반하면서 천천히 첨가하고, 1 N 염산을 사용하여 pH 5.5로 조정한 후, 또한 1 시간, 맨톤-가우린형 고압 호모게나이저를 사용하여 분산 처리하고, 마지막으로 주사용 수에 의해 10 L로 정용하여, 본 복합체를 함유하는 조성물을 얻었다. 추가로 이 본 복합체를 함유하는 조성물을 20 mL씩 바이알병에 나누어 부은 후, 통상의 방법에 따라 동결 건조 제제로 하였다. 이 동결 건조 제제를 20 mL가 되도록 주사용 수로 복수했을 때 본 복합체의 평균 입자경은 158 nm(광자 상관법에 의함)이었다.
실시예 11
2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 1 g과 난황 포스파티드 2 g에, 100 mL의 주사용 수에 용해시킨 포도당 40 g을 가하여 교반 혼합하고, 호모게나이저를 사용하여 5 분간 분산 처리한 후, 500 mL로 정용하여 양이온성 리포솜(담체)의 조분산액을 얻었다. 이러한 조분산액을 추가로 실험실용 소형 유화 분산기를 사용하여 1 시간 분산 처리하여, 양이온성 리포솜 용액을 얻었다. 이러한 용액을 10 mL씩 바이알병에 나누어 붓고 통상의 방법에 따라 동결 건조하였다. 이러한 동결 건조품에, 실시예 1, 2 또는 5, 6에서 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산나트륨염 및 폴리시티딜산나트륨과 시판되는 폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤) 및 폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 각각 5 mg을 포함하는 10 mL의 수용액을 가하고, 프로브형 초음파 분산기로 10 분간 분산 처리하여, 본 복합체를 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 12
실시예 3 및 4에서 얻어진 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리아데닐산나트륨염 및 폴리우리딜산나트륨염 각각 100 ㎍을 포함하는 1 mL의 수용액과, 시판되는 리포펙틴(상품명) 2 mg을 포함하는 수용액 2 mL를 교반하면서 혼합하고, 프로브형 초음파 분산기를 사용하여 15 분간 분산 처리하여, 본 복합체를 함유하는 조성물을 얻었다.
실시예 13
폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 약 200 mg에, 0.2 M 초산-초산나트륨 완충액(pH 5.2)을 가하고, 교반 용해시킨 후, 80℃로 가열하여, 시험예 6에 기재된 방법으로 인산 전위율을 모니터링하면서, 임의의 인산 전위율의 폴리이노신산을 샘플링하고, 계속해서 각 인산 전위율의 폴리이노신산을 붕산 완충액(pH 8.5) 중에서 60℃로 가열하여, 시험예 5에 기재된 방법으로 쇄 길이를 모니터링하면서 평균 쇄 길이가 200 ±50 b가 되도록 단쇄화하였다. 그 결과를 하기 표 3에 도시하였다. 얻어진 단쇄화 폴리이노신산 용액은각각 투석 처리한 후, 통상의 방법으로 동결 건조 처리하여 동결 건조품을 얻었다.
전위 반응 온도 전위 반응 시간 단쇄화 온도 단쇄화 시간 평균 쇄 길이 인산 전위율
80℃ 2.5 시간 60℃ 3 시간 227 b 0.7%
6.5 시간 1.5 시간 230 b 2.0%
9 시간 4 시간 191 b 2.8%
16.5 시간 2 시간 228 b 4.2%
실시예 14
폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 약 200 mg에, 0.2 M 초산-초산나트륨 완충액(pH 5.2)을 가하고, 교반 용해시킨 후, 80℃로 가열하여, 시험예 6에 기재된 방법으로 인산 전위율을 모니터링하면서, 임의의 인산 전위율의 폴리시티딜산을 샘플링하고, 계속해서 각 인산 전위율의 폴리시티딜산을 붕산 완충액(pH 8.5) 중에서 70℃로 가열하고, 시험예 5에 기재된 방법으로 쇄 길이를 모니터링하면서 평균 쇄 길이가 200 ±50 b가 되도록 단쇄화하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 얻어진 단쇄화 폴리시티딜산 용액은 각각 투석 처리한 후, 통상의 방법으로 동결 건조 처리하여 동결 건조품을 얻었다.
전위 반응 온도 전위 반응 시간 단쇄화 온도 단쇄화 시간 평균 쇄 길이 인산 전위율
80℃ 3 시간 70℃ 3 시간 157 b 1.2%
4.5 시간 1 시간 218 b 1.9%
6 시간 1 시간 236 b 2.7%
10 시간 미조정 170 b 3.8%
실시예 15: 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드
실시예 1, 2, 13 및 14에서 얻어진 인산 전위율이 0.7%인 폴리이노신산과 인산 전위율이 1.2%인 폴리시티딜산을 조합한 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드(이본쇄 RNA), 인산 전위율이 2.0%인 폴리이노신산과 인산 전위율이 1.9%인 폴리시티딜산을 조합한 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드(이본쇄 RNA), 인산 전위율이 2.8%인 폴리이노신산과 인산 전위율이 2.7%인 폴리시티딜산을 조합한 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드(이본쇄 RNA)를 각각 조제하였다. 각 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드는 각 폴리이노신산나트륨염과 폴리시티딜산나트륨염을 트리스-염산 완충액(pH 7, 0.15 M 염화나트륨 함유)에 용해시키고, 80℃에서 5 분간 가열한 후, 서서히 냉각시켜 얻었다.
비교예 1(실시예 1에 대응하는 종래 법에 의한 제조-1)
폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 5 mg에 주사용 수 10 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액에 포름아미드를 10 mL 가하여, 80℃에서 5 시간 가열하였다(인산 전위율 8.9%, 평균 쇄 길이 628 b).
비교예 2(실시예 2에 대응하는 종래 법에 의한 제조-1)
폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 5 mg에 주사용 수 10 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액에 포름아미드를 10 mL 가하여, 80℃에서 5 시간 가열하였다(인산 전위율 4.2%, 평균 쇄 길이751 b).
비교예 3(실시예 1에 대응하는 종래 법에 의한 제조-2)
폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 5 mg에 주사용 수 10 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액을 90℃에서 8 시간 가열하였다(인산 전위율 7.1%, 평균 쇄 길이 213 b).
비교예 4(실시예 2에 대응하는 종래 법에 의한 제조-2)
폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 5 mg에 주사용 수 10 mL를 가하여 교반 용해시켰다. 이러한 용액을 90℃에서 12 시간 가열하였다(인산 전위율 4.2%, 평균 쇄 길이 289 b).
비교예 5
실시예 13 및 14에서 얻어진 인산 전위율이 4.2%인 폴리이노신산과 인산 전위율이 3.8%인 폴리시티딜산을 조합한 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드(이본쇄 RNA)를 조제하였다. 이 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드는 폴리이노신산나트륨염과 폴리시티딜산나트륨염을 트리스-염산 완충액(pH 7, 0.1.5 M 염화나트륨 함유)에 용해시키고, 80℃에서 5 분간 가열한 후, 서서히 냉각시켜 얻었다.
시험예 1: 약리 활성에 대해 평균 쇄 길이가 미치는 영향
실시예 9에 따른 조성물의 약리 활성은 HeLa S3 암 세포에 대한 세포 증식 억제 작용(시험관내)에 의해 평가하였다. 실험은 HeLa S3 암 세포를 96 웰 평판에104세포/웰의 밀도로 접종하고, 24 시간 이상 배양하여 세포가 충분히 평판에 접착한 것을 확인한 후, 상기 조성물을 첨가하여 배양을 계속하였다. 3 일간 CO2배양기 내에서 배양한 후, 생세포 수를 MTT법으로 측정하였다. 세포 증식 억제율을 하기 수학식(1)으로부터 산출하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
평균 쇄 길이(인산 전위율) Hela S3 암세포에 대한 세포 증식 억제율(%)
폴리이노신산나트륨염+폴리시티딜산나트륨염 농도(mg/ml)
폴리이노신산 폴리시티딜산 0.1 1 10 100 1000
≫ 1000 b(a) ≫ 1000 b(b) 86 100 100 100 100
1419 b(0.1%) 1923 b(0.1%) 79 98 100 100 100
982 b(0.1%) 907b(0.2%) 65 96 100 100 100
524 b(0.4%) 489 b(0.3%) 23 85 98 100 100
360 b(0.2%) 318 b(0.1%) 17 70 97 100 100
118 b(1.2%) 139 b(0.8%) 9 45 89 98 100
84 b(1.8 %) 76 b(1.2%) 0 0 6 72 92
32 b(6.8%) 27 b(4.2%) 0 0 0 18 48
(a)폴리이노신산나트륨염(야마사 고교 가부시키가이샤 제품)(b)폴리시티딜산나트륨염(야마사 고교 가부시키가이샤 제품)
상기 표 5로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, 암 세포주인 HeLa S3에 대한 각 조성물의 세포 증식 억제 작용은 평균 쇄 길이와의 사이에 강한 상관 관계가 있었다. 상기 표 5에서는 일반적으로 인터페론 유도제로서 사용되는 1000 b 이상의 장쇄 길이의 폴리이노신산·폴리시티딜산이 가장 강한 증식 억제 작용을 보이지만, 본 발명에 의한 평균 쇄 길이의 범위가 0.1 kb∼1 kb인 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산·폴리시티딜산도, 약간 뒤떨어지지만 또한 충분히 강한 증식 억제 작용을 유지하고 있었다. 또한, 이러한 증식 억제 작용은 100 b 미만인 것에서는 급격히 저하되고, 올리고뉴클레오티드 영역에 가까운 것에서는 거의 활성을 보이지 않았다.
시험예 2: 골수 세포에 대한 영향
독성 평가로서, 골수 독성을 검토하였다. ddY 마우스(수컷, 8주)에, 시판되는 폴리이노신산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.8, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품) 및 폴리시티딜산나트륨염(S0 20,w(침강 상수): 8.6, 야마사 고교 가부시키가이샤 제품)과 실시예 5 및 6에 따른, 인산 전위가 적은 폴리이노신산, 폴리시티딜산 중 평균 쇄 길이가 각각 982 b 및 907 b인 것을 정맥내 투여하고, 다음날 대퇴골에서 골수 세포를 얻었다. 세포를 뉴 메틸렌 블루 및 지엠사(Giemsa)로 염색하여, 망상 적혈구와 성숙 적혈구의 수를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6의 골수 독성은 전체 적혈구 수에 대한 망상 적혈구 수의 비이며, 하기 수학식 2에 의해 정의된다. 또한,*표시는 유의 수준이 p < 0.01인 상태에서 폴리뉴클레오티드 없는 매체만의 정맥내 투여로부터 얻어진 대조군과 유의적인차(던네트(Dunnet)의 다중 비교법에 의함)가 있음을 의미한다.
평균 쇄 길이 투여량 골수 독성 대조군에 대한 변화율
폴리이노신산 폴리시티딜산
≫ 1000 b(a) ≫ 1000 b(b) 1 mg/kg 0,23* 39%
5 mg/kg 0,15* 61%
982 b 907 b 5 mg/kg 0,31 17%
125 mg/kg 0,29 24%
(a)폴리이노신산나트륨염(야마사 고교 가부시키가이샤 제품)(b)폴리시티딜산나트륨염(야마사 고교 가부시키가이샤 제품)
상기 표 6으로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, 일반적으로 인터페론 유도제로서 사용되는 1000 b를 넘는 장쇄 길이의 폴리이노신산·폴리시티딜산은 1 mg/kg의 투여량에서도 대조군에 대한 변화가 39%에 달했음에도 불구하고, 본 발명에 따른 평균 쇄 길이의 범위가 0.1 kb∼1 kb인 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산·폴리시티딜산은 그 25배의 투여량에서도 대조군에 대하여 유의적인 차가 없었다. 이 결과로부터 폴리이노신산·폴리시티딜산의 독성은 약리 활성과 마찬가지로, 평균 쇄 길이와의 상관 관계가 매우 강하다는 것을 알았다. 이러한 독성이 본 발명에 따른 단쇄화 폴리뉴클레오티드에 의해 비약적으로 개선된 것은 전혀 의외였다.
시험예 3: A431 암 세포에 대한 세포 증식 억제 작용(시험관내)(평균 쇄길이 200 ±50 b)
실시예 13 및 14에 따른 인산 전위율이 0.7∼4.2%인 폴리이노신산과 인산 전위율이 1.2∼3.8%인 폴리시티딜산, 실시예 1 및 2에 따른 단쇄화 폴리이노신산 및 폴리시티딜산을 사용하여, 실시예 11과 동일한 방식으로 조작하여 조성물을 조제하였다. A431 암 세포를 96 웰 평판에 104세포/웰의 밀도로 접종하고, 5 시간 이상 배양하여 세포가 충분히 평판에 접착한 것을 확인한 후, 그 조성물을 첨가하여 배양을 계속하였다. 각 조성물 첨가후, 3 일간 CO2배양기 내에서 배양한 후, 생세포 수를 MTT법으로 측정하였다. 세포 증식 억제율을 수학식 1로부터 구하고, 이러한 세포 증식 억제율로부터 50% 세포 증식 억제율에 해당하는 폴리이노신산나트륨염과 폴리시티딜산나트륨염의 합계 농도(IC50값)를 산출하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
폴리이노신산의 인산 전위율
0.2% 0.7% 2.0% 2.8% 4.2%
폴리시티딜산의전위율 0.1% 1.2 1.2 1.3 3.5 6.5
1.2% 1.1 1.2 1.4 5.6 10
1.9% 1.2 1.3 1.4 8.2 17
2.7% 4.2 6.2 10 17 36
3.8% 7.8 11 23 41 66
A431 세포에 대한 50% 세포 증식 억제 농도(ng/ml)
상기 표 7로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이, 암 세포인 A431에 대한 상기 조성물의 세포 증식 억제 작용은 인산 전위율과의 사이에 강한 상관 관계가 있었다. 즉, 폴리이노신산 또는 폴리시티딜산인지에 상관없이 인산기의 3'위에서 2'위로의 전위가 많은 것일수록, 증식 억제 작용이 약해지는 경향을 보였다. 주목이 되는 점은, 본 발명에 따른 인산 전위가 적은 단쇄화 폴리이노신산, 단쇄화 폴리시티딜산(인산 전위율 3% 이하, 특히 2% 이하)의 조합에서는 증식 억제 작용이 비약적으로 강하였다. 또한, 인산 전위율이 3%, 특히 2%를 넘는 폴리이노신산, 폴리시티딜산의 조합에서는 상승적으로 작용이 약해지는 경향이 있었다. 예컨대, 상기 표 7에서, 인산기의 전위율이 2.0% 및 1.9%인 폴리이노신산, 폴리시티딜산의 조합은 마찬가지로 2.8% 및 2.7% 또는 4.2% 및 3.8%인 폴리이노신산, 폴리시티딜산의 조합과 비교하여 IC50의 비가 12배 또는 47배까지 향상되었다. 인산기의 3'위에서 2'위로의 전위율이 3%, 특히 2%를 경계로 하여 약리 활성이 이와 같이 급격히 향상하는 것은 매우 의외였다.
시험예 4: 인산 전위에 의한 융해 온도(T m ) 및 약리 활성의 변화
이본쇄 RNA는 온도를 올려 가면 특정한 온도에서, 단일쇄 RNA로 해리된다. 이 온도는 RNA에 포함되는 염기의 종류에 따라 특정한 값을 보이므로, 이 온도를 이본쇄 RNA의 융해 온도로 하고, 일반적으로는 Tm값이라고 칭한다. 이러한 Tm값의 측정에는 여러 가지 방법이 있지만, 본 시험예에서는 가장 일반적인 흡광 광도법을 이용하여, 실시예 15 및 비교예 5에 따른 이본쇄 RNA의 Tm값를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 하기 표 8에 병기한 IC50값은 시험예 3에 의한 결과이다.
폴리이노신산의 인산전위율 폴리시티딜산의 인산전위율 융해 온도(Tm값) IC50
0.2% 0.1% 61℃ 1.2 ng/mL
0.7% 1.2% 62℃ 1.2 ng/mL
2.0% 1.9% 59℃ 1.4 ng/mL
2.8% 2.7% 59℃ 17 ng/mL
4.2% 3.8% 58℃ 66 ng/mL
인산 전위율이 대략 0∼4%인 폴리이노신산·폴리시티딜산으로 Tm값를 측정한 결과, 각 조합에 있어서 현저한 차는 보이지 않았다(일반적으로 인터페론 유도제로서 이용되는 장쇄 길이의 폴리이노신산·폴리시티딜산의 Tm값은 61℃임). 즉, 인산 전위율이 대략 0∼4%인 폴리이노신산·폴리시티딜산은 이본쇄 RNA의 특징인 이중 나사 모양 구조를 취할 수 있음이 분명하게 되었다. 그러나, 시험예 3으로부터, 인산 전위율이 2% 내지 3%를 경계로 하여 약리 활성이 4배∼50배 이상이나 다르므로, 폴리이노신산·폴리시티딜산의 주약효인 면역 부활 작용이나 항암 작용은 이본쇄 RNA의 이중 나사 모양 구조에 의해서만이 영향을 받는 것이 아나라, 인산기의 전위율에 의해서도 영향을 받는다는 것을 알게 되었다. 더구나, 그 약리 활성은 인산기의 3'위에서 2'위로의 전위가 2% 내지 3%를 경계로 하여 급격하게 향상한다는 것을 알 수 있었는데, 이는 전혀 의외의 일이었다.
시험예 5: 단쇄화 폴리뉴클레오티드의 평균 쇄 길이의 측정(GPC법)
1 mg/mL의 폴리뉴클레오티드 수용액을 사용하고, 하기의 겔 여과 크로마토그래피(GPC) 조작 조건으로 시험하여, 평균 쇄 길이를 구하였다.
GPC 조작 조건
검출 파장 UV 260 nm
컬럼 토소호(Tosoh) TSK 겔 G5000PWXL 7.8 mmΦ×300 mm
완충상 7 M 우레아를 함유하는 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)
유속 0.5 mL/분
사이즈 마커 RNA 래더(1770 b, 1520 b, 1280 b, 780 b, 530 b, 400 b, 280 b, 155 b)(기브코 BRL 제품)
시험예 6: 인산 전위율의 측정
1 mg/mL의 폴리뉴클레오티드 수용액 1 mL에, 500 U/mL의 뉴클레아제 P1(푸른 곰팡이 유래, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품) 수용액 3.2 mL를 가하고, 또한 물을 가하여 5 mL로 희석하였다. 이러한 수용액을 37℃의 수조에서 1 시간 반응시킨 후, 물을 가하여 10 mL로 하였다. 이러한 반응액으로부터 3.2 mL를 취해, 0.1 U/mL 알칼리 포스파타아제(송아지 소장 유래, 세이카가쿠 고교 가부시키가이샤 제품) 수용액 0.8 mL를 가한 후, 37℃의 수조에서 30 분간 반응시켰다. 이 용액을 적당히 희석하고, 하기의 액체 크로마토그래피 조작 조건에 의해 시험을 하여, 2'-5' 인산 디에스테르 결합을 갖는 이량체를 정량함으로써, 인산 전위율을 측정하였다.
GPC 조작 조건
검출 파장 UV 260 nm
컬럼 시세이도 캡셀 팩(Shishido Capcell pack) C18UG 120 5 ㎛ 4.6 mm Φ×250 mm
이동상 5 mM 테트라부틸암모늄 황산수소를 함유하는 50 mM 인산 완충액(pH 8)과 메탄올의 혼합 용액(95:5)
유속 1 mL/분

Claims (13)

  1. 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염에 있어서, 2'-5' 인산 디에스테르 결합이 전체 인산 디에스테르 결합의 3% 이하인 것을 특징으로 하는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 폴리이노신산 또는 그 유사체, 폴리시티딜산 또는 그 유사체, 폴리아데닐산 또는 그 유사체, 또는 폴리우리딜산 또는 그 유사체인 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 평균 쇄 길이가 0.1 k bases∼1 k bases 범위 이내에 있는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염에 있어서, 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염으로부터 형성되는 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  5. 제4항에 있어서, 이본쇄를 형성할 수 있는 2개의 단쇄화 폴리뉴클레오티드가 폴리이노신산과 폴리시티딜산, 폴리아데닐산과 폴리우리딜산, 폴리이노신산 유사체와 폴리시티딜산, 폴리이노신산과 폴리시티딜산 유사체, 폴리이노신산 유사체와 폴리시티딜산 유사체, 폴리아데닐산 유사체와 폴리우리딜산, 폴리아데닐산과 폴리우리딜산 유사체 및 폴리아데닐산 유사체와 폴리우리딜산 유사체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  6. 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 pH 7∼10의 용액 중에서 20∼110℃의 온도 조건 하에 단쇄화하는 것을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염의 제법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 포스포디에스테라아제로 단쇄화하는 것을 특징으로 하는 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염.
  8. 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체와, 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염, 또는 제4항 또는 제5항에 기재된 이본쇄 단쇄화 폴리뉴클레오티드 또는 그 염을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 복합체를 함유하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체가 정전하를 갖는 담체인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 정전하를 갖는 담체가 양이온성 리포솜인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 약물을 세포 내로 이입하는 데 유효한 담체가 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤 및 인지질을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 담체인 조성물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약제인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 약제가 인터페론 유도화제, 면역 부활제, 세포내 뉴클레아제 활성화제, 암 치료제 또는 예방제, 또는 간염 치료제 또는 예방제인 조성물.
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