JPH01503308A - ヘモグロビン コンプレツクス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモグロビン　コンプレックス 技術分野 本発明は代用血液（ｂｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）およびそれらの調製方 法に関する。

ピリドキサール−５−ホスフェートはヘモグロビンヲ可逆的に結合することが知 られており、またこの結合は還元により非可逆的にできることおよび可逆的およ び非可逆的に結合された生成物はいずれもヘモグロビンそれ自体よりも酸素結合 特性が弱いことも知られている。しかしながら、ピリドキサール−５′−ホスフ ェートを用いた共有結合誘導体化ではデキストラン−ヘモグロビンの酸素親和性 をピリドキサール−５′−ホスフェ−）ヲ用１’て誘導体化されたヘモグロビン （ＰＬＰ−Ｈｂ）のそれに近づけることはできないことが判っている。満足のい くヘモグロビン基代用血液には、　ＰＬＰ−Ｈｌ）のそれに近いまたはそれより も低い酸素親和性が望ましいと考えられる。

背景技術 ＵＳ！％許第４，０６４，１１８号は、約５，０ＯＣＩ〜約２．ｏｏｏ；ｏｏｏ の分子量を有するデキストランが共有結合的に結合したヘモグロビンの水溶性生 成物より成る、代用血液または血液増量剤として有用な組成物を記載している。

しかしながら、ヘモグロビンに比べ、ＵＳ特許！４，０６４，１１８あるが、ヘ モグロビンの本質的な酸素運搬・放出能を維持していることが判っている。

ＵＳ第許第４，６５０，７８６号は酸素親和性が低下した変性デキス）ラン−ヘ モグロビンコンプレックスを記載している。この変性デキストラン−ヘモグロビ ンコンプレックスは、まずそのデキストラン部分を活性化し、次いでその活性化 されたデキストランをヘモグロビンまたはヘモグロビン−イノシトールテトラキ スホスフェートジアルデヒド（ＦＰＡ）コンプレックスと反応させることにより 調製される。

しかしながら、デキストラン−ヘモグロビンコンプレックスや変性デキストラン −ヘモグロビンコンプレックスには、例えば１２日間またはそれ以上貯蔵した場 合に水溶液の粘度が高くなり過ぎて投与に不適当となる欠点がある。

我々は今般驚くべきことに、ヘモグロビンコンプレックスの酸素運搬特性に影響 を与えることなく、デキストラン部分の活性化部位をブロックでき、貯蔵時粘度 を改良させることができることを見出した。

発明の概要 本発明により、我々は、約７０，０００〜約２，０００，０００の分子量を有し そして次の式Ｉ Ｂ−Ｘ−’（ＰＳ）　−ｘ−（ｉ　１ （式中。

ｐｓは約２．ＯＤＤ〜２．Ｏ’００，０００の分子量の多糖類であり。

Ｘは共有結合的に結合した化学的架橋基であり、ＨはＨｂまたはＨｂ−Ｚ基であ り、 Ｂはブロックされた活性化基であり、 Ｈｂはヘモグロビン残基であり、そして２は２個またはそれ以上のホスフェート 基を含む酸素親和性低下性リガンドである） で示される水溶性化合物を提供する。

本発明により、我々は、次の式■ Ａ−Ｘ−（ＰＳ）　−ｘ−＠　ＩＩ （式中、 Ｘ％ＨおよびＰＳは前述の意味を有し、そしてＡは活性化基である） で示される化合物を活性化基をブロックできる化合物と反応させることより成る 式Ｉの化合物の製造方法をも提供する。

前記活性化基は多糖類の水酸基と反応し得るものでなければならない。更に、そ れは引き続きヘモグロビンと反応し得るものでなければならない。ヘモグロビン 上で利用可能な基としては例えばアミノ、フェノール（ｐｈｅｎｏ−１ｉｃ）、 スルフヒドリル、チオメチル、イミダゾ、カルボキシルおよびグアニジンなどが 挙げられる。

従って活性化基には次のものが包含され得る＝１）ヘモグロビン分子のアミノ基 と反応するアシル化基；１１）ヘモグロビン分子のスルフヒドリル、チオメチル 、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基；１ｉｉ）　ヘモグロビン分 子のカルボキシル基と反応するエステルまたはアミド形成基； １■）ヘモグロビン分子のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基； ■）ヘモグロビン分子のグアニジノ基と反応するジカルボニル基； Ｖｉ）　ヘモグロビン分子のフェノール基と反応するジアゾ基；または ｖｉｉ）　ヘモグロビン分子のアミノ基と反応する、ＪＩＥシアンと多糖類との 反応により得られる反応性基。

いずれの慣用の活性化基を用いてもよいが、ＵＳ特許第４．０６４，１１８号に 開示されているような活性化基が好ましＡ０ 特に、活性化基はアルキル化基、特にブロモアセチル基より成るのが好ましい。

好ましい活性化基はへロアセチルアミノアルキルアミノ基、好ましくはブロモア セチルアミノアルキルアミノ基、特にブロモアセチルアミノエチルアミノ基であ る。

前述の活性化基は、アミノ化合物、例えばテロシ／：。

またはスルフヒドリルと反応させることによりブロックすることができる。

活性化基の含量は、その化合物を加水分解することにより、好ましくは例えばＮ ａＯＨを用いて塩基加水分解することにより測定することができる。例えば、活 性化基が臭素を含んでいる場合には、　ＮａＯＨで加水分解すると活性化基は臭 素イオンに１対１で変化される。活性化化合物は、自体知られた慣用の分析技術 を用いて、例えばイオンクロマトグラフィにより、あるいは活性化基が臭素を含 んでいる場合にはブロマイド電極を用いて測定することができる。

弐Ｉの化合物のＰ２Ｏ値は、例えばＥｅｎｅｓｃｈ、　ＭａｃＤｕｆｆおよびＢ ｅｎｅｓｃｈ（１９６５）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１１８１〜８７の方 法によって測定される酸素解離曲線から測定することができる。

式■の化合物は２４℃において、７　ｒｎｒｎＨｇ以上、好ましくは３ｍｍＨｇ 、より好ましくは９ｍｍＨｇ以上、更により好ましくは１０ｚ＋：１１ｉＥｇ以 上のｐｓｏ値を有し得る。

ブロモアセチルアミノエチルアミン活性化基は好ましくは、スルフヒドリル基を 含む適切な化合物と反応させることによりブロックされる。

スルフヒドリル基を含む適切な化合物は生成物の酸素親和性に実質的に影響を与 えないものであり、例えばシスティン（２−アミノ−３−メルカプトプロピオン 酸）、システアミン（２−７ミノメチルメルカブタン）、２−メルカプトエタノ ール、２−メルカプトエタンスルホン酸および好ましくは３−メルカプトプロピ オン酸などである。

スルフヒドリル化合物のヘモグロビンに対する割合が高いとヘム基の損傷を招く ことがあり、従って避けるのが好ましい。式■の化合物がヘモグロビンに関し６ 〜８％　ｗ／ｖの濃度にある場合、スルフヒドリル化合物の使用濃度は、好まし くは１６０式以下、好ましくは８０ま以下、そしてより好ましくは５０ｐＭ以下 である。スルフヒドリル化合物濃度を１５〜２０二１１１例えば約１６ｍＷ　、 の濃度とするのが特に好ましい。反応を効果的に、そしてヘモグロビンに対する 損傷を回避するように行うには、−は好ましくは７〜１１．５の範囲、より好ま しくは８．５〜１０，５の範囲、そして更に好ましくは９〜１０の範囲、例えば 約９５とする。

活性化基を不活性し得る化合物との反応は、好ましくは約２５℃以下、より好ま しくは０〜５℃で行われる。

活性化基を不活性化し得る化合物との反応後、式■または■の化合物を自体知ら れた慣用の方法、例えば透析により単離することができる。

多糖類は、約５．ＯＤＤ〜２０．０００．０００の分子量、例えば約ｉｏ、ｏｏ ｏ〜ｉｏｏ、ｏｏｏの平均分子量とするのが好ましい。

その多糖類は、例えばヒドロキシエチルスターチであってもよいが、多糖類は７ ０，０００，４０，０００または２０，０００の平均分子量のデキストランであ るのが特に好ましい。

Ｈｉｔｐｂ−ｚ基であるのが好ましい。更に、Ｚはそのヒドロキシ基のうちの２ 個またはそれ以上が燐酸でエステル化されているポリオールであるのが好ましい 。特に、２は好ましくは２〜６個、より好ましくは２〜４個のホスフェート基を 含む。Ｚがポリオールのホスフェートエステルである場合、そのヒドロキシ基の うちの少くとも２個、好ましくはすべてが燐酸でエステル化されている。

更に、Ｚは４〜８個の炭素原子を含みモして直鎖状基であるのが好ましい。更に 、Ｚは、（少くとも１個の末端炭素原子以外の）各炭素原子が場合により燐酸で エステル化されたヒドロキシ基を有するポリオールから成るのが好ましい。

２基はＵＳ特許第４６５０７８６号に開示された方法に従ってヘモグロビンに結 合することができる。

ｚ基はイノシトールホスフェートから誘導するのが好ましい。イノシトールホス フェートは既知化合物であり、そしてこれまた自体知られた方法により製造し単 離することができる。ｚ基は、イノシトールテトラホスフェートから、例えば高 割合のイノシトールテトラホスフェートと低割合の他のイノシトールホスフェー トを含有する混合物から誘導するのが特に好ましい。

本発明により、我々は、更に、約７０，０００〜約２，０００，０００の分子量 を有しそして弐■ （ＰＳ）、　−Ｘ　−（Ｈｂ）　−Ｚ　ｌ（式中、Ｘ　、　ＨｂおよびＺは請求 の範囲第１項に記載された意味を有し、また（ｐｓ）ａは〜モグロビン１モルあ たり０．４モル以下の活性化基を含む約２．ＯＤＤ〜約２００．ＯＤＤの分子量 の多糖類である） で示される水溶性化合物を提供する。

式■の化合物は、式■の活性化化合物を前述の如き方法を用いてブロックするこ とにより製造できる。

ヘモグロビンのモル数に対する活性化基のモル数は好ましくは０．２以下、より 好ましくは０．１以下である。

化合物のヘモグロビン含有量は自体既知の慣用技術を用いて、例えば分光光度測 定分析（所定波長、例えば４１５ｎｍで光学密度を測定する）により、またはり 、　Ｌ。

ＤｒａｂｋｉｎおよびＪ、　Ｈ，Ａｕ５ｔｉｎ　ＳＪ、　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ｃｈｅｍｉ　−５ｔｒｙ　、Ｖｏｌ　１１２　ｐｐ　５１〜６５（１９３５） の方法により測定することができる。

式■の化合物は、例えば、欧州特許第０．１４０，６４０号の実施例１に記載さ れた如くに製造することができる。

本明細書に言及されるヘモグロビンは任意の適宜の動物、例えば牛馬の動物に由 来するものであってもよいが、ヒトヘモグロビンであるのが好ましい。

産業上の利用可能性 本発明の化合物は、酸素運搬能を有し有用である。従って、それら化合物は、例 えばＵＳ特許第４．３４３，７１５号Ｃ；記載の系における、固定化酸素抽出剤 （ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄｏｘｙｇｅｎ　ｅｘｔｒａｃｔａｎｔｓ）として有用 である。またそれら化合物は、代用血液または血液増量剤組成物としての用途の 適用もある。従って本化合物は、循環不良組織への酸素添加を高めるのに用いる ことができる。このような循環不良組織は癌増殖部、心筋梗塞または脳内出血の 場合に存在し得る。また本化合物は、代用血液として、例えば事故または暴力の 犠牲者に対して；血液の型と適合が不可能であり時間内に入手出来ない場合：患 者が通常の輸血では危険を伴うかそのような輸血を拒絶する場合：嘉保存すべき 組織または器官への酸素運搬目的のために；体外循環系のプライミングのために ；または赤血球において通常示されるその他の状況に用いることができる。

本発明により、我々は、医薬として用いるための式ｌの化合物を提供する。特１ ＝、我々は、酸素添加不良組織治療用医薬の調製に用いるだめの式Ｉの化合物を 提供する。

本発明の化合物は、薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤または担体と混合して、 例えば水溶液（これは緩衝されバランスのとられた塩溶液であってよい）として 当該患者に投与することができる。

本発明により我々は、式ｌの化合物を薬学的に許容し得る補助剤、希釈剤または 担体と混合して成る薬学的ね放物を提供する。

一般に本発明化合物は、血漿増量剤の投与に通常用いられるタイプの組成、包装 および投与形態を用いて投与される。また本発明化合物は、場合により低温保護 剤と共に、凍結乾燥し、次いで使用に際し再構成することができる。

本発明化合物の投与量は、患者の大きさ、状態および所望される治療により異な ることとなる。しかしながらある種の重症例（二おいては、本発明化合物を含む 組成物により実質的にすべての患者血液を置き換えることができる。

本発明化合物は、類似の既知化合物に比べより望ましい酸素吸収・放出特性を有 し、またより長い貯蔵寿命をもち、例えば貯蔵時粘度増加が低下するなどの点で 有利である。また本発明の化合物は、容易にかつ比較的高収率で製造できる点で も有利である。

本発明化合物は、補元動物（二対し宿主ヘモグロビンを置換するために投与する ことができる。更に我々は、９９％　ｖ／ｖヘモグロビン以下、好ましくは９８ ％ｖ／ｖ以下、より好ましくは９６％　Ｖ／Ｖそして特に９５％ｖ／ｖ以下の置 換のだめの医薬として用いるだめの本発明化合物を提供する。

本発明を次の実施例により例示するが、それによっていささかも限定されるもの ではない。実施例中温度は摂氏温度であり、また粘度はＯｓ　ｔｗａ　１ｄ粘度 計を用いて３７℃で測定した。

実施例　１ 式Ｉの化合物の製造 ａ）式■の化合物の形成 以下の手順をＯ〜４°で行った。Ｎ−ブロモアセチルアミノエチルアミノ−デキ ストラン（Ｂｒ−ｄｘ）　（ＵＳ特許第４０６４１１８号の実施例１の方法に従 って調製）とヘモグロビン（Ｈｂ）とを０．０５　Ｍ重炭酸ナトリウム中で一夜 インキユベーションすることによりＮ−ブロモアセチルアミノエチルアミル−デ キストラン−ヘモグロビン（Ｂｒ−ｄｘＨｂ）を製造した。０．０５　Ｍ重炭酸 ナトリウム（ｐＨ＝９．５）中の１ｏｏ−の氷冷６％ｗ／ｖ　（Ｗｂについて） Ｂｒ−ｄｘＨｂを４，４５−の２Ｍビス〔２−ヒドロキシエチルツーイミノ−ト リス−〔ヒドロキシメチルコメタン（ｂｉｓ　−Ｔｒｉｓ　）　（ｐ）（Ｚ５　 ）と混合した。この混合物に、６８−の０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ＝５． ２　’）中の０．５２のイノシトールテトラキスホスフェートジアルデヒド（Ｆ ＰＡ）を添加した。Ｄ、　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを用いて困な７４に調節し、１０ｍ １．の０．５　Ｍジメチルアミンボランを添加し、そしてその混合物を００で２ 時間攪拌しながらインキュベートした。８％ｗ／ｖ水性溶液を調製した。

ｂ）　３−メルカプトプロピオン酸による処理法に、前記工程ａ）の生成物に重 炭酸ナトリウムを添加して最終濃度０．２　Ｍとし、そして−を０．　Ｉ　Ｎ　 ＮａＯＨを用いて９５に調節した。６−メルカプトプロピオン酸を１６戊の最終 濃度となるまで添加した。次にその混合物を１ＭＮａＣ１を含有する０、　１　 Ｍ　）リス〔ヒドロキシメチルコアミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ｃｌ）緩衝剤 （ｐＨ８，５）に対して、次いで腎透析緩衝剤（ｐＨ７，４）に対して透析した 。８　％　Ｗ／Ｖ水性溶液を調製した。

実施例１　ａ）およびｉ　ｂ）の生成物のブロモアセチルアミノエテルアミノ（ ＢＡＥＡ）基を実施例４の方法１：より測定した。

実施例１　ａ）およびｉ　ｂ）により調製された溶液の粘度を時間間隔をおいて 測定した。結果は第１表に掲げである。

実施例　２ 前記実施例ｉ　ｂ）の手順を、６−メルカプトプロピオン酸に代えて ａ）　Ｌ−システィン ｂ）メルカプトエタノール を用いて行った。その生成物の８チ弓ん水性溶液を調製した。

生成物のＢＡＥＡ基含量全含量例４の方法により測定した。

溶液の粘度は時間間隔をおいて測定した。結果は第１表に掲げである。

実施例　３ ａ）実施例１　ａ）の生成物の６％ｙ／ｖ水性溶液を調製した。

ｂ）実施例１ｂ）の生成物の６　％　ｗ／ｖ水性溶液を調製した。

溶液の粘度は時間間隔をおいて測定した。結果は第１表に掲げである。

実施例　４ ＢＡＥＡ基含量 全含量施例１および２　ａ）およびｂ）に記載の如く調製された代用血液のＢＡ ＥＡ基含量全含量方法により測定した。

実施例１および２　ａ）およびｂ）の生成物をＱ、　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ中で１０ ０°で６０分間インキュベートした。次にその混合物を氷冷し、（１Ｎ酢酸を用 いて）　ｐＨ７，０に中和し、炉遇し１そしてイオンクロマトグラフィを用いて ブロマイド含量を分析した。

実施例　５ ５　実施例１および２　ａ）およびｂ）の生成物の酸素解離曲線を、Ｂｅｎｅｓ ｃｈ、　ＭａｃＤｕｆｆおよびＢｅ１１ｅｓｃｈ（１９６５）　Ａ＝ａｌ。

Ｂｉｏｃｂｅｍ　１１　Ｂ１−８７の方法を用いて（ただし２４°の温度および ０．０５Ｍ　ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，４）を用いる）作成した。結果を第 １図に示す。図中： ｙ軸は、Ｌｏｇ　ＰＯ２（０２の分圧）であり、ｙ軸は、酸素添加率（％）であ る。

１）実施例１ａ）の化合物 ２）実施例１ｂ）の化合物 ３）実施例２ｂ）の化合物 ４）実施例２ａ）の化合物 第１図より、２４°でのＰ２Ｏ値は次のとおり測定された：１）　１０．３　ｍ ＩｒｌＨｇ ２）　１０．３　ｍｐＨｇ ３）　８．７　ｍｚＨｇ ４）　９．５ｚ二Ｈｇ し 国際調査報告 匡際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）約７０，０００〜約２，０００，０００の分子量を有し、そして式Ｉ Ｂ−Ｘ−（ＰＳ）−Ｘ−（Ｈ）Ｉ （式中 ＰＳは約２，０００〜約２，０００，０００の分子量の多糖類であり、Ｘは共有 結合的に結合した化学的架橋基であり、ＨはＨｂまたはＨｂ−Ｚ基であり、 Ｂはブロツクされた活性化基であり、 Ｈｂはヘモグロビン残基であり、そしてＺは２個またはそれ以上のホスフェート 基を含む酸素親和性低下性リガンドである） で示される水溶性化合物。 ２）活性化基がアルキル化基より成る請求項１）記載の化合物。 ３）活性化基がスルフヒドリル基によりブロックされる請求項１）に記載の化合 物。 ４）スルフヒドリル基が３−メルカプトプロピオン酸である請求項３）に記載の 化合物。 ５）２４°Ｃにおいて７ｍｍＨｇ以上のＰ５０値を有する請求項１）に記載の化 合物。 ６）医薬として使用するための請求項１）に記載の化合物。 ７）酸素添加不良組織治療用医薬の調製に用いるための請求項１）に記載の化合 物。 ８）請求項１）に記載の化合物を薬学的に許容し得る補助剤、希釈剤または担体 と混合して成る薬学的組成物。 ９）式ＩＩ Ａ−Ｘ−（ＰＳ）−Ｘ−（Ｈ）ＩＩ （式中Ｘ、ＨおよびＰＳは請求項１）に記載の意味を有し、そしてＡは活性化基 である） で示される化合物を活性化基をブロックできる化合物と反応させることより成る 式Ｉの化合物の製造方法。 １０）活性化基をブロックできる化合物がスルフヒドリル基を含有する請求項９ ）に記載の方法。