CN116688143A - 一种PD-1抗体和iRGD的偶联物、制备方法及其在制备免疫治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种PD‑1抗体和iRGD的偶联物、制备方法及其在制备免疫治疗药物中的应用。本发明提供的PD‑1抗体和iRGD的偶联物具有位点特异性和高度均一性的特征，与未修饰PD‑1抗体相比，在体外3D细胞球模型及小鼠肿瘤模型中均显示出明显增强的穿透能力，同时有效促进PD‑1阳性T细胞对肿瘤局部的穿透作用；本发明提供的偶联物增强T细胞与肿瘤细胞的衔接，提高了靶向性，进一步改善T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；在不同的小鼠肿瘤模型中，本发明提供的PD‑1抗体和iRGD的偶联物能有效抑制肿瘤生长，且并未引起明显的主要脏器炎症损伤及小鼠体重降低等不良反应；相比于iRGD和PD‑1抗体联用，本发明提供的PD‑1抗体和iRGD的偶联物在更低的iRGD的剂量下，显示出相当或者更优的抗肿瘤活性。

Description

一种PD-1抗体和iRGD的偶联物、制备方法及其在制备免疫治 疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤免疫治疗药物领域，具体涉及一种PD-1抗体和iRGD的偶联物、制备方法及其在制备免疫治疗药物中的应用。
背景技术
近年来，随着老龄化程度不断，我国肿瘤性疾病负担显著增加，严重影响我国人群的生命健康。免疫治疗是继手术、化疗、放疗之后的肿瘤治疗新策略。免疫检查点抑制剂是临床应用最为广泛的免疫治疗手段，为肿瘤患者带来了明显的生存获益。然而，免疫检查点抑制剂的治疗响应率不高，仅为20％左右，极大地限制了临床应用。目前临床批准使用的免疫检查点抑制剂均为单克隆抗体，其分子量较大，难以在肿瘤局部迅速有效分布。同时，肿瘤局部异常血管生成、基质增生以及抑制性细胞共同形成“屏障”，进一步限制了大分子药物的分布。一项小样本临床同位素示踪试验提示PD-1单抗在肿瘤局部的摄取与患者的生存及免疫治疗反应正相关。因此，增强免疫检查点抑制剂的穿透性是增强临床治疗响应率的潜在策略。
iRGD是由9个氨基酸形成的肿瘤穿透性环肽，序列为c(CRGDKGPDC)。iRGD通过与整合素结合富集在肿瘤局部，被肿瘤微环境中的各类蛋白酶解后暴露出(Neuropilin-1，NRP1)结合位点介导二次穿透。iRGD与白蛋白紫杉醇、阿霉素、曲妥珠单抗的联合给药显著增加药物在肿瘤局部的分布。然而，联合给药存在一定的局限性，非偶联条件下需要高剂量的游离iRGD才能达成类似的穿透改善效果，存在一定安全隐患。另一方面，游离iRGD半衰期较短，需频繁给药不利于治疗依从性。将iRGD与PD-1单抗进行偶联不仅规避了高剂量游离iRGD的潜在副作用，而且允许较长的给药间隔，提升治疗依从性。然而制备PD-1抗体-iRGD偶联物仍具有很大的挑战，尤其对于均一稳定且能保持iRGD结构完整性的偶联物。通过融合表达的方案难以控制iRGD的环化状态。传统的偶联技术一般基于抗体氨基酸残基上的氨基和巯基，通过活化酯或者与马来酰亚胺发生加成反应实现药物与抗体偶联，通常获得是不均一的产品。加上iRGD结构复杂，进一步提升了偶联的难度。目前尚未有有效的方案能在PD-1抗体上构建出均一稳定的iRGD偶联物。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，提供一种PD-1抗体和iRGD的偶联物、制备方法及其在制备免疫治疗药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种PD-1抗体和iRGD的偶联物。
一种抗体偶联物，包括PD-1抗体和iRGD，所述PD-1抗体特异性结合于人或小鼠PD-1蛋白的一个或多个表位，所述iRGD是氨基酸序列为c(CRGDKGPDC)的环状多肽。
进一步地，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与GlcNAc连接，b为0或1；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接；
z为1～8中的任一整数。
进一步地，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
与PD-1抗体直接连接的GlcNAc为核心GlcNAc，核心GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与核心GlcNAc连接；
Man为甘露糖；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接。
进一步地，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与GlcNAc连接，b为0或1；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接。
进一步地，所述PD-1抗体包含以下抗体或其抗原结合部分：特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、派安普利单抗、赛帕利单抗、斯鲁利单抗、帕博利珠单抗和2E5。
进一步地，所述PD-1抗体包含HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1；所述HCDR3包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；所述HCDR1包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列；所述LCDR1包含SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
进一步地，所述PD-1抗体包含VL和VH；所述VL包含SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列；所述VH包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
进一步地，所述PD-1抗体的重链包含SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。
进一步地，所述PD-1抗体包含Fc片段，所述GlcNAc与Fc片段中的Asn直接或间接连接。
进一步地，所述GlcNAc与Fc片段中的Asn297直接或间接连接，所述Fc片段根据Kabat编号系统编号。
进一步地，所述Fuc*具有iRGD-L-Fuc’结构，L为连接子。
进一步地，iRGD-L-Fuc’结构中，所述iRGD具有以下结构：
式中右侧的螺线处表示和L连接。
进一步地，iRGD-L-Fuc’结构中，所述L的结构如下：
式中，FL为间隔子，FL选自以下物质中的至少一种：多肽及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、烷基及其衍生物；s为0或1。
进一步地，iRGD-L-Fuc’结构中，Fuc’的结构如下：
式中，右端的螺旋线表示Fuc’与GlcNAc连接，左端的螺旋线表示Fuc’和L连接。
进一步地，所述Fuc*的结构如下：
式中右端的螺线表示Fuc*与GlcNAc连接。
进一步地，所述GalX选自以下结构中的至少一种：
其中，上述结构中的螺线处表示与GlcNAc连接。
一种药物组合物，包含如上述的抗体偶联物，以及至少一种在药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
另一方面，本发明提供一种PD-1抗体和iRGD的偶联物的制备方法。
一种用于制备抗体偶联物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将3-15mg/mL的PD-1抗体、0.01-0.1mg/mL的EndoS和0.5-2mg/mL的Alfc在50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中，30-37℃下孵育；
步骤二、24小时后，向步骤一的反应混合物中加入UDP-Gal、UDP-GalNAz或UDP-GalNAc中的任一种、牛β1，4-GalT1和MnCl2，在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到抗体；
步骤三、用蛋白A树脂纯化修饰步骤二得到的抗体，得到αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc，3-15mg/mL的αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc通过超滤换液置换为50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，与终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度为0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT和终浓度为0-10mM的MgCl2在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到修饰的抗体；
步骤四、用蛋白A树脂纯化步骤三得到的修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物。
一种用于制备抗体偶联物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、3-15mg/mL的PD-1抗体与0.01-0.1mg/mL的EndoS在50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中，30-37℃下孵育0.1-1小时；
步骤二、向步骤一的反应混合物中加入终浓度为1-10mM的UDP-Gal或UDP-GalNAz中的任一种、终浓度0.1-0.5mg/mL的牛β1，4-GalT1和终浓度0.1-5mM的MnCl2，在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到修饰的抗体；
步骤三、用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc，3-15mg/mL的αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc通过超滤换液置换为50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，与终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT和终浓度0-10mM的MgCl2在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到PD-1抗体iRGD偶联物：αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD。
一种用于制备抗体偶联物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、3-15mg/mL的PD-1抗体、终浓度1-10mM的UDP-Gal、终浓度0.1-1.0mg/mL的牛β1，4-GalT1、终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT、终浓度0-10mM的MgCl2和50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液在30-37℃条件下孵育24-72小时，得到修饰的抗体；
步骤二、用蛋白A树脂纯化步骤一得到的修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物：αPD-1-G2F-FAm-iRGD。
再一方面，本发明提供一种PD-1抗体和iRGD的偶联物在制备免疫治疗药物中的应用，所述免疫治疗包含的疾病有：存在PD-1/PD-L1免疫检查点的癌症、胃癌、黑色素瘤等。
本发明的有益效果是：
1)传统的偶联技术一般基于抗体氨基酸残基上的氨基和巯基，通过活化酯或者与马来酰亚胺发生加成反应实现药物与抗体偶联，通常获得是不均一的产品，本发明提供有效的方案在PD-1抗体上构建出均一稳定的iRGD偶联物；
2)本发明提供的PD-1抗体和iRGD的偶联物具有位点特异性和高度均一性的特征；
3)与未修饰PD-1抗体相比，本发明提供的PD-1抗体和iRGD的偶联物在体外3D细胞球模型及小鼠肿瘤模型中均显示出明显增强的穿透能力，同时有效促进PD-1阳性T细胞对肿瘤局部的穿透作用；
4)本发明提供的PD-1抗体和iRGD的偶联物增强T细胞与肿瘤细胞的衔接，提高了靶向性，进一步改善T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；
5)在不同的小鼠肿瘤模型中，本发明提供的PD-1抗体和iRGD的偶联物能有效抑制肿瘤生长，且并未引起明显的主要脏器炎症损伤及小鼠体重降低等不良反应；
6)相比于iRGD和PD-1抗体联用，本发明提供的PD-1抗体和iRGD的偶联物在更低的iRGD的剂量下，显示出相当或者更优的抗肿瘤活性。
附图说明
图1为PD-1抗体iRGD偶联示意图和表征：(A)PD-1抗体iRGD偶联示意图；(B)αPD-1-(iRGD)2的高分辨率质谱图；(C)ELISA检测αPD-1-(iRGD)2和未修饰PD-1抗体对人PD-1蛋白的结合亲和力；(D)ELISA检测αPD-1-(iRGD)2和未修饰PD-1抗体对小鼠PD-1蛋白的结合亲和力；(E)GDP-FAm-iRGD的合成路线图。
图2为PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞与肿瘤细胞衔接并增强杀伤能力：(A)PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞与肿瘤细胞衔接的图示；(B)流式细胞术分析αPD-1-(iRGD)2-Cy5或αPD-1-Cy5共培养的GES-1、HGC27、NCIN87、MFC细胞系的相对平均荧光强度的变化；(C)反映iRGD的主要受体整合素αvβ5和Nrp-1在HGC27、N87和GES-1细胞系上表达的流式细胞图；(D)与αPD-1-(iRGD)2-Cy5或αPD-1-Cy5孵育1h后Jurkat细胞的MFI倍数变化；(E)与健康供体的PBMC共培养的单层HGC27细胞，加入αPD-1-(iRGD)2(浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0μg/100μl)或αPD-1(浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0μg/100μl)或αPD-1(浓度为0.1、0.5、1.0、2.5、5.0μg/100μl)联合0.1μg游离iRGD，以10：1的效靶比共孵育16小时后，肿瘤细胞的裂解比例；(F)用HGC27细胞构建的多细胞球状体(MCS)在所示抗体浓度下以10：1的效靶比共孵育16小时后，肿瘤细胞的裂解比例；(G)αPD-1-(iRGD)2促进T细胞与肿瘤细胞衔接的实验方法简图；(H)在Dye670标记的HGC27细胞与CFSE标记的OT-I细胞以1：10的效靶比共孵育，加入αPD-1-(iRGD)2(浓度为1μg/100μl)或αPD-1(浓度为1μg/100μl)或αPD-1(浓度为1μg/100μl)联合游离iRGD(0.1μg)1小时后CFSE和Dye670双阳性细胞的百分比；(I)代表性流式细胞术结果；(J)αPD-1-(iRGD)2促进Jurkat细胞与肿瘤细胞衔接的实验方法简图；(K)在Dye670标记的HGC27细胞与CFSE标记的Jurkat细胞以1：10的效靶比共孵育1小时后CFSE和Dye670双阳性细胞的百分比；(L)代表性流式细胞术结果，数据显示为平均值±s.e.m；n＝3。
图3为PD-1抗体iRGD偶联物的穿透性分析：(A)αPD-1-(iRGD)2-Cy5的穿透性测定示意图，其中的细胞球由HGC27细胞构成，每个球体含大约5×104个细胞，每孔加入αPD-1-Cy5(1μg)，或αPD-1-(iRGD)2-Cy5(1μg)，或αPD-1-Cy5(1μg)和低剂量游离iRGD(L-iRGD，0.01μg)，或αPD-1-Cy5(1μg)和高剂量游离iRGD(H-iRGD，0.1μg)；(B)αPD-1-(iRGD)2促进CFSE标记的Jurkat-PD-1细胞浸润到HGC27 MCS中的示意图，其中的细胞球由CFSE荧光标记的HGC27细胞构成，每个球体含大约5×104个细胞，每孔加入αPD-1(1μg)，或αPD-1-(iRGD)2(1μg)，或αPD-1(1μg)和高剂量游离iRGD(0.1μg)；(C)共聚焦显微镜图像，显示αPD-1-(iRGD)2-Cy5在MCS中的穿透性；(D)共聚焦显微镜图像，显示CFSE标记的Jurkat细胞在MCS中的穿透性，放大倍数×50；比例尺200μm；(E)与αPD-1-(iRGD)2-Cy5或对照试剂孵育的MCS在指定时间内的平均荧光强度；(F)与CFSE标记的Jurkat细胞和αPD-1-(iRGD)2或对照试剂共培养的MCS的平均荧光强度，数据显示为平均值±s.e.m；n＝3。
图4为PD-1抗体-iRGD偶联物的靶向性分析：(A)给皮下接种MFC细胞的小鼠腹腔注射αPD-1-(iRGD)2-Cy5(50μg)或αPD-1-Cy5(50μg)或αPD-1-Cy5(50μg)+游离iRGD(1.25μg)，每隔一段时间拍摄Cy5生物发光图像；(B)腹腔注射药物后24小时肿瘤、肝脏、心脏、肾脏、肺和脾脏的离体荧光图像；(C)每只MFC荷瘤小鼠注射药物后肿瘤部位的平均荧光强度折线图；(D)注射药物48h后切除的肿瘤体积的平均荧光强度，数据显示为平均值±s.e.m；n＝3。
图5为PD-1抗体iRGD偶联物的抗肿瘤效应分析：(A)MFC小鼠胃肿瘤模型中的治疗方案示意图，615系小鼠皮下注射1×106MFC细胞后第三天起，每三天腹腔注射PBS(100ul对照)、αPD-1(5mg/kg)、αPD-1(5mg/kg)以及游离iRGD(1.25μg)、αPD-1-(iRGD)2(5mg/kg)；(B)在MFC动物模型治疗终点收集的肿瘤体积折线图和肿瘤重量；(C)B16F10小鼠黑色素瘤模型中的治疗方案示意图；小鼠皮下接种1×105B16F10细胞，每三天腹腔注射PBS(100ul对照)、αPD-1(5mg/kg)、αPD-1(5mg/kg)和游离iRGD(1.25μg)、αPD-1-(iRGD)2(5mg/kg)；(D)在B16F10动物模型治疗终点收集的肿瘤体积折线图和肿瘤重量；(E)MFC小鼠胃肿瘤模型中肿瘤组织内的CD8+T细胞丰度；(F)MFC小鼠胃肿瘤模型的终点，流式细胞术定量瘤内CD8+T细胞上PD-1的表达；(G)MFC小鼠胃肿瘤模型的终点，流式细胞术分析肿瘤内的CD8+T细胞上GZMB和IFNγ的表达；(H)MFC小鼠胃肿瘤模型的终点，流式细胞术定量测定肿瘤内的CD4+T细胞上GZMB和IFNγ的表达；(I)在MFC小鼠胃肿瘤模型的终点，来自肿瘤内的CD8+T细胞上GZMB和IFNγ表达的代表性流式细胞术散点图；(J)在MFC小鼠胃肿瘤模型的终点，来自肿瘤内的CD4+T细胞上GZMB和IFNγ表达的代表性流式细胞术结果。
图6为PD-1抗体-iRGD偶联物的等效游离iRGD剂量测定：(A)显示了MFC同种移植模型中的治疗方案的示意图，简言之，用1×106MFC细胞处理荷瘤小鼠，每三天腹腔注射PBS(100μl对照)、αPD-1(5mg/kg)、游离iRGD(iRGD-Hi)(50μg)和αPD-1-(iRGD)2(5mg/kg)；(B)肿瘤体积折线图；(C)终点时的肿瘤重量柱状图；(D)终点时小鼠肿瘤组织离体成像。
图7为PD-1抗体iRGD偶联物调节肿瘤微环境：(A)单细胞分析，MFC小鼠胃肿瘤模型中的治疗方案示意图，615系小鼠皮下注射1×106MFC细胞后第三天起，每三天腹腔注射PBS(100μl对照)、αPD-1(5mg/kg)以及游离iRGD(1.25μg)、αPD-1-(iRGD)2(5mg/kg)；(B)CD45+肿瘤浸润免疫细胞的二维UMAP可视化；(C)单细胞分析中描述的CD45+肿瘤浸润免疫细胞内各亚群的比率；(D)CD45+肿瘤浸润免疫细胞内各治疗组NK细胞中所选基因的平均相对表达热图；(E)单细胞分析中描述的CD45+肿瘤浸润免疫细胞内的αPD-1-(iRGD)2治疗组中CD8+T细胞中所选基因的平均相对表达热图；(F)单细胞分析中描述的CD45+肿瘤浸润免疫细胞内的αPD-1-(iRGD)2治疗组中CD4+T细胞中所选基因的平均相对表达热图；(G)αPD-1和αPD-1-(iRGD)2在肿瘤内树突状细胞(DC)中差异表达基因的KEGG分析；(H)αPD-1和αPD-1-(iRGD)2巨噬细胞差异表达基因的KEGG分析。
图8为PD-1抗体iRGD偶联物扩增了肿瘤微环境中的具有干细胞特性的效应CD8+T细胞亚群：(A)CD3+T细胞的二维UMAP可视化；(B)所示CD3+肿瘤浸润T细胞内各亚群的比率；(C)六个CD3+T细胞簇内代表性基因的标准化表达热图；(D)CD3+T细胞六个簇中干性(Tcf7、Bach2)、效应(Gzmb、Ifng)、共刺激分子(CD7、CD27、CD28)、衰竭(PD-1、Tim-3、Lag3、Entpd1)、转录因子(Icos、T-bet、Tgfbi)的表达水平。
图9为PD-1抗体-iRGD偶联物安全性分析：(A)αPD-1-(iRGD)2治疗后MFC荷瘤小鼠的体重图，615系小鼠皮下注射1×106MFC细胞后的第三天起，每三天腹腔注射PBS(100μl对照)、αPD-1(5mg/kg)、αPD-1(5mg/kg)以及游离iRGD(1.25μg)、αPD-1-(iRGD)2(5mg/kg)；(B)αPD-1-(iRGD)2治疗后MFC皮下小鼠模型中主要器官(心、肝、脾、肺、肾脏)的H&E染色。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明。
一、蛋白表达与制备实验
1.1PD-1抗体表达和纯化
PD-1抗体重链以及轻链序列为SEQ ID NOs 9、10。构建了编码PD-1抗体轻链和重链的基因序列，并分别克隆到PPT5载体中(南京金斯瑞)。将293F细胞培养至约2.5×106细胞/ml的密度，并通过直接向悬浮培养物中添加0.37μg/ml和0.66μg/ml轻链和重链表达质粒DNA以及2.2μg/ml聚乙烯亚胺(线性25kDa PEI，Polysciences，Inc，Warrington，PA)进行转染。转染24小时后，用含有4.4mM丙戊酸(2.2mM终浓度)的293F表达培养基1：1稀释培养物，并在37℃下继续蛋白质生产4–5天。最终通过protein A琼脂糖纯化抗体。
1.2牛β1，4-GalT1(Y289L)，EndoS，Alfc和Hp1，3FucT的表达纯化
牛β1，4-GalT1(Y289L)(Bovineβ-1，4-galactosyltransferase I，牛β-1，4-半乳糖基转移酶带有Y289L突变，SEQ ID NO 15)，EndoS(Streptococcus pyogenesendoglycosidase S，酿脓链球菌内切糖苷酶S，SEQ ID NO 17)，Alfc(Lactobacilluscaseiα-1，6-fucosidase Alfc，干酪乳杆菌α-1，6-岩藻糖苷酶，SEQ ID NO 19)的克隆、表达及纯化分别参考Qasba P.K等报道的方法(J.Biol.Chem.2002，277，20833；Prot.Expr.Fur.2003，30，219)、Collin，M.等报道的方法(EMBO J.2001，20，3046；Infect.Immun.2001，69，7187)以及Wang L.等报道的方法(Methods Mol.Biol.2018，19，367)。
Hp1，3FucT的表达纯化是通过基因合成编码Hp1，3FucT(SEQ ID NO 14所示)的核酸序列，并通过NdeI和BamHI酶切位点，将该核酸序列插入至pET24b载体中(南京金斯瑞)。用构建好的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养经转化后的重组细菌，在37℃下培养至OD600达到0.6-0.8时，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.2mM，然后继续在25℃，200rpm的条件下孵育16小时进行蛋白诱导表达。诱导后的菌体经离心后，悬浮于裂解缓冲液中(25mM Tris-HCl，pH7.5，500mM氯化钠，20mM咪唑，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟))。将悬浮后的细胞经超声裂解，然后用Ni-NTA填料(GEHealth)进行纯化。收集纯度大于90％主组分，然后透析至保存缓冲液中(25mM Tris-HCl，pH7.5，150mM氯化钠，5％甘油)。
二、GDP-FAm-iRGD合成实验
合成GDP-FAmP4Pro：向500uL GDP-FAm(100mM)溶液中加入1500uL ddH2O、500uLNaHCO3(200mM)、1750uL THF和750uL NHS-PEG4-Prop(在四氢呋喃(THF)中50mM)。在室温(r.t.)下搅拌反应4小时，并通过薄层色谱(TLC)对反应过程进行监测。在减压状态下除去溶剂。通过Prep-HPLC系统进一步纯化粗产物，得到白色固体的所需产物(27.1mg，64％)。相对分子质量计算值为845.2013，使用高分辨质谱对产物进行分析，产物分子量约为845.1989，与预期一致。
合成GDP-FAm-iRGD：向640μL GDP-FAmP4Prop(50mM)存于ddH2O/DMSO(2048μL/1920μL)中的溶液中添加64μL CuSO4(50mM/ddH2O)、128ul BTTP(50mM-ddH2O中)、1280μL N3-iRGD(50mM，DMSO，南京源肽生物科技有限公司，中国)和320μL抗坏血酸(50mM/ddH2O)。反应在室温下搅拌12小时，并通过TLC监测反应过程。通过Prep HPLC系统进一步纯化粗产物，得到白色固体形式的产物(GDP-FAm-iRGD，38.4mg，64％)，其相对分子质量计算值为936.7932，高分辨质谱分析产物分子量为936.7961，与预期一致。
三、αPD-1-RGD偶联物合成实验
3.1αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD偶联物的合成
合成αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD合成过程如图1(A)，PD-1抗体(3-15mg/mL)与EndoS(0.01-0.1mg/mL)(SEQ.ID.NO：17)和Alfc(SEQ.ID.NO：19)(0.5-2mg/mL)在30-37℃的50mM Tris-HCl缓冲液(pH5.0-8.0)中孵育。24小时后，向反应混合物中加入UDP-Gal或UDP-GalNAz或UDP-GalNAc(终浓度1-10mM，上海保森生物科技有限公司，中国)、牛β1，4-GalT1(Y289L)(SEQ.ID.NO：15)(终浓度0.1-0.5mg/mL)和MnCl2(最终浓度0.1-5mM)在30-37℃条件下孵育2-48小时。用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc，其结构分别为αPD-1-(Galβ1，4)GlcNAc(质谱表征分子量为145964.00Da)，αPD-1-(GalNAzβ1，4)GlcNAc(质谱表征分子量为146128.00Da)和αPD-1-(GalNAcβ1，4)GlcNAc(质谱表征分子量为146043.00Da)。
αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc(3-15mg/mL)通过超滤换液置换为50mMTris-HCl缓冲液(pH 5.0-8.0)与GDP-FAm-iRGD(终浓度0.1-5mM)和Hp1，3-FucT(终浓度0.1-1mg/mL)和MgCl2(终浓度0-10mM)在30-37℃条件下孵育2-48小时。用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物，其式分别为αPD-1-(Galβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(质谱表征分子量为148831.00Da，药物载荷抗体的比值为1.8至2.0之间)，αPD-1-(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(质谱表征分子量为148992.00Da，药物载荷抗体的比值为1.8至2.0之间)和αPD-1-(GalNAcβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(质谱表征分子量为148910.00Da，药物载荷抗体的比值为1.8至2.0之间)。图和图注中将αPD-1-(Galβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD简写为αPD-1-(iRGD)2。
3.2αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD偶联物的合成
合成αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD合成过程如下所示：PD-1抗体(3-15mg/mL)与EndoS(0.01-0.1mg/mL)在30-37℃的50mM Tris-HCl缓冲液(pH5.0-8.0)中孵育0.1-1小时后，向反应混合物中加入UDP-Gal或UDP-GalNAz(终浓度1-10mM，上海保森生物科技有限公司，中国)、牛β1，4-GalT1(Y289L)(终浓度0.1-0.5mg/mL)和MnCl2(最终浓度0.1-5mM)在30-37℃条件下孵育2-48小时。用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc(质谱表征分子量为146417.00Da)。
αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc(3-15mg/mL)通过超滤换液置换为50mMTris-HCl缓冲液(pH 5.0-8.0)与GDP-FAm-iRGD(终浓度0.1-5mM)和Hp1，3-FucT(终浓度0.1-1mg/mL)和MgCl2(终浓度0-10mM)在30-37℃条件下孵育2-48小时。得到产物αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(质谱表征分子量为149285.00Da，药物载荷抗体的比值为1.8至2.0之间)。
3.3αPD-1-G2F-FAm-iRGD偶联物的合成
蛋白表达与制备实验中合成的人鼠通用PD-1抗体(3-15mg/mL)与UDP-Gal(终浓度1-10mM，上海保森生物科技有限公司，中国)、牛β1，4-GalT1(Y289L)(终浓度0.1-1.0mg/mL)、GDP-FAm-iRGD(终浓度0.1-5mM)和Hp1，3-FucT(终浓度0.1-1mg/mL)，MgCl2(终浓度0-10mM)，MnCl2(最终浓度0.1-5mM)和50mM Tris-HCl缓冲液(pH5.0-8.0)在30-37℃条件下孵育24-72小时。用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物，其式为αPD-1-G2F-FAm-iRGD(质谱表征分子量为154540Da，药物载荷抗体的比值为3.5至4.0之间)，如图1(C)所示。
3.4αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD偶联物的一锅法合成
合成αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD合成过程如图1(A)：PD-1抗体(3-15mg/mL)与EndoS(0.01-0.1mg/mL)(SEQ.ID.NO：17)和Alfc(SEQ.ID.NO：19)(0.5-2mg/mL)在30-37℃的50mM Tris-HCl缓冲液(pH5.0-8.0)中孵育。24小时后，向反应混合物中加入UDP-GalNH2(终浓度1-10mM，上海保森生物科技有限公司，中国)、牛β1，4-GalT1(Y289L)(SEQ.ID.NO：15)(终浓度0.1-0.5mg/mL)、GDP-FAm-iRGD(终浓度0.1-5mM)和Hp1，3-FucT(SEQ.ID.NO：14)(终浓度0.1-1mg/mL)，MgCl2(终浓度0-10mM)和MnCl2(最终浓度0.1-5mM)在30-37℃条件下孵育2-48小时。用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物，其式为αPD-1-(GalNH2β1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(质谱表征分子量为148831.00Da，药物载荷抗体的比值为1.8至2.0之间)。
四、PD-1抗体iRGD偶联物的结合能力表征
4.1构建Cy5荧光标记的PD-1抗体和PD-1抗体-iRGD偶联物
合成αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4BCN-Cy5)GlcNAc与αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4BCN-Cy5)GlcNAc-FAm-iRGD方法如下：分别将αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc(1-10mg/mL)、αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD(1-10mg/mL)与BCN-Cy5(3-10抗体当量)(西安瑞禧生物科技有限公司，中国)在含有10％DMF的PBS(pH7.0-7.5)缓冲液中孵育2-10小时。产物分别通过脱盐柱纯化。得到αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4BCN-Cy5)GlcNAc(简写为αPD-1-Cy5)与αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4BCN-Cy5)GlcNAc-FAm-iRGD(简写为αPD-1-(iRGD)2-Cy5)。
4.2PD-1抗体iRGD偶联物的与PD-1蛋白的结合能力表征
将重组人源或鼠源PD-1胞外域(PD-1，新生蛋白)稀释至最终浓度250ng/mL，涂有缓冲液，镀在96孔板(100μL/孔)4℃过夜。去除多余的抗原溶液后，用PBS中的3％(体积比)牛血清白蛋白在37℃下封闭板2小时。用PBST(含有0.03％吐温-20的PBS)洗涤3次后，将αPD-1和αPD-1-(iRGD)2添加到PBST(PBS中含有1％(v/v)牛血清白蛋白)中，达到一系列最终浓度(3000ng/mL、1000ng/mL、333.33ng/mL、111.11ng/mL、37.04ng/mL、12.35ng/mL、4.12ng/mL、1.37ng/mL、0.46ng/mL、0.15ng/mL、0.05ng/mL、0ng/mL)，并分别添加到平板中。孵育1.5小时后，用PBST洗涤平板3次，然后将辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗人IgG抗体加入每个孔中，并在37℃孵育1小时。最后，用PBST洗涤每个孔3次，然后对四甲基联苯胺底物进行共处理以产生用于可视化的颜色。孵育15分钟后，通过加入100μL 3M HCl停止每个孔中的反应。
在SynergyTM LX平板读取器上在450nm处读取吸光度，使用Graphpad7.0对吸光度进行非线性拟合，如图1(C)和图1(D)所示计算得PD-1抗体iRGD偶联物与人PD-1的KD为2.855ng/ml，与鼠PD-1的KD为3.944ng/ml；未修饰PD-1抗体与人PD-1的KD为2.599ng/ml，与鼠PD-1的KD为2.766ng/ml，提示修饰前后PD-1抗体与人及鼠的PD-1具有相当的亲和力。
4.3PD-1抗体iRGD偶联物的与肿瘤细胞的结合能力表征
首先，使用iRGD的受体NRP-1及整合素avβ5的流式抗体2μg与106个GES-1、HGC27、N87人源细胞在4℃下共孵育30分钟，用PBS洗两次后，使用BD Accuri C6 PLUS流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞检测，并使用FlowJo软件(10.4，Tree Star)进行数据处理，结果如图2(C)所示，待测人源细胞系均表达iRGD受体。将荧光标记的PD-1抗体iRGD偶联物(αPD-1-(iRGD)2-Cy5))或荧光标记的PD-1抗体(αPD-1-Cy5)2μg与106GES-1、HGC27、N87及MFC细胞4℃，共孵育30分钟，后使用PBS洗两次，使用BD Accuri C6 PLUS流式细胞仪(BDBiosciences)进行流式细胞检测，并使用FlowJo软件(10.4，Tree Star)数据处理，如图2(B)所示，PD-1抗体-iRGD偶联物与相应细胞系的亲和力显著高于未修饰PD-1抗体。
4.4PD-1抗体iRGD偶联物的与T细胞的结合能力表征
将αPD-1-(iRGD)2-Cy5(2μg)或αPD-1-Cy5(2μg)与106Jurkat细胞在4℃条件下共孵育30分钟后，用PBS洗两次后，使用BD Accuri C6 PLUS流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞检测，并使用FlowJo软件(10.4，Tree Star)数据处理，如图2(D)所示，PD-1抗体iRGD偶联物与PD-1抗体与细胞表面PD-1蛋白的结合能力相似。
五、PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞与肿瘤细胞衔接实验
为了验证PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞与肿瘤细胞衔接，首先用PLV-EF1a-PD-1产生的慢病毒转导Jurkat细胞，构建了表达人PD-1的Jurkat细胞(hPD-1+Jurkat细胞)。然后，分别用荧光细胞燃料标记肿瘤细胞及T细胞。如图2(G)及(J)所示，用2μM CFSE标记表达人PD-1蛋白的Jurkat细胞或OT-I细胞。用染料Dye eFluorTM 670(Thermo FisherScientific)标记HGC27细胞。用FACS缓冲液(含有2％FBS的DPBS)洗涤3次后，将hPD-1+Jurkat细胞或OT-I细胞与HGC27细胞以10：1的E：T共培养。将αPD-1-(iRGD)2(1μg)或αPD-1(1μg)与0.1μg游离iRGD一起加入培养基中(总体积100μL)。37℃孵育1小时后，使用BDAccuri C6 PLUS流式细胞仪(BD Biosciences)直接进行流式细胞检测。使用FlowJo软件(10.4，Tree Star)数据分析，如图2(H)-(L)所示，αPD-1-(iRGD)2显著提升了T细胞与肿瘤细胞的衔接比例。
六、PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤实验
6.1PBMC的获取及处理
通过Ficoll密度离心收集健康供体的外周血单核细胞(PBMC)，加入含10％FBS的AIM-V培养基(Gibco，USA)，在37℃和5％CO2的细胞孵箱中培养2小时后，收集仍未黏附在培养皿底部的悬浮T细胞并将其培养在含10％FBS、100IU白细胞介素2(IL2)(Peprotech，USA)、10ng/ml IL7(Peprotech，USA)和10ng/ml IL15(PeproTech，USA)的AIM-V培养基(Gibco，USA)中。
6.2HGC27细胞的多细胞球体(MCS)的构建
将HGC27细胞胰酶消化后，用含10％FBS、1％双抗的1640完全培养基重悬至1500个细胞/ml，按100ul/孔加入超低吸附96孔板中，隔天换液。至细胞球体直径达到大约500μm时，收集MCS备用。
6.3T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果分析
将1×105个T细胞与αPD-1-(iRGD)2(1μg)或αPD-1(1μg)或αPD-1(1μg)+游离iRGD(0.01μg)与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，MedChemExpress)标记的HGC27细胞以20：1的E：T共培养24小时。孵育结束后，将100ng/ml碘化丙啶(PI，MedChemExpress)加入培养基中。使用流式细胞术测量肿瘤细胞毒性。CFSE和PI双阳性细胞被认为是裂解的肿瘤细胞。使用one-way ANOVA进行统计检验，结果如图2(E)及(F)所示，在平面培养条件及MCS条件下，该抗体偶联物均能显著提示T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
七、PD-1抗体iRGD偶联物增强穿透能力实验
7.1PD-1抗体iRGD偶联物对MCS的直接穿透能力分析
如图3(A)所示，将MCS与αPD-1-(iRGD)2-Cy5(1μg)或αPD-1-Cy5(1μg)或αPD-1-Cy5(1μg)+低剂量游离iRGD(0.01μg)或αPD-1(1μg)+高剂量游离iRGD(0.1μg)在37℃下以5：1的效靶比共培养24小时。然后，用PBS洗涤MCS并用4％多聚甲醛固定，后使用ZEN710共焦显微镜(Zeiss，Jena，Germany)成像，获得接近球体中间高度的荧光成像，用Leica ApplicationSuite X(LAS X)计算荧光强度，结果如图3(C)及(E)所示，提示PD-1抗体iRGD偶联物与未修饰的PD-1抗体相比能更有效地穿透MCS的核心。
7.2PD-1抗体iRGD偶联物促进T细胞对MCS的穿透能力
如图3(B)所示，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，MedChemExpress)标记hPD-1+Jurkat细胞(英国剑桥Abcam)。标记后，将hPD-1+Jurkat细胞、MCS与αPD-1-(iRGD)2(1μg)或αPD-1(1μg)或αPD-1(1μg)+游离iRGD(0.1μg)在37℃下以5：1的效靶比共培养24小时。然后，用PBS洗涤MCS并用4％多聚甲醛固定，后使用ZEN710共焦显微镜(Zeiss，Jena，Germany)成像，获得接近球体中间高度的荧光成像，用Leica Application Suite X(LAS X)计算荧光强度。结果如图3(D)及(F)所示，提示PD-1抗体iRGD偶联物与未修饰的PD-1抗体相比能更有效地促进T细胞对MCS的穿透。
7.3PD-1抗体iRGD偶联物的体内穿透能力分析
近红外活体成像用于追踪αPD-1-(iRGD)2-Cy5或αPD-1-Cy5的分布。将αPD-1-(iRGD)2-Cy5(50μg)或αPD-1-Cy5(50μg)或αPD-1-Cy5(50μg)+游离iRGD(1μg)一起腹腔注射到平均肿瘤体积为200mm3的MFC荷瘤小鼠中。七氟醚气体麻醉后，在注射后30min，1h，3h，6h，24h，48h用CRi Maestro体内成像系统(美国马萨诸塞州剑桥研究仪器公司)扫描小鼠，结果如图4(A)及(C)所示，PD-1抗体iRGD偶联物能够在肿瘤局部更迅速且集中地分布。给药48小时后，运用人道主义方式处死小鼠，切除肿瘤组织和主要器官，用CRi Maestro体内成像系统(美国马萨诸塞州剑桥研究与仪器公司)进行扫描分析肿瘤和主要器官组织的体外平均辐射效率，如图4(B)及(D)所示，提示PD-1抗体iRGD偶联物主要集中分布于肿瘤组织，脏器分布较低。
八、PD-1抗体iRGD偶联物抑制小鼠胃癌及黑色素瘤模型中的肿瘤生长实验
8.1小鼠胃癌肿瘤模型构建
取体重20g左右，6-8周龄的615系小鼠，于左侧腹股沟皮下注射1×106MFC细胞，后隔日用游标卡尺测量皮下瘤的长径记为amm，短径记为bmm，肿瘤体积计算为a×b×b/2mm3。
8.2小鼠恶性黑色素瘤模型构建
取体重20g左右，6-8周龄的C57BL/6系小鼠，于左侧腹股沟皮下注射1×105B16F10细胞，后隔日用游标卡尺测量皮下瘤的长径记为amm，短径记为bmm，肿瘤体积计算为a×b×b/2mm3。
8.3PD-1抗体iRGD偶联物抗肿瘤给药模式
治疗过程如图5(A)及(C)所示，在小鼠肿瘤模型建立后第三天，随机将小鼠分为5组，每组6只，隔天腹腔注射100ul生理盐水；100μg PD-1单抗；1.25μg游离iRGD；100μg PD-1单抗+1.25μg iRGD；100μgαPD-1-(iRGD)2。完成四次给药后人道主义处死小鼠，解剖小鼠取出肿瘤组织及主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行相关分析。
8.4PD-1抗体iRGD偶联物抗肿瘤疗效分析
如图5(B)及(D)所示，在MFC及B16F10皮下肿瘤模型中，αPD-1-(iRGD)2显著延缓了肿瘤生长并显著减轻了肿瘤重量。未修饰PD-1抗体也在一定程度上抑制了肿瘤的生长，而PD-1抗体联合游离iRGD与PD-1组的抑瘤效果差异不大。αPD-1-(iRGD)2相比未修饰的PD-1单抗能够更有效地抑制肿瘤生长。
8.5PD-1抗体iRGD偶联物等效游离iRGD剂量分析
如图6(A)所示，在小鼠肿瘤模型建立后第三天，随机将小鼠分为5组，每组6只，隔天腹腔注射100μl生理盐水；100μg PD-1单抗；50μg游离iRGD；100μg PD-1单抗+50μg iRGD；100μgαPD-1-(iRGD)2。完成四次给药后人道主义处死小鼠，解剖小鼠取出肿瘤组织并进行称重分析，如图6(B-D)所示，PD-1抗体iRGD偶联物等效游离iRGD剂量约为50μg，40倍于实际偶联的iRGD量。
九、PD-1抗体iRGD偶联物在小鼠胃癌模型中增强抗肿瘤免疫实验
9.1肿瘤组织单细胞悬液制备
将PD-1抗体iRGD偶联物抑制小鼠胃癌及黑色素瘤模型中的肿瘤生长实验中各组小鼠肿瘤组织按照如下方法制成单细胞悬液：将肿瘤组织剪碎，用1mg/ml胶原酶IV(Sigma-Aldrich)在无血清RMPI-1640培养基37℃消化2h。通过40μm尼龙细胞过滤器(Biosharp)过滤细胞，并用PBS洗涤两次，然后应用红细胞裂解缓冲液(Biosharp)清除红细胞。
9.2流式染色及分析
检测胞外蛋白，用CD3、CD4、CD8、PD-1、CD51、NRP-1等标记物特异性抗体在4℃下对单细胞悬浮液染色30分钟。对于胞内蛋白，使用固定/破膜试剂盒(BD Biosciences)和/或BD GolgiPlug的白细胞活化组合液处理单细胞悬浮液(每106个细胞用量为2ul，BDBiosciences)，然后与靶向IFN-γ和GZMB的流式抗体孵育。使用BD Accuri C6 PLUS流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测，使用FlowJo软件(10.4，Tree Star)进行数据分析，结果如图5(F-J)所示，与其他组相比，αPD-1-(iRGD)2向肿瘤微环境中招募了更多的CD8+T细胞，且显著提高了CD8+和CD4+T细胞中干扰素γ(IFNγ)和颗粒酶B(GZMB)的表达，而PD-1抗体单独或与游离iRGD一起则仅对IFNγ和GZMB的表达有轻微影响。
十、PD-1抗体iRGD偶联物在小鼠中的安全性分析实验
10.1治疗期间小鼠体重分析
分析结果如图9(A)，显示治疗期间小鼠体重未见明显减低。
10.2主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)切片HE染色分析
新鲜取下的脏器用固定液固定24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II 30min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冷冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。依次将各脏器切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75％酒精5min，自来水洗。切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min，透明中性树胶封片。用光学显微镜对各主要脏器切片进行观察，结果如图9(B)，主要器官中未记录到异常的炎症损伤。
十一、PD-1抗体iRGD偶联物治疗后小鼠肿瘤微环境中的CD45+单细胞分析实验
11.1CD45+细胞分选
单细胞分析的小鼠模型构建如上文所述，治疗策略如图7(A)所示。如前所述在小鼠胃癌肿瘤模型中获得单细胞悬浮液，并通过67％ Percoll梯度(800g，20℃20分钟)以富集淋巴细胞。然后，将细胞悬浮液用Zombie AquuTM Fixable Viability Kit(#423101，Biolegend)和抗CD45-FITC(#157607，Biolegends)在4℃下染色30分钟，后使用FACS AriaII(BD Biosciences)系统分选出CD45阳性细胞。
11.2CD45+细胞标记、单细胞测序文库构建及测序
标记试剂(ClickTag)的制备：将0.5μl NHS-TCO(DMSO中为1mM)和20μl 25μM Tz寡聚物彻底混合，并立即移液到样品中，室温避光条件下混匀15分钟后，用10μl淬灭缓冲液(FBS中300μM炔基聚乙二醇四嗪)，保持5分钟。然后，用DPBS洗涤细胞三次，检测细胞数量和生存能力，混合标记后的细胞并加载到Singleron Matrix 15000个细胞的微孔芯片中(GEXSCOPE Single cell RNA seq Kit，Singleron Biotechnologies，中国南京)。单细胞测序文库根据制造商的说明(Singleron Biotechnologies，中国南京)制备。扩增后，分别用0.6×和1.4×SPRI分离cDNA和ClickTags。随后对ClickTag文库进行定量(Qubit，Invitrogen)，并使用引物SGR-beads-1/SGR-tag-1进行扩增，并通过使用引物SGR-beads-2/SGR-tag-2的额外PCR进行索引。在BioAnalyzer高灵敏度DNA试剂盒(Agilent)上分析最终ClickTag文库和转录组文库，并在Illumina NovaSeq 6000上测序。
11.3单细胞测序结果分析
如图7(B-C)所示，使用Seurat v.4包在R(R Core Team，2013)语言环境中处理、分析和可视化分析单细胞测序数据，结果如图。UMAP显示了27个集群，包括5种细胞类型。它们是T细胞(簇4，7，10，11，12，15，18，23)、DC(簇6，9，19，22)、巨噬细胞(簇0，6，8，14，16，21，24)、单核细胞(簇3，5，20)、NK细胞(簇12，26)。与先前的发现一致，在接受αPD-1-(iRGD)2治疗的小鼠的CD8+T细胞中，几种效应基因(Gzma、Ifng、Ifng1等)、炎性细胞因子受体(Il2ra、Il7r、Il12rb1等)和共刺激因子(Cd28、Cd27等)的表达上调。在CD4+TIL中也观察到类似的转录谱变化。如图7(E)所示，αPD-1-(iRGD)2给药后CD8+T细胞中干细胞和记忆相关基因(Lef1、Tcf7、Bach2、Ikzf2)显著上调。参与迁移和粘附的基因(Ccr2、Cxcr3、S1pr1、Itgb1和Ly6c2)的RNA水平也增加，表明αPD-1-(iRGD)2招募CD8+T细胞浸润TME。除T细胞外，NK细胞、DC和巨噬细胞也直接或间接参与了PD-1抗体的抑瘤作用。如图7(D)及(F)所示，在用αPD-1-(iRGD)2治疗的小鼠中，TME中的NK细胞表达了更高水平的效应基因(Nkg7、Gzma、Prf1、Klrg1)、共刺激因子(Slamf7、Cd244a、Klrk1)、迁移基因(Itgb2、Itga2、Icam1)、免疫刺激细胞因子和受体(Ifng、Ifng1、Il2ra、Il2rb)。使用DC和巨噬细胞的差异表达基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析。结果显示如图7(G-H)，用αPD-1-(iRGD)2处理的小鼠对IFNγ的应答、抗原处理和DC中的呈递增加。巨噬细胞对脂多糖和生物刺激的细胞反应通路中的基因明显激活。这些观察表明αPD-1-(iRGD)2同时改善NK、DC和巨噬细胞的功能。总之，αPD-1-(iRGD)2改善了免疫抑制性TME，从而促进CD8+T细胞的细胞毒性。
十二、PD-1抗体iRGD偶联物促进具有干细胞特征的特殊T细胞亚群扩增实验
如图8(A)所示，重新对T细胞进行了UMAP分析。UMAP显示了10个簇，根据细胞标志物将其注释为6个亚型，包括更好的效应CD8+T细胞(簇4)、效应CD8+T细胞(簇3)、中间耗竭CD8+T细胞(簇0，2，5)、终末耗竭CD8+T细胞(簇1，9)、记忆CD8+T细胞(簇6)、CD4+T细胞(簇7，8)。如图8(B)所示，CD8+T细胞中的独特亚群(更好的CD8+T效应细胞)在αPD-1-(iRGD)2治疗小鼠中显著增加，该亚群T细胞高表达干细胞和记忆相关基因(Tcf7、Il7r、Lef1、Bach2)的表达和效应基因(Gzma、Gzmb、Ifg)。此外，如图8(D)所示该CD8+T细胞群体还低表达PD-1、Lag3、Havcr2(TIM-3)和EntPD-1等耗竭指标。αPD-1-(iRGD)2增强了肿瘤内T细胞的效应功能，同时避免了耗竭，并保持了CD8+T细胞独特亚群的干细胞和记忆特性。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶为α1，3-岩藻糖基转移酶或其功能性变体或片段。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶源自细菌。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶源自幽门螺杆菌。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶源自幽门螺杆菌26695。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶是源自GenBank登录号为AAD07710.1的幽门螺杆菌α1，3岩藻糖基转移酶。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶包含催化活性区域和至少一个七肽重复片段，所述催化活性区域包含SEQ ID NO 11所示的氨基酸序列，且所述七肽重复片段包含SEQ ID NO 12所示的氨基酸序列。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶为α1，3-岩藻糖基转移酶或其功能性变体或片段，且其包含SEQ ID NO 13中所示的氨基酸序列。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶包含本申请所述的岩藻糖基转移酶和标签序列。
在本申请的某些实施方式中，所述岩藻糖基转移酶包含SEQ ID NO 13和14中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请的某些实施方式中，β-1，4半乳糖转移酶及其功能性变体包含牛β-1，4-半乳糖基转移酶、人β-1，4-半乳糖基转移酶或其功能变体或片段。
在本申请的某些实施方式中，β-1，4半乳糖转移酶包含具有Y285L突变的人β(1，4)-GalT1或具有Y289L突变的牛β(1，4)-GalT1。
在本申请的某些实施方式中，β-1，4半乳糖转移酶包含SEQ ID NO 15、SEQ ID NO16中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请的某些实施方式中，糖苷内切酶包含Endo S，Endo S2，Endo A，Endo F，Endo M，Endo D，Endo H和/或他们的功能性变体。
在本申请的某些实施方式中，糖苷内切酶包含Endo S。
在本申请的某些实施方式中，糖苷内切酶包含SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请的某些实施方式中，α1，6岩藻糖苷酶可以为BfFucH、Alfc，BKF和/或它们的功能性变体。
在本申请的某些实施方式中，α1，6岩藻糖苷酶包含Alfc。
在本申请的某些实施方式中，α1，6岩藻糖苷酶包含SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20中任一项所示的氨基酸序列。
本申请的方法可以在合适的缓冲溶液中进行。合适的缓冲液是本领域已知的。例如，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液或醋酸盐缓冲液等。本申请的方法可以在合适的pH下进行。合适的pH是本领域已知的。例如，所述合适pH范围为4-10。在一些实施方案中，合适的pH范围为5-9。在一些实施方案中，合适的pH范围为6-8。在一些实施方案中合适的pH范围为7-8。本申请的方法可以在合适的温度下进行。合适的温度是本领域已知的。例如，合适的温度为0-50℃。在一些实施方案中，合适的温度为10-45℃。在一些实施方案中，合适的温度为20-40℃。在一些实施方案中，合适的温度为25-37℃。例如，该方法可以在约30℃的温度下进行。例如，该方法可以在约37℃的温度下进行。本申请的方法可以在合适的金属离子存在的情况下进行。合适的金属离子是本领域已知的。例如，合适的金属离子可以是Mn2+，Mg2+等。
在本申请中，术语“抗体”通常是指通过免疫系统产生的能够识别并与特定抗原结合的蛋白质或其抗原结合片段。术语抗体在本申请中以其最广泛的意思使用并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如多特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。抗体也包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。在本申请中。术语“抗体”通常包括完整的抗体，但也包括抗体片段，例如来自经裂解的抗体的抗体Fab片段、(Fab’)2、Fv片段或Fc片段，scFv-Fc片段，小抗体(minibody)，单域抗体(也称为纳米抗体，nanobody)、多特异性抗体(diabody)，亲和体(affibody)或scFv。此外，术语“抗体”也包括经工程化或遗传学改造的抗体和/或抗体的衍生物。在一些实施方式中，抗体被称为免疫球蛋白并且包括各种类别和同种型，例如IgA(IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgG(IgG1、IgG3和IgG4)等。在本申请中，术语“抗体”可包括多克隆抗体和单克隆抗体及其功能片段。抗体包括保留特异性结合表位的能力的经修饰或衍生的抗体变体。抗体能够选择性地结合靶抗原或表位。在本申请中，抗体可以来自任何来源，例如小鼠或人，包括其嵌合抗体，例如，抗体可以是人源化的。
在本申请中，术语“Fc区”通常是指免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域和/或铰链区。在本申请中，术语“Fc区”包括任何多肽(或编码此类多肽的核酸)，无论其生产方式如何。如本文中所用，术语“单克隆抗体”通常是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，组成该群体的单个抗体是相同的。
在本申请中，术语“IgG”通常是指可通过生物化学方法区分的各种大类多肽或蛋白质。本领域技术人员将理解，免疫球蛋白重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4或α1-α2))。正是这种链的性质决定了抗体的“同种型”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被充分表征，并已知赋予功能特化。人IgG的典型特征在于Fc区的重链CH2区中Asn297位(根据Kabat编号)的糖基化。
在本申请中，术语“HCDR”指的是抗体重链互补决定区，“LCDR”指的是抗体重链互补决定区，互补决定区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补。
在本申请中，术语“VH”指的是抗体重链可变区，“VL”指的是抗体轻链可变区。抗体轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。
在本申请中，术语“HC”指的是抗体重链，“LC”指的是抗体轻链。
在本申请中，术语“糖”通常是指单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。术语“糖衍生物”在申请中通常是指单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH2)、半乳糖胺(GalNH2)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸(Sia)(也被称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc))、和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例也包括本申请中表示为GalX的化合物，其可以为半乳糖或半乳糖衍生物。糖衍生物的实例也包括本申请中表示为Fuc*的化合物，其可以为岩藻糖衍生物。
在本申请中，术语“直接连接”通常是指连接位点不包含另外的化合物(例如，其他糖基)或接头。例如，一个分子或实体与另一个直接连接，可以指二者之间不存在另外的分子或实体。例如，直接连接可以指一个部分与另一部分连接而没有任何中间部分或接头。例如，GlcNAc与蛋白质(如抗体)的氨基酸残基直接连接一般是指GlcNAc通过共价键与该蛋白质的氨基酸残基连接，例如通过N-糖苷键与酰胺氮键连接该蛋白质的氨基酸(如天冬酰胺氨基酸)侧链上的原子。在本申请中，当GlcNAc与蛋白质的氨基酸“间接连接”时，GlcNAc与蛋白质的氨基酸之间通常存在至少一个单糖部分。
在本申请中，术语“核苷酸”通常是指由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)和一个、两个或三个磷酸基组成的分子。不含磷酸基时，核碱基和糖构成了核苷。因此，核苷酸也被称为核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。核碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。核苷酸的实例包括二磷酸核糖核苷酸，例如尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)。
在本申请中，“Asn297”或“N297”可以互换使用，是抗体Fc片段的位点297(根据Kabat编号系统编号的)处的天冬酰胺。Asn297可以附接有一个或多个寡糖。
在本申请中，术语“GlcNAc”或“N-乙酰葡萄糖胺”可以互换地使用，通常是指单糖葡萄糖的酰胺衍生物。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指含有来自非人动物的一些或全部CDR的抗体，并且抗体的框架和恒定区含有源自人抗体序列的氨基酸残基。
在本申请中，术语“α1，6糖苷键”，“α1，3糖苷键”，“β1，4糖苷键”指糖之间的连接方式。如Fuc可通过α1，6糖苷键，使其C1位置与GlcNAc的C6位置。如GalX可以通过β1，4糖苷键，使其C1位置与GlcNAc的C6位置连接。如Fuc*可以通过α1，3糖苷键，使其使其C1位置与GlcNAc的C3位置连接。
在本申请中，术语“治疗”通常是指获得期望的药理和/或生理效果。该效果在完全地或部分地预防疾病或其症状方面可能是预防性的，和/或在疾病和/或由该疾病引起的副作用的部分或完全治愈方面可能是治疗性的。本申请中所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并包括预防疾病在受试者中发生，所述受试者可能易感染疾病但是还未被诊断出患有该疾病；抑制疾病，即阻止其发展；缓解疾病，即引起疾病的消退。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族。本申请中的PD-1可以为人PD-1，鼠PD-1或者其他种属来源的PD-1。在某些实施方案中，PD-1为人PD-1。
在本申请中，术语“iRGD”，通常是指自N端到C端序列为H2N-Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys-COOH，首尾两个Cys(半胱氨酸)形成二硫键的环状多肽。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (21)

1.一种抗体偶联物，其特征在于，包括PD-1抗体和iRGD，所述PD-1抗体特异性结合于人或小鼠PD-1蛋白的一个或多个表位，所述iRGD是氨基酸序列为c(CRGDKGPDC)的环状多肽。
2.根据权利要求1所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与GlcNAc连接，b为0或1；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接；
z为1～8中的任一整数。
3.根据权利要求1所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
与PD-1抗体直接连接的GlcNAc为核心GlcNAc，核心GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与核心GlcNAc连接；
Man为甘露糖；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接。
4.根据权利要求1所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物的结构如下：
式中：为PD-1抗体；
GlcNAc与PD-1抗体的氨基酸直接或间接连接；
GalX是半乳糖或其衍生物，GalX通过β-1，4糖苷键与GlcNAc连接；
Fuc为岩藻糖，Fuc通过α1，6糖苷键与GlcNAc连接，b为0或1；
Fuc*为包含iRGD的岩藻糖衍生物，Fuc*通过α1，3糖苷键与GlcNAc连接。
5.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述PD-1抗体包含以下抗体或其抗原结合部分：特瑞普利单抗、信迪利单抗、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗、派安普利单抗、赛帕利单抗、斯鲁利单抗、帕博利珠单抗和2E5。
6.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，
所述PD-1抗体包含HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1；
所述HCDR3包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；
所述HCDR2包含SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
所述HCDR1包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；
所述LCDR3包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列；
所述LCDR2包含SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列；
所述LCDR1包含SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，
所述PD-1抗体包含VL和VH；
所述VL包含SEQ ID NO 7所示的氨基酸序列；
所述VH包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述PD-1抗体的重链包含SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列，轻链包含SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述PD-1抗体包含Fc片段，所述GlcNAc与Fc片段中的Asn直接或间接连接。
10.根据权利要求9所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述GlcNAc与Fc片段中的Asn297直接或间接连接，所述Fc片段根据Kabat编号系统编号。
11.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述Fuc*具有iRGD-L-Fuc’结构，L为连接子。
12.根据权利要求11所述的一种抗体偶联物，其特征在于，iRGD-L-Fuc’结构中，所述iRGD具有以下结构：
式中右侧的螺线处表示和L连接。
13.根据权利要求11所述的一种抗体偶联物，其特征在于，iRGD-L-Fuc’结构中，所述L的结构如下：
式中，FL为间隔子，FL选自以下物质中的至少一种：多肽及其衍生物、聚乙二醇及其衍生物、烷基及其衍生物；s为0或1。
14.根据权利要求11所述的一种抗体偶联物，其特征在于，iRGD-L-Fuc’结构中，Fuc’的结构如下：
式中，右端的螺旋线表示Fuc’与GlcNAc连接，左端的螺旋线表示Fuc’和L连接。
15.根据权利要求12～14所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述Fuc*的结构如下：
式中右端的螺线表示Fuc*与GlcNAc连接。
16.根据权利要求2～4任一项所述的一种抗体偶联物，其特征在于，所述GalX选自以下结构中的至少一种：
其中，上述结构中的螺线处表示与GlcNAc连接。
17.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1～4任一项所述的抗体偶联物，以及至少一种在药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
18.一种用于制备如权利要求2所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将3-15mg/mL的PD-1抗体、0.01-0.1mg/mL的EndoS和0.5-2mg/mL的Alfc在50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中，30-37℃下孵育；
步骤二、24小时后，向步骤一的反应混合物中加入UDP-Gal、UDP-GalNAz或UDP-GalNAc中的任一种、牛β1，4-GalT1和MnCl2，在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到抗体；
步骤三、用蛋白A树脂纯化修饰步骤二得到的抗体，得到αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc，3-15mg/mL的αPD-1-(GalXβ1，4)GlcNAc通过超滤换液置换为50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，与终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度为0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT和终浓度为0-10mM的MgCl2在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到修饰的抗体；
步骤四、用蛋白A树脂纯化步骤三得到的修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物。
19.一种用于制备如权利要求3所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、3-15mg/mL的PD-1抗体与0.01-0.1mg/mL的EndoS在50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液中，30-37℃下孵育0.1-1小时；
步骤二、向步骤一的反应混合物中加入终浓度为1-10mM的UDP-Gal或UDP-GalNAz中的任一种、终浓度0.1-0.5mg/mL的牛β1，4-GalT1和终浓度0.1-5mM的MnCl2，在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到修饰的抗体；
步骤三、用蛋白A树脂纯化修饰的抗体，得到αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc，3-15mg/mL的αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc通过超滤换液置换为50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，与终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT和终浓度0-10mM的MgCl2在30-37℃条件下孵育2-48小时，得到PD-1抗体iRGD偶联物：αPD-1-(Fucα1，6)(GalNAzβ1，4)GlcNAc-FAm-iRGD。
20.一种用于制备如权利要求4所述的抗体偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、3-15mg/mL的PD-1抗体、终浓度1-10mM的UDP-Gal、终浓度0.1-1.0mg/mL的牛β1，4-GalT1、终浓度0.1-5mM的GDP-FAm-iRGD、终浓度0.1-1mg/mL的Hp1，3-FucT、终浓度0-10mM的MgCl2和50mM的pH为5.0-8.0的Tris-HCl缓冲液在30-37℃条件下孵育24-72小时，得到修饰的抗体；
步骤二、用蛋白A树脂纯化步骤一得到的修饰的抗体，得到PD-1抗体iRGD偶联物：αPD-1-G2F-FAm-iRGD。
21.如权利要求2～4任一项所述的抗体偶联物在制备免疫治疗药物中的应用。
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