SE469594B - Nukleinsyraderivat - Google Patents

Description

469 594.

Kibonukleirzsyra (R=OH, R' =H); deoxiribonuldemsyra (R=H, R'=cH3) (5 ' -cytidylsyræ O HN N | H\ :fm HO-P-OH C em 2l(° 71 OHOH (5 ' -inosi_nsyra) 10 15 20 25 30 35 469 594 Som sådana har många RNA-nukleinsyraderivat syntetiserats och deras fysiologiska aktiviteter har studerats.

Poly I.poly C är en substans, som har hög aktivitet, och dess användbarhet har utvärderats och studier har därför utförts.

En förening i vilken endast några få delar av cytidín i poly I-poly C är ändrade till uridin (dvs. icke passande RNA) har studerats p.g.a. att dess fysiologiska aktivitet liknar aktiviteten hos poly I-poly C (jfr. den publicerade japanska patentansökningen 50/082226).

Studier med polycytidylsyra har även utförts och det finns en rapport (brittisk patentansökan 2 038 628), som anger att när merkaptogrupp (-SH) införes (i en mängd av 50 % eller mer) i stället för -NH2-gruppen i pyrimidinringen i polycytidyl- syran ökar den fysiologiska aktiviteten.

De konventionella fysiologiskt aktiva substanserna som givits ovan kan antas ha värdefulla effekter, även om deras toxicitet såsom den manifesterar sig genom poly I-poly C, inte kan för- nekas (Declard et al: Infect. Immuni.. 6, 344, 1972) och det är nödvändigt att göra vissa förbättringar. Det är även önsk- värt att göra deras fysiologiska aktivitet starkare.

Under många års studier av föreliggande uppfinnare har det visat sig att RNA kan, dock helt slumpmässigt, bilda stabili- serade derivat med stor säkerhet genom vissa kovalensbindning- ar. När den fysiologiska aktiviteten hos dem mättes visade det sig att de har mycket starkare aktivitet i jämförelse med de konventionella fysiologiskt aktiva substanserna med mycket låg toxicitet. Dessa stabiliserade derivat utgör föreliggande uppfinning.

Föreliggande uppfinning avser en dubbelsträngad ribonuklein- syra, som kännetecknas av att i nukleinsyrapolymeren är en del av pyrimidinringen, som utgör en enhet därav, substituerad med en (svavel- en eller flera svavelatomer, eller bildar svavelatom atomerna) en eller flera bryggor genom en disulfidbindning. 10 15 20 25 30 35 469 594 4 Nukleinsyraderivat enligt föreliggande uppfinning kan synteti- seras från nukleinsyrabas i vilken SH-grupper kan införas.

Specifika exempel på nukleinsyraderivat enligt föreliggande uppfinning är det som har en komplementär dubbelspíralstruktur till en kedjeförenlng (benämnd 'poly C' i denna beskrivning) som är en cytidylsyrapolymer och en annan kedjeförening (be- nämnd 'poly I' i denna beskrivning) som är en inosinsyrapoly- mer. Aven om denna förening har en struktur liknande den redan givna poly I-poly C har nukleinsyraderivaten enligt förelig- gande uppfinning fortfarande bra egenskaper p.g.a. följande skäl.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning bildar derivat genom partiell substitution med svavelatom (SH-grupp), genom en tvärbindning (S-S-bindning) eller genom en samtidig närvaro av båda substituenterna.

Svavelatomerna i nukleinsyraderivaten enligt föreliggande upp- finning kan införas före eller efter polymerframstâllningen genom användning av en enzymreaktion. Införíngen sker genom att substítuera nukleínsyrabasen med -SH-gruppen så att en -NH2-grupp i en pyrimidínring i cytidylsyra ersättes med en -SH-grupp. Substituentresten benämnes 4-tíouridylsyra. 3 HN/j 0 in* u O Ho-e-onzc 0 1 on oH oH 5'-4-tiouridylsyra Den införda -SH-gruppen oxideras vidare med en lämplig metod som anges nedan så att S-S-bindningsbryggan kan bildas.

Derivat som har både SH- och S-S-grupper i en molekyl kan framställas antingen genom partiell oxidation av en förening, 10 15 20 25 30 35 5 469 594 vari -SH införes, eller genom en partiell reduktion av en _förening, vari S-S införes.

Den ovan nämnda nukleinsyrapolymeren (poly C) har en enda sträng. Den enkelsträngade nukleinsyrapolymeren kan efter bildning av HS-substitutionen eller S-S-bindningsbryggan associeras med en komplementär enkelsträngad nukleinsyrapoly- mer med en lämplig metod, som nämns här nedan, så att multipla strängar bildas. Omvänt är det också möjligt att den först svavelbehandlade enkelsträngade nukleinsyrapolymeren förenas med den komplementära nukleinsyrapolymeren för att bilda multipla strängar, följt av oxidation för framställning av S-S-bindningsbryggan. De så framställda nukleinsyraderivaten faller även inom ramen för de nukleinsyraderivat, som har fysiologisk aktivitet, och är föremål för föreliggande upp- finning. Sålunda inkluderas alla nukleinsyrapolymerer i före- liggande uppfinning så länge som de innehåller nukleinsyra- baser i vilka -SH-grupper införts. De föreningar, som erhålles genom disulfidering av nukleinsyrapolymerer, som innehåller 4-tiouridin, 2-tiouridin, 2-tioguanosin. 6-merkaptopurin, 8-merkaptopurin etc. inkluderas t.ex. i föreliggande uppfin- ning.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggand euppfinning kan spal- tas vid sina fosforsyrasidokedjor och ge föreningar med lägre molekylvikt, och sådana lågmolekylära föreningar inkluderas även i föreliggande uppfinning. I detta hänseende föreligger följaktligen en skillnad till den konventionella poly I-poly C.

På grund av egenskaperna hos nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning, dvs. substitution med SH, bildning av tvärbindning genom S-S-bindning och bildning av lågmolekylära substanser genom spaltning av fosforsyrasidokedjan, är det för första gången möjligt att erhålla fördelarna med föreliggande uppfinning, som består i att (l) den fysiologiska aktiviteten kan ökas och (2) säkerheten kan ökas.

Den fysiologiska aktiviteten hos nukleinsyraderivaten enligt 10 15 20 25 30 35 469 594 6 föreliggande uppfinning gör att dessa är värdefulla som läke- medel. Såsom beskrives nedan har nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning en stark verkan som interferoninduce- rare. Denna verkan är endast en av många fysiologiskt aktiva verkningar hos nukleinsyraderivaten enligt föreliggande upp- finning. När det gäller de fysiologiska verkningarna hos nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning kan flera verkningar anges såsom nämns nedan. Bland dem är förmågan att bilda TNF, förmågan att bilda interleukin l, förmågan att bilda interleukin 2, förmågan att aktivera makrofag, förmågan att aktivera NK-cell, inhiberande verkan på proliferation av tumörceller, inhiberande verkan på proliferation av tumör- celler i cancerbärande möss. inhiberande verkan på prolifera- tion i naken mus, som bär cancer från humana tumörceller, förhindrande verkan på metastasbildning av tumörceller till lungor etc.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning är säkrare i jämförelse med interferoninducerande substanser såsom kon- ventionell poly I-poly C. Föreningarna enligt föreliggande uppfinning är följaktligen värdefulla som antiviruella medel och antitumörmedel.

Uttrycket 'baspar' (förkortat som 'bp') användes ofta för att indikera molekylstorleken hos nukleinsyra och avser att ange molekylstorleken med antalet baser i nukleinsyran (t.ex. avser 10 bp den dubbelsträngade polymeren med 10 baser) i varje komplementär sträng. Eftersom nukleinsyrapolymerer andra än dubbelsträngade polymerer även avses enligt föreliggande beskrivning kommer uttrycket 'resttal' att användas i stället för bp. T.ex. avser '10 resttal' nukleinsyrapolymeren med 10 baser i en sträng.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning innehåller substanser med olika molekylstorlekar och det föredrages all- mänt att storleken inte är mindre än 50 resttal. t.ex. 50 till l0 000 resttal. Storleken kan t.o.m. vara mycket större, t.ex. 200 000 resttal är även möjligt, och det har visat sig att 10 15 20 25 30 35 7 469 594 molekylstorleken har litet inflytande på den fysiologiska aktiviteten hos föreningarna enligt föreliggande uppfinning.

När antalet svavelatomer i nukleinsyraderivaten enligt före- liggande uppfinning anges utnyttjas försvavlíngsgraden (n) i denna beskrivning. Cytidylsyra förändras till 4-tiouridylsyra genom substitutíon av gruppen -NH i pyrimidinringen med gruppen -SH, och 'n" anger antaleš cytidylsyror. som förelig- ger (4-tiouridylsyra). Nukleinsyraderivaten enligt föreliggan- de uppfinning innehåller substanser med många slags 'n' och det föredrages att detta n inte är mindre än 6. När n är mindre än 6 har det bekräftats att den fysiologiska aktivi- teten sjunker. När n är 6 eller större föreligger inte någon ytterligare begränsning, och det kan vara så många som 99, och det föreligger litet inflytande av n på den fysiologiska akti- viteten hos föreningarna enligt föreliggande uppfinning.

Vid framställning av nukleinsyraderlvaten enligt föreliggande uppfinning kan flera metoder användas. Poly C och liknande. som är utgângsmaterial enligt föreliggande uppfinning, är lättillgängliga. Poly C kan lätt försvavlas genom t.ex. om- sättning med försvavlande medel såsom vätesulfid. Som ett resultat av denna reaktion kan ett visst antal cytidylsyror i poly C förändras till 4-tiouridylsyra. När reaktionsbetingel- serna såsom reaktionstemperatur och reaktionstid varieras kan poly C med önskade 'n'-värden framställas.

Den försvavlade poly C kan förenas med poly I, som är lättill- gänglig med kända metoder. Den försvavlade poly C-poly I, erhållen som sådan, kan införas i nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning med en disulfidalstrande reaktion såsom t.ex. oxidation med jodreagens.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning kan erhål- las nästan kvantitativt med ovanstående metoder och det har visat sig att det totala utbytet är ca 90 %.

När det gäller syntes av andra nukleinsyror såsom poly A- 10 15 20 25 30 35 469 594 8 -poly U med disulfidbrygga framställes först polymeren med en enzymreaktion med användning av en nukleinsyrabas innehållande svavelatom däri. Konventionella metoder för framställning av heteropolymerer kan tillämpas.

Vanliga exempel är att när 36 mM av uridin-5'-difosfayt (UDP) och 7 mH 4-tiouridin-5'-difosfat (4-SDH UDP) brlngas att om- sättas vid 37°C under 5 timmar i 150 mH trisbuffert (pH 8.2) med användning av 0.5 enhet/ml polynukleotidfosforylas (PNP-ase, typ 15, PL, Biochemical) erhålles en heteropolymer, vari en 4-tiouridin föreligger per 13 urídinrester med ca 50-procentigt utbyte. När 2-tiouridin-5'-difosfat användes i stället för 4-tiouridindifosfat erhålles en poly U innehållan- de 2-tiouridin.

När en gång en nukleinsyrapolymer innehållande HS-grupper framställes som sådan kan följande derivat erhållas med samma förfarande som när försvavlad poly I-poly C erhålles såsom beskrives i exemplen. Närmare specifikt upplöses både försvav- lad polyuridylsyra och ekvimolär polyadenylsyra i neutral vattenlösning och utsättes för en återbildning av vätebryggor för komplexbildning.

Sålunda efter upplösning i vatten i en inkubator ökas tempera- turen gradvis till 85°C, varefter värmes under 10 minuter och man låter det hela stå vid rumstemperatur.

Det så erhållna komplexet oxideras under samma betingelser som vid disulfidbindningen av poly I-poly C, dvs. oxideras med 1 N -jodlösning för framställning av poly A-poly U-derivat med en- disulfidbrygga. Utbytet efter âterbildningen av vätebindningar är ca 80 %. och det totala utbytet är ca 40 %.

Disulfidkomplexet dialyseras väl till en vattenlösning och lyofiliseras för att ge vit och fibrös fast substans.

Det är inte alltid klart vilken sterisk struktur som förelig- ger i nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning vid deras karakteristiska S-S-bindning. 10 15 20 25 30i 35 9 469 594 Nukleínsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning har en viss tydligt smältande kurva såsom beskrives senare och det är följaktligen uppenbart att de har stabila fundamentala struk- turer.

Den 50-procentiga smälttemperaturen (Tm-värde) är 59,0°C för poly I-poly C under neutrala betingelser i närvaro av 0,1 H natrium under det att vid fall av SH-substituerat nukleinsyra- derivat, som innehåller 4-tiouridin i en grad om n=20 och S-S-substituerad nukleínsyraderivat därav är värdena 59,5°C och 59,3°C och följaktligen är de stabiliserade i samma ut- sträckning eller mer. När det gäller OH-substituerat nuklein- syraderivat, som innehåller uridín i en mängd av n=20. samma som ovan, ligger värdet så lågt som 53,l°C.

Introduktionen av svavelatomer är sålunda mer effektiv att stabilisera den högmolekylära strukturen hos nukleinsyra i jämförelse med andra substituerade derivat såsom dem, som är substituerade med NH eller med OH. 2 Sedan jämfördes motståndet mot hydrolys genom RNA-ase A (ett enzym, som bryter ned RNA) i form av tidsförhållandet tills nedbrytningen uppnår 50 %. Under vissa enzymatiska reaktions- betingelser var värdet för poly I-poly C 50 minuter, under det att värdet för 4-tiouridin (SH-grupp) och dess nukleinsyra- derivat (n=20, innehållande S-S) är 60 minuter och i motsats härtill värdet för nukleinsyraderivat (n=20) innehållande uridín (OH-grupp) var så lågt som 20 minuter. Det är därför tydligt att svavelatomer utövar substituerande effekt även när det gäller biokemisk stabilitet.

När nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning admi- nistreras som läkemedel ges de som de är eller som en farma- ceutisk komposition innehållande t.ex. 0,1 till 99,5 % (före- trädesvis 0,5 till 90 %) av ingrediensen i farmaceutiskt godtagbar och icke toxisk och inert bärare till djur inklude- rande människor. 10 15 20 25 30 35 469 594 10 När det gäller bärare kan en eller flera vätskeformiga, fasta eller halvfasta utdrygningsmedel, fyllmedel och andra hjälp- substanser för farmaceutiska beredningar användas. Det är önskvärt att de farmaceutiska kompositionerna administreras i enhetsdosform. Nukleinsyraderivat enligt föreliggande uppfin- ning kan ges via mun, vävnad, lokalt, rektum. De ges natur- ligtvis i lämpliga former för varje administreringssätt. T.ex. ges de som oral administreringsform. injektion, inhalering, ögondroppar, salva. suppositorium etc. Speciellt föredrages vävnad eller lokalt.

Det är önskvärt att dosen som läkemedel för malign tumör reg- leras genom att betrakta patientens status (t.ex. ålder, kroppsvikt etc.), administreringssätt och slaget och graden av sjukdom. I allmänhet användes 0.05 till 1000 mg per gång som en effektiv mängd av nukleinsyra enligt föreliggande uppfin- ning till vuxna och företrädesvis är 0,5 till 50 mg intravenös infusion vanlig. I vissa fall är en lägre dos tillräcklig och i vissa andra fall kan högre doser erfordras. Det är även möj- ligt att administreringen tillämpas en eller flera gånger per dag eller med ett uppehåll på en till flera dagar.

Dos för behandling av benign tumör eller för sjukdomar orsaka- de av virus regleras företrädesvis genom att betrakta slaget och graden av sjukdom. administreringssättet, patientens tillstånd etc. och det är i allmänhet vanligt att dosen är densamma till ca 1/5 av dosen för en maligna tumören ovan.

Nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning har föl- jande fysiologiska aktiviteter: (1) Interferon-inducerande aktivitet: Hed referens till försvavlat poly C-poly I-derivat, som är ett av nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning, be- stämdes dess verkan som interferon-inducerare med en analys- metod för antiviruell aktivitet. Det som prov I använda för- svavlade poly C-poly I-derivatet för testet är ett SH-substi- tut under det att prov II är ett S-S-substitut. Båda har ett 10 15 20 25 30 35 11 469 594 n-värde om 13 och med resttal i molekylstorleken på 50 till 2000.

Lymfocyter (106 celler per ml) erhållna från humant perifert blod behandlades 2 timmar med provet (10 mikrogram/ml) i en odlingsvätska (RPMI 1640; 20 % FCS). Den omsatta odlings- vätskan avlägsnades, cellerna flotterades igen i en nyberedd odlingsvätska (RPMI 1640; 20 % FCS), inkuberades 20 timmar och övervätskan utsattes för en vanlig mätníngsmetod med avseende på interferon-antivirusaktivítet med användning av sindbi's virus och FL cell (jfr. Rlncho Kensa, gg, 1726, 1984). Resul- taten återges i nedanstående tabell. Interferontitern mättes genom en spädningskoncentration med användning av en CPEISO (cytopatogen effektinhibering 50) metod. Prov I är ett S-H- -substituerat nukleinsyraderivat innehållande 4-tiouridin i en grad av n=2O under det att prov II är dessS'S-substitut. Kon- ventionell poly I-poly C användes som ett kontrollprov.

Koncentrationer (mikrogram/ml) 10 100 200 500 Testprov I 100 >6400 >6400 >6400 Testpzov II 100 >6400 >6400 >6400 Kontrollprov 100 800 1600 >6400 (Interferontiter: enheter/ml) Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning har stark verkan som en interferoninducerare.

Bland de försvavlade poly C-poly I-derivaten av nukleinsyra- derivaten enligt föreliggande uppfinning, som erhålles i det exempel, som ges nedan, användes ett med n-värdet 20 och mole- kylstorleken 50 till 300 resttal och ett annat med n-värdet 20 och molekylstorleken om 200 till 2000 resttal som testprover och utsattes för samma fysiologiska aktivitetstest och gav samma resultat. Samma resultat erhölls även med nukleinsyra- 10 15 20 25 30 35 469 594 12 derivatet (n-värdet 20 och molekylstorleken inte mindre än 20 000 resttal) före låg-molekyläriseringen. (2) TNF (tumörnekrosfaktor)-inducerad aktivitet Groende vesikelmakrofag från kaniner förbehandlade med BCG 10 och 14 dagar tidigare togs ut, justerades till 2xl06 per ml i ett 10-procentigt FCS-haltigt RPMI 1640-medium. l ml därav placerades i en plastskål och odlades i en inkubator med kol- díoxidgas (5 % C02) i närvaro eller frånvaro av provet vid 37°C.

Cellodlingens övervätska efter 2 till 8 timmar utsattes för TNF-aktivitetstest. Resultatet återges nedan. TNF-aktivitet- värdena bestämdes genom mätning av den cellhindrande aktivite- ten för LH-cell efter 72 timmar med användning av färgintag- ningsmetoden och utspädning till 50 % cellhindring indikerades som en titer. Det faktum att denna cellhindring berodde på TNF bekräftades med användning av en monoklonal antikropp mot kanin-TNF, genom dess aktivítetsneutralisering.

TNF-aktivitet Neutralisering med (2 tim) (8 tim) anti-TNF-antikropp Kontroll - - - LPS 32 >64 + Testprov I 32 >64 + Testprov II 32 >64 + Kontrollprov 32 >64 + LPS användes i en koncentration av 1 mikrogram/ml. och test- och kontrollproverna förelåg vid samma koncentration om 10 mikrogram/ml. De använda test- och kontrollproverna var de- samma som i (1). Det är tydligt att den TNF-inducerande akti- viteten hos nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfin- ning är stark. (3) DNF-inducerande aktivitet in vivo Heth A-tumör (2xlO5) transplanterades bakom bukskinnet på 10 15 20 25 30 35 13 469 594 BALB/c möss (6 till 8 veckor gamla, hannar). Läkemedel gavs på den 2:a och 12:e dagen efter transplantering. Blod togs ut l timme efter den andra administreringen, och TNF-aktiviteten i serum mättes. Nekrosfenomenet vid den cancerbärande delen skedde därefter och observerades ocksâ. Resultaten återges nedan. Värdena i tabellen var samma titer, som användes ovan (2).

Behandlingar TNF-aktivitet (lza) (2:a) i serum Nekros BCG LP 192 observerad BCG Testprov I 48 ” BCG Testprov II 50 ' BCG Kontrollprov 24 ' Testprov I, testprov I 12 ' Testprov II. testprov II 24 ' Både test- och kontrollprover var desamma som ovan (1). Det är tydligt att den TNF-producerande förmågan in vivo hos nuklein- syraderivaten enligt föreliggande uppfinning är stark. (4) Inducerande aktivitet för interleukin l.

Normalt humant heparinförsatt perifert blod separerades från mononukleära partiklar genom metoden med specifik densitets- centrifugering med användning av Ficoll-Hypaque (Farmacia.

Ficoll-paque, handelsnamn), antalet justerades till 5xl06/ml i ett 10-procentigt med FCS-försatt RPMI-medium, placerat i en plastskål, inkuberades vid 37°C under l timme och de kohesiva cellerna användes som en interleukin l-producerande källa.

Läkemedel sattes till de 5xl05/ml av enskilda partiklar, inkuberades vid 37°C under 24 timmar och interleukin 1-aktivi- teten i övervätskan bestämdes genom mätning av 3H-tymidin- -intagmetoden i en PHA-stimulerad mustymus med användning av tymuscellernas prolifererande förmåga som målobjekt. Resulta- ten âterges i följande tabell. Kontrollen var fysiologisk 10 15 20 25 30' 469 594 14 koksaltlösníng. Koncentratíonen av interleukin var 1,25 en- heter/ml och koncentrationen av testproverna I och II och kontrollprovet var 100 g/ml. Testproverna I och II och kontrollprovet var desamma som användes ovan under (1).

Använda prover Intagen mängd (DPH (XIO4) ) Kontroll 3370 Testprov I 11384 Testprov II ll560 Kontrollprov 8397 Interleukin l 12517 Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning har stark interleukín l-inducerande aktivitet. (5) Inducerande aktivitet från interleukin 2.

Lymfpartiklar erhållna från mjältceller från BALB/c-möss användes som en källa för produktion av interleukin 2.

Till 5x106/ml lymfpartiklar sattes läkemedlet. blandningen inkuberades vid 37°C under 24-48 timmar och interleukin 2- -aktiviteten i övervätskan bestämdes med en 3H-tymidín-in- korporeringsmetod med användning av CTLL-2 eller NK-7, som är cellstamprolifererande beroende på interleukin 2 med använd- ning av den prolifererande förmågan som mâlobjekt. Resultaten återges i följande tabell. Kontrollen är fysiologisk koksalt- lösning. Interleukin 2 förelåg I en koncentration om 5 enhe- ter/ml och båda testproverna I, II och kontrollproverna-var samma koncentration om 100 gamma/ml. Test- och kontrollpro- verna var desamma som användes under (1). 10 15 20 25 30 35 469 594 15 Prover Inkorporerad mängd (DPM (xl039) ) Kontroll 230 Testprov I 3247 Testprov II 3320 Kontrollprov 653 Interleukin 2 3778 Det är tydligt att nukleinsyraderívatet enligt föreliggande uppfinning utövar stark interleukin 2-inducerande aktivitet. (6) Hakrofagaktívering Prover administrerades till Balb/c-möss (7-10 veckor gamla. hannar) intraperitonealt, celler uttagna från peritoneum 3 till 5 dagar efter administreringen uppsamlades, plast-kohe- siva celler (huvudsakligen makrofag) separerades som effektor- celler, och makrofagaktiveringen undersöktes med en 3H-tymi- dinisoleringsmetod med användning av Heth-A-tumörcell som mål- objekt (varvid E/T-förhållandet var 15-20:l). Resultatet åter- ges i följande tabell. Kontrollen var 0,2 ml fysiologisk kok- saltlösning. Vardera 50 mikrogram/mus av testprov I, II eller kontrollprov administrerades. Test- och kontrollproverna var desamma som användes under (1). % cytotoxicitet beräknades genom: (experímentvärde) - (bakgrund) 3 x 100' (100 % H frígivning) - bakgrund) Prover % cytotoxicitet Kontroll 0,5 Testprov I 10,3 Testprov II 10.8 Kontrollprov 5.7 Det är tydligt att nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning har stark makrofagaktivitet. 10 15 20 25 30 35 469 594 16 (7) NK-cellaktívering Aktiveringen av NK-celler i humant perífert blod bestämdes genom mätning av den hindrande aktiviteten med användning av K562 som mâlcell med en ísoleríngsmetod med 5lCr. återges nedan. Den använda kontrollen var fysiologisk koksalt- lösning. Test- och kontrollproverna var desamma som ovan under l Resultaten Cr-isolering) (1).

Prover (mikrogram/ml) Smält % (% 5 Kontroll 30 Testprover I ( 10) 47 ( 30) 55 (100) 57 (300) 50 (500) 30 Testprover II ( 10) 51 ( 30) 59 (100) 63 (300) 60 (500) 45 Kontrollprover ( 10) 52 ( 30) 60 (100) 65 (300) 62 (500) 52 Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande' uppfinning utövar NK-cell-aktivering. (8) Inhíberande verkan på proliferation av tumörceller Inhiberande verkan på proliferation av cellinje av tumörceller mättes. Celler (3xl04/ml) behandlades 48 timmar i en od- lingsvätska innehållande 10 % PCS tillsammans med prover (10 mikrogram/ml och 100 mikrogram/ml) och inkuberades sedan 48 timmar med tritiummärkt tymidin. Inhibitionsprocenten erhölls 10 15 20 25 30 469 594 17 med en inkorporerad mängd av tymidin i förhållande till en kontroll, som inte behandlades med provet. Resultatet återges nedan. Testet och kontrollproverna var desamma som dem ovan (1)- Inhibiberíng % Kontrollprover Celler Test Prov I Test Prov II 100 10 mikrogram/ml NAMALWA 65,6 55,7 61,2 46,4 56,9 37,4 RAJl 68,3 64,6 67,8 61,5 74,7 69,4 L929 36,9 35,7 36,8 34,7 32,7 20,5 RAMOS 40,8 42,2 45,5 40,5 40,1 52,4 Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning utövar lnhlberande verkan på proliferation av tumörceller, (9) Inhiberande verkan pâ proliferatlon av tumör 1 cancer- bärande möss.

Den inhiberande verkan för tumörproliferering mättes med föl- jande metod i Meth-A-cancerbârande möss som är samma typ av transplanterad cancer. Meth-A-cell (3xlO5/0,1 ml) suspende- rades 1 fysiologisk koksaltlösníng, som ínjicerades med nål i Balb/c-möss (5 veckor gamla, hannar) och efter 2 dagar star- tade administreringen av läkemedlet tre gånger per vecka under två veckor. På den andra dagen efter slutadminístrering togs tumörceller ut och vikten mättes. Resultaten återges nedan.

Test- och kontrollproverna var samma som ovan under (1). 10 15 20 25 30 35 469 594 18 Prov (mikro- Antal Medelvärde ¿ stan- Inhibering % gram/mus) möss dardavvikelse Testprov I ( 10) 7 2,09 i 0.15 3 ( 30) 7 1.52 ¿ 0.28 30 (100) 5 0,96 ¿ 0,43 56 Testprov II ( 10) 7 2,10 i 0,27 ( 30) 7 1,62 ¿ 0,25 (100) 7 0,97 i 0,30 Kontrollprov ( 10) 8 2,12 ¿ 0,27 2 ( 30) 8 1,38 i 0.27 36 (100) 8 1,08 i 0,27 50 Det är tydligt att nuklelnsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning inhiberar prolifererlngen av tumörceller i cancer- bärande möss. (10) Inhíberande verkan pâ proliferering 1 nakna möss, som bär cancer från humana tumörceller.

Vardera 2.5x106 av cellstam HeLa S3 härledd från human uterushals och cellstam Hep-2 härledd från strupcancercell transplanterades under skinnet på buken och på den 7:e till 10:e dagen efter transplantationen bekräftades levande tumör- kohesíon. Därefter adminístrerades 100 ng/mus av testprovet (intravenöst) och 25 mg/kg av 5-FU (intraperitonealt) tvâ gånger per vecka under fyra veckor. Tumören extraherades på den fjärde veckan efter administreringen och vikten mättes.

Resultaten återges i följande tabell. Det använda testprovet var samma som det ovan under (1). 7 I (HeLa S3) Prov Vikt (g) i standardavvikelse Inhiberingsgrad (%) Kontroll 3.85 i 0,23 -- Testprov I 1.57 i 0.19 59 Testprov II 1.55 i 0.20 60 5-FU 2.06 i 0.35 47 10 15 20 25 306 35 469 594 19 (HeP-2) Prov Vikt (g) i standardavvikelse Inhiberingsgrad (%) Kontroll 0,88 i 0,07 -- Testprov I 0,38 i 0,07 57 Testprov II 0,35 ¿ 0,05 60 5-FU 0.56 i 0.12 36 Det är tydligt att nukleínsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning utövar stark inhiberande verkan på proliferationen. (ll) Inhíberande verkan mot metastaser av tumörceller till lunga.

Till C57BL/6 möss (hane. 5 veckor gammal) transplanterades 1 en intravenös ven 2xl05 Bl6FlO-celler som är transplanter- bart melanom av samma slag och antalet knölar, som flyttades till lungan (antalet kolonier) räknades den andra veckan efter transplantationen. Provet admínistrerades intravenöst 24 tim- mar före transplantationen av Bl6FlO-melanom. Antalet fall var 9. Resultaten återges nedan. De använda test- och kontroll- proverna var desamma som ovan under (1).

Antalet knölar, som flyttats till Prov (mikrogram/mus) lungan i standardavvikelse Kontroll gl A_ ll2 i 17 Testprov I ( 1) 33 i 6* ( 10) 21 i 10* (100) 4 i 2* Testprov II ( 1) 21 i 6* ( 10) 15 ¿ 4* (100) 4 ¿ 1* Kontrollprov ( 1) 36 i 16* ( 10) ¿ 0.7* (100) i 3* 10 15 20 25 30 35 469 594 20 Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning har inhiberande verkan mot metastaser av tumör- celler till lunga.

Säkerheten med nukleinsyraderivaten enligt föreliggande upp- flnning: Säkerheten med nukleinsyraderivaten enligt föreliggande upp- finning illustreras här nedan. Svavelbehandlad poly C-poly I- -derivat av ett av nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning togs ut och dess cytotoxiska effekt på benmärg- huvudceller undersöktes. Det använda försvavlade poly C- -poly I-derivatet hade ett n-värde om 20 och molekylstorlek om 150-2000 rester.

Provet ínjícerades intravenöst till möss (8 veckor gamla. hannar, varje grupp omfattar 5 möss) i dosen om 100 mikro- gram/mus och efter 24 timmar uppsamlades benmärgsceller från dem. Cellerna fixerades och fârgades med Giemsa. Celler av det utstrukna provet observerades med ett mikroskop och graden av uppträdandet av retikulocyter räknades i %. Känt poly I-poly C användes som en kontroll. Fysiologisk koksaltlösning admi- nistrerades till kontrollen. Resultaten återges i följande tabell.

Erytrocytceller (%) Kontroll 40 Testprov I 38 Testprov II p 39 Kontrollprov ll Det är tydligt att nukleinsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning har hög säkerhet.

Nedan skall den pyrogena effekten av nukleinsyraderivaten en- ligt föreliggande uppfinning förklaras. 10 15 20 25 30 35 21 469 594 Injektion av poly I-poly C in vivo har varit känd för att vara pyrogen. Som ett resultat av ett pyrogent test med kaniner har det visat sig att poly I-poly C ger l.45°C ökning i medeltal av kroppstemperaturen. A andra sidan visar nukleinsyraderiva- ten enligt föreliggande uppfinning (både SH- och S-S-substan- ser i ovanstående cytotoxiska experiment) endast 0,25°C ökning i kroppstemperatur i medeltal, och resultatet av det pyrogena testet var negativt. I dessa experiment användes tre kaniner per grupp och en lösning av provet (0,2 mikrogram/kg) i 10 ml fysiologisk koksaltlösning injicerades intravenöst under örat på kaninerna och kroppstemperaturen observerades 4 timmar efter injektionen.

Det är tydligt att nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning har mycket hög säkerhet.

Resultaten av akut toxicitetundersökning med nukleinsyraderi- vaten enligt föreliggande uppfinning återges enligt följande.

Med referens till normala ddY-möss begränsas dosen av nuklein- syraderivatet enligt föreliggande uppfinning genom den övre gränsen av lösligheten hos det givna läkemedlet, och LD50- -värdet var inte mindre än 394 mg/kg. Effekten bedömdes av det faktum vare sig musen var död eller levande en vecka efter den intravenösa injektionen. Liknande test med användning av andra mösstammar (C57BL6 och Balb/c) ger också resultatet att nuk- leinsyraderivatet (detsamma som ovan) enligt föreliggande upp- fínning har svagare toxicitet än poly I-poly C.

Det är tydligt att säkerheten med nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning är mycket hög.

LD50 Stam Administreringssätt Testprov I Testprov II Kontrollprov ddY intravenöst >394 mg/kg >394 mg/kg 132 mg/kg 10 15 20 25 30 35 469 594 22 (Utföringsexempel) Föreliggande uppfinning skall belysas ytterligare med exempel avseende framställningsmetoden för nukleinsyraderivaten enligt föreliggande uppfinning och det skall framhållas att förelig- gande uppfinning inte är begränsad till dessa.

Exempel (1) Syntes av försvavlad polycytidylsyra Poly C (0,5 g) upplöstes i ett blandat lösningsmedel av 4 ml vatten och 2 ml pyridin, och lösningen placerades i ett 30 ml reaktionsrör av rostfritt stål tillsammans med 5 ml vätskefor- mig vätesulfíd och bringades till omsättning vid 37°C under 6 timmar. Trycket i det förslutna röret under omsättningen var 20 till 22 kg/cmz.

Efter omsättningen kyldes reaktionsröret till 0°C eller lägre för att minska trycket tillräckligt, och reaktionsröret öppna- des. Ett överskott av icke omsatt vätesulfid avlägsnades, den försvavlade poly C-lösningen överfördes till en 50 ml rund kolv, och icke omsatt vätesulfid avlägsnades i vakuum. Där- efter dialyserades den resulterande lösningen tre gånger mot Tris-buffert (pH 7,5) innehållande 10 l 50 mH natriumklorid, och den resulterande transparenta vätskan lyofíliserades ytterligare och gav 0,47 g vit fiberaktiv substans.

Den resulterande substansens UV-spektrum uppmättes i en neut- ral vattenlösning och gav resultatet enligt fig. l. Det är känt att den maximala absorptionsvâglängden för cytidylsyra är 271 nm och att absorptionsvâglängden för 4-tiouridylsyra, vari gruppen -NH2 föreligger i 4-ställning i pyrimidinringen i cytidylsyran, substituerats med gruppen -SH framgår vid 330 nm.

Av förhållandet mellan höjderna på topparna i fig. 1 har det bekräftats att det föreligger en 4-tiouridylsyra per 13 cyti- dylsyror.

Pâ samma sätt varierades reaktionstemperaturerna och reak- 10 15 20 25 30 35 469 594 23 tionstiden i det rostfria röret, och försvavlade polycytidyl- syror med sulfateríngsgraderna enligt följande tabell erhölls.

Sulfateringsgraden återges med "n" och detta ”n” avser antalet cytidylsyror per en 4-tiouridylsyra.

Reaktíonstemp. Reaktionstid n 45°C l2 timmar 45 6 ' 6 ¿ 1 37 6 ' 13 i 2 37 4 ' 26 i 2 37 2,5 ' 39 ¿ 2 (2) Framställning av nukleinsyraderívat med dubbel sträng: Poly I och försvavlad poly C erhållen enligt ovan (1) upp- löstes i samma molmängd i en Tris-buffert innehållande 50 mM natriumklorid så att koncentrationen blev 10-20 mg/ml och temperaturen höjdes gradvis i vattenbadet från rumstemperatur till 68°C. Blandningen upprätthölls vid 68°C under 10 minuter, fick stå tills den antog rumstemperatur och lagrades vid 4°C.

Den resulterande lösningen lyofiliserades och gav 1,2 g nuk- leinsyraderivat med SH-grupper i vit fast substans.

Därefter försattes detta med ca 10 gånger volymen (mo1förhål- lande) av lN jodlösning (en blandning av 1/3 mol jod och 2/3 mol natriumjodid). Blandningen blandades väl så att den blev homogen och fick stå vid 0°C under l timme. Reaktíonslösningen dialyserades väl mot vatten tills den gula färgen från jod försvann.

Den så erhållna lösningen lyofiliserades och gav 0,98 g vit fast substans.

Det faktum att den resulterade fasta substansen innehåller en S-S-bindning bekräftades på följande sätt. 0,1 g av denna fasta substans upplöstes i 10 ml Tris-buffert (pH 7,5) inne- 10 15 20 25 30 35 469 594 24 hållande 0,03M av natriumsulfit, lagrat vid rumstemperatur från 0 till 7,5 timmar, och det ultravioletta absorptions- spektrat observerades vid varje tidpunkt. Resultatet återges i fig. 2. Det är känt att S-S-bindningen i allmänhet är rever- sibel och att S-S-bindningen spaltas genom reduktion, vilket ger en grupp -S-H. Under tidens gång sjunker en tröskeltopp vid 310 nm, som är en absorptionsvåglängd p.g.a. S-S-bindning- en under det att en absorption vid 330 nm, som beror av HS- -substans (4-tiouridin) ökar och efter 7,5 timmar är graden av absorption vid 330 nm identisk med den för den försvavlade poly C före oxidatíonen. Det är därför självklart att S-S- -bindningen kvantitativt reducerats till HS-grupp. (3) Tvärbindningsstruktur och biologisk aktivitet Bland nukleinsyraderivaten i vilka svavelatomer införes var de syntetiska metoderna och fysiologiska aktiviteterna hos test- prov I (med alla grupper av reducerad typ SH) och testprov III (med alla oxiderade grupper av typ S-S) såsom beskrivits här ovan. Tvärbindningssubstanserna av nukleinsyraderivaten, som beskrivits häri, och de föreningar vari en del av svavelato- merna införes i samma molekyl, har en disulfidbindning mellan eller i molekylerna.

De tvärbindande derivaten med 80 % HS-grupper och 20 % S-S- -grupper i samma molekyl kan t.ex. bilda en multisträngad tvärbindningsstruktur i 20 % av hela delen. När det med andras ord t.ex. gäller poly C med 1000 b.p. har den en tvärbind- ningsstruktur vid 10 delar. Vilket nukleinsyraderívat som helst med olika tvärbindningstal kan lätt framställas genom en partiell oxidation av HS-substansen under en mild betingelser eller genom en partiell reduktion av S-S-substansen under en mild betingelse. De syntetiska betingelserna är desamma som beskrivits i exemplen.

Förhållandet mellan HS~grupptal och S-S-grupptal, dvs. graden av tvärbindning, kan beräknas som ett förhållande mellan de värden, som erhålles genom att dividera U.V.-absorbanserna vid 310 nm för S-S-gruppen och 330 nm för HS-gruppen resp. med de molekylära absorptionskoefficienterna. 10 15 20 25 030 35 25 469 594 Ett alternativ är följande. Nukleinsyraderivatet nedbrytes med ett RNB-ase (t.ex. ribonukleas P1). Den nedbrutna produkten utsättes för en vätskekromatografi med hög prestanda (HPLC) med omvänt fassystem, och 4-tiouridin (eller 4-tiouridylsyra) och en bis-substans som bildas genom en disulfidbindning därav separeras och deras mängder mätes.

Hed referens till fysiologiska aktiviteter visade det sig att nukleinsyraderivaten med någon grad av fri bindning från 1 (total S-S-substans, tex. testprov II) till 0 (total SH-sub- stans. t.ex. testprov I) utövar samma aktivitet och säkerhet som de tidigare nämnda testproverna I och II.

Detta faktum antyder att även om nukleinsyraderivaten kan vara partiellt oxiderbara eller reducerbara kan de utöva samma sta- bila fysiologiska aktivitet som de ursprungliga. (4) Låg-molekylarisering Det HS-haltiga nukleinsyraderivatet (l g), som erhållits ovan (2). upplöstes i 120 ml vatten och 30 ml 5M natriumkloridlös- ning och 150 ml formamid tillsattes. Blandningen omrördes kraftigt och gav homogen lösning. Reaktionslösningen värmdes till 80°C under 8 timmar. dialyserades väl mot vatten och lyo- filiserades och gav 0,95 g vit fast substans.

När nukleinsyraderivat innehållande S-S-bindning, som er- hållits ovan. utsâttes för lågmolekylarisering som ovan er- hålles samma resultat.

Sedan utsattes detta för vätskekromatografi med hög prestandal genom en gelfiltrering och det resulterande mönstret återges i fig. 3. De använda betingelserna var att TSK-gel G4000SH (0.65x60 cm) användes. och som ett eluat användes 50 mH Tris-HC]-buffert (pH 7,5) innehållande 0,5! natriumklorid.

Varje pil i figuren visar elueringsläget för varje standardi- serad storleksmarkör (enhet på storleksmarkören var bp) och från fig. 3 framgår det att denna har en maximal fördelning 10 15 20 25 30 35 469 594 26 runt 500 resttal och att den har en molekylstorlek, som för- delar sig 150 till 1000 resttal. Resultatet överensstämmer med det värde, som erhölls från elektrofores med användning av polyakrylamidgel eller agarosgel. Såsom redan nämnts anges molekylstorleken i denna beskrivning med uttrycket 'resttal' och i fig. 3 är "resttalet“ i överensstämmelse med 'bp' som enheter.

När reaktionstiden och -temperaturen för denna låg-molekylari- sering varierades erhölls substanserna med följande molekyl- storlekar på samma sätt.

Reaktions- Reaktions- Maximal fördelning Fördelning temperatur tid (hp) (hp) - 0 timmar - 2000 80°C 24 ' 30 20 - 55 80°C 16 ' 200 50 - 300 80°C 8 ' 500 150 - 1000 80°C 8 ' 1000 200 - 5000 Bland de nukleinsyraderivat, som erhölls 1 exemplet ovan, togs de med 200 till 5000 resttal i molekylviktsfördelningen ut och smältkurvor uppmättes.

Provet I eller II (0,70 D/ml) i 10 mM Tris-buffert (pH 7,5) innehållande 0,1 H natriumklorid värmdes med ökande hastighet om 2°C/4 minuter från 20 till 90°C, varvid UV-absorbansen vid varje temperatur mättes vid våglängden 260 nm, och en ökning av UV-absorbansen med hyperkromicitet representerades med ett relativt förhållande, som gav tillståndet vid 20°C som en bas.

En Beckmann-DU-8B-spektrofotometer användes vid mätningen.

Resultaten återges i fig. 4. Fusion av nukleinsyraderivaten observerades gradvis under 35 till 55°C och runt 59°C erhölls en plötslig fusionskurva. Vid temperaturer högre än 70°C nådde kurvan nästan en platå och detta betyder att struktur med hög dimension försvinner och spiralstrukturbildning genom väte- bindning sker i nukleinsyraderivaten. *x 10 15 20 25 469 594 27 De 50-procentíga smälttemperaturerna för proverna I och II var 59.5 och 59,3°C resp. Från beräkningen från ökning/mínsknings- graden i UV-absorbansen vid 260 nm mellan 90°C och 25°C har det bekräftats att hyperkromiciteten (färgmörknande effekt) för proverna I och II var 43,5 resp. 42,4 %. Detta antyder att nukleinsyraderivaten har mycket stabila strukturer under fysiologiska betingelser. (4) Kort beskrivning av de bifogade ritningarna: Fig. l beskriver UV-absorptionsspektra av försvavlad polycyti- dylsyra erhâllen i (1) i exemplet. Ordinatan och abskissan är absorption resp. våglängd (nm).

Fig. 2 visar UV-absorptionsspektrat för nukleinsyraderívatet erhållet (2) i exemplet. Detta är ett UV-mönster av reduktio- nen med natriumtíosulfat. Ordinatan och abskissan är absorbans resp. våglängd (nm).

Fig. 3 visar elueringsmönstret med vätskekromatografi med hög prestanda av nukleínsyraderivat enligt föreliggande uppfinning erhållet i (3) i exemplet. Abskissan och ordinatan är elue- ringstid (minut) resp. eluerad mängd. Varje pil anger elue- ringsläget för storleksmarkören.

Fig. 4 visar fusionskurvan för nukleínsyraderivatet enligt föreliggande uppfinning, i vilket molekylstorleksfördelníngen är 50 till 2000 resttal. Abskissan och ordinatan är temperatur (°C) resp. relativ absorption.

Claims (4)

10 15 469 594 28 Éåšâëfikfa

1. l. Dubbelsträngad ribonukleinsyra, k ä n n e t e c k n a d av att i nukleínsyrapolymeren är en del av pyrimídinríngen, som utgör en enhet därav, substítuerad med en eller flera svavelatomer. eller bildar svavelatomen (svavelatomerna) en eller flera bryggor genom en dísulfídbíndníng.

2. Nukleínsyraderívat enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att polymerlängden är 50 till 10 000 räknat som antal baser.

3. Nukleínsyraderivat enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att antalet svavelatomer är ett (1) per 6-39 pyrimídín- ringar i poly C.

4. Dubbelsträngad ríbonukleínsyra enligt krav 3, k ä n n e - t e c k n a d av att den är sammansatt av poly I och poly C, som innehåller 4-tíouridylsyra med svavelatomer genom ersätt- ning av en NH grupp í pyrímídínríngen i cytídylsyra í 2 poly C med en SH grupp.