KR100644172B1

KR100644172B1 - 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법

Info

Publication number: KR100644172B1
Application number: KR1020007013233A
Authority: KR
Inventors: 스기하라가츠히로; 세키준조; 히라바야시가즈코
Original assignee: 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 1998-05-25
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2006-11-10
Also published as: KR20010043803A; WO1999061032A1; US20030091622A1; EP1086699A4; DE69942581D1; RU2222334C2; US6545138B1; CN1303293A; US6746690B2; CA2333162C; CN1166366C; JP3785932B2; EP1086699B1; ATE473748T1; CA2333162A1; EP1086699A1

Abstract

본 발명은 소위 여과 멸균이 가능하고, 인체에 대한 안전성에 문제가 있다고 여겨지는 7 ㎛ 이상의 조대한 입자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 균일한 양질의 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법에 관한 것이다. 양이온성 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 상기 제제의 제조 방법은 적어도 부분적으로 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체를 각각 따로따로 단일가닥 상태로 양이온성 담체에, 또는 양이온성 담체가 형성되기 전의 원료에 첨가하여 분산 처리하는 것을 특징으로 한다.

Description

핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING COMPOSITE PREPARATION CONTAINING NUCLEIC ACID}

본 발명은, 양이온성 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제에 관한 것이다. 상기 복합체는 리포플렉스(lipoplex)라 불리는 경우도 있다.

여기서 '양이온성 담체'란, 약물, 특히 음이온성 약물을 세포 내로 이입시키는 데 유효한, 수 중에서 양전하를 갖는 약물 담체를 말한다. 양이온성 담체는 최근 유전자나 폴리 I:C 등의 RNA를 세포 내로 이입시키기 위한 약물 담체로서 왕성히 연구되고 있다.

'핵산 중합체'란, 천연에서 유래하였거나, 합성 또는 반합성된 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA)와, 천연에서 유래하였거나, 합성 또는 반합성된 올리고뉴클레오티드를 말한다.

양이온성 담체와 폴리 음이온성이면서 이중 나선 구조를 갖는 이중가닥 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제는 단순히 양이온성 담체와 이중가닥 핵산 중합체를 혼합하는 것만으로 제조할 수 있다.

그러나, 이 방법으로 제조된 핵산 함유 복합체 제제는 일반적으로 복합체의 입자 직경이 수 ㎛ ∼ 수백 ㎛로 조대(粗大)하며, 균일하지 않다. 이러한 조대하고 불균일한 핵산 함유 복합체 제제는 핵산 중합체의 세포 내 이행이나 정보 발현에 관한 연구에서, 균일한 데이터를 충분히 얻을 수 없다고 하는 결점을 갖는다. 입자의 조대성(粗大性)과 관련한 가장 중대한 문제는 공업 스케일로 멸균하는 것이 곤란하다는 점과, 인간에게 안전하게 투여할 수 있다는 것을 전제로 하는 의약품 제제에 있어서, 주사바늘 속을 비롯하여, 정맥내 투여 시에는 모세 혈관에 색전 등을 일으킬 우려가 있다는 점이다. 이들 문제는 전술한 바와 같이 단순히 혼합하는 것만으로 상기 복합체 제제를 제조하는 방법뿐만 아니라, 적당한 유화 분산기 등을 사용하여 분산 처리를 실시함으로써 제조하는 방법에 있어서도 해결하기가 곤란한 문제이다.

입자의 조대 응집화는 상기 복합체 제제의 안정화를 위해 시도되는 동결 건조화에 있어서도 발생하는 문제이다.

상기 복합체 제제 중의 핵산 중합체는 투여량을 적게 하여 투여 시 환자나 의료 종사자의 부담을 경감시키기 위해, 또는 상기 복합체 제제의 제조 효율을 도모하기 위해 고농도인 것이 바람직하다. 그러나, 종래의 제조 방법에서는 핵산 중합체의 총량이 0.1 mg/mL 이상, 특히 0.5 mg/mL 이상이 되면, 제조 과정에서 현저한 응집이 발생하여, 육안으로 용이하게 확인할 수 있을 정도의 거대한 침전물 또는 부유물이 생기며, 이러한 것은 온갖 분산 처리에 의해서도 충분히 분산시킬 수는 없다.

그런데, 종래 유전자나 폴리 I:C 등의 RNA에 있어서는, 이중 나선 구조를 갖는 이중가닥인 것이 생리적인 측면 및 여러 가지 뉴클레아제에 대한 안정성의 관점에서, 말하자면 상식적으로 채용되어 왔다. 예컨대, 강력한 인터페론 유도능이나 면역 부활(賦活) 작용 등의 생리 활성을 갖는 폴리 I:C 대신 폴리 I와 폴리 C를 따로따로 투여하면 충분한 약리 효과를 얻을 수 없는 것으로 알려져 있다{ 문헌[Archives of Virology, 51, 199-215(1976)] 참조}. 이와 같이 유전자나 폴리 I:C 등의 RNA는 이중 나선 구조를 갖는 이중가닥인 것이 필수라고 생각되어 왔다.

양이온성 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제에 있어서는, 상기와 같은 핵산 중합체의 이중 나선 구조의 필요성에 관해 전혀 논의되지 않고, 상기 복합체 제제의 제조 시에도, 말하자면 상식적으로 이중 나선 구조를 갖는 이중가닥 DNA나 이중가닥 RNA가 채용되어 왔다.

본 출원인은 양이온성 담체와 폴리 I:C 등의 이중가닥 RNA와의 핵산 함유 복합체 제제가 암 치료 등에 유효한 암 세포 내의 뉴클레아제를 활성화시킨다는 점에서, 상기 핵산 함유 복합체 제제를 암 세포 내 뉴클레아제 활성화제로서 특허 출원하고, 또한 간장이나 비장에 특이적 유효량의 인터페론을 장시간 유도한다는 점에서, 상기 핵산 함유 복합체 제제를 간염 치료제로서 이미 특허 출원하고 있다(PCT/JP98/04695호, PCT/JP99/01438호).

본 발명의 목적은 특히, 소위 여과 멸균이 가능하고, 인체에 대한 안전성에 문제가 있다고 여겨지는 7 ㎛ 이상의 조대한 입자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 균일한 양질의 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 양이온성 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 과정에 있어서, 통상 이중 나선 구조를 갖는 이중가닥 DNA나 이중가닥 RNA를 사용하는 일이 없이, 이중 나선 구조를 풀어놓거나, 또는 이중 나선 구조를 미리 형성시키는 일이 없이 단일가닥 상태의 핵산 중합체를 사용하여 제조함으로써, 약리 활성 등에 영향을 주지 않고서 상기 과제를 한꺼번에 해결할 수 있는 것을 처음으로 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명으로서, 양이온성 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제(이하, '핵산 함유 복합체 제제'라 함)의 제조 과정에 있어서, 적어도 부분적으로 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체를, 각각 따로따로 단일가닥 상태로 양이온성 담체에, 또는 양이온성 담체가 형성되기 전의 원료에 첨가하여 분산 처리하는 것을 특징으로 하는 상기 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법을 들 수 있다.

이하, 본 발명을 상술한다.

본 발명에 적용할 수 있는 '양이온성 담체'로는, 예컨대 시판되는 리포펙틴(상품명)이나 리포펙트아민(상품명), 리포펙트에이스(상품명), DMRIE-C(상품명) 외에, PCT WO94/19314호 공보에 개시되어 있는 약물 담체, 예컨대 하기 화학식 1로 표시되는 2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤(이하 '화합물 A'라 함) 및 인지질을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 약물 담체나 폴리리신 등의 약물 담체를 들 수 있다.

본 발명에 적용할 수 있는 '2개의 단일가닥 핵산 중합체'로는 적어도 부분적으로 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체라면 특별히 제한되지 않지만, 예컨대 천연 유전자 또는 인위적으로 재조합된 유전자(예컨대, 플라스미드)를 구축하는 2개의 단일가닥 DNA나 단일가닥 RNA, 폴리 I와 폴리 C, 폴리 A와 폴리 U, 폴리 I와 폴리 C₁₂U, 일부가 화학적으로 변형된 폴리 I(예, 폴리(7-데아자이노신산))와 폴리 C, 폴리 I와 일부가 화학적으로 변형된 폴리 C(예, 폴리(5-브로모시티딜산), 폴리(2-티오시티딜산)) 등의 2개의 단일가닥 RNA를 들 수 있다. 본 발명은 이와 같이 강력한 인터페론 유도능 등의 생리 활성을 갖는 폴리 I:C를 구성하는 폴리 I와 폴리 C라는 2개의 단일가닥 RNA에 응용할 수 있다. 여기서, '폴리 I'는 폴리이노신산을, '폴리 C'는 폴리시티딜산을, '폴리 A'는 폴리아데닐산을, '폴리 U'는 폴리우리딜산을, '폴리 C₁₂U'는 각각 약 12개의 시티딜산에 대하여 우리딜산 1개가 시티딜산과 치환된 시티딜산 우리딜산 공중합체를 의미한다.

'적어도 부분적으로 이중가닥을 형성할 수 있다'란, 생리적 조건 하에서 이중가닥을 형성할 수 있을 정도로 상보적인 염기 관계에 있는 염기끼리 2개의 단일가닥 핵산 중합체 중에 존재하는 것을 말하며, 2개의 단일가닥 핵산 중합체의 종류나 각 핵산 중합체의 길이 등에 따라 다르지만, 구체적으로는 상보적인 염기 관계에 있는, 염기수 20 염기(염기(base) ; 염기의 갯수) 이상인 것이 일반적이다.

각 단일가닥 핵산 중합체가 갖는 염기수는 특별히 제한되지 않지만, 10,000 염기 이하가 적당하며, 2,000 염기 이하가 바람직하다. 이 염기수는 각각의 핵산 중합체가 갖는 성질에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 2개의 단일가닥 핵산 중합체가 반드시 동일한 염기수로 구성되어 있을 필요는 없다. 또한, 각 핵산 중합체는 통상 여러 가지 염기수로 이루어지는 일정한 분포로 존재하지만, 각 염기수는 최대 분포의 염기수를 의미하여, 여기서는 '평균 염기수'라 한다.

또한, 예컨대 본 발명에 있어서 폴리 I 및 폴리 C의 평균 염기수는 유효성과 안전성과의 균형에 근거하여 결정할 수 있다. 구체적으로는 모두 30∼3,000 염기의 범위 내가 적당하고, 60∼2,000 염기의 범위 내가 바람직하며, 100∼500 염기의 범위 내가 보다 바람직하다.

상기 화합물 A 및 인지질을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 약물 담체(양이온성 담체)에 있어서 인지질로는 의약상 허용되는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 스핀고미엘린, 레시틴 등을 들 수 있다. 또한, 수소가 첨가된 인지질도 예로 들 수 있다. 바람직한 인지질로는 난황 포스파티딜콜린, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 난황 포스파티드를 들 수 있다. 2종 이상의 인지질을 사용할 수도 있다. 또한, 이 양이온성 담체에 있어서는 포스파티딜콜린 또는 레시틴 쪽이, 양이온성 담체에 있어서 일반적으로 사용되고 있는 포스파티딜에탄올아민보다도 우수하다.

화합물 A 및 인지질의 구성 비율은 인지질의 종류나 적용하는 2개의 단일가닥 핵산 중합체의 종류 등에 따라 다르지만, 화합물 A 1중량부에 대하여 인지질 0.1∼10 중량부의 범위 내가 적당하고, 0.5∼5 중량부의 범위 내가 바람직하며, 1∼2 중량부의 범위 내가 보다 바람직하다. 이 인지질이 레시틴인 경우도 마찬가지이다.

본 발명에 있어서 양이온성 담체와 핵산 중합체의 구성 비율은 양이온성 담체의 종류나 사용하는 핵산 중합체의 종류 등에 따라 다르지만, 양이온성 담체 10 중량부에 대하여 핵산 중합체의 총량이 0.05∼10 중량부의 범위 내가 적당하고, 0.1∼4 중량부의 범위 내가 바람직하며, 0.5∼2 중량부의 범위 내가 보다 바람직하다. 2개의 단일가닥 핵산 중합체가 폴리 I 및 폴리 C이며, 화합물 A와 인지질을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 양이온성 담체와 폴리 I 및 폴리 C와의 복합체의 경우도 마찬가지로, 양이온성 담체 10 중량부에 대하여 폴리 I 및 폴리 C의 총량이 0.05∼10 중량부의 범위 내가 적당하고, 0.1∼4 중량부의 범위 내가 바람직하며, 0.5∼2 중량부의 범위 내가 보다 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산 함유 복합체 제제(이하 '본 발명의 제제'라 함)는, 예컨대 시판되는 양이온성 담체가 분산되어 있는 수용액 중에, 혹은 양이온성 담체의 원료가 분산되어 있는 수용액을 적당한 유화 분산기에서 통상의 방법에 의해 분산 처리하여 제조한 양이온성 담체가 분산되어 있는 수용액 중에, 또는 양이온성 담체가 형성되기 전의 원료가 분산되어 있는 수용액 중에, 순차로 또는 동시에 2개의 단일가닥 핵산 중합체를 첨가한 후, 적당한 유화 분산기 등을 사용하여 통상의 방법에 의해 분산 처리함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 제제는 고형의 양이온성 담체나 그 원료에 2개의 단일가닥 핵산 중합체를 첨가하고, 물을 가하여 적당한 유화 분산기에 의해 분산 처리하더라도 제조할 수 있다. 이들의 첨가 순서나 첨가량, 첨가 농도, 첨가 속도 및 양이온성 담체나 그 원료의 용액 중의 농도는 임의로 선택되며, 본 발명에 있어서 특별히 한정되는 것은 아니다.

보다 구체적으로는, 화합물 A 및 인지질을 필수 구성 성분으로 하여 형성되는 양이온성 담체를 사용하는 경우, 그 양이온성 담체가 분산되어 있는 수용액 중에 폴리 I 및 폴리 C의 수용액을 각각 따로따로 서서히 떨어뜨리면서 유화 분산 처리함으로써 본 발명의 제제를 제조할 수 있다. 또한, 화합물 A, 인지질, 폴리 I 및 폴리 C 각각을 비이커에 칭량하여 넣고, 물을 가하여 호모게나이저로 거칠게 분산시킨 후, 고압 유화 분산기로 분산 처리해도 본 발명의 제제를 제조할 수 있다.

2개의 단일가닥 핵산 중합체로는 이중가닥 핵산 중합체를 통상 행해지는 조작에 의해 풀은 것을 사용해도 좋다. 구체적으로는, 60℃ 이상으로 가열하는 등의 비효소적 처리 또는 효소적 처리를 들 수 있다.

상기 시판되는 양이온성 담체는 그대로 또는 적당히 가공하여 사용할 수 있다.

상기 수용액으로는 주사용수, 주사용 증류수, 생리 식염수 등의 전해질액, 포도당액 등을 들 수 있다.

상기 유화 분산기로는, 예컨대 호모믹서, 호모게나이저, 초음파 분산기, 초음파 호모게나이저, 고압 유화 분산기, 마이크로플루이다이저(상품명), 나노마이저(상품명), 알티마이저(상품명), DeBEE2000(상품명), 맨톤-가울린형 고압 호모게나이저 등을 들 수 있는데, 의약 용도로 적절하게 사용되는 것이면 충분하다. 처리 조건이나 처리 시간, 처리 온도 등은 적절히 선택된다.

본 발명의 제제는 임의의 의약상 허용되는 첨가제, 예컨대 유화 분산 보조제, 안정화제, 등장화제, 동결 건조 조제, pH 조절제를 적당량 함유하고 있어도 좋다. 구체적으로는, 탄소수 6∼22의 지방산(예, 카프릴산, 카프린산, 라우린산, 미리스틴산, 팔미틴산, 스테아린산, 올레인산, 리놀산, 아라키돈산, 도코사헥사엔산)이나 그 의약상 허용되는 염(예, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염), 알부민, 덱스트란 등의 유화 분산 보조제, 콜레스테롤, 포스파티딘산 등의 안정화제, 염화나트륨, 글루코스, 말토스, 락토스, 수크로스 등의 등장화제, 동결 건조 조제, 염산, 황산, 인산, 초산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민 등의 pH 조절제 등을 들 수 있다.

상기와 같은 의약상 허용되는 임의의 첨가제는 분산 전이나 분산 후에 적당한 공정으로 첨가할 수 있다.

분산 처리 후, 필요에 따라 0.2 ㎛의 여과 멸균막을 통과시켜, 앰플이나 바이알에 충전시킬 수 있다. 본 발명에 따른 복합체 입자의 입자 직경은 거의 전부가 200 nm 이하이다. 따라서, 본 발명의 제제는 0.2 ㎛의 여과 멸균막을 거의 100% 통과할 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따른 제조 방법에 의하면, 균일하고 미세한 복합체 입자를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제를 얻을 수 있고, 또한 핵산 중합체를 용액 중에 0.1 mg/mL 이상 함유하는 핵산 함유 복합체 제제를 얻을 수 있다.

따라서, 상기와 같은 제조 방법에 의해 얻어지는 핵산 함유 복합체 제제나, 상기와 같은 제조 방법에 의해 얻어지고, 또한 용액 중의 핵산 중합체의 농도가 0.1∼10 mg/mL의 범위 내, 0.5∼10 mg/mL의 범위 내, 1∼10 mg/mL의 범위 내, 또는 2∼10 mg/mL의 범위 내인 핵산 함유 복합체 제제도 본 발명에 포함시킬 수 있다. 또한, 핵산 중합체의 용액 중의 농도가 10 mg/mL보다 높은 것이 본 발명에서 제외되는 것은 아니다.

또한, 전술한 바와 같이 분산 처리하여 제조한 본 발명의 제제를 동결 건조시키면, 본 발명에 따른 동결 건조 제제가 될 수 있다. 따라서, 상기 동결 건조 제제도 본 발명의 제제의 하나로서 들 수 있다. 동결 건조는 통상의 방법에 의해 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 동결 건조 제제는, 예컨대 바이알에 나눠 부은 후, 약 -40℃∼-20℃의 조건으로 약 2시간 정도 예비 동결시켜, 약 0∼10℃에서 감압 하에 1차 건조를 행하고, 계속해서 약 15∼25℃에서 감압 하에 2차 건조시켜 동결 건조시킨다. 그리고, 일반적으로는 바이알 내부를 질소 가스로 치환하고, 뚜껑을 덮어 본 발명의 동결 건조 제제를 얻는다. 동결 건조를 실시하는 경우, 동결 건조 케이크를 형성하는 동결 건조 조제를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 당류가 적당하며, 그 중에서도 이당류, 특히 말토스가 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 동결 건조 제제는 일반적으로 임의의 적당한 용액(재용해액)을 첨가하여 재용해시켜 사용할 수 있다. 이러한 재용해액으로는 주사용수, 포도 당액, 생리 식염액 등의 전해질액, 기타 일반 수액을 들 수 있다. 이 재용해액의 액량은 용도에 따라 다르며 특별히 제한되지 않지만, 동결 건조 전 액량의 0.5∼2 배량, 또는 500 mL 이하가 적당하다.

본 발명의 제제는 주사제나 점적제(点滴劑) 등의 액제의 형태로, 또는 동결 건조 제제의 형태로 제공할 수 있다.

본 발명의 제제는 인간을 포함하는 동물에 대하여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여, 흡입 투여, 점비(点鼻) 투여, 점안(点眼) 투여, 경구 투여, 직장 투여 등 여러 가지 투여 경로로 투여할 수 있다. 그 투여 형태나 투여량은 희망에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 동식물이나 진균, 세균과 같은 미생물 등의 배양 세포 등에 대한 여러 가지 시약·약제로도 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 4에 따른 본 발명의 제제 중의 복합체 입자의 입자 직경 분포를 나타낸 것이다. 횡축은 입자 직경(㎛)을, 좌측 종축은 빈도(%)를, 우측 종축은 누계 빈도(%)를 각각 나타낸다.

도 2는 비교예 1에 따른 비교용 제제 중의 복합체 입자의 입자 직경 분포를 나타낸 것이다. 횡축은 입자 직경(㎛)을, 좌측 종축은 빈도(%)를, 우측 종축은 누계 빈도(%)를 각각 나타낸다.

이하에서는 실시예, 비교예 및 시험예를 들어 본 발명을 보다 자세히 설명하기로 한다.

실시예 1∼5에서는, 평균 염기수가 각각 대략 200 염기인 폴리 I 및 폴리 C의 단일가닥 RNA를 원료로 사용하였다. 또한, 각 실시예에서 실시한 분산 처리 후의 0.2 ㎛ 멤브레인 필터에 의한 여과 멸균에 있어서, 필터의 막힘이 없이 여과 멸균을 할 수 있고, 또한 여과액 중의 회수율은 각 핵산 중합체 모두 98∼102%의 범위 이내로서, 거의 100%의 여과 멸균이 가능하였다.

실시예 1

화합물 A 2 g과 정제 난황 레시틴 2 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g을 가하여 교반 혼합하고, 호모게나이저를 사용하여 5분간 분산 처리하여 양이온성 담체의 거친 분산액을 얻었다. 이러한 거친 분산액을 다시 실험용 소형 유화 분산기를 사용하여 1시간 동안 분산 처리하고, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL에 250 mg의 폴리 I을 포함하는 75 mL의 수용액을 교반하면서 첨가하고, 계속해서 250 mg의 폴리 C를 포함하는 75 mL의 수용액을 교반하면서 첨가하고, 다시 1시간 동안 실험용 소형 유화 분산기를 사용하여 분산 처리한 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명의 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치(DLS-700, 오오쓰카덴시사 제조)에 의해서 측정한 결과, 138 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

이어서, 이 본 발명의 제제를 1 mL씩 바이알에 나눠 붓고 통상의 방법에 따라서 동결 건조 제제로 가공하였다. 얻어진 동결 건조 제제에 0.9 mL의 주사용수를 가하여 재용해시켰다. 재용해 후의 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입 자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치(DLS-700, 오오쓰카덴시사 제조)에 의해 측정한 결과, 140 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 2

화합물 A 50 g과 난황 포스파티드 30 g에 10 L의 주사용수에 용해시킨 수크로스 4 kg을 가하여 맨톤-가울린형 고압 호모게나이저를 사용하여 10분간 분산 처리한 후, 25 L가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 20 L에 50 g의 폴리 C를 포함하는 6 L의 수용액을 교반하면서 첨가하고, 계속해서 50 g의 폴리 I을 포함하는 6 L의 수용액을 교반하면서 첨가하였다. 이 분산액을 염산을 사용하여 pH를 5.5로 조정하고, 또한 30분간 맨톤-가울린형 고압 호모게나이저를 사용하여 분산 처리한 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 측정한 결과, 150 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

이어서, 이 본 발명의 제제를 20 mL씩 바이알에 나눠 붓고 통상의 방법에 따라서 동결 건조 제제로 가공하였다. 얻어진 동결 건조 제제에 시판되는 5% 포도당 수액(500 mL)을 가하여 재용해시켰다. 재용해 후의 본 발명의 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 151 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 3

화합물 A 2 g, 대두 레시틴 2 g, 폴리 I 25 mg 및 폴리 C 25 mg를 비이커에 넣고, 이것에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 포도당 20 g를 가하여 교반 혼합하고, 호모게나이저를 사용하여 5분간 분산 처리하였다. 이러한 거친 분산액을 다시 실험용 소형 고압 유화 분산기(800 kg/cm²)를 사용하여 1시간 동안 분산 처리하고, 400 mL가 될때까지 주사용수를 부은 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 121 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 4

화합물 A 1.2 g과 정제 난황 레시틴 2.0 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g를 가해 교반 혼합하고, 실험용 소형 고압 유화 분산기를 사용하여 30분간 분산 처리하고, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL를 교반하면서, 100 mg의 폴리 I을 포함하는 75 mL의 수용액과 100 mg의 폴리 C를 포함하는 75 mL의 수용액을 각각 동시에 서서히 떨어뜨리고, 다시 2시간 동안 실험용 소형 고압 유화 분산기(1,100 kg/cm²)를 사용하여 분산 처리한 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 124 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

또한, 이 본 발명 제제의 입자 직경 분포를 레이저 회절 산란 방식의 입자 직경 측정 장치(LA-910, 호리바세이사쿠쇼사 제조)에 의해 측정한 결과, 도 1에 제시한 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과에 의하면, 입자 직경 분포의 피크는 139 nm이며, 조대한 입자는 검출되지 않았다.

실시예 5

화합물 A 4.8 g과 정제 난황 레시틴 8.0 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g를 가해 교반 혼합하고, 실험용 소형 고압 유화 분산기를 사용하여 30분간 분산 처리한 후, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL을 교반하면서, 400 mg의 폴리 I을 포함하는 75 mL의 수용액과 400 mg의 폴리 C를 포함하는 75 mL의 수용액을 각각 동시에 서서히 떨어뜨리고, 다시 2시간 동안 실험용 소형 고압 유화 분산기(1,100 kg/cm²)를 사용하여 분산 처리한 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과 멸균하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 138 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 6

시판되는 DNA 플라스미드 벡터(pMClneo) 100 ㎍을 포함하는 1 mL의 수용액을 교반하면서 70℃의 수욕(水浴) 중에서 3시간 가온하였다. 이와 마찬가지로, 70℃로 가온한 시판되는 리포펙틴(상품명) 2 mg을 포함하는 분산액 2 mL을 교반하면서 첨가하고, 10분간 프로브형 초음파 분산기를 사용하여 70℃에서 분산 처리한 다음, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과 멸균하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명의 제제 중 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 145 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 7

평균 염기수가 모두 약 1,500 염기인 폴리 I 및 폴리 C의 단일가닥 RNA를 원료로 사용하였다.

화합물 A 1.2 g과 정제 난황 레시틴 2.0 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g를 가해 교반 혼합하고, 실험용 소형 고압 유화 분산기를 사용하여 30분간 분산 처리한 후, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL을 교반하면서, 100 mg의 폴리 I을 포함하는 75 mL의 수용액과 100 mg의 폴리 C를 포함하는 75 mL의 수용액을 각각 동시에 서서히 떨어뜨리고, 다시 2시간 동안 실험용 소형 고압 유화 분산기(1,100 kg/cm²)를 사용하여 분산 처리한 후, 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과 멸균하여 본 발명의 제제를 얻었다. 이 본 발명 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 134 nm이었다. 또한, 1 ㎛ 이상의 입자는 포함되지 않았다.

실시예 8

평균 염기수가 약 350 염기인 폴리 I 200 mg, 평균 염기수가 약 350 염기인 폴리 C 200 mg을 사용하여, 800 kg/cm²의 분산 처리압 하에 실시예 7과 같은 방식으 로 평균 입자 직경이 130 nm인 본 발명의 제제를 얻었다.

실시예 9

평균 염기수가 약 1,450 염기인 폴리 I 200 mg, 평균 염기수가 약 1,450 염기인 폴리 C 200 mg을 사용하여, 800 kg/cm²의 분산 처리압 하에 실시예 7과 같은 방식으로 평균 입자 직경이 150 nm인 본 발명의 제제를 얻었다.

실시예 10

평균 염기수가 약 80 염기인 폴리 I 400 mg, 평균 염기수가 약 80 염기인 폴리 C 400 mg를 사용하여, 800 kg/cm²의 분산 처리압 하에 실시예 7과 같은 방식으로 평균 입자 직경이 135 nm인 본 발명의 제제를 얻었다.

비교예 1(실시예 4에 대응하는 종래 방법에 의한 제조)

화합물 A 1.2 g과 정제 난황 레시틴 2.0 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g를 가해 교반 혼합하고, 실험용 소형 고압 유화 분산기를 사용하여 30분간 분산 처리한 후, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL을 교반하면서, 대략 200 염기쌍수를 갖는 이중가닥 폴리 I:C 200 mg을 포함하는 150 mL의 수용액을 서서히 떨어뜨리고, 다시 2시간 동안 실험용 소형 고압 유화 분산기(1,100 kg/cm²)를 사용하여 분산 처리하여 비교용 제제를 얻었다. 이 비교용 제제 중의 복합체 입자의 평균 입자 직경을 동적 광산란 방식에 의한 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 182 nm이었다.

또한, 이 비교용 제제의 입자 직경 분포를 실시예 4와 같은 방식으로 레이저 회절 산란 방식의 입자 직경 측정 장치에 의해 측정한 결과, 도 2에 제시한 결과를 얻을 수 있었다. 이 결과에 의하면, 입자 직경 분포의 피크는 243 nm이었지만, 8000 nm에 분포 피크를 갖는 3∼20 ㎛의 조대한 입자가 약 20% 검출되어 이봉성(二峰性)의 입자 직경 분포를 나타내 보였다.

더욱이, 이 비교용 제제를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 멸균 여과해 본 결과, 50 mL 여과한 곳에서 필터의 눈이 막혀 여과 멸균을 할 수 없었다.

비교예 2(실시예 5에 대응하는 종래 방법에 의한 제조)

화합물 A 4.8 g과 정제 난황 레시틴 8.0 g에 100 mL의 주사용수에 용해시킨 말토스 40 g를 가해 교반 혼합하고, 실험용 소형 고압 유화 분산기를 사용하여 30분간 분산 처리하고, 250 mL가 될때까지 주사용수를 부어 양이온성 담체의 분산액을 얻었다. 이 분산액 250 mL을 교반하면서, 대략 200 염기쌍수의 이중가닥 폴리 I:C 800 mg를 포함하는 150 mL의 수용액을 서서히 떨어뜨리고, 다시 2시간 동안 실험용 소형 고압 유화 분산기(1,100 kg/cm²)를 사용하여 분산 처리하여, 비교용 제제를 회수하였다. 이 비교용 제제는 백색의 침전성 현탁액이며, 회수 후 5분 이내에 응집하여 침전하였다. 술지게미의 현탁액과 유사한 것이었다. 동적 광산란 방식의 입자 직경 측정 장치에 의한 측정 범위를 넘어서, 입자 직경을 측정할 수 없었다. 0.2 ㎛ 멤브레인 필터에 의한 여과 멸균도 할 수 없었다.

시험예 1

실시예 4에서 얻은 본 발명의 제제와 비교예 1에서 얻은 비교용 제제의 생물 활성을 자궁경부암 세포(HelaS3)에 대한 증식 억제 작용으로 평가하였다.

실험은 HelaS3 세포를, 96 웰 플레이트에 10⁴개/웰의 밀도로 시드하여, 5시간 이상 배양하여 세포가 웰에 접착된 것을 확인한 후, 각 제제를 첨가하여 배양을 계속하여, 약제 첨가 후 3일 후에 생세포수를 MTT법으로 측정하였다. 저해율(%)은 다음 식으로 구해 IC₅₀치를 산출하였다. 그 결과는 표 1에 제시하였다.

	IC₅₀ 값(ng/mL)
실시예 4의 본 발명 제제	8.6 ± 2.5
비교예 1의 비교용 제제	8.7 ± 1.2
IC₅₀ 값은 폴리I와 폴리C를 합한 총 핵산 중합체 농도를 나타냄.

표 1에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 실시예 4에 따른 본 발명의 제제와 비교예 1에 따른 비교용 제제와의 사이에 생물 활성치의 차이는 없었다.

본 발명은, 예를 들어 다음의 효과를 갖는다.

① 조대 복합체 입자가 없는 균일한 양질의 핵산 함유 복합체 제제를 제조할 수 있다.

② 조대 복합체 입자를 실질적으로 포함하지 않는 균일한 양질의 핵산 함유 복합체 제제를 제조할 수 있다. 이 효과는 핵산 중합체의 농도가 높아질수록 현저하다.

③ 본 발명에 의해 제조된 핵산 함유 복합체 제제를 동결 건조시킨 것을 재용해시키더라도 동결 건조 전과 동등한 핵산 함유 복합체 제제로 재구축할 수 있 다.

④ 0.2 ㎛의 여과 멸균막을 거의 100% 통과할 수 있는 핵산 함유 복합체 제제를 제공할 수 있다.

Claims

2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 및 인지질을 필수 원료로 하여 조제되는 약물 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 과정에 있어서, 부분적으로 또는 완전히 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체를 각각 따로따로 단일가닥 상태로 당해 약물 담체에 또는 당해 약물 담체가 형성되기 전의 원료에 첨가하여 분산 처리하는 것을 특징으로 하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법.
제1항에 있어서, 부분적으로 또는 완전히 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체의 평균 염기수가 모두 100∼2,000 염기 범위 내인 단일가닥 핵산 중합체인 것을 특징으로 하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 부분적으로 또는 완전히 이중가닥을 형성할 수 있는 2개의 단일가닥 핵산 중합체가 폴리 I과 폴리 C인 것을 특징으로 하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 인지질이 레시틴인 것을 특징으로 하는 핵산 함유 복합체 제제의 제조 방법.
2-0-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-0-디올레오일글리세롤 및 인지질을 필수 원료로 하여 조제되는 약물 담체와 핵산 중합체의 복합체를 함유하는 핵산 함유 복합체 제제에 있어서, 제1항 또는 제2항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 핵산 함유 복합체 제제.
제6항에 있어서, 핵산 중합체의 농도가 0.1∼10 mg/mL의 범위 이내인 것을 특징으로 하는 핵산 함유 복합체 제제.