TWI500430B - 伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體及其製備方法 - Google Patents

Description

伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體及其製備方法

本發明涉及一種伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體及其製備方法，以及含有該脂質體的注射劑及其製備方法。

伊立替康是喜樹鹼的半合成衍生物。喜樹鹼可特異性地與拓撲異構酶I結合，後者誘導可逆性單鏈斷裂，從而使DNA雙鏈結構解旋；伊立替康及其活性代謝物SN-38可與拓撲異構酶I-DNA複合物結合，從而阻止斷裂單鏈的再連接。現有研究提示，伊立替康的細胞毒作用歸因於DNA合成過程中，複製酶與拓撲異構酶I-DNA-伊立替康(或SN-38)三聯複合物相互作用，從而引起DNA雙鏈斷裂。

鹽酸伊立替康之藥理作用明顯，臨床療效確切，在惡性腫瘤治療中應用廣泛，但是，它和其他喜樹鹼類藥物一樣，同樣存在的一個問題就是，其結構中的飽和內酯環具有pH依賴性，在生理條件下會可逆的轉變為其羧酸鹽形式，而使抗腫瘤活性減弱。鹽酸伊立替康的現有市售製劑為鹽酸伊立替康注射液及其凍乾粉針製劑，臨床上經靜脈給藥後，游離藥物直接處在偏鹼性的生理環境下，其結構中的內酯環易發生水解反應轉變為羧酸鹽形式，從而失去活性，間接的降低了藥物的療效。而且，製劑的毒副作用較大，主要表現為中性粒細胞減少和遲發性腹瀉。

脂質體作為近年來研究較為廣泛的一種藥物載體，其主要特點是可以保護被包封藥物，增加藥物穩定性，改變藥物在體內的分佈行為，攜載藥物被動或主動靶向到病變部位。脂質體作為抗腫瘤藥物的良好載體可有效的提高藥物療效，降低毒副作用。

國際申請WO2005/117878公開了伊立替康脂質體的配方和製備方法，該製劑中含有伊立替康或鹽酸伊立替康、選自氫化大豆磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、卵磷脂、心磷脂等磷脂、膽固醇。同樣，中國專利申請CN1994279A也公開了伊立替康脂質體的配方和製備方法，其中實施例5的使用磷脂醯膽鹼作為磷脂製備了脂質體。

雖然上述專利文獻中記載的配方已經具有較好效果，但是如果製備成適合人體使用的製劑，該脂質體在穩定性、粒徑等方面仍不能令人滿意。

本發明的目的是提供一種載藥量較高，且能同時滿足包封率高，穩定性好、適合製備成製劑的伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體。

雖然目前一些文獻(例如國際申請WO2005/117878和CN1994279A)中記載了伊立替康的脂質體組成和製備方法，其中個別方案的部分指標較好。但針對穩定性、粒徑等方面的控制並未提供任何資訊。申請人經對脂質體進一步研究，令人驚奇的發現當選擇配方的輔料和用量關係符合某些條件時，特別膽固醇的用量對脂質體粒徑和穩定性有一定的影響，在選擇中性磷脂和膽固醇的基礎上控制二者之間的比例，能夠使脂質體的粒徑變得小而均勻，並且提高了脂質體的穩定性。與其他配方相比，本申請脂質體的穩定性等指標明顯提高。另外本發明與國際申請WO2005/117878和CN1994279A等技術相比，產品中不含鹼性官能團化合物和陽離子脂質，配方組成簡單，載藥量高，穩定性好，本發明的脂質體有很好的抗腫瘤效果。

本發明的脂質體含有伊立替康或鹽酸伊立替康、中性磷脂以及膽固醇，其中所述膽固醇與中性磷脂的重量比例為1：3至5，較佳比例為1：3.5至4.5，更佳為1：4。

本發明所使用的中性磷脂可選擇氫化大豆卵磷脂(HSPC)、蛋黃磷脂(EPC)、大豆磷脂(SPC)等材料，特別是當中性磷脂使用氫化大豆卵磷脂時，其效果最好。當進一步控制藥物和磷脂之間的重量配比關係為下述關係時，脂質體的載藥量極大地提高：

伊立替康或鹽酸伊立替康　1份

中性磷脂　2至5份，較佳2.5至4份。

本發明的脂質體可根據本領域常規的脂質體製備方法製備得到，對於本發明的脂質體來說，較佳使用離子梯度法製備。在使用離子梯度法時，所述脂質體內水相與外水相之間具有緩衝劑形成的離子梯度，較佳所述脂質體內水相比外水相具有離子濃度高的離子梯度，這可提高貯存期間脂質體的粒徑穩定，更好的維持藥效，這能夠控制脂質體平均粒徑小而均勻，可使脂質體粒徑在貯存期的變化減小到最低程度。

本發明經由在配方中加入親水性高分子的脂質衍生物可使脂質體粒徑在貯存期的變化減小到最低程度，同時聚乙二醇衍生物的加入可以延長脂質體在體內的迴圈時間。聚乙二醇衍生物選自聚乙二醇2000-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺(DSPE-PEG₂₀₀₀ )聚乙二醇5000-二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇2000-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇5000-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺。因此為了提高藥物的長效性，本發明較佳可在脂質體中添加親水性高分子的脂質衍生物，在該配方比例基礎上，使用DSPE-PEG₂₀₀₀ 是效果最明顯的。較佳脂質衍生物與伊立替康或鹽酸伊立替康的重量比為0.2至0.4。

脂質體可進一步含有帶電荷磷脂，帶電荷磷脂選自二月桂醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二油酸磷脂醯絲胺酸、二油醯磷脂醯甘油、二月桂醯磷脂酸、二肉豆蔻醯磷脂酸或二硬脂醯磷脂酸中的一種或多種，且帶電荷磷脂與中性磷脂的重量比例為1:5至1:100。

本發明較佳的脂質體含有以下重量配比的成分：

鹽酸伊立替康　1份

氫化大豆卵磷脂　3.2至3.8份

聚乙二醇2000-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺　0.32至0.38份

膽固醇　0.8至0.95份，

且膽固醇與氫化大豆卵磷脂的比例為1：4。

本申請還提供了伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體的製備方法，本發明的脂質體可選擇通常的脂質體製備方法製備得到。本領域技術人員可根據本發明提供的脂質體的配方，選擇各種方法製備得到。對於本發明的脂質體所選擇的配方而言，較佳的製備方法是離子梯度法。該製備方法包含下述步驟：

1)經由下述A至D中任何一種方法製備空白脂質體：

A、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，減壓除掉乙醇後得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

B、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於氯仿或氯仿-甲醇混合溶劑，旋轉蒸發形成脂質膜，加入緩衝劑水化得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

C、根據配方選用中性磷脂、膽固醇與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

D、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

2)脂質體膜內外水相離子梯度的產生：置換空白脂質體外水相，使脂質體內水相與外水相產生離子梯度；

3)含藥脂質體製備：配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，加熱攪拌，培育一定時間即得。

在步驟3)“含藥脂質體製備”步驟後，還可包含以下步驟：

4)游離藥物的去除及樣品的濃縮：在鹽酸伊立替康脂質體中加入緩衝介質，採用切向流裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至適當的體積。

本申請還提供了含有上述脂質體的脂質體注射劑。在將脂質體製備成適合使用的注射劑時，添加穩定劑是有益的。本發明所使用的穩定劑也可選擇通常使用的穩定劑，例如維生素E、乙二胺四乙酸等，這些穩定劑都對製劑的穩定性有所幫助。對於上述配方而言，經由對穩定劑的研究發現乙二胺四乙酸或其鹽相對於其他穩定劑效果最好，對於提高脂質體的穩定性最有好處，因此可選用乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸二鈣鹽中的一種或多種，且穩定劑的加入比例為0%至0.5 w/v%且下限不為0%。

本發明的組合物中較佳含有抗氧化劑，所述抗氧化劑可選自水溶性抗氧化劑或油溶性抗氧化劑，所述油溶性抗氧化劑選自α-生育酚、α-生育酸琥珀酸酯、α-醋酸生育酚或其混合物，所述水溶性抗氧化劑選自抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、L-半胱胺酸或其混合物，抗氧化劑的加入比例為0%至0.5 w/v%且下限不為0%。

注射劑可以是注射液或凍乾粉針形式。製劑中可含有滲透壓調節劑，所述滲透壓調節劑選自葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、氯化鈉、甘油、組胺酸及其鹽酸化物、甘胺酸及其鹽酸化物、賴胺酸、絲胺酸、谷胺酸、精胺酸或纈胺酸中的一種或多種，且滲透壓調節劑的加入比例為0%至5 w/v%且下限不為0%。

對於凍乾粉形式的製劑來說，注射劑進一步含有凍乾保護劑，進行冷凍乾燥後制得脂質體凍乾粉針。凍乾保護劑選自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐或乳糖中的一種或多種。

本發明較佳的注射劑脂質體含有以下重量配比的成分：

鹽酸伊立替康　1份

氫化大豆卵磷脂　3.4至3.8份

聚乙二醇2000-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺　0.34至0.38份

膽固醇　0.8至0.95份

乙二胺四乙酸二鈉　0.05至0.09份，

且膽固醇與氫化大豆卵磷脂的比例為1：4。

上述注射劑的製備方法包含下述步驟：

1)經由下述A至D中任何一種方法製備空白脂質體：

A、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，減壓除掉乙醇後得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

B、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於氯仿或氯仿-甲醇混合溶劑，旋轉蒸發形成脂質膜，加入緩衝劑水化得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

C、根據配方選用中性磷脂、膽固醇與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

D、根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；

2)脂質體膜內外水相離子梯度的產生：置換空白脂質體外水相，使脂質體內水相與外水相產生離子梯度；

3)含藥脂質體製備：配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，加熱攪拌，培育一定時間即得。

在步驟3)“含藥脂質體製備”步驟後，還可包含以下步驟：

4)游離藥物的去除及樣品的濃縮：在鹽酸伊立替康脂質體中加入緩衝介質，採用切向流裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至適當的體積。

在得到脂質體後，還可經由調整脂質體藥物濃度，定容，過濾除菌，灌封於小瓶中，得脂質體注射液；或者向脂質體藥物樣品中加入凍乾保護劑，調整藥物濃度，定容，過濾除菌，灌封於瓶中，冷凍乾燥，得凍乾粉針。

本發明的有益效果：

將鹽酸伊立替康製成脂質體製劑，克服現有產品和技術的不足，將藥物包裹於脂質體內水相中，提高藥物穩定性，使藥物在體內以內酯環的狀態存在，能夠長時間維持活性代謝物SN-38在血漿中的濃度，以達到增加製劑療效，降低藥物的毒副作用。

本發明的伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體製劑經由調控特定的藥物、磷脂和膽固醇的比例關係，可達到解決脂質體載藥量低的問題，藥脂比(w/w)可達0.25以上，同時藥物包封率可達90%以上，較佳的配方可達95%以上；本發明經由進一步選擇膽固醇和磷脂的用量關係，製備的脂質體粒徑較小，提高了脂質體的穩定性。本發明還經由對穩定劑的篩選，較佳選擇加入一定比例的乙二胺四乙酸鹽明顯提高了脂質體的穩定性；脂質體的粒徑在10 nm至220 nm之間，分佈均勻；性質穩定，伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體注射劑影響因素實驗結果表明，40℃條件下放置10天，粒徑和包封率均無顯著變化，各項指標符合要求；伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體注射劑與市售製劑相比，抑瘤率顯著提高，毒性顯著降低。

下面實施例用於進一步說明本發明，但本發明並不僅限於此實施例。

實施例1

配方

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂(HSPC)、膽固醇(CHOL)溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸銨溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar均質5次迴圈，之後經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。之後加入配製好的DSPE-PEG₂₀₀₀ 水溶液，攪拌培育20分鐘。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充注射用水，即得空白脂質體。

用注射用水配製鹽酸伊立替康水溶液，按照鹽酸伊立替康與HSPC的重量比例為1:3.5加入到上述具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入0.45 g氯化鈉調節滲透壓。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。

製備的各配方粒徑變化如下表所示，結果表明，磷脂與膽固醇重量比為4:1時樣品粒徑最小。

將不同磷脂與膽固醇重量比製備的樣品在25℃條件下放置，考察穩定性。結果如下表，25℃條件下放置60天，磷脂與膽固醇重量比為4:1樣品粒徑及包封率無明顯變化，其他比例的樣品粒徑增大，包封率也有所下降，可見，磷脂與膽固醇重量比為4:1的樣品穩定性較好。

結論：綜合各項指標，結果證明膽固醇與磷脂之間的比例控制在1：3至5可達到比較好的使用效果，最佳配比為1：4。

實施例2

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸銨溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar均質5次迴圈，之後經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。之後加入配製好的DSPE-PEG₂₀₀₀ 水溶液，攪拌培育20分鐘。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充注射用水，即得空白脂質體。

用注射用水配製鹽酸伊立替康水溶液，按照鹽酸伊立替康與HSPC的重量比例為1:3.5加入到上述具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入0.45 g氯化鈉調節滲透壓。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。

實施例3

空白脂質體配方及製備方法與實施例2相同，不同的是按照鹽酸伊立替康與HSPC的重量比例分別為為1:1.5、1:2、1:3.5、1:4及1:5進行製備脂質體，鹽酸伊立替康脂質體樣品包封率及粒徑見下表。

結果說明，當鹽酸伊立替康與HSPC的比例為1:1.5時包封率顯著降低，而當其比例為1:5時載藥量下降明顯，不適合製備成臨床應用的製劑，當其比例在1:2與1:4之間時包封率及載藥量均較高。

實施例4

按照實施例2中配方組份的用量來製備空白脂質體及載藥脂質體，製備方法同實施例2所述方法，所不同的是分別採用高純蛋黃磷脂(EPC)、高純大豆磷脂(SPC)替換配方中的HSPC來製備。將製備的脂質體樣品置於25℃條件下考察穩定性。結果見下表。試驗結果表明，採用HSPC製備的脂質體樣品穩定性最好，25℃條件下放置2個月主要指標無明顯變化。

實施例5

製備方法<1>：

乙醇注入法：將配方量的氫化大豆卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀ 、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，注入到鹽酸伊立替康的生理鹽水溶液中，減壓除掉乙醇得到脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar均質5次迴圈，之後經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。

製備方法<2>：

薄膜分散法：將配方量的氫化大豆卵磷脂、DSPE-PEG₂₀₀₀ 、膽固醇溶於適量氯仿得脂質溶液，將脂質溶液旋轉蒸發成膜，除盡氯仿然後加入鹽酸伊立替康的生理鹽水溶液水化培育約1h。之後採用高壓均質機1000 bar均質5次迴圈，再經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。

測定製備方法<1>、<2>以及實施例2製備的鹽酸伊立替康脂質體包封率及粒徑。

結果表明，採用被動載藥法如乙醇注入法及薄膜蒸發法製備鹽酸伊立替康脂質體時，可以製備出目的產品。但其樣品包封率較低，大部分藥物都沒有進入到脂質體中；而採用主動載藥法製備的樣品(實施例2)包封率高，載藥量高，粒徑小而均勻，所以採用主動載藥法。本發明中即採用離子梯度法製備鹽酸伊立替康脂質體有非常好的效果。

實施例6

製備方法：

空白脂質體：將脂質乙醇注入。均質1000bar，6次；200nm擠出3次，100nm擠出5次；加入PEG₂₀₀₀ -DSPE，60℃培育30min。切向流透析3次，每次加入50ml。其中VE加在磷脂有機溶劑中，EDTA加在硫酸銨溶液中。

載藥脂質體：配製約10mg/ml的鹽酸伊立替康水溶液，加入空白脂質體中，60℃培育15min。用切向流濃縮樣品至約50ml，即為5mg/ml樣品。

穩定性結果見下表，可見，單獨加入乙二胺四乙酸二鈉樣品各項指標無顯著變化，能顯著提高了脂質體的穩定性，而其他穩定劑對脂質體的穩定性沒有明顯改善。

實施例7

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸錳溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充注射用水，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，50℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入2.5 g甘露醇調節滲透壓。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。經過奈米粒度測定儀測得脂質體粒度為89.3nm，包封率為97.5%。

製備方法：

將配方量的氫化蛋黃卵磷脂、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸鎂溶液混合。之後經由擠出設備擠出脂質體調控其粒徑(擠出器鋪2張0.1μm擠出膜，擠出5次)。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充注射用水，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，50℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入2.5 g組胺酸調節滲透壓。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。經過奈米粒度測定儀測得脂質體粒度為87.6 nm，包封率為98.1%。

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸銨溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar均質5次迴圈後，之後加入配製好的DSPE-PEG₂₀₀₀ 水溶液，攪拌培育20分鐘。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充注射用水，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入0.45 g氯化鈉調節滲透壓。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。經過奈米粒度測定儀測得脂質體粒度為87.3 nm，包封率為99.2%。

實施例8

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂、心肌磷脂、DSPE-PEG₅₀₀₀ 、膽固醇、α-生育酚溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml檸檬酸溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar，均質5次。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充0.9%氯化鈉溶液400 ml，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。經過奈米粒度測定儀測得脂質體粒度為85.8 nm，包封率為98.6%。

實施例9

製備方法：

將配方量的DPPC、DPPG、膽固醇溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸銨溶液(含乙二胺四乙酸二鈉)混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar，均質5次。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充0.9%氯化鈉溶液400 ml，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入抗壞血酸。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，充氮氣灌封於小瓶中，即得鹽酸伊立替康脂質體注射劑。經過奈米粒度測定儀測得脂質體粒度為89.4 nm，包封率為97.2%。

實施例10

製備方法：

將配方量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇、α-生育酚溶於適量無水乙醇得脂質溶液，與100 ml硫酸銨溶液混合，減壓除掉乙醇得到空白脂質體粗品。之後採用高壓均質機1000 bar，均質5次，再經由擠出設備擠出脂質體(擠出器鋪5張100 nm擠出膜，擠出5次)，之後加入配製好的DSPE-PEG₅₀₀₀ 水溶液，攪拌培育20分鐘。採用切向流超濾裝置透析空白脂質體，中間不間斷的補充0.9%氯化鈉溶液400ml，即得空白脂質體。用注射用水配製鹽酸伊立替康溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，60℃加熱攪拌，培育20分鐘即得載藥脂質體。採用切向流超濾裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至約50 ml，加入蔗糖和甘露醇使混合均勻。調整藥物濃度，定容，0.22μm濾膜過濾除菌，罐裝於西林瓶中，冷凍乾燥，即得鹽酸伊立替康脂質體凍乾粉針。將脂質體凍乾粉針水化後測定脂質體粒度為90.8 nm，包封率為97.5%。

試驗例1

根據本發明制得的成品(按實施例2)的理化特徵：

【粒徑分佈】取本品適量，以水稀釋後用動態光散射法進行測定。測定波長λ=633nm，測定角度173°，溫度25℃。粒徑大小以強度徑(Intensity)資料表示。粒徑分佈圖見圖1，平均粒徑為85.9nm。

【形態學考察】吸取脂質體樣品適量，將銅網置於乾淨濾紙上，向銅網上滴加樣品，用2%磷鎢酸染色，待乾燥後在JEM2010穿透式電子顯微鏡(日本電子株式會社)下觀察本品。形態圖見圖2。經穿透式電子顯微鏡觀察，伊立替康脂質體形態均為典型的雙分子層結構，粒徑大部分在200 nm以下，與動態光散射法測定的結果相吻合。

【包封率測定】藥物含量測定方法：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5μm)；流動相：乙腈-0.05M磷酸二氫鉀緩衝液(pH 4，含1%三乙胺)=20:80；柱溫：40℃；進樣體積：20μL；流速：1.0 mL/min。

包封率測定方法：吸取1 mL樣品溶液至10 mL量瓶中，加入水稀釋至刻度，搖勻，置8010型超濾器(MILLIPORE公司)超濾，棄去初濾液，取續濾液為供試品溶液。分別吸取供試品溶液、對照品溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標法計算製劑游離藥物含量，記為W；另按含量測定項下方法計算樣品的藥物總含量，記為W₀ 。按下式計算樣品的包封率。

測定結果：本品包封率為99.4。

【影響因素試驗】取樣品置於不同條件下進行影響因素考察，結果如下表所示：

結果表明，樣品對光照敏感，經過強光照射樣品外觀變黃，含量下降，有關物質明顯增大；樣品在高溫40℃時包封率和粒徑無明顯變化，但有關物質略增大；低溫和冷凍迴圈試驗表明樣品產生大粒子。綜合考慮磷脂在高溫狀態下的不穩定性，結合影響因素試驗結果，本品應低溫避光貯存。

[體內抗腫瘤藥效試驗]

藥物名稱：按實施例2製備的鹽酸伊立替康脂質體(CPT-11脂質體)由上海恒瑞醫藥有限公司提供，鹽酸伊立替康注射液(CPT-11，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供)

配製方法：均用生理鹽水配成所需濃度。

實驗動物：BALB/cA-nude裸小鼠，6至7週齡，雌性(♀)，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。合格證號：SCXK(滬)2007－0005。飼養環境：SPF級。

試驗方法：裸小鼠皮下接種人結腸癌Ls-174t細胞，待腫瘤生長至150至300 mm³ 後，將動物隨機分組(d0)。給藥劑量和給藥方案見下表。每週測2至3次瘤體積，稱鼠重，記錄資料。腫瘤體積(V)計算公式為：

V=1/2×a×b² 其中a、b分別表示長、寬。

實驗結果：

CPT-11脂質體及CPT-11均明顯抑制人結腸癌Ls-174t裸小鼠移植瘤的生長，CPT-11脂質體抑制Ls-174t生長有明顯的劑量依賴性，高劑量(3 mg/kg)給藥時，有4/14個腫瘤部分消退，低劑量(1 mg/kg)給藥時的療效與CPT-1110 mg/kg給藥時相當，提示CPT-11脂質體的療效有可能比其注射液至少提高10倍，具體結果見第3圖。

第1圖顯示本發明伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體注射劑的粒徑分佈。

第2圖顯示本發明伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體注射劑的形態圖。

第3圖顯示本發明伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體注射劑的體內抗腫瘤藥效試驗的結果。

無元件符號

Claims (23)

1. 一種伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體，其特徵在於該脂質體含有伊立替康或鹽酸伊立替康、中性磷脂以及膽固醇，其中該膽固醇與中性磷脂的重量比例為1：3至5，其中該中性磷脂是氫化大豆卵磷脂，其中該中性磷脂和伊立替康或鹽酸伊立替康符合以下重量配比：伊立替康或鹽酸伊立替康 1份中性磷脂 2至5份。
2. 如申請專利範圍第1項所述的脂質體，其中該膽固醇與中性磷脂的比例為1：3.5至4.5。
3. 如申請專利範圍第1項所述的脂質體，其中該膽固醇與中性磷脂的比例為1：4。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的脂質體，其中該脂質體經由離子梯度法製備得到。
5. 如申請專利範圍第4項所述的脂質體，其中該脂質體在用離子梯度法製備時內水相與外水相之間具有緩衝劑形成的離子梯度。
6. 如申請專利範圍第5項所述的脂質體，其中該脂質體在用離子梯度法製備時內水相具有比外水相離子濃度高的離子梯度。
7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的脂質體，其中該脂質體還含有親水性高分子的脂質衍生物。
8. 如申請專利範圍第7項所述的脂質體，其中該親水性高分子的脂質衍生物與伊立替康或鹽酸伊立替康的重量比為0.2至0.4。
9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的脂質體，其中該脂質體進一步含有帶電荷磷脂，該所述帶電荷磷脂選自二月桂醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二油酸磷脂醯絲氨酸、二油醯磷脂醯甘油、二月桂醯磷脂酸、二肉豆蔻醯磷脂酸或二硬脂醯磷脂酸中的一種或多種，且帶電荷磷脂與中性磷脂的重量比例為1：5至1：100。
10. 如申請專利範圍第1項所述的脂質體，其中該脂質體含有以下重量配比的成分：鹽酸伊立替康 1份氫化大豆卵磷脂 3.2至3.8份聚乙二醇2000-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺 0.32至0.38份膽固醇 0.8至0.95份，且膽固醇與氫化大豆卵磷脂的比例為1：4。
11. 一種申請專利範圍第1至10項中任一項所述的脂質體的製備方法，其特徵在於該製備方法包含下述步驟：1)經由下述A至D中任何一種方法製備空白脂質體：A.根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，減壓除掉乙醇後得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；B.根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於氯仿或氯仿-甲醇混合溶劑，旋轉蒸發形成脂質膜，加入緩衝劑水化得到空白脂質體粗品，之後採用高壓均質機或 /和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；C.根據配方選用中性磷脂、膽固醇與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；D.根據配方選用中性磷脂、膽固醇溶於無水乙醇或無水乙醇-叔丁醇混合溶劑中，與緩衝劑混合，之後採用高壓均質機或/和擠壓設備製備空白脂質體至所需的粒度；2)脂質體膜內外水相離子梯度的產生：置換空白脂質體外水相，使脂質體內水相與外水相產生離子梯度；3)含藥脂質體製備：配製鹽酸伊立替康水溶液，加入到具有離子梯度的空白脂質體分散液中，加熱攪拌，培育，即得。
12. 如申請專利範圍第11項所述的製備方法，其中在3)含藥脂質體製備步驟後，還包含以下步驟：4)游離藥物的去除及樣品的濃縮：在鹽酸伊立替康脂質體中加入緩衝介質，採用切向流裝置除去未包封的藥物，同時將樣品濃縮至適當的體積。
13. 如申請專利範圍第11至12項中任一項所述的製備方法，其中該緩衝劑選自含有Na⁺ 、K⁺ 、Fe²⁺ 、Ca²⁺ 、Ba²⁺ 、Mn²⁺ 、Mg²⁺ 、Li⁺ 、NH₄ ⁺ 或H⁺ 離子鹽的一種或多種。
14. 一種脂質體注射劑，其含有申請專利範圍第1至10項中任一項所述伊立替康或鹽酸伊立替康脂質體。
15. 如申請專利範圍第14項所述的脂質體注射劑，其中該 注射劑含有穩定劑，該穩定劑選自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽、乙二胺四乙酸二鈣鹽中的一種或多種，穩定劑的加入比例為0%至0.5w/v%且下限不為0%。
16. 如申請專利範圍第15項所述的脂質體注射劑，其中穩定劑為乙二胺四乙酸二鈉鹽。
17. 如申請專利範圍第14項所述的脂質體注射劑，其中該注射劑是注射液或凍乾粉針。
18. 如申請專利範圍第14項所述的脂質體注射劑，其特中該注射劑含有滲透壓調節劑，該滲透壓調節劑選自葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、氯化鈉、甘油、組胺酸及其鹽酸化物、甘胺酸及其鹽酸化物、賴胺酸、絲胺酸、谷胺酸、精胺酸或纈胺酸中的一種或多種，滲透壓調節劑的加入比例為0%至5w/v%且下限不為0%。
19. 如申請專利範圍第14項所述的脂質體注射劑，其中該注射劑進一步含有抗氧化劑，該抗氧化劑選自水溶性抗氧化劑或油溶性抗氧化劑，該油溶性抗氧化劑選自α-生育酚、α-生育酸琥珀酸酯、α-醋酸生育酚或其混合物，該水溶性抗氧化劑選自抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、L-半胱胺酸或其混合物，抗氧化劑的加入比例為0%至0.5w/v%且下限不為0%。
20. 如申請專利範圍第17項所述的脂質體注射劑，其中該注射劑是凍乾粉針，其中含有凍乾保護劑，是經由冷凍乾燥製得的脂質體凍乾粉針。
21. 如申請專利範圍第14項所述的脂質體注射劑，其中該注射劑脂質體含有以下重量配比的成分：鹽酸伊立替康 1份氫化大豆卵磷脂 3.2至3.8份聚乙二醇2000-二硬酯醯磷脂醯乙醇胺 0.32至0.38份膽固醇 0.8至0.95份乙二胺四乙酸二鈉 0.05至0.09份，且膽固醇與氫化大豆卵磷脂的比例為1：4。
22. 一種申請專利範圍第14至21項中任一項所述脂質體注射劑的製備方法，其特徵在於該方法包括申請專利範圍第11至12項中任一項所述的製備方法。
23. 如申請專利範圍第22項的製備方法，其中該方法還包括：定容、除菌、分裝：調整脂質體藥物濃度，定容，過濾除菌，灌封於小瓶中，得脂質體注射液；或者向脂質體藥物樣品中加入凍乾保護劑，調整藥物濃度，定容，過濾除菌，灌封於瓶中，冷凍乾燥，得凍乾粉針。