WO1999061032A1 - Procede de production d'une preparation composite contenant de l'acide nucleique - Google Patents

Procede de production d'une preparation composite contenant de l'acide nucleique Download PDF

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WO1999061032A1
WO1999061032A1 PCT/JP1999/002713 JP9902713W WO9961032A1 WO 1999061032 A1 WO1999061032 A1 WO 1999061032A1 JP 9902713 W JP9902713 W JP 9902713W WO 9961032 A1 WO9961032 A1 WO 9961032A1
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WO
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nucleic acid
poly
preparation
stranded
cationic carrier
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PCT/JP1999/002713
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Inventor
Katsuhiro Sugihara
Junzo Seki
Kazuko Hirabayashi
Original Assignee
Nippon Shinyaku Co., Ltd.
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid-containing complex preparation containing a complex of a cationic carrier and a nucleic acid polymer.
  • the complex is sometimes called lipoplettus.
  • the “r cationic carrier” refers to a drug carrier having a positive charge in water, which is effective for transferring a drug, particularly an anionic drug, into cells.
  • cationic carriers have been actively studied as drug carriers for transferring genes and RNAs such as poly I: C into cells.
  • Nucleic acid polymer refers to naturally-occurring or synthetic or semi-synthetic polynucleotides (DNA, RNA) and naturally-occurring or synthetic or semi-synthetic oligonucleotides.
  • a nucleic acid-containing complex formulation containing a complex of a cationic carrier and a double-stranded nucleic acid polymer having a polyanionic double helical structure can be obtained by simply mixing a cationic carrier with a double-stranded nucleic acid polymer. It can be manufactured by
  • the nucleic acid-containing complex preparation produced by this method is generally coarse, with the particle size of the complex ranging from several meters to several hundreds, and is non-uniform.
  • Such a coarse and heterogeneous nucleic acid-containing complex preparation has a drawback that uniform data cannot be sufficiently obtained in studies on the transfer of a nucleic acid polymer into cells and information expression.
  • the most important for coarseness of particles The problem is that in pharmaceutical preparations that are difficult to sterilize on an industrial scale and that they can be safely administered to humans, emboli etc. in capillaries in intravenous administration, including injection needles, etc. This may cause a problem.
  • These problems can be solved not only by the method of producing the complex preparation by simply mixing as described above, but also by the method of producing the composite preparation by performing dispersion treatment using an appropriate emulsifying disperser or the like. This is a difficult problem.
  • Coarse agglomeration of particles is a problem that also occurs in lyophilization that is attempted to stabilize the complex preparation.
  • the nucleic acid polymer in the complex preparation should be at a high concentration in order to reduce the dosage and reduce the burden on patients and medical staff during administration, or to increase the production efficiency of the complex preparation. Is desirable.
  • the total amount of the nucleic acid polymer is 0.1 mg / mL or more, especially 0.5 mg / mL or more, remarkable aggregation occurs in the production process, and it is so large that it can be easily confirmed with the naked eye. Giant sediments or suspended solids are formed, which cannot be sufficiently dispersed by any dispersion treatment.
  • RNAs such as poly I: C double-stranded ones having a double helix structure have been considered common sense from the viewpoints of physiological aspects and stability against various nucleases. It has been adopted.
  • poly I: C which has a strong interferon-inducing ability and a physiological activity such as an immunostimulatory effect, sufficient pharmacological effects cannot be obtained even if Boli I and poly C are separately administered. This is known (Archives of Virology, 51, 199-215 (1976)).
  • RNAs such as nucleic acids and poly I: C are double-stranded having a double helix structure.
  • nucleic acid-containing complex containing a complex of a cationic carrier and a nucleic acid polymer
  • a nucleic acid polymer as described above.
  • complex preparations double-stranded DNA and double-stranded RNA having a double helix structure have been commonly used.
  • a nucleic acid-containing complex preparation of a cationic carrier and a double-stranded RNA such as poly I: C activates a nuclease in cancer cells that is effective for cancer treatment and the like.
  • Patent application for a nucleic acid-containing complex preparation as a nuclease activator in pain cells, and since it induces an effective amount of interfacial protein in the liver and spleen specifically for a long period of time A patent application has already been filed for a complex preparation as a therapeutic agent for hepatitis (PCT / JP98 / 04695, PCT / JP99 / 01438).
  • An object of the present invention is to provide a uniform and high-quality nucleic acid, which is characterized in that it is capable of so-called sterilization and does not contain coarse particles of 7 m or more, which are considered to be problematic for human health.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a complex preparation containing the same.
  • the present inventors In the process of producing a nucleic acid-containing complex preparation containing a complex of a cationic carrier and a nucleic acid polymer, the present inventors usually use double-stranded DNA or double-stranded RNA having a double helix structure. In particular, pharmacology is achieved by using a single-stranded nucleic acid polymer without unwinding the double helix structure or forming the double helix structure in advance. The inventors have found for the first time that the above problems can be solved at once without affecting the activity and the like, and have completed the present invention.
  • nucleic acid-containing complex preparation containing a complex of a cationic carrier and a nucleic acid polymer
  • nucleic acid-containing complex preparation Two single-stranded nucleic acid polymers capable of forming chains are separately added to the cationic carrier in a single-stranded state, or added to the raw material before the cationic carrier is formed and subjected to dispersion treatment.
  • a method for producing the above-mentioned nucleic acid-containing complex preparation which is characterized by this, may be mentioned.
  • cationic carrier examples include commercially available Libofectin (trade name), Libofectamine (trade name), Libofectect Ace (trade name), and DMR iB- C (trade name) and drug carriers disclosed in PCT W094 / 19314, such as the following structural formula
  • compound A 2-Gethylaminoethyl potassium-rubamoyl-1.3-0-dioleoylglycerol
  • carrier examples include drug carriers such as a carrier and a polylysine.
  • two single-stranded nucleic acid polymers applicable to the present invention, It is not particularly limited as long as it is at least two single-stranded nucleic acid polymers capable of partially forming a double strand.
  • a natural or artificially recombined gene for example, a plasmid is constructed.
  • poly I and poly C Two single-stranded DNAs or single-stranded RNAs, poly I and poly C, poly A and poly U, poly I and poly C 12 U, partially modified poly I (eg, poly (7- Two single strands such as dezainosinic acid)) and poly (:, poly I and partially modified poly C (eg, poly (5-bromocytidylic acid), poly (2-thiocytidylic acid))
  • poly I and partially modified poly C eg, poly (5-bromocytidylic acid), poly (2-thiocytidylic acid)
  • poly I and partially modified poly C eg, poly (5-bromocytidylic acid), poly (2-thiocytidylic acid)
  • poly I and poly C which constitute poly I: C, which has strong interferon-inducing ability and other physiological activities.
  • Poly I refers to polyinosinic acid
  • Poly (:) refers to poly.
  • Chijiru acid a "poly A” poly adenylate, a “poly U” poly U lysyl acid, "Helsingborg C] 2 U"
  • one ⁇ lysyl acid against almost 12 cytidylate Is a cytidylic acid-co-polysilicic acid copolymer in which is replaced with cytidylic acid, respectively.
  • Able to form at least partially a double strand means that a single-stranded nucleic acid polymer comprising two bases having base relations complementary to each other to such an extent that a double strand can be formed under physiological conditions. It depends on the type of two single-stranded nucleic acid polymers, the length of each nucleic acid polymer, etc.Specifically, the number of bases that have a complementary base relationship is 20 base ( base: the number of bases).
  • each single-stranded nucleic acid polymer is not particularly limited, but is suitably 10, OOObase or less, and preferably 2, OOObase or less.
  • the number of bases may be appropriately selected depending on the properties of each nucleic acid polymer. Can be.
  • the two single-stranded nucleic acid polymers need not necessarily be composed of the same number of bases.
  • Each nucleic acid polymer usually exists with a certain distribution consisting of various numbers of bases, but each number of bases means the maximum number of bases, which is referred to herein as "average number of bases".
  • the average number of bases of Bol I and poly C can be determined in balance between efficacy and safety. More specifically, it is appropriate to set the range between 30 and 3 and OOObase,
  • O O O base is preferable, and the range of 100 to 500 base is more preferable.
  • the phospholipid in the drug carrier (cationic carrier) formed using the compound A and the phospholipid as essential components is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, sphingomyelin, lecithin and the like can be mentioned.
  • hydrogenated phospholipids can be mentioned.
  • Preferred phospholipids include egg yolk phosphatidylcholine, egg yolk lecithin, soybean lecithin, and egg yolk phosphatide. Two or more phospholipids can be used.
  • phosphatidylcholine or lecithin is superior to phosphatidyl ethanolamine, which is generally used in cation carriers.
  • composition ratio of Compound A and phospholipid varies depending on the type of phospholipid and the type of two single-stranded nucleic acid polymers to be applied, etc.
  • a range of 1 to 10 parts by weight is appropriate, It is preferably in the range of 0.5 to 5 parts by weight, and more preferably in the range of 1 to 2 parts by weight. The same applies when the phospholipid is lecithin.
  • the composition ratio between the cationic carrier and the nucleic acid polymer varies depending on the type of the cationic carrier, the type of the nucleic acid polymer used, and the like.
  • the total amount of the nucleic acid polymer is 0 with respect to 10 parts by weight of the cationic carrier.
  • the range of from 0.05 to 10 parts by weight is suitable, the range of from 0.1 to 4 parts by weight is preferred, and the range of from 0.5 to 2 parts by weight is more preferred.
  • the two single-stranded nucleic acid polymers are poly I and poly C, and a complex of polycation I and poly C with a cationic carrier formed by using compound A and phospholipid as essential components.
  • the total amount of poly I and poly C is in the range of 0.05 to 10 parts by weight, preferably in the range of 0.1 to 4 parts by weight, and more preferably 0.5 to 10 parts by weight with respect to 10 parts by weight of the cationic carrier. -A range of 2 parts by weight is more preferred.
  • the nucleic acid-containing complex preparation of the present invention (hereinafter referred to as “the preparation of the present invention”) comprises, for example, a commercially available aqueous solution in which a cationic carrier is dispersed or a raw material of a cationic carrier dispersed therein.
  • aqueous solution in which a cationic carrier produced by subjecting the aqueous solution to an appropriate emulsifying disperser and dispersed by a conventional method is dispersed, or an aqueous solution in which a raw material before the cationic carrier is formed is dispersed.
  • the preparation of the present invention can also be produced by adding two single-stranded nucleic acid polymers to a solid cationic carrier or its raw material, adding water, and subjecting the dispersion to a suitable emulsifying dispersing machine.
  • the order of addition, the amount of addition, the concentration, the rate of addition, and the concentration of the cationic carrier and its raw material in the solution are arbitrarily selected and are particularly limited in the present invention. It is not something to be done.
  • an aqueous solution in which the cationic carrier is dispersed contains an aqueous solution of poly I and poly C, respectively.
  • the preparation of the present invention can be produced by emulsifying and dispersing while separately and gradually dropping it.
  • compound A, phospholipid, poly I, and poly C are each taken in a beaker, and water is added thereto, and then coarsely dispersed with a homogenizer. Dispersion treatment using a high-pressure emulsifying and dispersing machine is also possible.
  • the preparation of the present invention can be produced.
  • a double-stranded nucleic acid polymer obtained by unraveling by a commonly used operation may be used.
  • Specific examples include non-enzymatic treatment or enzymatic treatment in which heating is performed at 60 ° C. or more.
  • the above-mentioned commercially available cationic carrier can be used as it is or after being appropriately processed.
  • aqueous solution examples include water for injection, distilled water for injection, an electrolyte solution such as physiological saline, and a glucose solution.
  • Examples of the emulsifying and dispersing machine include a homomixer, a homogenizer 1, an ultrasonic dispersing machine, an ultrasonic homogenizer, a high-pressure emulsifying and dispersing machine, a microfluidizer 1 (trade name), a nanomizer 1 (trade name), and an artimizer 1 (Trade name), De BEE 2000 (trade name), and Manton-Gaulin type high-pressure homogenizer, etc., but those appropriately used in pharmaceutical applications are sufficient. Processing conditions, processing time, processing temperature, and the like are appropriately selected.
  • the preparation of the present invention may contain any pharmaceutically acceptable excipient, for example, Appropriate amounts of powder adjuvants, stabilizers, isotonic agents, freeze-drying aids, and pH regulators may be contained.
  • fatty acids having 6 to 22 carbon atoms e.g., caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, amino acid, lumitic acid, stearic acid, oleic acid
  • Linoleic acid, arachidonic acid, docosahexanoic acid and pharmaceutically acceptable salts thereof (eg, sodium salt, calcium salt, calcium salt), albumin, dextra Emulsifying and dispersing aids such as cholesterol, phosphatidic acid, etc.
  • isotonizing agents such as sodium chloride, glucose, maltose, lactose and sucrose, and freeze-drying aids.
  • pH regulators such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium
  • any of the above-mentioned pharmaceutically acceptable additives can be added in an appropriate step before or after dispersion.
  • the dispersion treatment After the dispersion treatment, it can be filled into ampoules and vials through a 0.2 / zm filter sterilization membrane as needed. Almost all of the composite particles according to the present invention have a particle diameter of 200 nm or less. Therefore, the preparation of the present invention can pass almost 100% through a 0.2 m filtration membrane.
  • nucleic acid-containing complex preparation containing uniform and fine complex particles
  • a nucleic acid polymer containing at least 0.1 lnig / mL in a solution can be obtained.
  • the present invention does not exclude a nucleic acid polymer having a concentration in a solution of more than 10 mg / mL.
  • freeze-dried preparation of the present invention can be obtained by freeze-drying the preparation of the present invention produced by the dispersion treatment as described above. Therefore, the freeze-dried preparation can also be mentioned as one of the preparations of the present invention. Freeze-drying can be performed by a conventional method.
  • the lyophilized preparation according to the present invention is, for example, after dispensing into vials, preliminarily freezing at about -40 to -20 ° C for about 2 hours, and primary drying under reduced pressure at about 0 to 10 ° C. Then, secondary drying is performed under reduced pressure at about 15 to 25 ° C, and freeze-drying is performed. Then, generally, the inside of the vial is replaced with nitrogen gas and stoppered to obtain the freeze-dried preparation of the present invention. When freeze-drying is indicated, it is preferable to use a freeze-drying aid that forms a freeze-dried cake. Saccharides are particularly preferred, and disaccharides, especially maltose, are most preferred.
  • the freeze-dried preparation according to the present invention can be used after being generally re-dissolved by adding any appropriate solution (re-dissolution liquid).
  • a re-dissolved solution include water for injection, a glucose solution, an electrolyte solution such as a physiological saline solution, and other general infusions.
  • the volume of the re-dissolved solution varies depending on the application and is not particularly limited, but is suitably 0.5 to 2 times the volume of the solution before freeze-drying, or 500 mL or less.
  • the preparation of the present invention can be provided in the form of a liquid preparation such as an injection or a drip, or in the form of a lyophilized preparation.
  • the preparation of the present invention can be administered to animals including humans by various routes such as intravenous administration, intraarterial administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, inhalation administration, nasal administration, ophthalmic administration, oral administration, and rectal administration. Can be administered.
  • the dosage form and dosage can be appropriately selected as desired.
  • it can be used as various reagents for cultured cells of microorganisms such as animals and plants, fungi and bacteria.
  • RNAs of poly I and poly C each having an average base number of about 200 bases were used as raw materials.
  • the filtration sterilization can be performed without clogging of the filter, and the recovery rate in the filtrate can be improved.
  • the formulation of the present invention was sterile filtered through a 0.2 / zm membrane filter.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention was measured by a dynamic light scattering type particle size analyzer (DLS-700; manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd .; the same applies hereinafter). No particles larger than 1 m were included.
  • the preparation of the present invention was dispensed into vials 1 m at a time, and a lyophilized preparation was prepared according to a conventional method.
  • the obtained lyophilized preparation was redissolved by adding 0.9 m of water for injection.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a dynamic light scattering particle size analyzer (DLS-700; manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd .; the same applies hereinafter). Atsuta. Also, particles of 1 ⁇ m or more were not included.
  • the pH of this dispersion is adjusted to 5.5 using hydrochloric acid, and the dispersion is further dispersed using a Manton-Gaulin high-pressure homogenizer for 30 minutes, and then sterilized with a 0.2 zm membrane filter. After filtration, the preparation of the present invention was obtained.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention was 150 nm. Also, particles larger than 1 m were not included.
  • the preparation of the present invention is dispensed into vials 20 m at a time according to a standard method.
  • a commercially available 5% glucose infusion solution 500 mL was added to the obtained lyophilized product to redissolve it.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention after re-dissolution was measured by a dynamic light scattering type particle size measuring apparatus, and was found to be 151 nm. Also, particles larger than 1 m were not included.
  • the particle size distribution of the preparation of the present invention was measured using a laser diffraction scattering type particle size measuring device (LA-910; manufactured by HORIBA, Ltd .; the same applies hereinafter), and the results shown in FIG. 1 were obtained. According to this result, the peak of the particle size distribution was 139 nm, and no coarse particles were detected.
  • LA-910 laser diffraction scattering type particle size measuring device
  • the mixture was sterilized by filtration with a 0.2 zm membrane filter to obtain the preparation of the present invention.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention was 138 nm as measured by a particle size measuring device using a dynamic light scattering method. Also, particles larger than 1 m were not included.
  • Single-stranded RNAs of poly I and poly C each having an average number of bases of about l, 500 bases were used as raw materials.
  • the mixture was sterilized by filtration through a 0.2 m membrane filter to obtain the preparation of the present invention.
  • the average particle size of the composite particles in the preparation of the present invention was 134 nm when measured by a particle size measuring device by a dynamic light scattering method. Also, particles of 1 in or more were not included.
  • Example 9 Using 200 mg of poly I having an average base number of about 1,450 base and 200 mg of poly C having an average base number of about 1,450 base and a dispersion treatment pressure of 800 kg / cm 2 , the average particle diameter was 150 nm as in Example 7. Of the present invention was obtained.
  • Example 7 Using 400 mg of poly I having an average number of bases of about 400 mg and 400 mg of poly C having an average number of bases of about 80 base, and having a dispersion treatment pressure of 800 kg / cm 2 , the present invention having an average particle diameter of 135 nm as in Example 7 A formulation was obtained.
  • the particle size distribution of this comparative preparation was measured by a laser diffraction scattering type particle size measuring device in the same manner as in Example 4, and the results shown in FIG. 2 were obtained. According to this result, the peak of the particle size distribution was 243, but roughly 20% of coarse particles of 3 to 20 ⁇ m with a distribution peak at 8000 nm were detected, and a bimodal particle size distribution was found. did.
  • This comparative preparation was a white, sedimentable suspension that aggregated and precipitated within 5 minutes after collection. It was similar to a suspension of sake lees. The particle size could not be measured because it exceeded the measurement range of the dynamic light scattering type particle size measuring device. Filter sterilization with a 0.2 mm membrane filter also failed.
  • Example 4 The biological activities of the preparation of the present invention obtained in Example 4 and the comparative preparation obtained in Comparative Example 1 were evaluated on the growth inhibitory effect on cervical cancer cells (HelaS3).
  • [C 60 value is the total nucleic acid polymer of poly I and poly C combined
  • the present invention has the following effects, for example.
  • a uniform and high-quality nucleic acid-containing complex preparation without coarse complex particles can be manufactured.
  • a uniform and high-quality nucleic acid-containing complex preparation substantially free of coarse complex particles can be produced. This effect becomes more pronounced as the concentration of the nucleic acid polymer increases.
  • FIG. 1 shows the particle size distribution of the composite particles in the preparation of the present invention according to Example 4.
  • the horizontal axis represents the particle diameter (m)
  • the left vertical axis represents the frequency (%)
  • the right vertical axis represents the integrated frequency (%)
  • FIG. 2 shows the particle size distribution of the composite particles in the comparative preparation according to Comparative Example 1.
  • the horizontal axis represents the particle diameter (im)
  • the left vertical axis represents the frequency (%)
  • the right vertical axis represents the integrated frequency (%).

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Description

明 細 書
核酸含有複合体製剤の製造方法 技 術 分 野
本発明は、 カチォン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核 酸含有複合体製剤に関する ものである。 当該複合体は、 リ ポプレ ツ タスと呼ばれるこ ともある。
ここで rカチオン性担体」 とは、 薬物、 特にァニオン性の薬物を 細胞内へ移入するのに有効な、 水中で陽電荷を有する薬物担体をい う。 カチオン性担体は、 近年、 遺伝子やポリ I ： C等の R N Aを細 胞内へ移入するための薬物担体として盛んに研究されている。
「核酸重合体」 とは、 天然由来の又は合成若しく は半合成された ポリ ヌ ク レオチ ド （D N A、 R N A ) 、 及び天然由来の又は合成若 しく は半合成されたォリ ゴヌ ク レオチ ドをいう。
背 景 技 術
カチオン性担体とポリアニォン性で二重らせん構造を有する二本 鎖核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合体製剤は、 単に力 チオン性担体とニ本鏆核酸重合体とを混合するだけで製造すること ができる。
しかし、 この方法で製造された核酸含有複合体製剤は、 一般に、 複合体の粒子径が数 m〜数百 と粗大であり、 不均一である。 このような粗大で不均一な核酸含有複合体製剤は、 核酸重合体の細 胞内移行や情報発現に関する研究において、 均一なデータが十分に 得られないという欠点を有する。 粒子の粗大性に関する最も重大な 問題は、 工業スケールで滅菌するこ とが困難であるこ と、 ヒ トに安 全に投与できるこ とを前提とする医薬品製剤において、 注射針内を はじめ、 静脈内投与においては毛細血管に塞栓等を生ずるおそれが あるこ とである。 これらの問題は、 上記のような単に混合するだけ で当該複合体製剤を製造する方法のみならず、 適当な乳化分散機等 を用いて分散処理を施すこ とにより製造する方法においても解決す るこ とが困難な問題である。
粒子の粗大凝集化は、 当該複合体製剤の安定化のために試みられ る凍結乾燥化においても発生する問題である。
当該複合体製剤中の核酸重合体は、 投与量を少なく し、 投与時に おける患者や医療従事者の負担を軽減するため、 又は当該複合体製 剤の製造効率を図るために高濃度であるこ とが望ま しい。 しかし、 従来の製造方法では、 核酸重合体の総量が 0. lmg/mL以上、 特に 0. 5 mg/mL 以上になると、 製造過程において著しい凝集が起こ り、 肉眼 的に容易に確認できるほどの巨大な沈殿物あるいは浮遊物が生じ、 このようなものは、 あらゆる分散処理によつても十分には分散させ るこ とができない。
ところで、 従来、 遺伝子やポリ I ： C等の R N Aにおいては、 二 重らせん構造を有する二本鎖のものが、 生理的な側面及び種々のヌ ク レアーゼに対する安定性の観点から、 いわば常識的に採用されて きた。 例えば、 強力なイ ンタ一フ ロ ン誘導能や免疫賦活作用等の 生理活性を有するポリ I ： Cについては、 ボリ I とポリ C とを別々 に投与しても十分な薬理効果が得られないこ とが知られている ( Archi ves of V i ro l ogy, 51 , 199-215 (1976) ) 。 このように遗伝 子やポリ I ： C等の R N Aは、 二重らせん構造を有する二本鎖であ るこ とが必須と考えられてきた。
カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含有複合 体製剤については、 上記のような核酸重合体の二重らせん構造の必 要性に閭して全く論じられておらず、 当該複合体製剤の製造におい ても、 いわば常識的に二重らせん構造を有する二本鎖 D N Aや二本 鎖 R N Aが採用されてきた。
本出願人は、 カチオン性担体とポリ I ： C等の二本鎖 R N Aとの 核酸含有複合体製剤が、 癌治療等に有効な癌細胞内のヌ ク レアーゼ を活性化するこ とから、 当該核酸含有複合体製剤を痛細胞内ヌ ク レ ァーゼ活性化剤と して特許出願し、 また肝臓や脾臓に特異的に有効 量のイ ンターフ 口ンを長時間誘導するこ とから、 当該核酸含有複 合体製剤を肝炎治療剤として既に特許出願している （PCT/JP98 /04695号、 PCT/JP99/01438号） 。
発 明 の 開 示
本発明の目的は、 特に、 いわゆる滤過滅菌が可能で、 人体に対す る安全性に問題があるとされる 7 m以上の粗大な粒子を含まない ことを特徴とする、 均一で良質な核酸含有複合体製剤の製造方法を 提供するこ とにある。
本発明者らは、 カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有す る核酸含有複合体製剤の製造過程において、 通常二重らせん構造を 有する二本鎖 D N Aや二本鎖 R N Aを用いるこ とな く、 二重らせん 構造をほどいた、 又は二重らせん構造をあらかじめ形成させるこ と なく一本鎖の状態の核酸重合体を用いて製造するこ とにより、 薬理 活性等に影響を与えることな く上記課題を一挙に解決できるこ とを 初めて見出し、 本発明を完成した。
従って、 本発明として、 カチオン性担体と核酸重合体との複合体 を含有する核酸含有複合体製剤 （以下、 「核酸含有複合体製剤」 と いう） の製造過程において、 少なく とも部分的に二本鎖を形成し得 る 2つの一本鎖核酸重合体を、 それぞれ別々 に一本鎖の伏態でカチ ォン性担体に、 又はカチォン性担体が形成される前の原料に添加し 分散処理するこ とを特徴とする前記核酸含有複合体製剤の製造方法 を挙げるこ とができる。
以下、 本発明を詳述する。
本発明に適用し得る 「カチオン性担体」 としては、 例えば、 市販 のリ ボフ ヱクチン （商品名） やリ ボフ ヱ ク トァ ミ ン （商品名） 、 リ ボフエク トエース （商品名） 、 DMR i B- C (商品名） の他、 PCT W094 /19314号公報に開示されている薬物担体、 例えば、 次の構造式
〔 I 〕 で表される 2-0- (2- ジェチルア ミ ノエチル） 力ルバモイル- 1. 3-0-ジォレオイルグリ セロール （以下 「化合物 A」 という） 及び リ ン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体やポリ リ ジ ン等 の薬物担体を挙げるこ とができる。
〕
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本発明に適用 し得る 「 2つの一本鎖核酸重合体」 としては、 少な く とも部分的に二本鎖を形成し得る 2つの一本鎖核酸重合体であれ ば特に制限されないが、 例えば、 天然の又は人為的に組み換えられ た遺伝子 （例えば、 プラス ミ ド） を構築する 2つの一本鎖 D N Aや —本鎖 R N A、 ポリ I とポリ C、 ポリ Aとポリ U、 ボリ I とポリ C 1 2 U、 一部化学修飾が施されたポリ I (例、 ポリ （7-デァザイ ノ シン酸） ） とポリ （：、 ポリ I と一部化学修飾が施されたポリ C (例. ポリ （5-ブロモシチジル酸） 、 ポリ （2-チオシチジル酸） ） などの 2つの一本鎖 R N Aを挙げるこ とができる。 このように、 強力なィ ンターフ ロン誘導能等の生理活性を有するポリ I ： Cを構成する ポリ I とポリ Cといった 2つの一本鎖 R N Aに応用するこ とができ る。 こ こで、 「ポリ I 」 はポリ イノ シン酸を、 「ポリ （：」 はポリ シ チジル酸を、 「ポリ A」 はポリ アデニル酸を、 「ポリ U」 はポリ ウ リ ジル酸を、 「ボリ C】2 U」 は、 ほぼ 12個のシチジル酸に対してゥ リ ジル酸 1 個がシチジル酸と置き換えられたシチジル酸ゥ リ ジル酸 コポリマーを、 それぞれ意味する。
「少な く とも部分的に二本鎖を形成し得る」 とは、 生理的条件下 で二本鎖を形成し得る程度に相補的な塩基関係にある塩基同士が 2 つの一本鎖核酸重合体中に存在するこ とをいい、 2つの一本鎖核酸 重合体の種類や各核酸重合体の長さ等によって異なるが、 具体的に は、 相捕的な塩基関係にある塩基数が 20base ( base ： 塩基の個数） 以上であるのが一般的である。
各一本鎖核酸重合体が有する塩基数は、 特に制限されないが、 10, OOObase以下が適当であり、 2, OOObase 以下が好ま しい。 当該塩 基数は、 それぞれの核酸重合体が有する性質により適宜選択するこ とができる。 また、 2つの一本鎖核酸重合体は、 必ずしも同じ塩基 数から構成されている必要はない。 なお、 各核酸重合体は、 通常様 々な塩基数からなる一定の分布を持って存在するが、 各塩基数は最 大分布の塩基数を意味し、 こ こでは 「平均塩基数」 という。
なお、 例えば、 本発明においてボリ I 及びポリ Cの平均塩基数は. 有効性と安全性とのバランスにおいて決定することができる。 具体 的には、 いずれも 30〜3 , OOObas e の範囲内が適当であり、 60〜
2. O O Obas e の範囲内が好ま し く 、 1 00 〜500bas e の範囲内がより好 ま しい。
上記、 化合物 A及びリ ン脂質を必須構成成分と して形成される薬 物担体 （カチオン性担体） における リ ン脂質としては、 医薬上許容 されるものであれば特に制限されない。 例えば、 ホスフ ァチジルコ リ ン、 ホスフ ァチジルェタ ノ 一ルァ ミ ン、 ホスフ ァチジルイ ノ シ ト —ル、 ホスフ ァチジルセ リ ン、 スフ イ ンゴ ミ エ リ ン、 レシチン等を 挙げるこ とができる。 また、 水素添加されたリ ン脂質も挙げるこ と ができる。 好ま しいリ ン脂質と しては卵黄ホスフ ァチジルコ リ ン、 卵黄レシチン、 大豆レ シチン、 卵黄フ ォスフ ァ チ ドを挙げる こ とが できる。 2種以上のリ ン脂質を用いるこ ともできる。 なお、 この力 チォン性担体においては、 ホスファチジルコ リ ン又はレシチンの方 が、 カチォン性担体において一般的に用いられているホスファチジ ルェタノ ールァ ミ ンより も優れている。
化合物 A及びリ ン脂質の構成比率は、 リ ン脂質の種類や適用する 2つの一本鎖核酸重合体の種類等によって異なるが、 化合物 A 1 重 量部に対して、 リ ン脂質が 0. 1 〜1 0重量部の範囲内が適当であり、 0. 5 〜 5重量部の範囲内が好ま しく、 1 ~ 2重量部の範囲内がより 好ま しい。 当該リ ン脂質が、 レ シチンの場合も同様である。
本発明においてカチォン性担体と核酸重合体との構成比率は、 力 チオン性担体の種類や用いる核酸重合体の種類等によって異なるが. カチォン性担体 10重量部に対し、 核酸重合体の総量が 0. 05〜10重量 部の範囲内が適当であり、 0. 1 〜 4重量部の範囲内が好ま しく、 0. 5 〜 2重量部の範囲内がより好ま しい。 2つの一本鎖核酸重合体 がポリ I 及びポリ Cであり、 化合物 Aと リ ン脂質とを必須構成成分 として形成されるカチォン性担体とポリ I 及びポリ C との複合体の 場合も同様に、 カチオン性担体 10重量部に対し、 ポリ I及びポリ C の総量が 0. 05〜10重量部の範囲内が適当であり、 0. 1 〜 4重量部の 範囲内が好ま しく、 0. 5 - 2重量部の範囲内がより好ま しい。
本発明に係る核酸含有複合体製剤 （以下 「本発明製剤」 という） は、 例えば、 市販のカチオ ン性担体が分散している水溶液中に、 若 しく はカチオン性担体の原料が分散している水溶液を適当な乳化分 散機にかけ、 常法により分散処理して製造されたカチオン性担体が 分散している水溶液中に、 又はカチオン性担体が形成される前の原 料が分散している水溶液中に、 順次又は同時に 2つの一本鎖核酸重 合体を添加し、 適当な乳化分散機等を用いて常法により分散処理し て製造するこ とができる。 本発明製剤は、 固形のカチオン性担体や その原料に 2つの一本鎖核酸重合体を添加し、 水を加えて適当な乳 化分散機により分散処理しても製造するこ とができる。 これらの添 加順序や添加量、 添加濃度、 添加速度、 及びカチオン性担体やその 原料の溶液中の濃度は、 任意に選択され、 本発明において特に限定 されるものではない。
より具体的には、 化合物 A及びリ ン脂質を必須構成成分として形 成されるカチォン性担体を用いる場合、 当該カチォン性担体が分散 している水溶液中に、 ポリ I 及びポリ Cの水溶液をそれぞれ別々 に 徐々 に滴下しながら乳化分散処理して本発明製剤を製造するこ とが できる。 また、 化合物 A、 リ ン脂質、 ポリ I 、 及びポリ Cのそれぞ れをビーカーに抨取し、 水を加えてホモジナイザーで粗分散した後. 高圧乳化分散機で分散処理することによつても本発明製剤を製造す ることができる。
2つの一本鎖核酸重合体は、 二本鎖核酸重合体を、 通常行われる 操作により解いたものを用いてもよい。 具体的には、 60°C以上の加 熱等行う非酵素的処理又は酵素的処理を挙げるこ とができる。
上記市販のカチォン性担体は、 そのまま又は適当に加工して用い ることができる。
上記水溶液と しては、 注射用水、 注射用蒸留水、 生理食塩水等の 電解質液、 ブドウ糖液などを挙げるこ とができる。
上記乳化分散機と しては、 例えば、 ホモ ミ キサー、 ホモジナイザ 一、 超音波分散機、 超音波ホモジナイザー、 高圧乳化分散機、 マイ クロフルイダイザ一 （商品名） 、 ナノマイザ一 （商品名） 、 アルテ イマィザ一 （商品名） 、 D e B E E 2000 (商品名） 、 マン ト ンーガ ゥ リ ン型高圧ホモジナイザー等が挙げられるが、 医薬用途で適宜用 いられるもので十分である。 処理条件や処理時間、 処理温度等は適 宜選択される。
本発明製剤は、 任意の医薬上許容される添加剤、 例えば、 乳化分 散補助剤、 安定化剤、 等張化剤、 凍結乾燥助剤、 p H調節剤を適当 量含有していてもよい。 具体的には、 炭素数 6 〜 2 2の脂肪酸 （例. カプリ ル酸、 力プリ ン酸、 ラウ リ ン酸、 ミ リ スチン酸、 ノ、'ルミ チン 酸、 ステア リ ン酸、 ォレイ ン酸、 リ ノ 一ル酸、 ァラキ ドン酸、 ドコ サへキサェン酸） やその医薬上許容される塩 （例、 ナ ト リ ウム塩、 カ リ ウム塩、 カルシウム塩） 、 アルブ ミ ン、 デキス ト ラ ン等の乳化 分散補助剤、 コ レステロール、 ホスフ ァチジン酸等の安定化剤、 塩 化ナ ト リ ウム、 グルコース、 マル トース、 ラ ク 卜ース、 スク ロース 等の等張化剤、 凍結乾燥助剤、 塩酸、 硫酸、 リ ン酸、 酢酸、 水酸化 ナ ト リ ウム、 水酸化カ リ ウム、 ト リ エ夕 ノールア ミ ン等の p H調節 剤等を挙げるこ とができる。
上記のような医薬上許容される任意の添加剤は、 分散前でも分散 後でも適当な工程で添加するこ とができる。
分散処理後、 必要に応じ 0. 2 /z mの濾過滅菌膜を通し、 アンプル やバイアルに充塡するこ とができる。 本発明に係る複合体粒子の粒 子径は、 ほとんど全てが 200nm以下である。 従って、 本発明製剤は, 0. 2 mの滤過滅菌膜をほぼ 100%通過するこ とができる。
上記のような本発明に係る製造方法により、 均一で微細な複合体 粒子を含有する核酸含有複合体製剤を得ることができ、 しかも核酸 重合体を溶液中 0. lnig/mL以上含有する核酸含有複合体製剤を得るこ とができる。
従って、 上記のような製造方法により得られる核酸含有複合体製 剤や上記のような製造方法により得られ、 かつ溶液中の核酸重合体 の濃度が 0. 1〜1 0mg/mL の範囲内、 0. 5〜10mg/mし の範囲内、 1 〜 l Omg/mL の範囲内、 あるいは 2〜1 0mg/mL の範囲内である核酸含有 複合体製剤も本発明に含めるこ とができる。 なお、 本発明は、 核酸 重合体の溶液中の濃度が 1 0mg/mL より高いものを除外する ものでは ない。
さ らに、 上記のように分散処理して製造された本発明製剤を凍結 乾燥すれば、 本発明に係る凍結乾燥製剤とするこ とができる。 従つ て、 当該凍結乾燥製剤も本発明製剤の一つと して挙げるこ とができ る。 凍結乾燥は、 常法により行う こ とができる。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、 例えば、 バイアルに分注後、 約 -40 〜- 20 °Cの条件で予備凍結を約 2時間程度行い、 約 0〜1 0 °Cで 減圧下に一次乾燥を行い、 次いで約 15〜25 °Cで減圧下に二次乾燥し て凍結乾燥する。 そして、 一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置 換し、 打栓して本発明の凍結乾燥製剤を得る。 凍結乾燥を適応する 場合、 凍結乾燥ケーキを形成する凍結乾燥助剤を用いるこ とが好ま しい。 特に糖類が好適であり、 とりわけ二糖類、 特にマル トースが 最も好ま しい。
本発明に係る凍結乾燥製剤は、 一般に任意の適当な溶液 （再溶解 液） の添加によって再溶解して使用することができる。 このような 再溶解液としては、 注射用水、 ブドウ糖液、 生理食塩液等の電解質 液、 その他一般輸液を挙げるこ とができる。 この再溶解液の液量は、 用途によつて異なり特に制限されないが、 凍結乾燥前の液量の 0. 5 〜 2倍量、 または 500mL 以下が適当である。
本発明製剤は、 注射剤や点滴剤等の液剤の形態で、 又は凍結乾燥 製剤の形態で提供するこ とができる。 本発明製剤は、 ヒ トを含む動物に対して、 静脈内投与、 動脈内投 与、 皮下投与、 筋肉内投与、 吸入投与、 点鼻投与、 点眼投与、 経口 投与、 直腸投与など種々の投与経路で投与するこ とができる。 その 投与形態や投与量は所望に応じ適宜選択するこ とができる。 また、 動植物や真菌、 細菌等の微生物などの培養細胞等に対する種々の試 薬 ' 薬剤としても用いるこ とができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例、 比較例、 及び試験例を掲げて、 本発明をより詳し く説明する。
実施例 1 〜 5では、 平均塩基数が各々 ほぼ 200bas e のポリ I及び ポリ Cの一本鎖 R N Aを原料として用いた。 また、 各実施例で行わ れた分散処理後の 0. 2 mメ ンブレンフィ ルターによる濾過滅菌に おいて、 フィ ルタ一の目詰まり もなく濾過滅菌を行う こ とができ、 また濾液中の回収率は、 各核酸重合体とも 98〜 102%の範囲内であり . ほぼ 1 00%の攄過滅菌が可能であつた。
実施例 1
化合物 A 2 g と精製卵黄レシチン 2 gに 100 mLの注射用水に溶解 したマル ト一ス 40 gを加え攪拌混合し、 ホモジナイザ一を用いて 5 分間分散処理してカチオン性担体の粗分散液を得た。 かかる粗分散 液を更に実験用小型乳化分散機を用いて 1 時間分散処理し、 注射用 水で 250 mLに定容してカチオン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mLに 250 mgのポリ I を含む 75 mL の水溶液を攪拌しながら添加 し、 次いで 250 mgのポリ Cを含む 75 mL の水溶液を攪拌しながら添 加し、 更に 1 時間実験用小型乳化分散機を用いて分散処理した後、 0. 2 /z mメ ンブレ ンフィ ルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。 こ の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子怪を動的光散乱方式による 粒子径測定装置 （DLS- 700 ； 大塚電子社製。 以下同じ） によって測 定したところ、 1 38nmであった。 また、 1 m以上の粒子は含まれ なかった。
その後、 この本発明製剤を 1 mしづつバイアルに分注し常法に従つ て凍結乾燥製剤とした。 得られた凍結乾燥製剤に 0. 9 mしの注射用水 を加えて再溶解した。 再溶解後の本発明製剤中の複合体粒子の平均 粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置 （DLS- 700 ； 大塚電 子社製。 以下同じ） によって測定したところ、 1 40 nmであつた。 ま た、 1 u m以上の粒子は含まれなかった。
実施例 2
化合物 A 50 g と卵黄ホスフ ァチ ド 30 gに 10 Lの注射用水に溶解し たスクロース 4 kgを加えマン ト ン一ガウ リ ン型高圧ホモジナイザー を用いて 10分間分散処理し、 注射用水で 25 Lに定容してカチオン性 担体の分散液を得た。 この分散液 20 Lに 50 gのポリ Cを含む 6し の 水溶液を攪拌しながら添加し、 次いで 50 gのポリ I を含む 6 L の水 溶液を攪拌しながら添加した。 この分散液を塩酸を用いて pHを 5. 5 に調整し、 さ らに 30分間マン ト ン一ガウ リ ン型高圧ホモジナイザー を用いて分散処理した後、 0. 2 z mメ ンブレ ンフィ ルターで滅菌濾 過し本発明製剤を得た。 この本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子 径を測定したところ、 1 50nmであった。 また、 1 m以上の粒子は 含まれなかった。
その後、 この本発明製剤を 20mしづつバイアルに分注し常法に従つ て凍結乾燥製剤とした。 得られた凍結乾燥製剤に市販の 5%ブ ドウ糖 輸液 （ 500 mL) を加えて再溶解した。 再溶解後の本発明製剤中の複 合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によ つて測定したところ、 151 nmであった。 また、 1 m以上の粒子は 含まれなかった。
実施例 3
化合物 A 2 g、 大豆レシチン 2 g、 ポリ I 25mg 、 及びポリ C 25 mgをビ一カーにとり、 これに 100 mLの注射用水に溶解したブド ゥ糖 20 gを加え攪拌混合し、 ホモジナイザ一を用いて 5分間分散処 理した。 かかる粗分散液を更に実験用小型高圧乳化分散機 （ 800 kg /cm 2 ) を用いて 1 時間分散処理し、 注射用水で 400 mLに定容した後， 0. 2 mメ ンブレンフィ ルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。 こ の本発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による 粒子径測定装置によって測定したところ、 121 nmであった。 また、 1 m以上の粒子は含まれなかった。
実施例 4
化合物 A 1. 2 g と精製卵黄レシチン 2. 0 gに 100 mLの注射用水に 溶解したマル ト―ス 40 gを加え攪拌混合し、 実験用小型高圧乳化分 散機を用いて 30分間分散処理し、 注射用水で 250 mLに定容してカチ ォン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mしに対し攪拌しながら、 100 mgのポリ I を含む 75 mし の水溶液と 100 mgのポリ Cを含む 75 mL の水溶液をそれぞれ同時に徐々 に滴下し、 更に 2時間実験用小 型高圧乳化分散機 （1 , 100 kg/cm z ) を用いて分散処理した後、 0. 2 mメ ンブレンフィ ルターで滅菌濾過し本発明製剤を得た。 この本 発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 124 nmであった。 また、 1 m以上の粒子は含まれなかった。
また、 この本発明製剤の粒径分布をレーザー回折散乱方式の粒子 径測定装置 （LA-910 ； 堀場製作所社製。 以下同じ） により測定した ところ、 図 1 に示す結果が得られた。 この結果によると、 粒径分布 のピークは 139 nmであり、 粗大な粒子は検出されなかった。
実施例 5
化合物 A4.8 g と精製卵黄レシチン 8.0 gに 100 mしの注射用水に 溶解したマル トース 40gを加え攪拌混合し、 実験用小型高圧乳化分 散機を用いて 30分間分散処理し、 注射用水で 250 mLに定容してカチ オン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mLに対し攪拌しながら, 400 mgのポリ I を含む 75 mL の水溶液と 400 mgのポリ Cを含む 75 mし の水溶液をそれぞれ同時に徐々 に滴下し、 更に 2時間実験用小 型高圧乳化分散機 （1, 100 kg/cm2) を用いて分散処理した後、 0.2 z mメ ンブレ ンフィ ルタ一で漶過滅菌し本発明製剤を得た。 この本 発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 138 nmであった。 また、 1 m以上の粒子は含まれなかった。
実施例 6
市販の D NAプラス ミ ドベクター （pMClneo) 100 gを含む l mL の水溶液を攪拌しながら 70°Cの水浴中で 3時間加温した。 これに同 じく 70DCに加温した市販の リ ポフエ クチン （商品名） 2 mgを含む分 散液 2 mLを攪拌しながら添加し、 10分間プロ一ブ型超音波分散機を 用いて 70°Cで分散処理し、 その後 0. 2 / mメ ンブレンフィ ルターで 濾過滅菌し本発明製剤を得た。 この本発明製剤中の複合体粒子の平 均粒子径を動的光散乱方式による粒子径測定装置によって測定した ところ、 145 nmであった。 また、 1 m以上の粒子は含まれなかつ た。
実施例 7
平均塩基数がいずれも約 l , 500bas e のポリ I 及びポリ Cの一本鎖 R N Aを原料として用いた。
化合物 A 1 . 2 g と精製卵黄レシチン 2. 0 gに 100 mLの注射用水に 溶解したマル トース 40 gを加え攪拌混合し、 実験用小型高圧乳化分 散機を用いて 30分間分散処理し、 注射用水で 250 mLに定容してカチ オン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mLに対し攪拌しながら, 100 mgのポリ I を含む 75 mL の水溶液と 100 mgのポリ Cを含む 75 mL の水溶液をそれぞれ同時に徐々 に滴下し、 更に 2時間実験用小 型高圧乳化分散機 （1 . 100 kg/cm2 ) を用いて分散処理した後、 0. 2 mメ ンブレンフィ ル夕一で濾過滅菌し本発明製剤を得た。 この本 発明製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 怪測定装置によって測定したところ、 134 nmであった。 また、 1 in以上の粒子は含まれなかつた。
実施例 8
平均塩基数が約 350baseのポリ I 200mg、 平均塩基数が約 350 baseのポリ C 200mgを用い、 800kg/cin 2 の分散処理圧で実施例 7 と 同様にして、 平均粒子径が 130mnの本発明製剤を得た。
実施例 9 平均塩基数が約 l, 450baseのポリ I 200mg、 平均塩基数が約 1， 450baseのポリ C 200mgを用い、 800kg/cm2 の分散処理圧で実施 例 7 と同様にして、 平均粒子径が 150nmの本発明製剤を得た。
実施例 10
平均塩基数が約 SObaseのポリ I 400mg、 平均塩基数が約 80baseの ポリ C 400mgを用い、 800kg/cm2 の分散処理圧で実施例 7 と同様に して、 平均粒子径が 135nmの本発明製剤を得た。
比較例 1 (実施例 4 に対応する従来法による製造）
化合物 A 1.2 g と精製卵黄レシチン 2.0 gに 100 mLの注射用水に 溶解したマル トース 40 gを加え攪拌混合し、 実験用小型高圧乳化分 散機を用いて 30分間分散処理し、 注射用水で 250 mLに定容してカチ オン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mLに対し攪拌しながら. ほぼ 200 塩基対数を有する二本鎖ポリ I ： C 200mgを含む 150 mLの 水溶液を徐々に滴下し、 更に 2時間、 実験用小型高圧乳化分散機 (1, 100 kg/cm2) を用いて分散処理し、 比較用製剤を得た。 この比 較用製剤中の複合体粒子の平均粒子径を動的光散乱方式による粒子 径測定装置によって測定したところ、 182 nmであった。
また、 この比較用製剤の粒径分布を実施例 4 と同様にレーザー回 折散乱方式の粒子径測定装置によって測定したところ、 図 2 に示す 結果が得られた。 この結果によると、 粒径分布のピークは 243 で あつたが、 8000 nm に分布のピークを有する 3〜 20〃 mの粗大な粒 子がおよそ 20%検出され二峰性の粒子径分布を有した。
更に、 この比較用製剤を 0.2 〃 mメ ンブレ ンフィ ルターで滅菌濾 過してみたところ、 50 mL 濾過したところでフィ ルタ一が目詰ま り 訂正された用紙 （規則 91) し、 濾過滅菌ができなかった。
比較例 2 (実施例 5 に対応する従来法による製造）
化合物 A4.8 g と精製卵黄レシチン 8.0 gに 100 mLの注射用水に 溶解したマル トース 40 gを加え攪拌混合し、 実験用小型高圧乳化分 散機を用いて 30分間分散処理し、 注射用水で 250 mLに定容してカチ オン性担体の分散液を得た。 この分散液 250 mLに対し攪拌しながら. ほぼ 200 塩基対数の二本鎖ポリ I ： C 800mgを含む 150 mしの水溶液 を徐々 に滴下し、 更に 2時間、 実験用小型高圧乳化分散機 （1， 100 kg/cm2) を用いて分散処理し、 比較用製剤を回収した。 この比較用 製剤は白色の沈殿性の懸濁液であり、 回収後 5分以内に凝集し沈殿 した。 酒粕の懸濁液に類似したものであった。 動的光散乱方式の粒 子径測定装置による測定範囲を超え、 粒子径は測定できなかった。 0.2 〃 mメ ンブレンフィ ルタ一での濾過滅菌もできなかった。
試験例 1
実施例 4で得られた本発明製剤と比較例 1 で得られた比較用製剤 の生物活性を子宮頸部癌細胞 （HelaS3) に対する増殖抑制作用で評 価した。
実験は、 HelaS3細胞を、 96ゥエルプレー トに 104 個/ゥエルの密 度でまき、 5時間以上培養して細胞がゥエルに接着したこ とを確認 した後、 各製剤を添加して培養を続け、 薬剤添加後 3 日後に生細胞 数を MT T法により測定した。 阻害率 （％) は次式で求め IC5。値を 算出した。 その結果を表 1 に示す。
盯正された用紙 （規則 91) 薬剤処理細胞群の吸光度値
I C B 0 ( 1 -) X 1 0 0 %
生理食塩液処理細胞の吸光度値'
表 1
Figure imgf000020_0001
[ C 6 0値はポリ I とポリ C とを合わせた総核酸重合体
濃度で表示
表 1 から明らかなように、 実施例 4 に係る本発明製剤と比較例 1 に係る比較用製剤との間に生物活性値の差はなかつた。
発 明 の 効 果
本発明は、 例えば以下の効果を有する。
①粗大複合体粒子がない均一で良質な核酸含有複合体製剤を製造す るこ とができる。
②粗大複合体粒子を実質的に含まない均一で良質な核酸含有複合体 製剤を製造するこ とができる。 この効果は、 核酸重合体の濃度が高 く なるほど顕著である。
③本発明により製造された核酸含有複合体製剤を凍結乾燥したもの を再溶解しても凍結乾燥前と同等の核酸含有複合体製剤に再構築す るこ とができる。
④ 0. 2 z mの濾過滅菌膜をほぼ 100 通過するこ とができる核酸含有 複合体製剤を提供するこ とができる。
図面の簡単な説明
図 1 は、 実施例 4 に係る本発明製剤中の複合体粒子の粒径分布を 示す。 横軸は粒子径 （ m ) を、 左縦軸は頻度 （％) を、 右縦軸は 積算頻度 （％) を、 それぞれ表す。 図 2は、 比較例 1 に係る比較用製剤中の複合体粒子の粒径分布を 示す。 横軸は粒子径 （ im) を、 左縦軸は頻度 （％) を、 右縦軸は 積算頻度 （％) を、 それぞれ表す。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . カチォン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含 有複合体製剤の製造過程において、 少な く とも部分的に二本鎖を形 成し得る 2つの一本鎖核酸重合体を、 それぞれ別々 に一本鎖の状態 でカチオン性担体に又はカチオン性担体が形成される前の原料に添 加し分散処理することを特徴とする前記核酸含有複合体製剤の製造 方法。
2 . 少なく とも部分的に二本鎖を形成し得る 2つの一本鎖核酸 重合体の平均塩基数が、 いずれも 100〜 2. OOObas eの範囲内である 一本鎖核酸重合体である請求項 1 記載の核酸含有複合体製剤の製造 方法。
3 . 少なく とも部分的に二本鎖を形成し得る 2つの一本鎖核酸 重合体が、 ポリ I とボリ Cである請求項 1 又は 2記載の核酸含有複 合体製剤の製造方法。
4 . カチオン性担体が、 2-0- (2- ジェチルア ミ ノエチル） カル バ乇ィル - 1 , 3-0- ジォレオイルグリセロール及びリ ン脂質を必須構 成成分と して形成される薬物担体である、 請求項 1 〜 3のいずれか に記載の核酸含有複合体製剤の製造方法。
5 . リ ン脂質がレ シチンである請求項 4記載の核酸含有複合体 製剤の製造方法。
6 . カチオン性担体と核酸重合体との複合体を含有する核酸含 有複合体製剤において、 請求項 1 〜 5 のいずれかに記載の製造方法 により得られる核酸含有複合体製剤。
7 . 核酸重合体の濃度が 0. l〜10mg/mL の範囲内である請求項 記載の核酸含有複合体製剤。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003023031A1 (fr) * 2001-09-04 2003-03-20 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Methode d'evaluation de l'efficacite d'une therapie aux acides nucleiques
JPWO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2006-07-20 日本新薬株式会社 オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
WO2006129594A1 (ja) 2005-05-30 2006-12-07 Nippon Shinyaku Co., Ltd. 核酸含有複合体製剤の製造方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0127832D0 (en) * 2001-11-20 2002-01-09 Jagotec Ag Method for the preparation of pharmaceutical nanosuspensions
EP1581201A4 (en) 2002-12-23 2011-03-30 Vical Inc METHOD FOR PRODUCING STERILIC DRUGS ON POLYNUCLEOTIDE BASIS
EP1640452A4 (en) * 2003-05-30 2009-12-23 Nippon Shinyaku Co Ltd OLIGOBICATENARY RNA INHIBITING BCL-2 EXPRESSION AND MEDICINAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
US20080271995A1 (en) * 2007-05-03 2008-11-06 Sergey Savastiouk Agitation of electrolytic solution in electrodeposition
WO2012129767A1 (zh) * 2011-03-28 2012-10-04 南京大学 阳离子修饰的琼脂糖水凝胶和核酸药物组合物及制法和应用
SG10201911695SA (en) 2014-05-14 2020-01-30 Targimmune Therapeutics Ag Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors
CN109355334A (zh) * 2018-12-06 2019-02-19 江苏省农业科学院 一种制备聚肌胞的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5653621A (en) * 1979-09-17 1981-05-13 Merck & Co Inc Medicinal composition made from denatured polyriboinosinic aciddpolyribocytidilic acid for inducing interferon
JPS61103824A (ja) * 1984-10-27 1986-05-22 Nippon Kayaku Co Ltd ポリリボイノシン酸・ポリリボシチヂル酸・ポリ−レ−リジン複合体の注射用製剤の新規調製法
JPS62252798A (ja) * 1986-01-06 1987-11-04 Nippon Shinyaku Co Ltd 核酸誘導体
JPH01104094A (ja) * 1987-07-03 1989-04-21 Nippon Shinyaku Co Ltd 核酸誘導体の製法及び製剤法
WO1994019314A1 (en) * 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ194880A (en) 1979-09-17 1983-07-15 Merck & Co Inc Interferon-inducing composition containing modified polyriboinosinic-polyribocytidylic acid
US5298614A (en) 1986-01-06 1994-03-29 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Size limited double stranded poly I poly(cytidylate/4-thiouridylate)
GB2207138B (en) 1987-07-03 1992-02-05 Nippon Shinyaku Co Ltd Preparation of nucleic acid derivatives.
US5698721A (en) * 1992-12-17 1997-12-16 Megabios Corporation Catonic amphiphiles
US5908635A (en) * 1994-08-05 1999-06-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for the liposomal delivery of nucleic acids
JP2001508815A (ja) * 1996-05-29 2001-07-03 セル ジェネシス，インコーポレイテッド カチオン性ポリマー／脂質核酸送達ビヒクル
US6217900B1 (en) * 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
TW524693B (en) * 1997-10-16 2003-03-21 Nippon Shinyaku Co Ltd Cancer cell nuclease activator
CA2325550A1 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Remedies for hepatitis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5653621A (en) * 1979-09-17 1981-05-13 Merck & Co Inc Medicinal composition made from denatured polyriboinosinic aciddpolyribocytidilic acid for inducing interferon
JPS61103824A (ja) * 1984-10-27 1986-05-22 Nippon Kayaku Co Ltd ポリリボイノシン酸・ポリリボシチヂル酸・ポリ−レ−リジン複合体の注射用製剤の新規調製法
JPS62252798A (ja) * 1986-01-06 1987-11-04 Nippon Shinyaku Co Ltd 核酸誘導体
JPH01104094A (ja) * 1987-07-03 1989-04-21 Nippon Shinyaku Co Ltd 核酸誘導体の製法及び製剤法
WO1994019314A1 (en) * 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
WO1994018987A1 (en) * 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Drug composition containing nucleic acid copolymer

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003023031A1 (fr) * 2001-09-04 2003-03-20 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Methode d'evaluation de l'efficacite d'une therapie aux acides nucleiques
JPWO2004105774A1 (ja) * 2003-05-30 2006-07-20 日本新薬株式会社 オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
JP4623426B2 (ja) * 2003-05-30 2011-02-02 日本新薬株式会社 オリゴ核酸担持複合体、当該複合体を含有する医薬組成物
WO2006129594A1 (ja) 2005-05-30 2006-12-07 Nippon Shinyaku Co., Ltd. 核酸含有複合体製剤の製造方法
JP5056413B2 (ja) * 2005-05-30 2012-10-24 日本新薬株式会社 核酸含有複合体製剤の製造方法

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