JPS62252798A - 核酸誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は医薬品として有用な 生理活性を有する核酸誘導体に 関する。

（従来の技術） 核酸はプリン環またはピリミジ ン環にリボース等の糖が結合し これらがリン酸を介在して鎖状 に連なって構成されている。

核酸のうちＲＮＡ（リボヌク レオチドポリマー）は糖として リボースを有し、糖部がリン酸 のジエステル結合で結ばれた鎖 状の高分子化合物である。二重 鎖は、核酸を構成する塩基（例 えば、イノシン、シチジン、ウ リジン等）のプリン環またはピリ ミジン環部分がいわゆる相補的に水素結合によって結び
つき、立体構造としてらせん状に構成されている。二重
鎖を有する核酸は有用な生理活性を有することからこれ
まで多くの研究がなされてきた。

これらのうち、天然の、例えば、ウィルス由来のＲＮＡ
や、合成二重鎖ＲＮＡとしてのポリイノシン酸・ポリシ
チジル酸誘導体（以下「ポリ■・ポリＣ」という）、ポ
リアデニル酸・ポリウリジル酸誘導体等は、インターフ
ェロン・インデューサーとして多くの研究がなされてき
ている（デクラークら。　　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｐｏｒｔ
ｓ　ｏｎＢｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　
　ｉＬ７？　（１９８２）　）。

（５′−シチジル酸）（５′−イノシン酸）このように
、これまで多くのＲＮＡ核酸誘導体が合成されその生理
活性が研究されてきた。

ポリ！・ポリＣは高い活性を有する物質としてその有用
性が評価され、研究が続行されている。またポリ！・ポ
リＣ中のシチジンの極一部がウリジンに変化した化合物
（ミスマツチドＲＮＡ）がポリＩ・ポリＣに近い生理活
性を有するものとして研究されている（特開昭５０−０
８２２２６号）。

ポリシチジル酸の研究も続いており、ポリシチジル酸の
ピリミジン環の−ＮＨ２基の代わりにその５０％以上に
メノトカブト基（−ＳＨ）を導入するとその生理活性が
増大するとの研究もある（英国特許出願２０３８６２８
）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記した従来の生理活性物質は、なるほど有用なる効果
を充分に期待することができるものの、ポリＩ・ポリＣ
の如くその毒性を否定することができず（デクラークら
。Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｉ、＋６３４４　（１
９７２）　）　、何らかの工夫を要するものであった。

また、その生理活性を更に強力にすることが望まれてい
た。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、永年の研究を続ける過程において、偶然
のことではあったが、ＲＮＡが一定量の硫黄原子の導入
によって安定した高次構造の誘導体を形成することがで
きることを見いだし、この生理活性を測定したところ、
このものが従来ある生理活性物質に較べて極めて強力な
る活性を有しかつその毒性が極めて弱いことをも見いだ
し、本発明を完成するに至った。

本発明の要旨は、核酸の分子構造一部をＳＯ置換するこ
とにより、又はＳ−３置換の共有結合による架橋によっ
て結ぶことにより、安定に存在する核酸の高次構造を得
たことにある。

本発明の核酸誘導体は、−３１１基が導入できる核酸塩
基から合成される。本発明の核酸誘導体の具体例として
は、シチジル酸のポリマーである鎖状化合物（本明細書
において「ポリＣ」という）と、イノシン酸のポリマー
である鎖状化合物（本明細書において「ポリＩ」という
）との相補的二重らせん構造を有するものを挙げること
ができる。この場合、上記したポリＩ・ポリＣに似た構
造を有するのであるが、本発明の核酸誘導体が特徴的で
あるのは、以下の点にある。

本発明の核酸誘導体は、硫黄原子による部分的置換（Ｓ
Ｈ基）、これらの架橋（Ｓ−Ｓ結合）、又は両置換基の
混在によって誘導体を形成している。

本発明の核酸誘導体における硫黄原子はポ）ツマ−調製
の後又はその前に合成又は酵素反応を利用して導入され
る。−ＳＨ基が導入できる核酸塩基、例えば、シチジル
酸のピリミジン環中にある４位の−Ｎ）１２基を−ＳＲ
基で置換することにより導入するものである。この置換
体残基を４−チオウリジル酸という。

（５”−４−チオウリジル酸） 更に、導入されたーＳＨ基を後述する適当な方法によっ
て酸化することによりＳ−Ｓ結合架橋を形成させること
ができる。

分子内にＳＲ基とＳ−Ｓ基が混在する誘導体は、ＳＨ基
導入体を部分的に酸化するかＳ−Ｓ基導入体を部分的に
還元することによってつくることができる。

ところで、上記した核酸ポリマー（ポリＣ）は一重鎖で
ある。この、ＳＨ置換又はＳ−Ｓ結合架橋を形成させた
後の一重鎮核酸ポリマーは、後述する適当な方法によっ
て相補的な一重鎮核酸ボリマーと会合させて多重鎮を形
成させることができる。また逆に、先に硫化した一重鎖
核酸ポリマーと相補的な核酸ポリマーとを会合させて多
重鎮をつくり、その後に酸化反応によりＳ−３結合架橋
を形成させることもできる。このようにして形成した核
酸誘導体もまた本発明の目的である生理活性を有する核
酸誘導体に含まれるものである。即ち、−３Ｈ基を導入
できる核酸塩基を一部に有する核酸ポリマーであれば本
発明に含まれる０例えば、核酸残基に、４−チオウリジ
ン、２−チオウリジン、２−チオグアノシン、６−メル
カプトプリン、８−メルカプトプリン等を含む核酸ポリ
マーをジスルフィド化したものも本発明に含まれるもの
である。

本発明の核酸誘導体はまた、リン酸側鎖部を開裂させる
ことによって低分子化させることができ、この低分子化
したものも本発明に含まれる。従って、この意味からも
既存のポリＩ・ポリＣとは異なる。

叙上の、ＳＨ置換やＳ−Ｓ結合による架橋の形成、及び
好ましくはリン酸側鎖部開裂による低分子化という本発
明の核酸誘導体の特徴によって、本発明の効果、即ち、
■生理活性を高めること、■安全性を高めること、を発
現せしめることが初めて可能となったのである。

本発明の核酸誘導体の生理活性は医薬品として極めて有
用なものである。後述するように、本発明の核酸誘導体
は強力なインターフェロン・インデューサーとしての作
用を有する。この作用は、本発明の核酸誘導体の持つい
くつかの生理活性作用のひとつに過ぎない。本発明の核
酸誘導体の生理活性としては、例えば、後述する複数の
生理活性を挙げることができる。この中には、ＴＮＦ産
生能、インターロイキン１産生能、インターロイキン２
産生能、マクロファージ活性化能、ＮＫ細胞への活性化
作用、ｌ１ｉｉ細胞増殖阻止作用、担癌マウスにおける
腫瘍増殖阻止作用、ヒト腫瘍細胞担癌ヌードマウスにお
ける増殖阻止作用、腫瘍細胞の肺転移抑制作用等が含ま
れる。

また、本発明の核酸誘導体はこれまでのポリ■・ポリＣ
等のインターフェロン・インデューサー等に比べて極め
て安全性が高い。従って、本発明化合物は抗ウィルス剤
、抗腫瘍剤等として有用である。

核酸の分子サイズを表現する単位として繁用されている
ベース・ペア（以下ｒｂｐＪという）は、核酸の塩基数
によってその分子サイズを表わすものである（１０ｂｐ
は１０個の塩基を持つ二重鎖ポリマーを意味する）。本
明細書においては二重鎖ポリマー以外の核酸ポリマーを
も扱うことから、ｂｐＯ代わりに「残基数」の言葉を使
用する（例えばｒｌＯ残基数」とは、１０個の塩基を持
つ核酸ポリマーを意味することとする）。

本発明の核酸誘導体には多くの種類の分子サイズを有す
るものが含まれるが、５０残基数以上、例えば、５０〜
１００００残基数であるものがよい。

それ以上であれば、例えば、２０万残基数程度の、より
大きいものであってもよく、本発明の生理活性を維持す
るのに分子サイズの大きさが影響を与えることは少ない
ことが判っている。

本発明の核酸誘導体における硫黄数を表わすのには、こ
の明細書においては硫化度数（ｎ）をもって表現する。

シチジル酸はそのピリミジン環中の−ＮＨ２基を一５Ｈ
基に置換することによって４−チオウリジル酸に変わる
が、ｎは１個の４−チオウリジル酸に対して存在するシ
チジル酸の個数を表わす。本発明の核酸誘導体には多く
の種類のｎを有するものが含まれるが、ｎが６以上であ
るものがよい。ｎがそれより小さくなると本発明の生理
活性が低下することが判っている。ｎが６以上であれば
、例えば、ｎが３９程度のものであってもよく、本発明
の生理活性を維持するのにｎの値が影響を与えることは
少ない。

本発明の核酸誘導体の製造にあたっては種々の方法をと
ることができる。本発明の核酸誘導体の原料であるポリ
Ｃ等は容易に入手することができる。ポリＣは、例えば
、硫化水素等の硫化剤と反応させることにより硫化する
ことができる。この反応によってポリＣ中の一定の数の
シチジル酸を４−チオウリジル酸に変換することができ
る。反応温度と反応時間等の反応条件を変化させること
により、所望のｎ値を有するポリＣを得ることができる
。

硫化ポリＣは、容易に入手可能なポリ■とともに既に公
知の方法によって会合させることができる。この方法に
よって得られた硫化ポリＣ・ポリＩは、ジスルフィド形
成反応、例えば、ヨード試薬による酸化反応等、を利用
することにより本発明の核酸誘導体に導くことができる
。

上記の方法により得られる本発明の核酸誘導体は、はぼ
定量的に得ることができ、その収率は全体を通してほぼ
９０％程度であることが判っている。

他の核酸、例えば、ジスルフィド架橋をもつポリＡ・ポ
リＵの合成の場合には、まず酵素反応により硫黄原子の
入った核酸塩基を用いてポリマーを調製する。これはヘ
テロポリマーを作る通常の方法を用いることができる。

具体例を挙げると、ポリヌクレオチドフォスフォリラー
ゼ（ＰＮＰａｇｅ、　ｔｙｐｅ１５、ＰＬバイオケミカ
ル）０．５ユニット／ｍｌを用いウリジン−５′−シフ
オスフェート（ＵＤＰ　）　３６ｍＭと４−チオウリジ
ン−５′−シフオスフェート（４−ＳＨＵＤＰ）　　７
ｍＭを、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｍＭＥＤＴ
Ａを含む１５０ｍＭ　ｌ−リスバッフ、　−（ｐＨ８，
２）中、３７℃５時間で反応を行うと収率５０％程度で
ウリジン残基１３個に４−チオウリジン残基が１個の割
合で含まれるヘテロポリマーを得る。ここで４−チオウ
リジン−５′−シフオスフェートの代わりに２−チオウ
リジン−５′−シフオスフェートを用いると、２−チオ
ウリジンが含まれるポリＵが得られる。

このように、−ＳＨ基を含む核酸ポリマーを種々の通常
知られた方法で調製した後は、実施例で述べる硫化ポリ
Ｉ・ポリＣの場合と同様の操作によって以下の誘導体に
導くことができる。

即ち、具体例を挙げると、硫化ポリウリジル酸と当モル
のポリアデニル酸をともに中性水溶液に溶解し、複合体
形成のためにアニーリングを行う。即ち、インキュベー
ターで水溶し、温度を徐々に・８５℃まであげ、そのま
ま１０分間加熱後、室温に放置する。

このようにして得られた複合体をポリＩ・ポリＣのジス
ルフィド化反応で示したと同様の条件、即ちＩＮよう素
溶液で酸化することによりジスルフィド架橋をもったポ
リＡ・ポリＵ誘導体を得ることができる。アニーリング
から後の収率は８０％程度であり、全体を通した収率は
４０％程度である。

ジスルフィド化した複合体は、中性の水溶液に対して充
分透析した後、凍結乾燥することによって白色繊維状固
体として得ることができる。

本発明の核酸誘導体が、その特徴として有するＳ−３結
合によっていかなる立体構造を形成しているものである
かは必ずしも明らかではない。

本発明の核酸誘導体は、後述するように、一定の明確な
融解曲線を描くことから、安定な基本構造を有するもの
であることが明白である。

５０％融解温度ＣＴｍ値）を求めると、０．１Ｍナトリ
゛ウムイオン存在下、中性条件でポリＩ・ポリＣが５９
．０℃であるのに比べ、ｎ＝２０の割合で４−チオウリ
ジンを含むＳＨ置換核酸誘導体及びそのＳ−３置換核酸
誘導体は、それぞれ５９．５°Ｃ１５９，３℃と同等又
はそれ以上に安定化されていた。

一方、同じｎ＝２０の割合でウリジンを含む水酸基置換
核酸誘導体は、５３．１℃と低い。

即ち、硫黄原子の導入によって、他の置換体、例えば、
アミノ基や水酸基の場合に比べ核酸の高次構造を安定化
することができる。

次にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ　Ａ）の水解に対する
抵抗性を、分解率が５０％に達する時間比で比較すると
、一定の酵素反応条件下でボＩＪ　Ｉ・ポリＣの５０分
に比べ、４−チオウリジン（Ｓ）ｌ基）及びそのＳ−Ｓ
基を含むｎ＝２０の核酸誘導体はともに６０分であり、
一方ウリジン（水酸基）を含むｎ＝２０の核酸誘導体は
２０分と短く、生化学的安定性においても硫黄原子の置
換効果が見いだされている。

本発明の核酸誘導体を医薬として投与する場合、本発明
の核酸誘導体はそのまま又は医薬的に許容される無毒性
かつ不活性の担体中に、例えば０．１％〜９９．５％、
好ましくは０．５％〜９０％含有する医薬組成物として
、人を含む動物に投与される。

担体としては、液状、固形、又は半固形の希釈剤、充填
剤、及びその他の処方用の助剤一種以上が用いられる。

医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましい
。本発明の核酸誘導体は、経口投与、組織内投与、局所
投与又は経直腸的に投与することができる。これらの投
与方法に通した剤型、例えば、各種の経口剤、注射剤、
吸入剤、点眼剤、軟膏剤、生動等、で投与されるのはも
ちろんである。例えば、組織内投与、局所投与が特に好
ましい。

悪性腫瘍治療剤としての用量は、年齢、体重等の患者の
状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮した上で調
整することが望ましいが、通常は、成人に対して本発明
の核酸誘導体の有効成分量として、１回あたり、０．０
５〜１０００ｍｇの範囲が用いられ、好ましくは０．５
〜５０ｍｇの点滴静注が一般的である。場合によっては
、これ以下で足りるしまた逆にこれ以上の用量を必要と
することもある。また１日１〜数回投与又は１導数日の
間隔で投与することができる。

良性ｌ１ｆｆｉ瘍又はウィルス疾患治療剤としての用量
は、病気の性質と程度、投与経路、患者の状態等を考慮
した上で調整することが望ましいが、通常は、畝上の悪
性腫瘍治療剤としての用量の１導数十分の−の範囲が一
般的である。

の　　８導　の生　′ 以下に本発明の核酸誘導体の生理活性について説明する
。

（１）インターフェロン・インデューサー能本発明の核
酸誘導体のひとつである硫化ポリＩ・ポリＣ誘導体につ
いて、そのインターフェロン・インデューサーとしての
作用を、抗ウィルス活性のアッセイ法で求めた。

試験検体Ｉとした硫化ポリ！・ポリＣ誘導体はＳＲ置換
体であり、試験検体■は５−ｓＨ置換体ある。ともにｎ
値はｎ＝２０、分子サイズが５０〜２０００残基数も用
いた。

ヒト末梢血から得たリンパ球（１０６細胞数／ｍｌ）を
培養液（ＲＰＭＩ　１６４０　、２０％ＦＣＳ　）中で
検体（１０μｇ／ｍｌ）と２時間処理する。反応培養液
を除き再び新たな培養液（ＲＰＭＩ　１６４０　、２０
％ＦＣＳ　）中に細胞を浮遊させた後、２０時間インキ
ュベートし、その上滑液をシンドビスウイルスとＰＬ細
胞を用いた通常のインターフェロン−抗ウイルス活性測
定法にかけた（臨床検査　胆１７２６　（１９８４）　
）。その結果を下表に示す。なお、インターフェロンの
力価はＣＰＥＩｓａ（Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　
！Ｅｆｆｅｃｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　５０　）法を
用いた希釈濃度によって求めた６試験検体■はｎ＝２０
の割合で４−チオウリジンを含むＳ−３置換核酸誘導体
であり、試験検体■はそのＳＨ置換体である。対照検体
として既存のポリＩ・ポリＣを用いた。

試験検体Ｉ　　　１００　　　＞６４００　　＞６４０
０　　＞６４００試験検体ＩＩ　　１００　　　＞６４
００　　＞６４００　　＞６４６０（インターフェロン
力（ｉｌｌ＋　（ユニット／ｍｌ）　）本発明の核酸誘
導体のインターフェロン・インデューサーとしての強力
な作用が明らかである。

なお、後述する実施例において得られた本発明の核酸誘
導体の硫化ポリトボリＣ誘導体のうち、ｎ値が２０で分
子サイズが５０〜３００残基数のもの、及び、ｎ値が２
０で分子サイズが２００〜２０００残基数のものを試験
検体として同様の生理活性をみたところ、はぼ同様の結
果を得た。また、低分子化する前のもとの核酸誘導体（
ｎ値が２０で分子サイズが２万残基数程度以上）におい
ても同様の結果を得た。

（２）ｌ！！！瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ　ＦａｃｔｏｒＴＮＦ）産生能 ＢＣＧで１０〜１４日前に前処理したウサギからの肺胞
マクロファージを分取し、１０％ＦＣ３加ＲＰＭ１１６
４０培地にて２　Ｘｌ０６（ＩＩ／ｍｌに調整後その１
ｍｌをプラスチックシャーレにまき、検体の存在又は非
存在下３７℃にて炭酸ガスインキュベーター内（５％Ｃ
０２）で培養する。

２時間又は８時間後の細胞培養上清を用いてＴＮＦ活性
を求めた。結果を下表に示す。ＴＮＦ活性値は７２時間
後のＬ−Ｍ細胞に対する細胞障害活性を色素の取込み法
で測定し、５０％細胞障害での希釈倍数をタイターとし
て表わす。なお、この細胞障害がＴＮＦによることをウ
サギＴＮＦに対するモノクローナル抗体を用いてその活
性中和により確認した。

コントロール　−−−−−−− ＬＰＳ　　　　３２＞６４　　　　　＋試験検体１３２
＞６４　　　　　　＋ 試験検体［３２＞６４　　　　　　＋ 対照検体ｎ　　　３２　　＞６４　　　　　　＋ＬＰＳ
は１　ｐｇ　／ｍｌ、試験検体Ｉ、試験検体■及び対照
検体は１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。

試験検体■、試験検体■及び対照検体は（１）と同じで
ある。本発明の核酸誘導体のＴＮＦ産生能が強いもので
あることが明らかである。

（３）生体内ＴＮＦ産生能 ＢＡＬＢ／Ｃ？ウス（６〜８週令、雄性）にＭｅ　ｔｈ
Ａｌｌｔ瘍２Ｘ１０５個を腹側皮下に移植し、移植後２
日後と１２日後の２回、薬物投与し、２回目投与の１時
間後に一部採血し、血清中のＴＮＦ活性を測定した。ま
た、その後生じる担癌部位でのネタローシス現象を観察
した。結果を下表に示す。なお、表中の数値は、前記（
２）に示したと同じタイターを用いた。

ＢＣＧ　　　　ＬＰＳ　　　　　１９２　　　　　　　
有りＢＣＧ　　　試験検体１　　４８　　　　　　有り
ＢＣＧ　　　試験検体ｎ　　　５０　　　　　　有りＢ
ＣＧ　　　対照検体　　　２４　　　　　　有り試験検
体１　試験検体Ｉ　　　１２　　　　　　有り試験検体
■、試験検体■及び対照検体は上記（１）と同じである
。本発明の核酸誘導体の生体内ＴＮＦ産生能が強いもの
であることが明らかである。

（４）インターロイキン１の産生能 正常ヒトヘパリン加末稍血よりＦｉｃｏｌ−Ｈｙｐａｑ
ｕｅ（ファルマシア、Ｆｉｃｏｌ−ｐａｑｕｅ　　（登
録商標））比重遠心法で単核球と分離後、１０％ＦＣ５
加ＲＰＭＩ培地にて５Ｘ１０６個／　ｍ　ｌに調整し、
プラスチックシャーレに入れ３７℃、１時間培養後、付
着性の細胞をインターロイキン１産生源として用いた。

得た単球５Ｘ１０５個／ｍｌに薬物を加え、２４時間３
７°Ｃで培養後の上清中のインターロイキン１活性をＰ
ＨＡ刺激マウマウ腺ＩＩＩＩＩ８！への３Ｈ−チミジン
取り込み法により、胸腺細胞の増殖能を指標として測定
した。結果を下表に示す。コントロールは生理食塩水を
表わす。インターロイキン１は１．２５ユニツ）／ｍｌ
、試験検体■、試験検体■、及び対照検体は１００γ／
　ｍ　１の濃度であった。なお、試験検体■、試験検体
■、及び対照検体は上記（１）と同じである。

試験検体１　　　　　　１１３８４ 試験検体Ｉ［１１５６０ 対照検体　　　　　　　８３９フ インターロイキン１　　１２５１７ 生能の強さが明らかである。

（５）インターロイキン２の産生能 Ｂａ１ｂ／ｃマウスの肺臓細胞から得たリンパ球をイン
ターロイキン２産生源として用いた。

得られたリンパ球５　ＸＩＱ６／ｍｌに薬物を加え３７
℃で２４〜４８時間培養した上清中のインターロイキン
２活性をインターロイキン２依存性に増殖する細胞株で
あるＣＴＬＬ−２又はＮに−７を用い、３Ｈ−チミジン
取り込み法により増殖能を指標として測定した。結果を
下表に示す。コントロールは生理食塩水を表わす。イン
ターロイキン２は５ユニフｌ−／ｍｌ、試験検体Ｉ、試
験検体■、及び対照検体は、１００γ／　ｍ　ｌの濃度
であった。

なお、試験検体！、試験検体■、及び対照検体は上記（
１）と同じである。

試験検体１　　　　　　３２４７ 試験検体ＩＩ　　　　　　　３３２０ 対照検体　　　　　　　　６５３ インターロイキン２　　　３５７８ 本発明の核酸誘導体のインターロイキン２産生能の強さ
が明らかである。

（６）マクロファージの活性化能 Ｂａ１ｂ／ｃマウス（７〜１０週令、退会）に検体を腹
腔内投与し、投与後３〜５日目の腹腔浸出細胞を採取後
、プラスチック付着性細胞（主としてマクロファージ）
をエフェクター細胞として分離し、Ｍｅ　ｔｈ　−Ａ腫
瘍細胞をターゲットとして（Ｅ／Ｔ比は１５〜２０：１
）、３Ｈ−チミジン遊離法を用い、Ｍｅｔｈ−Ａ）Ｉｔ
瘍細胞障害性を指標としてマクロファージの活性化能を
検討した。結果を下表に示す。コントロールは生理的食
塩水を０．２ｍｌ用い、試験検体１、試験検体■、及び
対照検体は、５０μｇ／マウスをそれぞれ投与した。

試験検体■、試験検体■、及び対照検体は上記（１）と
同じである。

％サイトドキシシティは、 （各実験値−バンクグラウンド）÷（１００％３Ｈ遊離
−バックグラウンド）　ｘ　１００　　として求めた。

検　　体　　　　　　％サイトドキシシティコントロー
ル　　　　　　　０．５ 試験検体１　　　　　　　１０．３ 試験検体ｎ　　　　　　　　１０．８ 対照検体　　　　　　　　５．７ 本発明の核酸誘導体の強いマクロファージ活性化能が明
らかである。

（７）ＮＫｍ胞への活性化作用 ヒト末梢血中のＮＫ１［１胞に対する活性化作用を、Ｋ
５６２をターゲット細胞とし障害活性を５ｔＣｒのＭ離
去に基づいて測定した。結果を下表に示す。コントロー
ルとして生理的食塩水を用いた。試験検体■、試験検体
■、及び対照検体は上記（１）と同じである。

（以下次頁） 本発明の核酸誘導体のＮＫ細胞への活性化作用が明らか
である。

（８）ｌｌｉｔ瘍細胞増殖阻止作用 株化腫瘍細胞に対する増殖阻止効果を求めた。

細胞（３ＸＩＯ’　ｉｔ！ｊ／ｍｌ）を１０％ＦＣＳを
含む培養液中に検体（１０７ｊｇ　／ｍｌ及び１００μ
ｇ　／ｍｌ）とともに４８時間処理した後、トリチウム
ラベルしたチミジンと２４時間インキュベートする。阻
害％は検体無処理のコントロールに対するチミジンの取
り込み量で表わす。結果を下表に示す。

なお、試験検体Ｉ、試験検体■、及び対照検体は上記（
１）と同じである。

ＲＡＪＩ　　　　６Ｂ、３　５Ｂ、３　６７．８　６１
．５　７４．７　６９．４Ｌ９２９　　　３６．９　３
５．７　３６．８　３４．７　３２．７　２０．５本発
明の核酸誘導体のｌＩｔ瘍細胞増殖阻止作用が明らかで
ある。

（９）担癌マウスにおける腫瘍増殖阻止作用同系移植点
であるＭｅｔｈ−Ａ担癌マウスでの腫瘍増殖阻止作用を
以下の方法で求めた。　Ｍｅｔｈ−Ａ細胞（３ＸＩＯ３
／　０．１ｍ１）を生理食塩水にサスペンドし、Ｂａ１
ｂ／ｃマウス（５週令、雄性）に皮下注射し、２日後か
ら週３回のスケジュールで２週間検体投与を行い、最終
投与の２日後、腫瘍細胞部を摘出、その重量を測定した
。その結果を下表に示す。なお、試験検体Ｉ、試験検体
■、及び対照検体は上記（１）と同じである。

本発明の核酸誘導体の担癌マウスにおける腫瘍増殖阻止
効果が明らかである。

（１０）ヒト腫瘍細胞担癌ヌードマウスにおける増殖阻
止作用 Ｂａ１ｂ／ｃ由来ヌードマウス（５週令、雄性）にヒト
子宮頚部由来細胞株ＨｅＬａ　Ｓ３　、喉頭癌細胞由来
細胞株Ｈｅｐ−２細胞を、各２．５　Ｘ　１０６個を腹
側皮下に移植し、移植後７〜１０日後にｌｉｔ瘍の生着
を確認し、試験検体Ｉ及び試験検体■１００γｇ／マウ
ス（ｉ、ｖ、）　、５−ＦＵ　　２５ｍｇ／ｋｇ　（ｉ
、ｐ、）を週２回、４週間投与した。投与後さらに４週
後の腫瘍を摘出し、重量を測定した。結果を下表に示す
。試験検体Ｉ及び試験検体■は、上記（１）と同じであ
る。

）１ｅｌａ　Ｓ３ 検　　体　　　重量（ｇ　）±Ｓ、Ｅ、　　抑制率（％
）コントロール　　３．８５±０．２３ 試験検体１　　　１．５７±０．１９　　　　５９試験
検体ＩＩ　　　　１．５５±０．２０　　　　６０５−
ＦＵ　　　　　　２．０６±０．３５　　　　４７Ｈｅ
ｐ−２ 試験検体Ｉ　　　　Ｑ、３８±Ｏ，Ｑ７　　　　５７試
験検体ｎ　　　　Ｏ，３５±０．０５　　　　６０本発
明の核酸誘導体の強い増殖阻止作用が明らかである。

（１１）腫瘍細胞の肺転移抑制作用 Ｃ５７ＢＬ　１５マウス（雄性、５週令）に同系可移植
性メラノーマであるＢ１６Ｆ１０細胞２Ｘ１０Ｓ　ｉ固
を静脈内に移植し、移植後２週間後の肺転移部数（コロ
ニー数）をカウントした。検体は８１６ＦＩＯメラノ一
マ移植２４時間前に静脈内投与した。

例数は９であった。結果を下表に示す。試験検体Ｉ、試
験検体■、及び対照検体は上記（１）と同じである。

−：　　Ｐ＜０．０１ 本発明の核酸誘導体の腫瘍細胞肺転移抑制作用が明らか
である。

■のタ　８′　の 本発明の核酸誘導体の安全性について説明する。本発明
の核酸誘導体のひとつである硫化ポリ■・ポリＣ誘導体
について、そのマウスの骨髄幹細胞に対する細胞毒性効
果を求めた。試験検体Ｉ、試験検体■、とした硫化ポリ
Ｉ・ポリＣ誘導体はｎ値が２０．分子サイズが１５０〜
２０００残基数であった。

検体をＢａ１ｂ／Ｃマウス（８週令、雄性、各群５匹）
に、１００μｇ／マウスの量を静注し、２４時間後にそ
のマウスの骨髄細胞を採取した。細胞を固定後、ギムザ
染色した。このスメア標本の細胞を顕微鏡下で観察し、
網状赤血球の出現度を％で算出した。対照検体として既
存のポリＩ・ポリＣを使用した。コントロールには生理
食塩水を投与した。結果を下表に示す。

コントロール　　　４０ 試験検体Ｉ　　　　　３８ 試験検体Ｈ３９ 対照）素体　　　　　１１ 本発明の核酸誘導体の安全性が極めて高いことが明白で
ある。

本発明の核酸誘導体の発熱効果について述べる。

ポリＩ・ポリＣは生体投与すると発熱性のあることが知
られている。ウサギに対する発熱テストの結果、ポリ■
・ポリＣは平均　１．４５℃の体温上昇が見られた。一
方、本発明の核酸誘導体（前記細胞毒性試験と同じもの
）は、Ｓ８体及びＳ−Ｓ体ともに平均　０．２５℃の体
温上昇が認められたに過ぎず、発熱テストはネガティブ
であうた。この実験には一群３匹のウサギを用い、検体
（０，２μｇ／ｋｇ）を１０ｍ１の生理食塩水に熔解し
、ウサギ耳下へ静脈注射後４時間体温を観測して実施し
た。

本発明の核酸誘導体の安全性が極めて高いことが明白で
ある。

次に本発明の核酸誘導体のマウスにおける急性毒性試験
について述べる０通常のｄｄＹマウスでは本発明の核酸
誘導体はその薬物の溶解度の上限によって投与量が限ら
れ、ＬＤｓＯ値は３９４ＩＩＩｇ／ｋｇ以上であった。

なお、検体は、１．ｖ、　１回投与後１週間マウスの生
死によってその効果を判定した。別系統のマウス、Ｃ５
７ＢＬ６及びＢａ１ｂ／Ｃについて行われた同様の試験
においても、本発明の核酸誘導体（前記と同じ）はポリ
Ｉ・ポリＣに比べ毒性が弱いことが判明している。

本発明の核酸誘導体の安全性が極めて高いことが明白で
ある。

ｄｄＹ　　ｉ、ｖ、　　　＞３９４ｍｇ／ｋｇ　　　＞
３９４　　　１３２（以下次頁） （実施例） 以下に本発明の核酸誘導体の製造法に係る実施例を掲げ
て本廃明を更に詳しく説明するが、本発明が実施例のみ
に限定されるものではないことは畝上の記述により明白
である。

実施例 （１）硫化ポリシチジル酸の合成 ポリＣ０，５ｇを水４ｍｌとピリジン２ｍｌの混合溶媒
に溶解し、液化硫化水素５ｍｌとともに３０ｍ１容量の
ステンレス反応管に封入し、３７℃、６時間反応する。

この間の封管圧力は２０〜２２ｋｇ／ｃ己であった。

反応後、反応管を０℃以下に冷却し、圧力を充分に下げ
た後、反応管を開く。過剰の未反応硫化水素を除いた後
、硫化したボ＋Ｊ　Ｃ溶液を５０ｍ１ナスコルに移し、
減圧留去によって未反応硫化水素を更に除去する。得ら
れた溶液を１０２の５０ｍＭ食塩含有のトリスバッファ
（ｐＨ７，５）で３回透析すると透明液体が得られ、更
に凍結乾燥によって０．４７ｇの白色繊維状物質を得た
。

このものの紫外部吸収スペクトルを、中性の水溶液中に
て測定したところ、第１図の結果を得た。シチジル酸の
最大吸収波長は２７１ｎｍであり、シチジル酸のピ、リ
ミジン環の４位の−ＮＨ２基を−ＳＨ基に置換した４−
チオウリジル酸の吸収波長が３３０ｎｍにあることが判
っている。

第１図のピークの高さの比率から、存在するシチジル酸
２０個数に対して４−チオウリジル酸が１個存在してい
ることが判った。

同様の方法によって、ステンレス反応管の反応温度と反
応時間を変化させることにより、以下の表に示す硫化度
をもつ硫化ポリシチジル酸を得た。ここに硫化度はｎを
もって表わし、ｎは１個の４−チオウリジル酸に対して
存在するシチジル酸の個数を表わす。

（２）二重鎖核酸誘導体の製造 上記（１）で得られた硫化ポリＣと、ポリＩとを、当モ
ル量、５０ｍＭ食塩を含むトリスバッファに１０〜２０
ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解し、水浴中で室温か
ら６８℃まで徐々に温度を上げ、６８℃で約１０分間保
温した後、室温になるまで放置した後、４℃で保存する
。

このようにして得られた溶液を凍結乾燥すると、Ｓｉｔ
基を含む核酸誘導体の白色固体が１．２ｇ得られる。

その後、このものにモル比で約１０倍量の１規定ヨード
溶液（１／３モルのヨードと２／３モルのヨウ化ナトリ
ウムとの混合物）を加える。

混合均一化した後、Ｏ′Ｃで１時間放置する。反応液を
水に対してヨードの黄色が消失するまで充分に透析する
。

このようにして得られた溶液を凍結乾燥すると、白色の
固体が０．９８ｇ得られる。

このものがＳ−３架橋を有することは以下のようにして
確認した。このものの０．１ｇを０．０３Ｍの亜硫酸ナ
トリウム含有のトリスバッファ　（ｐＨ７，５）　１０
ｍ１中に溶解し、室温でＯ〜７．５時間おいて各時間に
おける紫外部吸収スペクトルを見た。その結果を第２図
に示す。一般にＳ−Ｓ結合は可逆的であり、還元反応に
よってＳ−Ｓ結合が切れてＳＨ基となる。時間の経過に
よってＳ−３結合に基づく吸収波長である３１０ｎｍの
肩ピークが減少し、代わりにＳＨ基体（４−チオウリジ
ン）の吸収波長である３３０ｎｍの吸収が増加して、７
．５時間後には３３０ｎｍでの吸収度が酸化する前の硫
化ポリＣのそれと一致した。このことから定量的にＳ−
８結合がＳＨ基に還元されたことが明白である。

（３）架橋構造と生物活性 これまでにおいて、硫黄原子を導入ｔｍされた核酸誘導
体のうち、すべてが還元型のＳ）Ｉ基体を有する試験検
体Ｉと、すべてが酸化型のＳ−Ｓ基体を有する試験検体
■の合成法と生理活性について述べた。

ここで述べる核酸誘導体の架橋体は、同一分子内に導入
された硫黄原子の一部が、分子間又は分子間でジスルフ
ィド結合を有する化合物である。

例えば同一分子内に８０％のＳＨ基と２０％のＳ−８基
をもつ架橋誘導体は、全体の２割の部分で多重鎮的架橋
構造を形成することができる。言い換えれば、残基数１
０００のポリＣの場合を例にすると１０箇所でジスルフ
ィド結合をもつ架橋構造をもつことになる。種々の架橋
数をもつ任意の核酸誘導体は、Ｓ８体を緩和条件で部分
的に酸化するかＳ−Ｓ体を緩和条件で部分的に還元する
ことにより容易に得ることができる。合成条件は実施例
で述べた場合と同様である。

ＳＨ基数とＳ−Ｓ基数との比、即ち架橋度は、Ｓ−３基
の３１０ｒ＋ｍとＳＨ基の３３０ｎｍのそれぞれの紫外
部吸収度からそれぞれの分子吸収係数で割った値の比と
して求めることができる。

また別法としては、核酸誘導体をＲＮＡ分解酵素（例え
ばりボヌクレアーゼＰ１）で分解し、その分解物を逆相
系の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、
４−チオウリジン（又は４−チオウリジン酸）とそのジ
スルフィド結合したビス体を分離し定量することにより
求め得る。

生理活性について、架橋度１（Ｓ−Ｓ体１００％、例え
ば試験検体■）から、架橋度０　（ＳＲ体１００％、例
えば試験検体■）までの間にある任意の架橋度を持つ核
酸誘導体は、前述した試験検体工及び試験検体■と同程
度の活性と安全性を示した。

このことは、これらの核酸誘導体が生体内で部分的に酸
化又は還元を受けるものであっても、もとの状態と同じ
安定した生理活性を発揮し続けることができることを示
唆している。

（４）低分子化 上記（２）で得たＳＨ基を含有する核酸誘導体１ｇを水
１２０ｍ１に溶解し、それに５Ｍの食塩水３０ｍ　ｌと
ホルムアミド１５０ｍ１とを加える。激しく攪拌し、均
一溶媒とする。この反応液を８０°Ｃ１８時間加熱した
後、水に対して充分に透析し、凍結乾燥すると白色毛の
固体０．９５　ｇが得られた。

また同条件下において上記（２）で得たＳ−３結合を含
有する核酸誘導体を低分子化すると全く同様の結果が得
られる。

このもののゲル濾過法による高速液体クロマトグラフィ
ー溶出パターンを第３図に示す。条件はＴＳＫ−ｇｅｌ
　Ｇ４０００ＳＷ　　（０，６５Ｘ６０ｃｍ）を用い、
溶出液には０．５Ｍの食塩を含む５０ｍＭ　）リス塩酸
バッファ　（ｐＨ７，５）を使用した。

図中の各矢印はそれぞれの標準サイズマーカー（このサ
イズマーカーの単位はｂｐである）の溶出位置を示して
おり、第３図から、このものは５００残基数付近に最大
分布を持ち、かつ１５０〜１０００残基数までに分布す
る分子サイズを有することが明白である。この結果は、
ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動法
から求めた値とよく一致している。なお、前記したよう
に本明細書においては分子サイズを「残基数」をもって
表現するが、第３図においては「残基数」とｒｂｐＪと
が単位として一致することとなる。

この低分子化反応の反応時間と反応温度とを変化させる
ことにより、同様の方法で以下の分子サイズを有する物
質を得た。

上記実施例によって得た本発明の核酸誘導体のうち、分
子サイズ分布２００〜５０００残基数のもののの融解曲
線を求めた。

試験検体Ｉ又は試験検体ＩＩ　（０，７００／ｍｌ）を
０．１Ｍ食塩含有の１０ｍＭ　）リスバッファ　（ｐＨ
７，５）中で、温度を２０℃から２℃ずつ各４分間の間
隔で９０℃まで上昇させ、それぞれの温度における紫外
部吸収度を２６０ｎｍの波長で測定し、ハイパークロミ
スティーの効果による紫外部吸収度の増加を２０℃の状
態を基とした相対比で表わした。

測定はベフクマンーＤＵ−８Ｂスペクトロフォトメータ
ーを用いた。結果を第４図に示す。

核酸誘導体の融解は３５℃より５５℃間で徐々に見られ
るが、５９℃付近を中心として急激な融解曲線が得られ
る。７０℃以上においてはほぼ曲線はプラトーに達し核
酸誘導体の水素結合による高次構造及びらせん構造の形
成が消失したことを意味している。

５０％融解温度は試験検体Ｉと試験検体■でそれぞれ５
９．５℃及び５９．３℃であった。また９０℃と２５℃
間における２６０ｒ＋ｍでの紫外部吸収度の増減率から
計算すると、ハイパークロミスティー（濃色効果）は試
験検体Ｉと試験検体■とでそれぞれ４３．５％及び４２
．４％であることが判った。このことは、これらの核酸
誘導体が生理的条件下では極めて安定な構造をとってい
ることを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例中（１）で得られた硫化ポリシチジル
酸の紫外部吸収スペクトルを示す。 縦軸は吸収度、横軸は波長（ｎｍ）を表わす。 第２図は、実施例中（２）で得られた本発明の核酸誘導
体の紫外部吸収スペクトルを示す。 これはチオ硫酸ナトリウムによる還元のＵＶパターンで
ある。縦軸は吸収度、横軸は波長（ｎｍ）を表わす。 第３図は、実施例中（３）で得られた本発明の核酸誘導
体の高速液体クロマトグラフィー熔出パターンを示す。 横軸は溶出時間（分）、縦軸は溶出量を表わす。各矢印
は、サイズマーカーの溶出位置を表わす。 第４図は、実施例で得られた本発明の核酸誘導体のうち
、分子サイズ分布が５０−２０００残基数のものの融解
曲線を示す、横軸は温度（’Ｃ）、縦軸は相対吸収度を
表わす。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）核酸ポリマーにおいて、その構成単位であるプリ
   ン環又はピリミジン環の一部を硫黄原子で置換すること
   により、若しくは当該置換された硫黄原子がジスルフィ
   ド結合による架橋を形成することにより、当該核酸ポリ
   マーが高次構造を有することとなったことを特徴とする
   核酸誘導体。
2. （２）核酸ポリマーが、一重鎖リボヌクレオチドポリマ
   ーである特許請求の範囲第１項記載の核酸誘導体。
3. （３）一重鎖リボヌクレオチドポリマーが、ポリＣ中の
   シチジル酸のピリミジン環中の−ＮＨ＿２基を−ＳＨ基
   に置換することによって硫黄原子を含むこととなった４
   −チオウリジル酸を一定の割合で含むポリＣである特許
   請求の範囲第２項記載の核酸誘導体。
4. （４）ポリマーの長さが、塩基数にして５０〜１０００
   ０である特許請求の範囲第３項記載の核酸誘導体。
5. （５）硫黄原子の数が、ポリＣ中に存在するシチジル酸
   数６〜３９に対して１個である特許請求の範囲第３項記
   載の核酸誘導体。
6. （６）硫黄原子の数が、ポリＣ中に存在するシチジル酸
   数６〜３９に対して１個である特許請求の範囲第４項記
   載の核酸誘導体。
7. （７）核酸ポリマーが、一重鎖リボヌクレオチドポリマ
   ーである特許請求の範囲第１項記載の核酸誘導体。
8. （８）二重鎖リボヌクレオチドポリマーが、ポリＣ中の
   シチジル酸のピリミジン環中の−ＮＨ＿２基を−ＳＨ基
   に置換することによって硫黄原子を含むこととなった４
   −チオウリジル酸を一定の割合で含むポリＣと、ポリ
   I とで構成される二重鎖リボヌクレオチドポリマーであ
   る特許請求の範囲第７項記載の核酸誘導体。
9. （９）ポリマーの長さが、塩基数にして５０〜１０００
   ０である特許請求の範囲第８項記載の核酸誘導体。
10. （１０）硫黄原子の数が、ポリＣ中に存在するシチジル
    酸数６〜３９に対して１個である特許請求の範囲第８項
    記載の核酸誘導体。
11. （１１）硫黄原子の数が、ポリＣ中に存在するシチジル
    酸数６〜３９に対して１個である特許請求の範囲第９項
    記載の核酸誘導体。