WO2019212288A1 - Messenger rna 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Messenger rna 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2019212288A1
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남혜영
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주식회사 삼양바이오팜
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    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)

Definitions

  • step (c) adding an aqueous solvent to the mixture of step (b) and mixing;
  • the surface charge of the nanoparticles may be -20 to 20 mV, more specifically -10 to 10 mV.
  • the particle size and surface charge of the nanoparticles maintain this level, it is desirable in view of the stability of the nanoparticle structure and the content of components, the absorption of mRNA in the body, and the convenience of sterilization as a pharmaceutical composition.
  • cationic lipids In the case of using such cationic lipids, it is preferable to use a small amount of polycationic lipids having high cation density in the molecule in order to reduce the toxicity caused by the cationic lipids, and more specifically, to display cations in an aqueous solution per molecule. There may be one functional group.
  • n and m are each independently 1 to 9, and 2 ⁇ n + m ⁇ 10.
  • cationic lipids include 1,6-dioleoyltriethylenetetramide, 1,8-dilinoleylyltetraethylenepentamide, 1,4-dimyristoleoyldiethylenetriamide, 1,10-dis At least one selected from the group consisting of thearoylpentaethylene hexamide and 1,10-dioleoylpentaethylenehexamide.
  • the hydrophilic A block may be at least one selected from the group consisting of monomethoxy polyethylene glycol, monoacetoxy polyethylene glycol, polyethylene glycol, copolymers of polyethylene and propylene glycol, and polyvinylpyrrolidone.
  • the functional group or ligand is an anamide (anisamide), vitamin B9 (folic acid), vitamin B12, vitamin A, galactose, lactose, mannose, hyaluronic acid, RGD peptide, NGR peptide, transferrin, antibodies to the transferrin receptor It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the hydrophobic B block may have a number average molecular weight of 50 to 50,000 Daltons, more specifically 200 to 20,000 Daltons, even more specifically 1,000 to 5,000 Daltons.
  • the polylactic acid salt contained in the inner wall component of the nanoparticles as a separate component from the amphiphilic block copolymer may have a number average molecular weight of 500 to 50,000 Daltons, and more specifically 1,000 to 10,000 Daltons.
  • the polylactic acid salt has a number average molecular weight of less than 500 Daltons, the hydrophobicity is too low to be present in the core (inner wall) of the nanoparticles. If the polylactic acid salt exceeds 50,000 Daltons, the particles of the polymer nanoparticles become large.
  • the composition of the present invention may contain 2 to 15 parts by weight of the cationic lipid, 10 to 500 parts by weight of the amphipathic block copolymer, and 1 to 100 parts by weight of polylactic acid based on 1 part by weight of mRNA. have.
  • the composition of the present invention 2 to 14 parts by weight of cationic lipids, 10 to 400 parts by weight (more preferably 15 to 300 parts by weight) of the amphiphilic block copolymer,
  • the polylactic acid salt may be contained in an amount of 2 to 50 parts by weight (more preferably 2.5 to 20 parts by weight).
  • X is a methyl group
  • Y ' is a hydrogen atom or a phenyl group
  • p is an integer from 0 to 25
  • q is an integer from 0 to 25, provided that p + q is an integer from 5 to 25
  • R is a hydrogen atom or an acetyl, benzoyl, decanoyl, palmitoyl, methyl or ethyl group
  • M is Na, K, or Li
  • Z is a hydrogen atom, methyl or phenyl group
  • X and X ' are independently hydrogen, alkyl having 1 to 10 carbon atoms or aryl having 6 to 20 carbon atoms; Y and Z are independently Na, K, or Li; m and n are independently integers from 0 to 95, with 5 ⁇ m + n ⁇ 100; a and b are independently an integer from 1 to 6; R is-(CH 2 ) k- , divalent alkenyl having 2 to 10 carbon atoms, divalent aryl having 6 to 20 carbon atoms, or a combination thereof, wherein k is 0 to 10 Is an integer.
  • the fusion lipid may be one or a combination of two or more selected from the group consisting of phospholipids, cholesterol, and tocopherols.
  • the fusion lipids are dilauroyl phosphatidylethanolamine, dimyristoyl phosphatidylethanolamine, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine, and distearoyl phosphatidyl ethanolamine.
  • the present invention also provides a method of preparing a pharmaceutical composition comprising the amphiphilic block copolymer nanoparticles containing the mRNA.
  • a method of preparing a pharmaceutical composition comprising the amphiphilic block copolymer nanoparticles containing the mRNA.
  • it in order to solve the problem of difficulty in the production of nanoparticles due to the instability of the mRNA itself, it provides a method of forming a complex in the polymer nanoparticles by forming a complex in the water-miscible organic solvent of ethanol alone do.
  • step (c) of the first manufacturing method may include adding an aqueous solvent to the mixture of step (b) and dispersing with an ultrasonic ultrasonicator.
  • step (c) removing the water-miscible organic solvent from the mixture of step (b); wherein the water-miscible organic solvent of step (a) is ethanol alone.

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Abstract

유효성분으로서 mRNA; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 mRNA는 상기 양이온성 화합물과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 형성하는 나노입자 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 하는 mRNA 전달용 고분자 나노입자 조성물과 그 제조방법이 개시된다.

Description

MESSENGER RNA 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법
본 발명은 mRNA를 전달하기 위한 고분자 나노입자 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. mRNA(messenger RNA)는 단백질을 합성하기 전 단계의 물질로서, 유전정보를 담고 있다. mRNA는 다양한 치료제로의 접근이 가능하여 예방용 또는 치료용 백신으로 활용 가능하며, 결여된 단백질도 mRNA를 통해 합성이 가능하다. mRNA 치료제의 장점은 DNA와 비교해 핵까지 전달 되지 않아도 되며, 유전체에 삽입되는 것이 아니므로 영구적인 유전적 질병을 유발하지 않아 안전성이 높다. 또한, 단백질 치료제가 접근할 수 없는 세포 내부의 결여된 단백질까지 mRNA로 합성이 가능하다. mRNA는 발현하는 단백질에 따라 다양한 크기를 지닐 수 있으며, 단일 가닥으로 존재한다. DNA로부터 만들어진 mRNA는 핵에서 세포질로 빠져나와 라이보좀과 만나 단백질을 생성한다. mRNA는 차세대 유전자 치료제로 각광받고 있지만 단일가닥이기 때문에 안정성이 매우 낮아 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설될 뿐 아니라, 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다.
핵산을 비롯한 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다. 바이러스성 전달체의 경우 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.
비바이러스성 전달체중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포 내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.
한편, 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 나노입자의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다(한국등록특허 제0180334호). 그러나, 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 나노입자를 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만, 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 나노입자 내부에 봉입할 수 없으므로, 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다. 이에, 핵산과 양이온성 지질의 정전기적 상호작용에 의한 복합체를 형성하여 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입되도록 하는 음이온성 약물 전달 조성물 및 다양한 제조 방법을 개시한 바 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2017-0032858호는 유효성분으로서 음이온성 약물; 양이온성 화합물; 양친성 블록 공중합체; 및 폴리락트산염을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되는 것을 특징으로 하는 음이온성 약물 전달용 조성물 및 그의 제조방법을 개시하고 있다. 상기 공개특허는 음이온성 약물로서 디옥시리보핵산, 리보핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산, 예를 들어 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산 등 매우 다양한 물질을 언급하고, 구체적으로는 siRNA를 사용하고 있으나, mRNA에 대한 언급은 전혀 없다. 전달하고자 하는 핵산의 종류에 따라 상이한 전달체 및 제조방법이 요구되는바, mRNA 전달체로서 안정성 및 제조 수율이 증가된 제형 및 그 제조방법이 요구되어 왔다.
본 발명은 폴리락트산염을 함유하여 mRNA를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 나노입자 구조체를 포함하는 mRNA 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기와 같은 mRNA를 체내에 효과적으로 전달할 수 있는 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양은,
유효성분으로서 mRNA;
양이온성 화합물;
양친성 블록 공중합체; 및
폴리락트산염;을 포함하며,
상기 mRNA는 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는, mRNA 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 태양은,
(a) mRNA 수용액과 양이온성 화합물이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물에, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
(c) 단계 (b)의 혼합물에 수성 용매를 가하여 혼합하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되, 단계 (a)와 단계 (b)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 하는, 상기 mRNA 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은,
(a) 양이온성 화합물, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 수혼화성 유기용매에 용해시키는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물에 mRNA 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되, 단계 (a)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 하는, 상기 mRNA 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 mRNA 함유 약제학적 조성물은, 양이온성 화합물, 양친성 블록 고분자 및 폴리락트산염을 사용하여 mRNA를 나노입자 구조 내부로 봉입함에 따라 mRNA의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있다. 본 약제학적 조성물은 물에 용해가 가능하고, 나노입자 구조체를 형성하는 일 성분으로서 폴리락트산염을 포함함으로써, 체내 주입시 혈중 안정성 증가 및 세망내피계(RES)를 회피하는 것을 통하여 표적 부위, 구체적으로 암조직으로의 전달 효율이 우수하므로, 세망내피계(RES) 회피 및/또는 표적화 증진 용도로도 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 태양에 따른 mRNA 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 나노입자 전달체의 개략적인 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 태양에 따른 고분자 나노입자에 봉입된 mRNA의 분해여부를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 태양에 따른 고분자 나노입자의 마우스 근육 주사후 단백질 발현 정도를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 태양에 따른 고분자 나노입자의 마우스 정맥 주사후 단백질 발현 정도를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 조성물의 구성성분 중, mRNA와 양이온성 화합물은, 양친성 블록 고분자와 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되고, 이러한 mRNA 및 양이온성 화합물의 복합체가 봉입된 고분자 나노입자 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1을 참조하면, mRNA는 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여, mRNA와 양이온성 화합물 복합체를 형성한다. 형성된 mRNA와 양이온성 화합물 복합체는, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조 내에 봉입된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체는, 수성 환경에서 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 나노입자의 외벽을 형성하고, 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 함유된 폴리락트산염이 나노입자의 내벽을 형성하며, 그 형성된 나노입자의 내부에 mRNA와 양이온성 화합물 복합체가 봉입된 구조이다.
상기 mRNA와 양이온성 화합물 복합체는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 나노입자 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하여 혈중 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다.
일 예에서, 상기 나노입자의 입자 크기는 10 내지 200 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm일 수 있다.
또한, 일 예에서, 상기 나노입자의 표면 전하는 -20 내지 20 mV일 수 있고, 더욱 구체적으로 -10 내지 10 mV일 수 있다.
나노입자의 입자 크기 및 표면 전하가 상기 수준을 유지할 경우, 나노입자 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 mRNA의 흡수도 및 약제학적 조성물로서 멸균의 편의성면에서 바람직하다.
상기 mRNA는 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다.
구체적으로는, mRNA의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.
또한, 상기 mRNA의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
본 발명에서, mRNA는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.05 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 0.1 내지 5중량%, 보다 더 구체적으로는 0.5 내지 3 중량%로 포함될 수 있다. 상기 mRNA의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.05 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양이온성 화합물은, mRNA와 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다. 따라서, 상기 양이온성 화합물은, mRNA와 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어, 양이온성 지질 또는 양이온성 고분자 종류일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액 상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다.
이에 따라, 보다 바람직한 일 태양에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
한편, 일 구체예에서, 상기 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 프로타민(protamine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.
구체적인 일 태양에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 7의 양이온성 지질일 수 있다:
[화학식 7]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000001
상기 식에서,
n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이고,
a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 6이며,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
상기 화학식 7에서, 바람직하게 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10일 수 있다.
상기 화학식 7에서, 바람직하게 a 및 b는 각각 독립적으로 2 내지 4일 수 있다.
상기 화학식 7에서, 바람직하게 R1 및 R2는 각각 독립적으로, 라우릴(lauryl), 미리스틸(myristyl), 팔미틸(palmityl), 스테아릴(stearyl), 아라키딜(arachidyl), 베헨닐(behenyl), 리그노세릴(lignoceryl), 세로틸(cerotyl), 미리스트올레일(myristoleyl), 팔미트올레일(palmitoleyl), 사피에닐(sapienyl), 올레일(oleyl), 리놀레일(linoleyl), 아라키도닐(arachidonyl), 에이코사펜타에닐(eicosapentaenyl), 에루실(erucyl), 도코사헥사에닐(docosahexaenyl), 및 세로틸(cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
양이온성 지질의 구체적인 예는 1,6-디올레오일트리에틸렌테트라마이드, 1,8-디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 1,4-디미리스톨레오일디에틸렌트리아마이드, 1,10-디스테아로일펜타에틸렌헥사마이드 및 1,10-디올레오일펜타에틸렌헥사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은, 전체 조성물의 중량을 기준으로, 1 내지 50중량%로 포함될 수 있고, 보다 구체적으로는 2 내지 40중량% , 보다 더 구체적으로는 3 내지 30중량%로 포함될 수 있다. 상기 양이온성 지질의 함량이 전체 조성물의 중량을 기준으로 1중량% 미만이면 mRNA와 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50중량%를 초과하면, 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.
상기 양이온성 화합물과 mRNA는, 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다. 구체적인 일 태양으로서, 상기 mRNA(P)과 양이온성 화합물(N)의 전하량의 비율(N/P; mRNA의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.5 내지 100일 수 있고, 보다 구체적으로는 1 내지 50, 보다 더 구체적으로는 2 내지 20일 수 있다. 상기 비율(N/P)이 0.5 미만인 경우에는 충분한 양의 mRNA를 포함하는 복합체를 형성하기 어렵기 때문에, 0.5 이상이어야 충분한 양의 음이온 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 100을 초과할 시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 100 이하로 하는 것이 좋다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수용액 상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 나노입자를 형성한다.
상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤인 것일수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.
또한, 필요에 따라, 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 폴리락트산염으로 형성된 고분자 나노입자 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 나노입자 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤인 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.
또한, 일 실시예에서 상기 소수성 B 블록은, 소수성 B 블록의 소수성을 증가시켜 나노입자의 안정성을 향상시키기 위하여, 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 B 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 수식된 것일 수 있다.
상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 10 내지 95중량%일 수 있고, 보다 구체적으로는 20 내지 90중량%, 보다 더 구체적으로는 30 내지 85중량%일 수 있다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 조성물 전체 건조중량을 기준으로 10중량% 미만이면 나노입자의 크기가 너무 커져 나노입자의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 95중량%를 초과하면 함입할 수 있는 mRNA의 함량이 너무 적어지게 된다.
또 다른 일 실시예에서, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70중량% 범위일 수 있고, 보다 구체적으로는 50 내지 60중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 공중합체 중량을 기준으로 40중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 나노입자를 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 나노입자를 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 이상인 것이 좋다. 한편, 친수성 블록(A)의 비율이 공중합체 중량을 기준으로 70중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 나노입자의 안정성이 낮아져서 mRNA/양이온성 지질 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 나노입자 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70중량% 이하인 것이 좋다.
구체적인 일 태양에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 수용액 상에서 mRNA와 양이온성 지질 복합체를 나노입자 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 mRNA 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율[a/b X 100; (mRNA 중량+양이온성 지질 중량)/양친성 블록 공중합체 중량 X 100]은, 1 내지 60%일 수 있고, 보다 구체적으로는 1.5 내지 50%, 보다 더 구체적으로는 2 내지 40%일 수 있다. 상기 중량 비율(a/b X 100)이, 1% 미만인 경우에는 mRNA 및 양이온성 지질 복합체의 함량이 지나치게 낮아져서 mRNA가 효과적으로 작용할 수 있는 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 60% 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 mRNA 및 지질 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 나노입자 구조를 형성하지 못하기 때문이다.
본 발명에 따른 조성물 중 나노입자 구조체는 폴리락트산염(예컨대, 폴리락트산나트륨염(PLANa))를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리락트산염은 나노입자의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 나노입자를 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 양이온성 복합체와 결합하여 고분자 나노입자의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 나노입자에 비해 표면전위의 양성 전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.
상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 나노입자 내벽 성분으로 포함되는 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50,000달톤인 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 1,000 내지 10,000달톤인 것일 수 있다. 폴리락트산염은 수평균분자량이 500달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 나노입자의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 50,000달톤을 초과하면 고분자 나노입자의 입자가 커지는 문제가 있다.
상기 폴리락트산염은 양친성 블록 공중합체 100 중량부에 대하여 1 내지 70 중량부로 사용될 수 있고, 보다 구체적으로는 2 내지 50 중량부, 보다 더 구체적으로 5 내지 30 중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 사용량이 양친성 블록 공중합체 100 중량부 대비 70 중량부를 초과하면 나노입자의 크기가 증가하여, 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1 중량부 미만이면 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은, mRNA 1 중량부 대비 양이온성 지질을 2 내지 15 중량부, 양친성 블록 공중합체를 10 내지 500 중량부, 폴리락트산염을 1 내지 100 중량부로 함유할 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은, mRNA 1 중량부 대비 양이온성 지질을 2 내지 14 중량부, 양친성 블록 공중합체를 10 내지 400 중량부(보다 바람직하게는 15 내지 300 중량부), 폴리락트산염을 2 내지 50 중량부(보다 바람직하게는 2.5 내지 20 중량부)로 함유할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리락트산염(예컨대, 폴리락트산나트륨염)의 말단 중 카르복실산금속(예컨대, 카르복실산나트륨)의 반대편의 말단은, 히드록시, 아세톡시, 벤조일옥시, 데카노일옥시, 팔미토일옥시 및 탄소수 1 내지 2개의 알콕시로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나로 치환될 수 있다.
바람직한 하나의 태양으로서, 본 발명의 폴리락트산염은 하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000002
상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다;
[화학식 2]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000003
상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다;
[화학식 3]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000004
상기 식 3에서, W-M'는
Figure PCTKR2019005328-appb-I000005
또는
Figure PCTKR2019005328-appb-I000006
이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다;
[화학식 4]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000007
상기 식 4에서, S는
Figure PCTKR2019005328-appb-I000008
이고; L은 -NR1- 또는 -0-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1- 10알킬이고; Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다;
[화학식 5]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000009
또는
Figure PCTKR2019005328-appb-I000010
상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다;
[화학식 6]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000011
상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 폴리락트산염은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 mRNA의 세포 내 전달 효율을 증가시키기 위하여 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.01 내지 50중량%의, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10중량%의 융합성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합성 지질은 mRNA와 양이온성 지질의 복합체에 혼합시, 소수성 상호작용으로 결합하여 mRNA, 양이온성 지질 및 융합성 지질의 복합체를 형성하고, 상기 융합성 지질을 포함하는 복합체는 양친성 블록 공중합체의 나노입자 구조 내부에 봉입된다.
일 구체예에서, 상기 융합성 지질은 인지질, 콜레스테롤, 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
구체적으로, 상기 인지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산(phosphatidic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamin, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딘산은 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 형태일 수 있다. 상기 콜레스테롤 및 토코페롤에는 콜레스테롤 및 토코페롤의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.
구체적으로, 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일 포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤 및 토코페롤로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 융합성 지질은 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디팔미토올레오일포스포콜린(1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 디올레오일포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 디팔미토올레오일포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적인 일 태양으로서, 본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 나노입자 구조체에 봉입된 mRNA-양이온성 화합물 복합체 함유 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제, 캡슐, 분체 제제, 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데, 바람직한 일 태양으로서, 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우, 이를 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 mRNA를 함유하는 양친성 블록 공중합체 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 태양에 따르면, mRNA 자체의 불안정성 때문에 나노입자 제조가 어려운 문제를 해결하기 위하여, mRNA와 양이온성 지질을 에탄올 단독인 수혼화성 유기용매에서 복합체를 형성하여 고분자 나노입자 내에 봉입하는 방법을 제공한다.
구체적인 일 태양으로서, 본 발명의 제1 제조방법은,
(a) mRNA 수용액과 양이온성 화합물이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물에, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
(c) 단계 (b)의 혼합물에 수성 용매를 가하여 혼합하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되, 단계 (a)와 단계 (b)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 한다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 제조방법의 단계 (c)는 단계 (b)의 혼합물에 수성 용매를 가하고 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 태양으로서, 본 발명의 제2 제조방법은,
(a) 양이온성 화합물, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 수혼화성 유기용매에 용해시키는 단계;
(b) 단계 (a)의 혼합물에 mRNA 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되, 단계 (a)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 한다.
일 구체예에 따르면, 상기 제2 제조방법의 단계 (b)는 단계 (a)의 혼합물에 mRNA 수용액을 가하고 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 초음파분쇄기로는 배쓰 타입 초음파분쇄기(bath type ultrasonicator)를 사용하는 것이 바람직하다. 배쓰 타입 초음파분쇄기는 20 내지 40 W/L(Watt/Liter)의 약한 초음파분쇄를 제공하고 매우 불균일한 분포를 제공하는 것으로 알려져 있는 반면, 프로브 타입 초음파분쇄기(probe type ultrasonicator)는 대략 20,000 W/L을 가할 수 있다. 이는 프로브 타입의 초음파분쇄기가 집중되고 균일한 초음파 강도 투입으로 인해 배쓰형 타입 초음파분쇄기 보다 약 1,000배 우수함을 의미하는 것이다. 일반적으로, mRMA는 그 불안정성으로 인해, 초음파 분쇄가 불가능하거나 곤란한 것으로 알려져 있었으나, 본 발명과 같이 mRNA를 고분자 나노입자 내에 봉입시킴으로써 비로소 초음파분쇄기를 사용하는 것이 가능해져 전달체 제조 시 보다 편리하고 효율적인 제조가 가능하다.
또 다른 하나의 추가적인 태양으로서, 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계 이후에, 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 추가적인 태양으로서, 상기 제조방법은, 상기 동결 건조 전에 고분자 나노입자 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 양친성 블록 공중합체 조성물을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%일 수 있고, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량%일 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 제조방법을 통해 제조된, mRNA와 양이온성 화합물 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염 나노입자 구조체에 봉입된 형태의 조성물 내의 나노입자는 혈중에서 안정하며, 그 크기는 구체적으로 10 내지 200 nm일수 있고, 더욱 구체적으로는 10 내지 150 nm일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[ 비교예 1] mRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 ( dio - TETA )/mPEG- PLA -토코페롤(2k-1.7k)/PLANa(1.7k) 함유 조성물 제조
LUC(Luciferase)를 발현하는 mRNA(이하, 'LUC mRNA'라 함) 10 ㎍을 증류수 10㎕에 녹이고, 여기에, dioTETA 180 ㎍을 증류수 혹은 산성 용매인 100 mM 소듐아세테이트 완충용액(pH 4.2) 36 ㎕에 녹인 용액을 섞어주었다. 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE) 20.8 ㎍을 에틸아세테이트 1㎕에 녹인 용액, 폴리락트산나트륨염(PLANa) 600 ㎍을 에틸아세테이트 30㎕에 녹인 용액, mPEG-PLA-토코페롤 2mg을 에틸아세테이트 400㎕에 녹인 용액을 차례로 섞어준 후, 복합 유상액에 3배의 양인 210㎕의 증류수를 섞어주고, 탐침형(Probe type) 초음파 분쇄기로 10분간 분산시켜 주었다. 결과물을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸아세테이트를 선택적으로 제거하여 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물을 0.22 μm hydrophilic filter로 여과시킨 후 4℃에 보관하여 제형의 특성을 관찰하였다(표 1).
[표 1]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000012
상기 표 1의 조성비에서 제시된 각 수치들은 순서대로 "mRNA 사용량(μg)-지질 N/P 비율-고분자 1 사용량(mg)-고분자 2 사용량(mg)"이다. 이하의 표에서 동일하게 적용된다.
[ 실시예 1 및 2] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k ) 또는 mPEG- PLA (2k-1.7k)/PLANa(1.7k) 함유 조성물 제조: mRNA와 1,6- dioTETA 복합체를 먼저 형성한 후 에탄올과 수상에서 나노입자를 형성하는 방법
mRNA 수용액(10μg/10μl)에 에탄올 10μl를 넣고 섞어준 뒤, 여기에 1,6 dioTETA 50μg을 10μl 에탄올에 녹인 용액을 넣어 섞어 주고, 5분간 방치한다. mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)[또는 mPEG-PLA(2k-1.7k)] 200 μg 과 PLANa(1.7k) 200 μg을 각각 에탄올 4 μL, 10 μL에 녹였다. mRNA 및 1,6 dioTETA가 섞인 용액에 mPEG-PLA-토코페롤(또는 mPEG-PLA)과 PLANa를 차례로 섞어 준 후, 에탄올 2.75μl에 녹인 DOPE 55μg를 섞어주었다. 에탄올과 증류수의 부피 비율이 1:8이 되도록 혼합물에 증류수를 첨가해 주었다. 1분간 섞어 준 뒤, 3분간 초음파 분쇄 상태(bath type)에 두었다. 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에탄올을 선택적으로 제거하여 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)[또는 mPEG-PLA(2k-1.7k)]/DOPE 함유 조성물을 제조하였다. 제조된 조성물은 0.22 μm PVDF 필터로 여과시켜 입자가 큰 제형은 배제하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000013
[ 실시예 3] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 함유 조성물 제조: mRNA를 제외한 모든 성분들을 에탄올에 녹인 후 수상에 있는 mRNA와 섞어주는 방법
1,6 dioTETA 50μg을 10μl 에탄올에 녹이고, 여기에 mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k) 200μg과 PLANa(1.7k) 200μg을 각각 에탄올 4μl, 10μl에 녹인 용액을 섞어 주었다. mRNA 수용액(10μg/10μl)에 증류수 62μl를 첨가하고, 여기에, 상기 성분들이 녹아있는 에탄올 용액을 넣고 섞어 주었다. 1분간 섞어 준 뒤, 3분간 bath 타입의 초음파 분쇄기로 분산 시켰다. 제조한 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에탄올을 선택적으로 제거하여 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE 함유 고분자 나노입자를 제조하였다. 제조된 나노입자는 0.22 μm PVDF 필터로 여과시켜 입자가 큰 제형은 배제하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000014
[ 실시예 4, 5, 6] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k )/ PLA ( 1.7k ) 함유 조성물 제조
실시예 1 및 2와 동일한 방법으로 조성물 구성성분들의 양을 달리 하여 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)[또는 mPEG-PLA(2k-1.7k)]/PLANa(1.7k) 함유 조성물을 제조하였다. 그 결과, mRNA가 나노 입자속에 효율적으로 봉입되어 있는 제형을 수득할 수 있었다(실시예 4, 5, 6).
실시예 4, 5, 6에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4에 정리하였다:
[표 4]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000015
[ 실험예 1] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 고분자 나노입자에 봉입된 mRNA 상태 비교
제조법에 따라 나노 입자 안에 봉입된 mRNA의 상태가 온전한지 비교하였다. 제조된 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa(1.7k) 고분자 나노입자에서 mRNA를 추출하여 아가로즈 젤로 mRNA의 크기를 비교하였다. 수용액 상태에 존재하는 나노입자 10μl에 20% 트라이톤X-100(Triton X-100) 10μl을 첨가하고, 100mM 헤파린 2μl를 넣어 섞어 준 뒤, 70℃ 인큐베이터에 15분 두었다. 나노입자로부터 추출된 mRNA는 1.5% 아가로즈 젤에 로딩하여 10분 뒤에 확인하였다. mRNA의 분해여부를 도 2에 나타내었다.
[ 실험예 2] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 고분자 나노입자의 mRNA 함량 비교
각 제조법 및 조성비에 따라 나노 입자의 수득률이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 mRNA 함량을 정량하였다. 제조된 mRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa(1.7k) 함유 고분자 나노입자에서 mRNA 양을 정량하였다. 수용액 상태에 존재하는 나노입자 10μl에 20% 트라이톤X-100(Triton X-100) 10μl을 첨가하고, 100mM 헤파린 2μl를 넣어 섞어 준 뒤, 70℃ 인큐베이터에 15분 두었다. 나노입자로부터 추출된 mRNA는 1.5% 아가로즈 젤에 로딩하여 10분뒤에 확인하였다. 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000016
조성물을 에탄올에 용해하고, dioTETA와 mRNA를 먼저 결합한 후 수상에서 나노입자를 형성하는 제법에서 조성물의 양을 다르게 한 실시예 4, 5, 6의 mRNA 함량을 아래의 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000017
[ 실험예 3] 제법 및 조성물 차이에 따른 고분자 나노입자 크기 비교
동적 광산란(DLS; dynamic light scattering) 방법을 이용하여 입자의 크기와 표면 전하를 측정하였다. He-Ne 레이져를 광원으로 사용하였으며, MALVERN사의 Zetasizer Nano ZS90 기기를 매뉴얼에 따라 작동하였다.
제법 및 조성물 차이에 따른 나노입자의 크기는 아래의 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure PCTKR2019005328-appb-I000018
[ 실험예 4] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 또는 mPEG- PLA (2k-1.7k)/PLANa(1.7k) 고분자 나노입자의 마우스의 근육 주사 후 단백질 발현 여부 확인
실시예 1, 2, 4, 5, 6으로 제조된 제형을 마우스 뒷다리에 투여하고, 투여 후 24시간, 48시간 뒤 Luciferin 을 정맥주사하여 이미징 기계(IVIS Lumina III In Vivo Imaging System , PerkinElmer)로 단백질 발현 정도를 확인하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
[ 실험예 5] mRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤(2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 고분자 나노입자의 마우스의 정맥 주사 후 단백질 발현 여부 확인
실시예 1, 4, 5로 제조된 제형을 마우스 꼬리에 정맥 투여하고, 투여 6시간 뒤 Luciferin 을 정맥주사하여 이미징 기계(IVIS Lumina III In Vivo Imaging System , PerkinElmer)로 단백질 발현 정도를 확인하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

Claims (20)

  1. 유효성분으로서 mRNA(messenger RNA);
    양이온성 화합물;
    양친성 블록 공중합체; 및
    하기 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리락트산염;을 포함하며,
    상기 mRNA는 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의하여 형성된 나노입자 구조 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는,
    mRNA 전달용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000019
    상기 식 1에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- 또는 -COO-CH2CH2OCH2이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다;
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000020
    상기 식 2에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다;
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000021
    상기 식 3에서, W-M'는
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000022
    또는
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000023
    이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다;
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000024
    상기 식 4에서, S는
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000025
    이고; L은 -NR1- 또는 -0-이며, 여기서 R1은 수소원자 또는 C1- 10알킬이고; Q는 CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3, 또는 CH2C6H5이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다;
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000026
    또는
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000027
    상기 식 5에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH2CH2-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다;
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000028
    상기 식 6에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH2)k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 나노입자의 입자 크기가 10 내지 200 nm인, mRNA 전달용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 나노입자의 표면 전하가 -20 내지 20 mV인, mRNA 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 양이온성 화합물이 양이온성 지질인, mRNA 전달용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 화학식 7의 양이온성 지질인, mRNA 전달용 조성물:
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019005328-appb-I000029
    상기 식에서,
    n 및 m은 각각 독립적으로 0 내지 12이되, 2 ≤ n + m ≤ 12이고,
    a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 6이며,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로 이루어진 군에서 선택된 것이다.
  6. 제5항에 있어서, n 및 m이 각각 독립적으로 1 내지 9이며, 2 ≤ n+m ≤ 10인, mRNA 전달용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, a 및 b가 각각 독립적으로 2 내지 4인, mRNA 전달용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, R1 및 R2가 각각 독립적으로 라우릴(lauryl), 미리스틸(myristyl), 팔미틸(palmityl), 스테아릴(stearyl), 아라키딜(arachidyl), 베헨닐(behenyl), 리그노세릴(lignoceryl), 세로틸(cerotyl), 미리스트올레일(myristoleyl), 팔미트올레일(palmitoleyl), 사피에닐(sapienyl), 올레일(oleyl), 리놀레일(linoleyl), 아라키도닐(arachidonyl), 에이코사펜타에닐(eicosapentaenyl), 에루실(erucyl), 도코사헥사에닐(docosahexaenyl) 및 세로틸(cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것인, mRNA 전달용 조성물.
  9. 제4항에 있어서, mRNA(P)와 양이온성 지질(N)의 전하량의 비율(N/P)이 0.5 내지 100인, mRNA 전달용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 양친성 블록 공중합체가 친수성 A 블록과 소수성 B 블록으로 구성되는 A-B 형 이중 블록 공중합체이며, 여기서,
    상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 소수성 B 블록은 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인,
    mRNA 전달용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 소수성 B 블록이, 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 B 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시키는 것에 의하여 수식된 것인, mRNA 전달용 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 친수성 A 블록의 수평균 분자량이 200 내지 50,000달톤이고, 친수성 B 블록의 수평균 분자량이 50 내지 50,000달톤인, mRNA 전달용 조성물.
  13. 제4항에 있어서, 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 mRNA 및 양이온성 지질 복합체의 중량(a) 비율(a/b X 100)이 1 내지 60%인, mRNA 전달용 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 폴리락트산염의 수평균 분자량이 500 내지 50,000달톤인, mRNA 전달용 조성물.
  15. 제4항에 있어서, mRNA 1 중량부 대비 양이온성 지질을 2 내지 15 중량부, 양친성 블록 공중합체를 10 내지 500 중량부, 및 폴리락트산염을 1 내지 100 중량부로 함유하는, mRNA 전달용 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 폴리락트산염이 화학식 1 또는 화학식 2로 나타내어지는 것인, mRNA 전달용 조성물.
  17. (a) mRNA 수용액과 양이온성 화합물이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 혼합물에, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염이 수혼화성 유기용매에 용해되어 있는 용액을 혼합하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 혼합물에 수성 용매를 가하여 혼합하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되,
    단계 (a)와 단계 (b)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 하는,
    제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 단계 (c)가, 단계 (b)의 혼합물에 수성 용매를 가하고 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함하는, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  19. (a) 양이온성 화합물, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염을 수혼화성 유기용매에 용해시키는 단계;
    (b) 단계 (a)의 혼합물에 mRNA 수용액을 가하여 혼합하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 혼합물로부터 상기 수혼화성 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하되,
    단계 (a)의 수혼화성 유기용매가 에탄올 단독인 것을 특징으로 하는,
    제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 (b)가, 단계 (a)의 혼합물에 mRNA 수용액을 가하고 초음파분쇄기(ultrasonicator)로 분산시키는 것을 포함하는, mRNA 전달용 조성물의 제조방법.
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