JP3785932B2 - 核酸含有複合体製剤の製造方法 - Google Patents
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Description
技 術 分 野
本発明は、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤に関するものである。当該複合体は、リポプレックスと呼ばれることもある。
ここで「カチオン性担体」とは、薬物、特にアニオン性の薬物を細胞内へ移入するのに有効な、水中で陽電荷を有する薬物担体をいう。カチオン性担体は、近年、遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡを細胞内へ移入するための薬物担体として盛んに研究されている。
「核酸重合体」とは、天然由来の又は合成若しくは半合成されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及び天然由来の又は合成若しくは半合成されたオリゴヌクレオチドをいう。
背 景 技 術
カチオン性担体とポリアニオン性で二重らせん構造を有する二本鎖核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤は、単にカチオン性担体と二本鎖核酸重合体とを混合するだけで製造することができる。
しかし、この方法で製造された核酸含有複合体製剤は、一般に、複合体の粒子径が数μｍ〜数百μｍと粗大であり、不均一である。このような粗大で不均一な核酸含有複合体製剤は、核酸重合体の細胞内移行や情報発現に関する研究において、均一なデータが十分に得られないという欠点を有する。粒子の粗大性に関する最も重大な問題は、工業スケールで滅菌することが困難であること、ヒトに安全に投与できることを前提とする医薬品製剤において、注射針内をはじめ、静脈内投与においては毛細血管に塞栓等を生ずるおそれがあることである。これらの問題は、上記のような単に混合するだけで当該複合体製剤を製造する方法のみならず、適当な乳化分散機等を用いて分散処理を施すことにより製造する方法においても解決することが困難な問題である。
粒子の粗大凝集化は、当該複合体製剤の安定化のために試みられる凍結乾燥化においても発生する問題である。
当該複合体製剤中の核酸重合体は、投与量を少なくし、投与時における患者や医療従事者の負担を軽減するため、又は当該複合体製剤の製造効率を図るために高濃度であることが望ましい。しかし、従来の製造方法では、核酸重合体の総量が０．１ｍｇ／ｍＬ以上、特に０．５ｍｇ／ｍＬ以上になると、製造過程において著しい凝集が起こり、肉眼的に容易に確認できるほどの巨大な沈殿物あるいは浮遊物が生じ、このようなものは、あらゆる分散処理によっても十分には分散させることができない。
ところで、従来、遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡにおいては、二重らせん構造を有する二本鎖のものが、生理的な側面及び種々のヌクレアーゼに対する安定性の観点から、いわば常識的に採用されてきた。例えば、強力なインターフェロン誘導能や免疫賦活作用等の生理活性を有するポリＩ：Ｃについては、ポリＩとポリＣとを別々に投与しても十分な薬理効果が得られないことが知られている（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５１，１９９−２１５（１９７６））。このように遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡは、二重らせん構造を有する二本鎖であることが必須と考えられてきた。
カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤については、上記のような核酸重合体の二重らせん構造の必要性に関して全く論じられておらず、当該複合体製剤の製造においても、いわば常識的に二重らせん構造を有する二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡが採用されてきた。
本出願人は、カチオン性担体とポリＩ：Ｃ等の二本鎖ＲＮＡとの核酸含有複合体製剤が、癌治療等に有効な癌細胞内のヌクレアーゼを活性化することから、当該核酸含有複合体製剤を癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤として特許出願し、また肝臓や脾臓に特異的に有効量のインターフェロンを長時間誘導することから、当該核酸含有複合体製剤を肝炎治療剤として既に特許出願している（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０４６９５号、ＰＣＴ／ＪＰ９９／０１４３８号）。
発 明 の 開 示
本発明の目的は、特に、いわゆる濾過滅菌が可能で、人体に対する安全性に問題があるとされる７μｍ以上の粗大な粒子を含まないことを特徴とする、均一で良質な核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤の製造過程において、通常二重らせん構造を有する二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡを用いることなく、二重らせん構造をほどいた、又は二重らせん構造をあらかじめ形成させることなく一本鎖の状態の核酸重合体を用いて製造することにより、薬理活性等に影響を与えることなく上記課題を一挙に解決できることを初めて見出し、本発明を完成した。
従って、本発明として、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤（以下、「核酸含有複合体製剤」という）の製造過程において、少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体を、それぞれ別々に一本鎖の状態でカチオン性担体に、又はカチオン性担体が形成される前の原料に添加し分散処理することを特徴とする前記核酸含有複合体製剤の製造方法を挙げることができる。
以下、本発明を詳述する。
本発明に適用し得る「カチオン性担体」としては、例えば、市販のリポフェクチン（商品名）やリポフェクトアミン（商品名）、リポフェクトエース（商品名）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商品名）の他、ＰＣＴ ＷＯ９４／１９３１４号公報に開示されている薬物担体、例えば、次の構造式〔Ｉ〕で表される２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下「化合物Ａ」という）及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体やポリリジン等の薬物担体を挙げることができる。
本発明に適用し得る「２つの一本鎖核酸重合体」としては、少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体であれば特に制限されないが、例えば、天然の又は人為的に組み換えられた遺伝子（例えば、プラスミド）を構築する２つの一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡ、ポリＩとポリＣ、ポリＡとポリＵ，ポリＩとポリＣ１２Ｕ、一部化学修飾が施されたポリＩ（例、ポリ（７−デアザイノシン酸））とポリＣ、ポリＩと一部化学修飾が施されたポリＣ（例、ポリ（５−ブロモシチジル酸）、ポリ（２−チオシチジル酸））などの２つの一本鎖ＲＮＡを挙げることができる。このように、強力なインターフェロン誘導能等の生理活性を有するポリＩ：Ｃを構成するポリＩとポリＣといった２つの一本鎖ＲＮＡに応用することができる。ここで、「ポリＩ」はポリイノシン酸を、「ポリＣ」はポリシチジル酸を、「ポリＡ」はポリアデニル酸を、「ポリＵ」はポリウリジル酸を、「ポリＣ１２Ｕ」は、ほぼ１２個のシチジル酸に対してウリジル酸１個がシチジル酸と置き換えられたシチジル酸ウリジル酸コポリマーを、それぞれ意味する。
「少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る」とは、生理的条件下で二本鎖を形成し得る程度に相補的な塩基関係にある塩基同士が２つの一本鎖核酸重合体中に存在することをいい、２つの一本鎖核酸重合体の種類や各核酸重合体の長さ等によって異なるが、具体的には、相補的な塩基関係にある塩基数が２０ｂａｓｅ（ｂａｓｅ：塩基の個数）以上であるのが一般的である。
各一本鎖核酸重合体が有する塩基数は、特に制限されないが、１０，０００ｂａｓｅ以下が適当であり、２，０００ｂａｓｅ以下が好ましい。当該塩基数は、それぞれの核酸重合体が有する性質により適宜選択することができる。また、２つの一本鎖核酸重合体は、必ずしも同じ塩基数から構成されている必要はない。なお、各核酸重合体は、通常様々な塩基数からなる一定の分布を持って存在するが、各塩基数は最大分布の塩基数を意味し、ここでは「平均塩基数」という。
なお、例えば、本発明においてポリＩ及びポリＣの平均塩基数は、有効性と安全性とのバランスにおいて決定することができる。具体的には、いずれも３０〜３，０００ｂａｓｅの範囲内が適当であり、６０〜２，０００ｂａｓｅの範囲内が好ましく、１００〜５００ｂａｓｅの範囲内がより好ましい。
上記、化合物Ａ及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体（カチオン性担体）におけるリン脂質としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されない。例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄フォスファチドを挙げることができる。２種以上のリン脂質を用いることもできる。なお、このカチオン性担体においては、ホスファチジルコリン又はレシチンの方が、カチオン性担体において一般的に用いられているホスファチジルエタノールアミンよりも優れている。
化合物Ａ及びリン脂質の構成比率は、リン脂質の種類や適用する２つの一本鎖核酸重合体の種類等によって異なるが、化合物Ａｌ重量部に対して、リン脂質が０．１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．５〜５重量部の範囲内が好ましく、１〜２重量部の範囲内がより好ましい。当該リン脂質が、レシチンの場合も同様である。
本発明においてカチオン性担体と核酸重合体との構成比率は、カチオン性担体の種類や用いる核酸重合体の種類等によって異なるが、カチオン性担体１０重量部に対し、核酸重合体の総量が０．０５〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．１〜４重量部の範囲内が好ましく、０．５〜２重量部の範囲内がより好ましい。２つの一本鎖核酸重合体がポリＩ及びポリＣであり、化合物Ａとリン脂質とを必須構成成分として形成されるカチオン性担体とポリＩ及びポリＣとの複合体の場合も同様に、カチオン性担体１０重量部に対し、ポリＩ及びポリＣの総量が０．０５〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．１〜４重量部の範囲内が好ましく、０．５〜２重量部の範囲内がより好ましい。
本発明に係る核酸含有複合体製剤（以下「本発明製剤」という）は、例えば、市販のカチオン性担体が分散している水溶液中に、若しくはカチオン性担体の原料が分散している水溶液を適当な乳化分散機にかけ、常法により分散処理して製造されたカチオン性担体が分散している水溶液中に、又はカチオン性担体が形成される前の原料が分散している水溶液中に、順次又は同時に２つの一本鎖核酸重合体を添加し、適当な乳化分散機等を用いて常法により分散処理して製造することができる。本発明製剤は、固形のカチオン性担体やその原料に２つの一本鎖核酸重合体を添加し、水を加えて適当な乳化分散機により分散処理しても製造することができる。これらの添加順序や添加量、添加濃度、添加速度、及びカチオン性担体やその原料の溶液中の濃度は、任意に選択され、本発明において特に限定されるものではない。
より具体的には、化合物Ａ及びリン脂質を必須構成成分として形成されるカチオン性担体を用いる場合、当該カチオン性担体が分散している水溶液中に、ポリＩ及びポリＣの水溶液をそれぞれ別々に徐々に滴下しながら乳化分散処理して本発明製剤を製造することができる。また、化合物Ａ、リン脂質、ポリＩ、及びポリＣのそれぞれをビーカーに秤取し、水を加えてホモジナイザーで粗分散した後、高圧乳化分散機で分散処理することによっても本発明製剤を製造することができる。
２つの一本鎖核酸重合体は、二本鎖核酸重合体を、通常行われる操作により解いたものを用いてもよい。具体的には、６０℃以上の加熱等行う非酵素的処理又は酵素的処理を挙げることができる。
上記市販のカチオン性担体は、そのまま又は適当に加工して用いることができる。
上記水溶液としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液などを挙げることができる。
上記乳化分散機としては、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散機、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、ＤｅＢＥＥ２０００（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザー等が挙げられるが、医薬用途で適宜用いられるもので十分である。処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択される。
本発明製剤は、任意の医薬上許容される添加剤、例えば、乳化分散補助剤、安定化剤、等張化剤、凍結乾燥助剤、ｐＨ調節剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化分散補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース等の等張化剤、凍結乾燥助剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調節剤等を挙げることができる。
上記のような医薬上許容される任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
分散処理後、必要に応じ０．２μｍの濾過滅菌膜を通し、アンプルやバイアルに充填することができる。本発明に係る複合体粒子の粒子径は、ほとんど全てが２００ｎｍ以下である。従って、本発明製剤は、０．２μｍの濾過滅菌膜をほぼ１００％通過することができる。
上記のような本発明に係る製造方法により、均一で微細な複合体粒子を含有する核酸含有複合体製剤を得ることができ、しかも核酸重合体を溶液中０．１ｍｇ／ｍＬ以上含有する核酸含有複合体製剤を得ることができる。
従って、上記のような製造方法により得られる核酸含有複合体製剤や上記のような製造方法により得られ、かつ溶液中の核酸重合体の濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、あるいは２〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内である核酸含有複合体製剤も本発明に含めることができる。なお、本発明は、核酸重合体の溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍＬより高いものを除外するものではない。
さらに、上記のように分散処理して製造された本発明製剤を凍結乾燥すれば、本発明に係る凍結乾燥製剤とすることができる。従って、当該凍結乾燥製剤も本発明製剤の一つとして挙げることができる。凍結乾燥は、常法により行うことができる。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、例えば、バイアルに分注後、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の凍結乾燥製剤を得る。凍結乾燥を適応する場合、凍結乾燥ケーキを形成する凍結乾燥助剤を用いることが好ましい。特に糖類が好適であり、とりわけ二糖類、特にマルトースが最も好ましい。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、一般に任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解して使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、ブドウ糖液、生理食塩液等の電解質液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、または５００ｍＬ以下が適当である。
本発明製剤は、注射剤や点滴剤等の液剤の形態で、又は凍結乾燥製剤の形態で提供することができる。
本発明製剤は、ヒトを含む動物に対して、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、吸入投与、点鼻投与、点眼投与、経口投与、直腸投与など種々の投与経路で投与することができる。その投与形態や投与量は所望に応じ適宜選択することができる。また、動植物や真菌、細菌等の微生物などの培養細胞等に対する種々の試薬・薬剤としても用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例、比較例、及び試験例を掲げて、本発明をより詳しく説明する。
実施例１〜５では、平均塩基数が各々ほぼ２００ｂａｓｅのポリＩ及びポリＣの一本鎖ＲＮＡを原料として用いた。また、各実施例で行われた分散処理後の０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過滅菌において、フィルターの目詰まりもなく濾過滅菌を行うことができ、また濾液中の回収率は、各核酸重合体とも９８〜１０２％の範囲内であり、ほぼ１００％の濾過滅菌が可能であった。
実施例１
化合物Ａ２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理してカチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに２５０ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、次いで２５０ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置（ＤＬＳ−７００；大塚電子社製。以下同じ）によって測定したところ、１３８ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．９ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置（ＤＬＳ−７００；大塚電子社製。以下同じ）によって測定したところ、１４０ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例２
化合物Ａ５０ｇと卵黄ホスファチド３０ｇに１０Ｌの注射用水に溶解したスクロース４ｋｇを加えマントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて１０分間分散処理し、注射用水で２５Ｌに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２０Ｌに５０ｇのポリＣを含む６Ｌの水溶液を攪拌しながら添加し、次いで５０ｇのポリＩを含む６Ｌの水溶液を攪拌しながら添加した。この分散液を塩酸を用いてｐＨを５．５に調整し、さらに３０分間マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を測定したところ、１５０ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
その後、この本発明製剤を２０ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に市販の５％ブドウ糖輸液（５００ｍＬ）を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１５１ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例３
化合物Ａ２ｇ、大豆レシチン２ｇ、ポリＩ ２５ｍｇ、及びポリＣ ２５ｍｇをビーカーにとり、これに１００ｍＬの注射用水に溶解したブドウ糖２０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理した。かかる粗分散液を更に実験用小型高圧乳化分散機（８００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて１時間分散処理し、注射用水で４００ｍＬに定容した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１２１ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例４
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、１００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と１００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１２４ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
また、この本発明製剤の粒径分布をレーザー回折散乱方式の粒子径測定装置（ＬＡ−９１０；堀場製作所社製。以下同じ）により測定したところ、図１に示す結果が得られた。この結果によると、粒径分布のピークは１３９ｎｍであり、粗大な粒子は検出されなかった。
実施例５
化合物Ａ４．８ｇと精製卵黄レシチン８．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、４００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と４００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１３８ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例６
市販のＤＮＡプラスミドベクター（ｐＭＣｌｎｅｏ）１００μｇを含む１ｍＬの水溶液を攪拌しながら７０℃の水浴中で３時間加温した。これに同じく７０℃に加温した市販のリポフェクチン（商品名）２ｍｇを含む分散液２ｍＬを攪拌しながら添加し、１０分間プローブ型超音波分散機を用いて７０℃で分散処理し、その後０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４５ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例７
平均塩基数がいずれも約１，５００ｂａｓｅのポリＩ及びポリＣの一本鎖ＲＮＡを原料として用いた。
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、１００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と１００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１３４ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例８
平均塩基数が約３５０ｂａｓｅのポリＩ ２００ｍｇ、平均塩基数が約３５０ｂａｓｅのポリＣ ２００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１３０ｎｍの本発明製剤を得た。
実施例９
平均塩基数が約１，４５０ｂａｓｅのポリＩ ２００ｍｇ、平均塩基数が約１，４５０ｂａｓｅのポリＣ ２００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１５０ｎｍの本発明製剤を得た。
実施例１０
平均塩基数が約８０ｂａｓｅのポリＩ ４００ｍｇ、平均塩基数が約８０ｂａｓｅのポリＣ ４００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１３５ｎｍの本発明製剤を得た。
比較例１（実施例４に対応する従来法による製造）
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、ほぼ２００塩基対数を有する二本鎖ポリＩ：Ｃ ２００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を徐々に滴下し、更に２時間、実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理し、比較用製剤を得た。この比較用製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１８２ｎｍであった。
また、この比較用製剤の粒径分布を実施例４と同様にレーザー回折散乱方式の粒子径測定装置によって測定したところ、図２に示す結果が得られた。この結果によると、粒径分布のピークは２４３ｎｍであったが、８０００ｎｍに分布のピークを有する３〜２０μｍの粗大な粒子がおよそ２０％検出され二峰性の粒子径分布を有した。
更に、この比較用製剤を０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過してみたところ、５０ｍＬ濾過したところでフィルターが目詰まりし、濾過滅菌ができなかった。
比較例２（実施例５に対応する従来法による製造）
化合物Ａ４．８ｇと精製卵黄レシチン８．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、ほぼ２００塩基対数の二本鎖ポリＩ：Ｃ ８００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を徐々に滴下し、更に２時間、実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理し、比較用製剤を回収した。この比較用製剤は白色の沈殿性の懸濁液であり、回収後５分以内に凝集し沈殿した。酒粕の懸濁液に類似したものであった。動的光散乱方式の粒子径測定装置による測定範囲を超え、粒子径は測定できなかった。０．２μｍメンブレンフィルターでの濾過滅菌もできなかった。
試験例１
実施例４で得られた本発明製剤と比較例１で得られた比較用製剤の生物活性を子宮頸部癌細胞（ＨｅｌａＳ３）に対する増殖抑制作用で評価した。
実験は、ＨｅｌａＳ３細胞を、９６ウエルプレートに１０４個／ウエルの密度でまき、５時間以上培養して細胞がウエルに接着したことを確認した後、各製剤を添加して培養を続け、薬剤添加後３日後に生細胞数をＭＴＴ法により測定した。阻害率（％）は次式で求めＩＣ５０値を算出した。その結果を表１に示す。
表１から明らかなように、実施例４に係る本発明製剤と比較例１に係る比較用製剤との間に生物活性値の差はなかった。
発 明 の 効 果
本発明は、例えば以下の効果を有する。
▲１▼粗大複合体粒子がない均一で良質な核酸含有複合体製剤を製造することができる。
▲２▼粗大複合体粒子を実質的に含まない均一で良質な核酸含有複合体製剤を製造することができる。この効果は、核酸重合体の濃度が高くなるほど顕著である。
▲３▼本発明により製造された核酸含有複合体製剤を凍結乾燥したものを再溶解しても凍結乾燥前と同等の核酸含有複合体製剤に再構築することができる。
▲４▼０．２μｍの濾過滅菌膜をほぼ１００％通過することができる核酸含有複合体製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４に係る本発明製剤中の複合体粒子の粒径分布を示す。横軸は粒子径（μｍ）を、左縦軸は頻度（％）を、右縦軸は積算頻度（％）を、それぞれ表す。
図２は、比較例１に係る比較用製剤中の複合体粒子の粒径分布を示す。横軸は粒子径（μｍ）を、左縦軸は頻度（％）を、右縦軸は積算頻度（％）を、それぞれ表す。
本発明は、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤に関するものである。当該複合体は、リポプレックスと呼ばれることもある。
ここで「カチオン性担体」とは、薬物、特にアニオン性の薬物を細胞内へ移入するのに有効な、水中で陽電荷を有する薬物担体をいう。カチオン性担体は、近年、遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡを細胞内へ移入するための薬物担体として盛んに研究されている。
「核酸重合体」とは、天然由来の又は合成若しくは半合成されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及び天然由来の又は合成若しくは半合成されたオリゴヌクレオチドをいう。
背 景 技 術
カチオン性担体とポリアニオン性で二重らせん構造を有する二本鎖核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤は、単にカチオン性担体と二本鎖核酸重合体とを混合するだけで製造することができる。
しかし、この方法で製造された核酸含有複合体製剤は、一般に、複合体の粒子径が数μｍ〜数百μｍと粗大であり、不均一である。このような粗大で不均一な核酸含有複合体製剤は、核酸重合体の細胞内移行や情報発現に関する研究において、均一なデータが十分に得られないという欠点を有する。粒子の粗大性に関する最も重大な問題は、工業スケールで滅菌することが困難であること、ヒトに安全に投与できることを前提とする医薬品製剤において、注射針内をはじめ、静脈内投与においては毛細血管に塞栓等を生ずるおそれがあることである。これらの問題は、上記のような単に混合するだけで当該複合体製剤を製造する方法のみならず、適当な乳化分散機等を用いて分散処理を施すことにより製造する方法においても解決することが困難な問題である。
粒子の粗大凝集化は、当該複合体製剤の安定化のために試みられる凍結乾燥化においても発生する問題である。
当該複合体製剤中の核酸重合体は、投与量を少なくし、投与時における患者や医療従事者の負担を軽減するため、又は当該複合体製剤の製造効率を図るために高濃度であることが望ましい。しかし、従来の製造方法では、核酸重合体の総量が０．１ｍｇ／ｍＬ以上、特に０．５ｍｇ／ｍＬ以上になると、製造過程において著しい凝集が起こり、肉眼的に容易に確認できるほどの巨大な沈殿物あるいは浮遊物が生じ、このようなものは、あらゆる分散処理によっても十分には分散させることができない。
ところで、従来、遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡにおいては、二重らせん構造を有する二本鎖のものが、生理的な側面及び種々のヌクレアーゼに対する安定性の観点から、いわば常識的に採用されてきた。例えば、強力なインターフェロン誘導能や免疫賦活作用等の生理活性を有するポリＩ：Ｃについては、ポリＩとポリＣとを別々に投与しても十分な薬理効果が得られないことが知られている（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５１，１９９−２１５（１９７６））。このように遺伝子やポリＩ：Ｃ等のＲＮＡは、二重らせん構造を有する二本鎖であることが必須と考えられてきた。
カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤については、上記のような核酸重合体の二重らせん構造の必要性に関して全く論じられておらず、当該複合体製剤の製造においても、いわば常識的に二重らせん構造を有する二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡが採用されてきた。
本出願人は、カチオン性担体とポリＩ：Ｃ等の二本鎖ＲＮＡとの核酸含有複合体製剤が、癌治療等に有効な癌細胞内のヌクレアーゼを活性化することから、当該核酸含有複合体製剤を癌細胞内ヌクレアーゼ活性化剤として特許出願し、また肝臓や脾臓に特異的に有効量のインターフェロンを長時間誘導することから、当該核酸含有複合体製剤を肝炎治療剤として既に特許出願している（ＰＣＴ／ＪＰ９８／０４６９５号、ＰＣＴ／ＪＰ９９／０１４３８号）。
発 明 の 開 示
本発明の目的は、特に、いわゆる濾過滅菌が可能で、人体に対する安全性に問題があるとされる７μｍ以上の粗大な粒子を含まないことを特徴とする、均一で良質な核酸含有複合体製剤の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤の製造過程において、通常二重らせん構造を有する二本鎖ＤＮＡや二本鎖ＲＮＡを用いることなく、二重らせん構造をほどいた、又は二重らせん構造をあらかじめ形成させることなく一本鎖の状態の核酸重合体を用いて製造することにより、薬理活性等に影響を与えることなく上記課題を一挙に解決できることを初めて見出し、本発明を完成した。
従って、本発明として、カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤（以下、「核酸含有複合体製剤」という）の製造過程において、少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体を、それぞれ別々に一本鎖の状態でカチオン性担体に、又はカチオン性担体が形成される前の原料に添加し分散処理することを特徴とする前記核酸含有複合体製剤の製造方法を挙げることができる。
以下、本発明を詳述する。
本発明に適用し得る「カチオン性担体」としては、例えば、市販のリポフェクチン（商品名）やリポフェクトアミン（商品名）、リポフェクトエース（商品名）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商品名）の他、ＰＣＴ ＷＯ９４／１９３１４号公報に開示されている薬物担体、例えば、次の構造式〔Ｉ〕で表される２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下「化合物Ａ」という）及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体やポリリジン等の薬物担体を挙げることができる。
「少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る」とは、生理的条件下で二本鎖を形成し得る程度に相補的な塩基関係にある塩基同士が２つの一本鎖核酸重合体中に存在することをいい、２つの一本鎖核酸重合体の種類や各核酸重合体の長さ等によって異なるが、具体的には、相補的な塩基関係にある塩基数が２０ｂａｓｅ（ｂａｓｅ：塩基の個数）以上であるのが一般的である。
各一本鎖核酸重合体が有する塩基数は、特に制限されないが、１０，０００ｂａｓｅ以下が適当であり、２，０００ｂａｓｅ以下が好ましい。当該塩基数は、それぞれの核酸重合体が有する性質により適宜選択することができる。また、２つの一本鎖核酸重合体は、必ずしも同じ塩基数から構成されている必要はない。なお、各核酸重合体は、通常様々な塩基数からなる一定の分布を持って存在するが、各塩基数は最大分布の塩基数を意味し、ここでは「平均塩基数」という。
なお、例えば、本発明においてポリＩ及びポリＣの平均塩基数は、有効性と安全性とのバランスにおいて決定することができる。具体的には、いずれも３０〜３，０００ｂａｓｅの範囲内が適当であり、６０〜２，０００ｂａｓｅの範囲内が好ましく、１００〜５００ｂａｓｅの範囲内がより好ましい。
上記、化合物Ａ及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体（カチオン性担体）におけるリン脂質としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されない。例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄フォスファチドを挙げることができる。２種以上のリン脂質を用いることもできる。なお、このカチオン性担体においては、ホスファチジルコリン又はレシチンの方が、カチオン性担体において一般的に用いられているホスファチジルエタノールアミンよりも優れている。
化合物Ａ及びリン脂質の構成比率は、リン脂質の種類や適用する２つの一本鎖核酸重合体の種類等によって異なるが、化合物Ａｌ重量部に対して、リン脂質が０．１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．５〜５重量部の範囲内が好ましく、１〜２重量部の範囲内がより好ましい。当該リン脂質が、レシチンの場合も同様である。
本発明においてカチオン性担体と核酸重合体との構成比率は、カチオン性担体の種類や用いる核酸重合体の種類等によって異なるが、カチオン性担体１０重量部に対し、核酸重合体の総量が０．０５〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．１〜４重量部の範囲内が好ましく、０．５〜２重量部の範囲内がより好ましい。２つの一本鎖核酸重合体がポリＩ及びポリＣであり、化合物Ａとリン脂質とを必須構成成分として形成されるカチオン性担体とポリＩ及びポリＣとの複合体の場合も同様に、カチオン性担体１０重量部に対し、ポリＩ及びポリＣの総量が０．０５〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．１〜４重量部の範囲内が好ましく、０．５〜２重量部の範囲内がより好ましい。
本発明に係る核酸含有複合体製剤（以下「本発明製剤」という）は、例えば、市販のカチオン性担体が分散している水溶液中に、若しくはカチオン性担体の原料が分散している水溶液を適当な乳化分散機にかけ、常法により分散処理して製造されたカチオン性担体が分散している水溶液中に、又はカチオン性担体が形成される前の原料が分散している水溶液中に、順次又は同時に２つの一本鎖核酸重合体を添加し、適当な乳化分散機等を用いて常法により分散処理して製造することができる。本発明製剤は、固形のカチオン性担体やその原料に２つの一本鎖核酸重合体を添加し、水を加えて適当な乳化分散機により分散処理しても製造することができる。これらの添加順序や添加量、添加濃度、添加速度、及びカチオン性担体やその原料の溶液中の濃度は、任意に選択され、本発明において特に限定されるものではない。
より具体的には、化合物Ａ及びリン脂質を必須構成成分として形成されるカチオン性担体を用いる場合、当該カチオン性担体が分散している水溶液中に、ポリＩ及びポリＣの水溶液をそれぞれ別々に徐々に滴下しながら乳化分散処理して本発明製剤を製造することができる。また、化合物Ａ、リン脂質、ポリＩ、及びポリＣのそれぞれをビーカーに秤取し、水を加えてホモジナイザーで粗分散した後、高圧乳化分散機で分散処理することによっても本発明製剤を製造することができる。
２つの一本鎖核酸重合体は、二本鎖核酸重合体を、通常行われる操作により解いたものを用いてもよい。具体的には、６０℃以上の加熱等行う非酵素的処理又は酵素的処理を挙げることができる。
上記市販のカチオン性担体は、そのまま又は適当に加工して用いることができる。
上記水溶液としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液などを挙げることができる。
上記乳化分散機としては、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散機、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、ＤｅＢＥＥ２０００（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザー等が挙げられるが、医薬用途で適宜用いられるもので十分である。処理条件や処理時間、処理温度等は適宜選択される。
本発明製剤は、任意の医薬上許容される添加剤、例えば、乳化分散補助剤、安定化剤、等張化剤、凍結乾燥助剤、ｐＨ調節剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化分散補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース等の等張化剤、凍結乾燥助剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調節剤等を挙げることができる。
上記のような医薬上許容される任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
分散処理後、必要に応じ０．２μｍの濾過滅菌膜を通し、アンプルやバイアルに充填することができる。本発明に係る複合体粒子の粒子径は、ほとんど全てが２００ｎｍ以下である。従って、本発明製剤は、０．２μｍの濾過滅菌膜をほぼ１００％通過することができる。
上記のような本発明に係る製造方法により、均一で微細な複合体粒子を含有する核酸含有複合体製剤を得ることができ、しかも核酸重合体を溶液中０．１ｍｇ／ｍＬ以上含有する核酸含有複合体製剤を得ることができる。
従って、上記のような製造方法により得られる核酸含有複合体製剤や上記のような製造方法により得られ、かつ溶液中の核酸重合体の濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、あるいは２〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内である核酸含有複合体製剤も本発明に含めることができる。なお、本発明は、核酸重合体の溶液中の濃度が１０ｍｇ／ｍＬより高いものを除外するものではない。
さらに、上記のように分散処理して製造された本発明製剤を凍結乾燥すれば、本発明に係る凍結乾燥製剤とすることができる。従って、当該凍結乾燥製剤も本発明製剤の一つとして挙げることができる。凍結乾燥は、常法により行うことができる。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、例えば、バイアルに分注後、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の凍結乾燥製剤を得る。凍結乾燥を適応する場合、凍結乾燥ケーキを形成する凍結乾燥助剤を用いることが好ましい。特に糖類が好適であり、とりわけ二糖類、特にマルトースが最も好ましい。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、一般に任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解して使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、ブドウ糖液、生理食塩液等の電解質液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、または５００ｍＬ以下が適当である。
本発明製剤は、注射剤や点滴剤等の液剤の形態で、又は凍結乾燥製剤の形態で提供することができる。
本発明製剤は、ヒトを含む動物に対して、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、吸入投与、点鼻投与、点眼投与、経口投与、直腸投与など種々の投与経路で投与することができる。その投与形態や投与量は所望に応じ適宜選択することができる。また、動植物や真菌、細菌等の微生物などの培養細胞等に対する種々の試薬・薬剤としても用いることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例、比較例、及び試験例を掲げて、本発明をより詳しく説明する。
実施例１〜５では、平均塩基数が各々ほぼ２００ｂａｓｅのポリＩ及びポリＣの一本鎖ＲＮＡを原料として用いた。また、各実施例で行われた分散処理後の０．２μｍメンブレンフィルターによる濾過滅菌において、フィルターの目詰まりもなく濾過滅菌を行うことができ、また濾液中の回収率は、各核酸重合体とも９８〜１０２％の範囲内であり、ほぼ１００％の濾過滅菌が可能であった。
実施例１
化合物Ａ２ｇと精製卵黄レシチン２ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理してカチオン性担体の粗分散液を得た。かかる粗分散液を更に実験用小型乳化分散機を用いて１時間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに２５０ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、次いで２５０ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液を攪拌しながら添加し、更に１時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置（ＤＬＳ−７００；大塚電子社製。以下同じ）によって測定したところ、１３８ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
その後、この本発明製剤を１ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に０．９ｍＬの注射用水を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置（ＤＬＳ−７００；大塚電子社製。以下同じ）によって測定したところ、１４０ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例２
化合物Ａ５０ｇと卵黄ホスファチド３０ｇに１０Ｌの注射用水に溶解したスクロース４ｋｇを加えマントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて１０分間分散処理し、注射用水で２５Ｌに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２０Ｌに５０ｇのポリＣを含む６Ｌの水溶液を攪拌しながら添加し、次いで５０ｇのポリＩを含む６Ｌの水溶液を攪拌しながら添加した。この分散液を塩酸を用いてｐＨを５．５に調整し、さらに３０分間マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を測定したところ、１５０ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
その後、この本発明製剤を２０ｍＬづつバイアルに分注し常法に従って凍結乾燥製剤とした。得られた凍結乾燥製剤に市販の５％ブドウ糖輸液（５００ｍＬ）を加えて再溶解した。再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１５１ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例３
化合物Ａ２ｇ、大豆レシチン２ｇ、ポリＩ ２５ｍｇ、及びポリＣ ２５ｍｇをビーカーにとり、これに１００ｍＬの注射用水に溶解したブドウ糖２０ｇを加え攪拌混合し、ホモジナイザーを用いて５分間分散処理した。かかる粗分散液を更に実験用小型高圧乳化分散機（８００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて１時間分散処理し、注射用水で４００ｍＬに定容した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１２１ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例４
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、１００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と１００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１２４ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
また、この本発明製剤の粒径分布をレーザー回折散乱方式の粒子径測定装置（ＬＡ−９１０；堀場製作所社製。以下同じ）により測定したところ、図１に示す結果が得られた。この結果によると、粒径分布のピークは１３９ｎｍであり、粗大な粒子は検出されなかった。
実施例５
化合物Ａ４．８ｇと精製卵黄レシチン８．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、４００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と４００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１３８ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例６
市販のＤＮＡプラスミドベクター（ｐＭＣｌｎｅｏ）１００μｇを含む１ｍＬの水溶液を攪拌しながら７０℃の水浴中で３時間加温した。これに同じく７０℃に加温した市販のリポフェクチン（商品名）２ｍｇを含む分散液２ｍＬを攪拌しながら添加し、１０分間プローブ型超音波分散機を用いて７０℃で分散処理し、その後０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１４５ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例７
平均塩基数がいずれも約１，５００ｂａｓｅのポリＩ及びポリＣの一本鎖ＲＮＡを原料として用いた。
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、１００ｍｇのポリＩを含む７５ｍＬの水溶液と１００ｍｇのポリＣを含む７５ｍＬの水溶液をそれぞれ同時に徐々に滴下し、更に２時間実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理した後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌し本発明製剤を得た。この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１３４ｎｍであった。また、１μｍ以上の粒子は含まれなかった。
実施例８
平均塩基数が約３５０ｂａｓｅのポリＩ ２００ｍｇ、平均塩基数が約３５０ｂａｓｅのポリＣ ２００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１３０ｎｍの本発明製剤を得た。
実施例９
平均塩基数が約１，４５０ｂａｓｅのポリＩ ２００ｍｇ、平均塩基数が約１，４５０ｂａｓｅのポリＣ ２００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１５０ｎｍの本発明製剤を得た。
実施例１０
平均塩基数が約８０ｂａｓｅのポリＩ ４００ｍｇ、平均塩基数が約８０ｂａｓｅのポリＣ ４００ｍｇを用い、８００ｋｇ／ｃｍ２の分散処理圧で実施例７と同様にして、平均粒子径が１３５ｎｍの本発明製剤を得た。
比較例１（実施例４に対応する従来法による製造）
化合物Ａ１．２ｇと精製卵黄レシチン２．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、ほぼ２００塩基対数を有する二本鎖ポリＩ：Ｃ ２００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を徐々に滴下し、更に２時間、実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理し、比較用製剤を得た。この比較用製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定したところ、１８２ｎｍであった。
また、この比較用製剤の粒径分布を実施例４と同様にレーザー回折散乱方式の粒子径測定装置によって測定したところ、図２に示す結果が得られた。この結果によると、粒径分布のピークは２４３ｎｍであったが、８０００ｎｍに分布のピークを有する３〜２０μｍの粗大な粒子がおよそ２０％検出され二峰性の粒子径分布を有した。
更に、この比較用製剤を０．２μｍメンブレンフィルターで滅菌濾過してみたところ、５０ｍＬ濾過したところでフィルターが目詰まりし、濾過滅菌ができなかった。
比較例２（実施例５に対応する従来法による製造）
化合物Ａ４．８ｇと精製卵黄レシチン８．０ｇに１００ｍＬの注射用水に溶解したマルトース４０ｇを加え攪拌混合し、実験用小型高圧乳化分散機を用いて３０分間分散処理し、注射用水で２５０ｍＬに定容してカチオン性担体の分散液を得た。この分散液２５０ｍＬに対し攪拌しながら、ほぼ２００塩基対数の二本鎖ポリＩ：Ｃ ８００ｍｇを含む１５０ｍＬの水溶液を徐々に滴下し、更に２時間、実験用小型高圧乳化分散機（１，１００ｋｇ／ｃｍ２）を用いて分散処理し、比較用製剤を回収した。この比較用製剤は白色の沈殿性の懸濁液であり、回収後５分以内に凝集し沈殿した。酒粕の懸濁液に類似したものであった。動的光散乱方式の粒子径測定装置による測定範囲を超え、粒子径は測定できなかった。０．２μｍメンブレンフィルターでの濾過滅菌もできなかった。
試験例１
実施例４で得られた本発明製剤と比較例１で得られた比較用製剤の生物活性を子宮頸部癌細胞（ＨｅｌａＳ３）に対する増殖抑制作用で評価した。
実験は、ＨｅｌａＳ３細胞を、９６ウエルプレートに１０４個／ウエルの密度でまき、５時間以上培養して細胞がウエルに接着したことを確認した後、各製剤を添加して培養を続け、薬剤添加後３日後に生細胞数をＭＴＴ法により測定した。阻害率（％）は次式で求めＩＣ５０値を算出した。その結果を表１に示す。
発 明 の 効 果
本発明は、例えば以下の効果を有する。
▲１▼粗大複合体粒子がない均一で良質な核酸含有複合体製剤を製造することができる。
▲２▼粗大複合体粒子を実質的に含まない均一で良質な核酸含有複合体製剤を製造することができる。この効果は、核酸重合体の濃度が高くなるほど顕著である。
▲３▼本発明により製造された核酸含有複合体製剤を凍結乾燥したものを再溶解しても凍結乾燥前と同等の核酸含有複合体製剤に再構築することができる。
▲４▼０．２μｍの濾過滅菌膜をほぼ１００％通過することができる核酸含有複合体製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４に係る本発明製剤中の複合体粒子の粒径分布を示す。横軸は粒子径（μｍ）を、左縦軸は頻度（％）を、右縦軸は積算頻度（％）を、それぞれ表す。
図２は、比較例１に係る比較用製剤中の複合体粒子の粒径分布を示す。横軸は粒子径（μｍ）を、左縦軸は頻度（％）を、右縦軸は積算頻度（％）を、それぞれ表す。
Claims (7)
- カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤の製造過程において、少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体を、それぞれ別々に一本鎖の状態でカチオン性担体に又はカチオン性担体が形成される前の原料に添加し分散処理することを特徴とする前記核酸含有複合体製剤の製造方法。
- 少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体の平均塩基数が、いずれも１００〜２，０００ｂａｓｅの範囲内である一本鎖核酸重合体である請求項１記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- 少なくとも部分的に二本鎖を形成し得る２つの一本鎖核酸重合体が、ポリＩとポリＣである請求項１又は２記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- カチオン性担体が、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- リン脂質がレシチンである請求項４記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
- カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤において、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法により得られる核酸含有複合体製剤。
- 核酸重合体の濃度が０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内である請求項６記載の核酸含有複合体製剤。
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