NL8300757A - Resorbeerbaar ijzerderivaat, dat de maagwand niet aantast, werkwijze voor zijn bereiding en geneesmiddelen met dit derivaat daarin. - Google Patents

Description

i VO 4622 »·** - * f

Titel: Resorbeerbaar ijzerderivaat, dat de maagwand niet aantast, werkwijze voor zijn bereiding en geneesmiddelen met dit derivaat daarin.

De uitvinding betreft gesuccinyleerde eiwitten met een succinyleringsgraad tussen 20 en 100% met daarin 0,1 - 20 gew.% ijzer, die verkregen worden door een omzetting van gesuccinyleerde eiwitten met ijzerzouten en wel bij een passende pH. De genoemde verbindingen 5 worden bijzonder goed verdragen en gekenmerkt door een optimale resorptie van het ijzer.

IJzer, dat aanwezig is in alle lichaamsweefsels speelt een onmisbare fysiologische rol. Het is deel en een essentieel bestanddeel van haemoglobine, nyoglobine en de enzymen: catalase ,fumaarzuur-dehydro-10 genase, peroxidase, de cytochromen, DPN-cytochroomreductase en metalloflavo-proteinen, zoals ferroflavine. De weefsels van een volwassen menselijk lichaam bevatten 1,5 tot 5 g ijzer, waarvan 60-65% in de rode bloedlichaampjes is geconcentreerd, terwijl 18-30% gebonden is aan de ferritine-eiwitten en hae nosiderine, welke stoffen zijn geloca-15 liseerd in de lever, de milt, het beendermerg en cellen van het endotheliale reticulaire systeem. De rest is verdeeld in de diverse genoemde enzym-systemen, in nyoglobine (ca. 4%) en in transferrine (ca. 0,1%), het β^-globuline voor het bloedtransport van ijzer van darmafkomst. Dit is in staat bij fysiologische pH-waarden twee atomen 20 ijzer op een practisch niet dissocieerbare wijze te binden.

De behoefte aan ijzer wordt gedeeltelijk door endogeen ijzer (afkomstig van de destructie van oude rode bloedlichaampjes) en gedeeltelijk door een opname van exogeen ijzer gedekt. De opname van exogeen ijzer vindt plaats via het duodenum en het bovenste deel van 25 het jejunum en dit ijzer wordt hoofdzakelijk in de lever opgeslagen.

Het eerste pathologische symptoom van een ijzer-deficiëntie is een hyperchrome sideropene anemie, waarvan de primaire oorzaak kan variëren: chronische bloedingen, die plaatsvinden bij maag-darm zweren of neoplasie; een deficient dieet of een slechte opname zoals bij 30 diarrhee; verhoogde behoefte, bijvoorbeeld bij zwangerschap, melkgift, infectieuze ziekten enz.; slecht metabool gebruik; specifieke behandelingen zoals een toediening van ACTH en cortisonen.

De meest geschikte therapie is de toediening van ijzer.

8300757 ιΡ ί -2-

Dit vermindert de anemie sterk wanneer deze voortvloeit uit een actuele ijzer-deficientie. Dit gaat evenwel veelal gepaard met ongewenste neveneffekten, die verband houden met het vector-type, dat voor het ijzer wordt gebruikt. De meest gebruikte farmaceutische orale 5 preparaten zijn gebaseerd op diverse organische en anorganische zouten, die langzamerhand bij de therapie zijn ingevoerd in de hoop de bovengenoemde neveneffekten te verminderen. Orale specialiteiten zijn bijvoorbeeld op de markt gebracht op basis van: ferri-chloride, ferrosulfaat,ferrifosfaat, of zelfs organische zouten, zoals citraten, 10 cholinaten, aspartaten, fumaraten, gluconaten, glycinaten, lactaten, oxalaten en succinaten. Bij een diepe intramusculaire toediening is ferro-dextran complex voorgesteld, terwijl voor i.v. behandelingen (voor een sideropene anemie, waarbij een orale behandeling heeft gefaald) gebruik..is gemaakt van het ferro-dextrine complex.

15 Bij deze laatste typen complexen kunnen de neveneffekten evenwel de vorm aannemen van allergische reacties, temperatuursverho-gingen, tachycardie, leucocytose, lymphadenopathie bij intramusculaire behandeling en zelfs anaphylactische shock, thrombo-phlebitis en circulaire collaps bij een i.v. behandeling.'Bij een orale behandeling 20 onder toepassing van recepten gebaseerd op de bovengenoemde verbindingen worden neveneffekten veelal gevormd door maag-darm-beschadigingen met necrose en perforatie van de slijmvliesmembranen in de ernstigere gevallen, alsmede diarrhee en braken. Voorts maakt een slechte verdraag» baarheid een toediening van passende hoeveelheden ijzer moeilijk. Om deze 25 neveneffekten tot een minimum terug te brengen is gesuggereerd gelijktijdig voedsel in te nemen, maar dit is in tegenspraak met de bewezen variabiliteit tg.deresorptie van ijzer als functie van de samenstelling van dit voedsel zelf. In feite is bewezen., dat de resorptie van ijzer uit preparaten optimaal is, wanneer de patient juist heeft gevast.

30 Bovendien wordt een irritatie van het maagslijmvlies veelal gevolgd door een gebruik van antacida, die op hun beurt de resorptie verminderen en de anemische toestand verergeren.

Aanmerkelijke vooruitgang in de ijzertherapie, speciaal de orale therapie is bereikt met introductie van op ferritine gebaseerde 35 specialiteiten.

Ferritine is een ijzer-globuline en vormt het belangrijkste 8300757 » Λ -3- i jzer-houdende eiwit in het lichaam van zoogdieren. Het commerciële produkt wordt geëxtraheerd uit paardenmilt als uitgangsmateriaal.

Zijnijzergehalte bedraagt 20% berekend op het droge gewicht. Het eiwitstuk, apoferritine, heeft een molecuul gewicht van 5 ca. 44500 en omgeeft een kern van crystallijn oxide-fosfaat-ijzer.

Dit is bijzonder bruikbaar voor een orale toediening, aangezien het oplosbaar is in water.

Een op ferritine gebaseerde behandeling resulteert niet in maag-darm-neveneffekten die worden veroorzaakt door de eerder genoemde 10 ijzerderivaten. Het gebruik daarvan is echter beperkt vanwege de hoge kosten van het uitgangsmateriaal en in het bijzonder door de beperkte beschikbaarheid van dit uitgangsmateriaal.

De stand van de techniek lijkt aan te tonen, dat de optimale drager voor het ijzer voor een goede resorptie zonder neveneffekten 15 een eiwitdrager zou zijn. Vele eiwitten hebben een zekere affiniteit voor ijzer. Bepaalde typen eiwit van dierlijke oorsprong (serum eiwitten, orgaan eiwitten, ovalbuminen, lactoproteinen) of van . plantaardige herkomst (soya eiwit) zijn daartoe onderzocht voor hun toepassing als dragers.

20 De interactie tussen anorganische ferrizouten en de bovenge noemde eiwitten leidt tot een vorming van ferroproteine-derivaten, waarvan het therapeutisch belang evenwel wordt verminderd door een reeks negatieve eigenschappen, zoals: - de onoplosbaarheid van de verkregen derivaten wanneer het gebonden 25 percentage ijzer meer dan 0,5% bedraagt; - de moeilijkheid of zelfs de onmogelijkheid te beoordelen welke fractie van het totale ijzergehalte onder deze onoplosbaarheidr-omstandigheden aan het eiwit wordt gebonden en welke fractie encfe vorm vein gehydrateerde oxiden co-precipiteert, hetgeen ernstige maagklachten kan veroorzaken; 30 - het gebrek aan homogeniteit en stabiliteit wat betreft het ijzer in deze derivaten.

Bovendien is bij sommige eiwitten, met inbegrip van melk-eiwitten de aanwezigheid van oplosbare ijzerderivaten met een aanmerkelijk percentage onoplosbare derivaten bij diverse pH-waarden waargeno-35 men, waarbij de samenstelling van deze oplosbare fracties sterk wisselde 8300757 * * -4- als ftinctie van zeer geringe variaties in de experimentele parameters.

Er werd nu verrassenderwijze gevonden, dat bij een succinylering van de bovengenoemde eiwitten onder passende voorwaarden (een werkwijze die gewoonlijk wordt gebruikt voor het verkrijgen van 5 eiwit-succinyl derivaten voor toepassing in voedingsmiddelen en dierlijk voeder) het mogeUjc is' door een reactie daarvan met ijzer, ferroproteine-derivaten te verkrijgen met een hoog ijzergehalte die stabiel zijn, oplosbaar zijn bij pH-waarden van meer dan 5j verschillende maar reproduceerbare ijzergehalten bezitten, in staat 10 zijn ijzer aan zoogdieren bij orale toediening zonder neveneffekten van het maagzweer-type toe.te voeren. Bij ratten leidde een dagelijkse orale toediening gedurende 20 achtereenvolgende dagen niet tot enigerlei maagbeschadging, tewijl dit materiaal werd verdragen.

Bij ratten toonde een vergelijking tussen de toestand van 15 een sideremie na orale toediening van equjyalente hoeveelheiden ijzer in de vorm van ferrosulfaat, paardemilt-ferritine (Sigma, Saint Louis, Missouri) en ferroproteine-derivaten uit gesuccinyleerde melk-eiwitten, bereid als beschreven in voorbeeld 1, aan dat: a) de bloedijzerspiegels verkregen met het derivaat volgens de uitvin-20 ding vergeleken met die verkregen met ferrosulfaat, in tijd verlengd zijn (zie tabel I); b) de bloedijzerspiegels verkregen met het onderhavige derivaat verge-. leken met standaard ferritine hoger zijn (ca.1,5 x gemiddeld) binnen de zes-uurs-periode van het experiment (zie tabel J).

25 In verband met de goede verdraagbaarheid van het produkt, zijn geringe giftigheid (meer dan 4000 mg/kg bij Swiss muizen), de hoge ijzer-bloedspiegels, die kunnen worden verkregen en het gemak vaa?-mee het uitgangsmateriaal kan worden verkregen, vormt de toepassing van de derivaten volgens de uitvinding een duidelijke verbetering met de 30 stand van de techniek wat betreft een ijzertherapie.

De fysico-chemische eigenschappen van de onderhavige succiny 1-ferroproteinen, als boven weergegeven, zijn reproduceerbaar en_stabiel zoals weergegeven in de voorbeelden. De afwezigheid van ijzer dat orgebonden is, wordt aangetoond door de volledige oplosbaarr 35 heid in een alkalisch medium (voorwaarden waarbij ijzer-ionen precipiteren in de vorm van gehydrateerd oxide) bij de preparaten ver- 8300757

m V

-5- kregen uit gesuccinyleerde eiwitten en een ijzerzout.

De uitvinding betreft derhalve derivaten, die tot dusverre onbekend waren en tot kenmerk hebben, dat ze hoeveelheden ijzer bevatten, die in percentage kunnen variëren, en hoeveelheden dierlijk of 5 plantaardig eiwit, dat in verschillende mate is gesuccinyleerd, welke zo zijn ontworpen dat ze resorbeerbaar ijzer aan zoogdieren verschaffen zonder maag-darm beschadigingen te veroorzaken bij orale toediening, zoals is weergegeven bij de volgende voorbeelden.

Deze derivaten kunnen worden gebruikt als het actieve bestand-10 deel bij de bereiding van farmaceutische specialiteiten voor een behandeling van anemie veroorzaakt door ijzergebrek bij zoogdieren, zodat de uitvinding tevens alle farmaceutica en toedieningen betreft, waarin de onderhavige stoffen voor humane of veterinaire toepassing zijn verwerkt.

15 De uitvinding betreft tevens een werkwijze voor het bereiden van de onderhavige succinyl-ferroproteine derivaten, welke tot kenmerk heeft, dat gesuccinyleerde eiwitten op een op zichzelf bekende wijzé met i jzerionen worden omgezet üj een pH tussen ca. 2 en 10, bij voorkeur bij een pH nabij het neutrale punt,enwel in waterige oplosmiddelen 20 en waarbij de verkregen produkten uit het reactiemengsel worden geïsoleerd door ze bij een pH tussen 2 en 4 neer te slaan, welke laatste pH spontaan of door aanzuren wordt verkregen. Als alternatief kan het reactieprodukt worden geïsoleerd door een verwijdering van het oplosmiddel nadat de pH tevoren nagenoeg neutraal was gemaakt.

25 Voorbeeld I.

Bereiding van 5% ijzerderivaten uit gesuccinyleerde eiwitten van volle melkpoeder.

1 kg Melkpoeder werd gesuspendeerd in 6 liter 0,3M natriumbicarbonaat en onder mechanisch roeren en regelingvan de pH, hieraan 30 500 g bamsteenzuur-anhydride portiesgewijs toegevoegd , waarbij de pH tussen 7,5 en 8 werd gehouden met behulp van een toevoeging van 4N natroloog. Nadat alles was toegevoegd, werd het mengsel nog 2 tot 3 uren bij kamertemperatuur nageroerd. Hierna was alles in oplossing gegaan. De opalescerende oplossing werd gecentrifugeerd of gefiltreerd 35 tot hij nagenoeg helder was en langzaam met zoutzuur aangezuurd tot pH 3. , 8300757

> P

-6-

Hetdaarbij gevormde neerslag werd.afipcentrifugeerd of afge-filtreerd en opnieuw in ca. 8 liter gesuspendeerd. Natraioog werd toegevoegd tddst alles was opgelost (pH ca. 7,5). Hierna werd gecentrifugeerd en de heldere oplossing opnieuw met zoutzuur op pH 2,5-3 5 gebracht.

Hetgenoemde neerslag werd afgefiltreerd of gecentrifugeerd, en gewassen met een zoutzuuroplossing met een pH van 3. Bet residu bestaande uit de gesuccinyleerde proteinen (waarvan de mate van succinylering varieert naar gelang van de gebruikte hoeveelheid bamsteenzuur -10 anhydride; in het onderhavige geval bedroeg deze 90% berekend op de succinyleerbare groepen van het eiwit) werd na drogen onder vacuum in gedestilleerd water gedispergeerd. Het werd opgelost door een toevoeging van natraioog tot pH 7,5, waarbij de oplossing zodanig werd verdund, dat de uiteindelijke eiwitconcentratie ca. 0,04 g/cm3 bedroeg.

15 Een oplossing .van een ijzerzout (bijvoorbeeld FeCl ) in de verhou-

3+ J

ding Fe /gesuccinyleerd eiwit van 1:10 gewichtsdelen werd aan deze oplossing toegevoegd. Hierdoororfcstond een suspensie, die door mechanisch roeren fijn werd gedispergeerd, terwijl de pH tegelijkertijd op ca. 2,5 daalde. Na drie uren naroeren bij kamertemperatuur werd de 20 suspensie gefiltreerd. Het vaste materiaal werd in ca. 3 volumina water gesuspendeerd en wederom opgelost door een toevoeging van natzaloog tot pH 7,5..

De niet geheel heldere oplossing werd nu gefiltreerd en hetvaste materiaal gewonnen onder toepassing van een van de volgende 25 methoden: a) de oplossing werd aangezuurd en het verkregen neerslag bij een pH van 2,5 afgefiltreerd en in vacuo gedroogd; b^ de heldere oplossing werd tegen water gedialyseerd om het natrium chloride te verwijderen en daarna gevriesdroogd of via een sproeier 30 gedroogd.

De opbrengsten aan eindprodukt waren gelijk en bedroegen ca. 20 gew.% van de oorspronkelijke melkpoeder. De eigenschappen van dit produkt zijn weergegeven in tabel A (voorbeeld 1B).

Voorbeeld H.

35 Bereiding van 5% ijzerderivaten van gesuccinyleerde melkeiwitten.

8300757 -7-

Voorbeeld 1 werd herhaald met dit verschil, dat het aanvankelijke produkt bestond uit 350 g melkeiwit, tevoren uit melkpoeder neergeslagen door dispersie van poeder in ca. 5 liter water, aanzuren op pH 2,5 met een anorganisch zuur en vervolgens affiltreren of afcentrifugeren 5 van het vaste eiwitmateriaal gevolgd door drogen.

Het ijzergehalte, zie onder (tabel A), voor de derivaten volgens voorbeelden I en II bedroeg ca. 4-5 gew.%.

Voorbeeld lil.

Bereiding van ijzerderivaten uit gesuccinyleerde melkeiwitten met 10 verschillende ijzergehalten.

De voorbeelden I en li werden herhaald met dezelfde hoeveelheden melkpoeder of tevoren neergeslagen melkeiwitten, terwijl men de verhouding Fe3+/gesuccinyleerd eiwit liet variëren tussen 0,1:10, 0,2:10, 0,5:10 en 1,5:10. Daarbij ontstonden ijzerderivaten, waarvan 15 de eigenschappen zijn weergegeven in tabel A.

Voorbeeld IV.

Bereiding van ijzerderivaten uit gesuccinyleerde eierproteinen (ovalbumine).

5g Ovalbumine werd opgelost in 100 cm3 water met daarin 3g 20 KHCO^ waarna 2,5 g bamsteenzuur anhydride portiesgewijs aan de heldere oplossing werd toegevoegd, terwijl door toevoeging van natroloog de pH tussen 5 en 8 werd gehouden. Dit mengsel liet men 2 uren bij kamertemperatuur reageren. Na aanzuren op pH 3,4 ontstond een neerslag, dat werd af gecentrifugeerd, gezuiverd door oplossen bij pH 7,5 25 en vervolgens neerslaan bij pH 3,4. Het vaste materiaal werd af gecentrifugeerd en in vacuum gedroogd. Het droge materiaal werd in gedestilleerd water gesuspendeerd en opgelost door toevoeging van natcoriLoog tot pH 8, waardoor een uiteindelijke oplossing van 40 g eiwit per liter ontstond.

30 Een oplossing van een ferrizout (bijvoorbeeld ferrichloride) werd toegevoegd aan de zeer visceuze oplossing,waardoor per gewicht een verhouding gesuccinyleerd eiwit/Fe3+ van 10:1 ontstond. Onder deze voorwaarden liep de pH terug tot 2,6 onder vorming van een neerslag, dat werd af gefiltreerd .Dit neerslag werd opnieuw in water opgelost en 35 natroioog toegevoegd tot alles volledig in oplossing was gegaan (pH 7,5).

8300757 ► Λ. · · -8-

Na een dialyse tegen water ter verwijdering van natriumchloride, werd het vaste produkt gewonnen door vriesdrogen of door een sproeidro-ger. De opbrengst aan derivaat bedroeg 33 gew.% berekend op het aanvankelijke eiwit. Het ijzergehalte en de eigenschappen zijn weergegeven 5 in tabel A.

Voorbeeld V

Bereiding van ijzerderivaten van gesuccinyleerde eiwitten van runderse-rum. - 1,5 g NaHCO^ werd toegevoegd aan 50 cm3 van een oplossing 10 van runderserumeiwitten en dit mengsel werd behandeld met 6 g barnsteen-zuur anhydride, dat geleidelijk en portiesgewijs werd toegevoegd, terwijl de pH -tussen 7,5 en 8 werd gehouden door toevoeging van natronloog. Nadat alles was toegevoegd, liet men het mengsel 2 uren bij kamertemperatuur uitreageren, waarna het door aanzuren op pH 2,4 verkregen 15 neerslag werd afgecentrifugeerd en gezuiverd als beschreven in voorbeeld 4.

Het vaste produkt werd in water gesuspendeerd en met natronloog op pH 7,5 gebracht. De aldus verkregen oplossing werd toegevoegd aan een oplossing van ferrizout (bijvoorbeeld ferrichloride) totdat 3+ 20 de verhouding tussen gesuccinyleerd eiwit en Fe 10:1 gewichtsdelen bedroeg. De pH daalde daarbij spontaan op 2,4 en men verkreeg een neerslag, dat bij brengen van de pH op 7,5 slechts gedeeltelijk in oplossing ging. Deze oplossing werd van het residu door centrifugeren gescheiden, daarna een dialyse tegen water uitgevoerd om het natrium-25 chloride te verwijderen en tenslotte gevriesdroogd. De gewichtsopbrengst aan ijzerderivaten vergeleken met het oorspronkelijke eiwit bedroeg ca. 30%. Het ijzergehalte en de eigenschappen zijn weergegeven in tabel A.

Voorbeeld VI.

30 Bereiding van ijzerderivaten uit gesuccinyleerde eiwitten van varkenslever.

400 g Verse varkenslever werd gehomogeniseerd in een Silverson homogenisator bij aanwezigheid van 800 cm3 0,2M KHCO^ oplossing met pH 8,3. Na centrifugeren met 9000 tpm bij 5°C werd bovenstaande 35 vloeistof opgevangen en door een0,45 μ cellulose acetaat membraan gefil- 8300757 -9- treerd. 1,2 g Bamsteenzuur-anhydride werd toegevoegd in opeenvolgende porties aan 50 cm3 van een heldere oplossing, waarbij zo te werk werd gegaan, dat de pH met natrcnloog tussen 7,5 en 8,0 werd gehouden.

De oplossing werd 1 uur bij kamertemperatuur weggezet en 5 daarna aangezuurd met een anorganisch zuur tot de pH 3 bedroeg, waarbij een neerslag ontstond, dat op dezelfde wijze zoals beschreven in voorbeeld IV werd behandeld met dit verschil, dat de uiteindelijke winning werd uitgevoerd door vriesdrogen van de oplossing, die tegen water was gedialiseerd.

10 Het gevriesdroogde residu werd in water gesuspendeerd en met soda op pH 8 gebracht. Dit leverde een oplossing, die niet helemaal helder was en vervolgens werd gecentrifugeerd. Een ijzeroplossing (bijvoorbeeld ferrichloride) werd aan de heldere bovenstaande vloeistof 3+ toegevoegd en wel zodanig dat de (geschatte) succinyleiwit/Fe ver-15 houding ca. 10:1 bedroeg.

De pH van de oplossing daalde daarbij tot 2,6, waarbij een neerslag ontstond, dat op dezelfde wijze werd gezuiverd als in de vorige voorbeelden is beschreven. Het verkregen vaste materiaal na vriesdrogen van de uiteindelijke oplossing werd tegen water gedialiseerd en 20 had de eigenschappen en een ijzergehalte dat is weergegeven in tabel A. Voorbeeld VII.

Bereiding van ijzerderivaten uit gesuccinyleerde soya-eiwltten.

5g Soya eiwit werd gesuspendeerd in 100 cm3 water met daarin 3g NaHCC>3. Dit mengsel werd geroerd totdat alles in oplossing was gegaan, 25 waarbij de pH tussen 7,5 en 8 met natroioog werd gehandhaafd, waarna 2,5 g bamsteenzuur-anhydride portiesgewijs werd toegevoegd. Het mengsel werd hierna 2 uren bij kamertemperatuur geroerd en met een anorganisch zuur op pH 3,4 gebracht, waarbij een neerslag ontstond, dat op dezelfde wijze werd gezuiverd als in de vorige voorbeelden is beschreven.

30 Het vaste residu-van de uiteindelijke vriesdroging werd in 100 cm3 water gesuspendeerd, de pH met soda op 8 gebracht en de oplossing die daarna nog geheel helder was, gecentrifugeerd.

De heldere bovenstaande vloeistof werd met een ijzeroplossing (bijvoorbeeld ferrichloride) behandeld en wel zodanig, dat de verhouding 3+ 35 tussen gesuccinyleerd eiwit en Fe 10:1 gewichtsdelen bedroeg. De pH van de oplossing daalde daarbij spontaan op 2,6 en het gevormde 8300757 -10- neerslag werd op dezelfde wijze als in de voorgaande voorbeelden behandeld. Het verkregen vaste materiaal na vriesdrogen had de eigenschappen en het ijzergehalte dat is weergegeven in tabel A. De gewichts-opbrengst berekend op aanvankelijk gebruikt eiwit bedroeg 22%.

5 CHEMISCH-FYSISCHE EIGENSCHAPPEN VAN DE IJZERDERIVATEN VAN

GESUCCINYLEERDE EIWITTEN VERKREGEN VOLGENS DE VOORBEELDEN I-VII.

De volgens de voorgaande voorbeelden verkregen derivaten werden met de volgende methoden geanalyseerd: a) Mate van suecinylering 10 Deze eigenschap werd uitgedrukt als een percentage van de ge- succinyleerde groepen vergeleken met de groepen, die in het aanvankelijke eiwit kunnen worden gesuccinyleerd. Deze methode is beschreven door Moore & Stein in J. Biol. Chem. 211, 907 (1954), waarbij de vrije aminogroepen met ninhydrine worden omgezet. De resultaten zijn 15 weergegeven in tabel A.

b) IJzergehalte

Het ijzergehalte werd bepaald ofwel na een hete extractie met 2N HC1 of na een volledige ontleding van het eiwit met zwavelzuur, als beschreven in Standard Methods, 14e druk (1975), blz. 208, 20 APHA-AWWA-WPCF (reactie met o-fenantroline). De cijfers zijn weergegeven in tabel A.

c) Spectroscopische gegevens 1) EPR-spectroscopie

Alle derivaten beschreven in de voorgaande voorbeelden vertoon- 25 den hetzelfde spectroscopische gedrag. Het EPR-spectrum van het succinyl-ferroproteinederivaat verkregen volgens voorbeeld I werd bij wijze van voorbeeld uitgetekend. Dit spectrum werd opgenomen bij een gevriesdroogd poeder en had een zeer wijd signaal met een centrum bij ca. g = 2,0 met een signaalamplitude van ca. 2000 G. Een verder goed 30 opgelosd signaal was aanwezig en ook gecentreerd bij g = 2,0. De vorm 3+ van beide signalen was karakteristiek voor een interactie van Fe -paramagnetische centra (Reid et al., Inorg. Chem. 1_, 119, 1968). Al deze cijfers toonden de aanwezigheid van eiwitstructuren rondom het bindende middel aan.

8300757 -11- 2. Circulair dichrolsme

Het gedrag van de diverse derivaten was ook in dit geval telkens nagenoeg gelijk. Het circulaire dichrolsmespectrum van het succinyl-ferroproteïnederivaat volgens voorbeeld I werd bij wijze van 5 voorbeeld uitgetekend. Dit spectrum werd gekarakteriseerd door een negatieve activiteit in de UV-zone. Dit gaf een intens negatieve band aan met een piek rond 200 nm en een schouder, eveneens negatief, gecentreerd rond 225 nm. Deze spectrumkarakteristieken geven de predomi-nantie weer van een willekeurige eiwitstructuur (inter alia: 10 F. Ciardelli & P. Salvador!: Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism - Heyden & Son Ltd., Londen (1973), hoofdstuk 4.5).

3. W-zichtbare absorptiespectra

Het gedrag wat betreft het elektroniscte spectrum van de diverse beschreven derivaten was gelijkelijk. Fig. 1 geeft het UV-zichtbare 15 spectrum weer voor het succinyl-ferroproteïnederivaat verkregen volgens voorbeeld I.

Het spectrum (continue lijn) geeft geen absorptiepieken weer maar slechts een zwakke schouder rond 450 nm. Onder UV was een vrij duidelijke schouder zichtbaar met een centrum bij 270 nm en een zeer 20 intense absorptie met een piek beneden 220 nm.

Fig. 1 geeft eveneens (stippellijn) het spectrum weer van ferritinë uit paardemilt als vergelijking (Boehringer-Mannheim).

De absorptiespectra in het zichtbare stuk zijn weergegeven in fig. 1 en werden uitgevoerd in water met pH 7. Het spectrum van paarde-25 milt-ferritine onder dezelfde voorwaarden is ter vergelijking eveneens weergegeven.

4. Fluorescentie-emissiespectrum

De fluorescentie-emissiespectra zijn weergegeven in fig. 2 waarbij de continue lijn correspondeert met de succinyl-ferroprotelne-30 derivaten volgens de uitvinding, de punt-streeplijn met lactoprotelnen als zodanig en de stippellijn met die voor gesuccinyleerde lactoprotelnen.

Uitdoving van de fluorescentie van het eiwit door de aanwezigheid van metaal kan worden gezien.

35 8300757 -12- d) Elektroforese

De elektroforetische sporen op cellulose-acetaat voor de diverse derivaten vergeleken met de gesuccinyleerde eiwitten, de oorspronkelijke eiwitten en ferritine zijn weergegeven in de fig. 3-6.

> 5 Fig. 3 geeft de resultaten weer van een elektroforese uitgevoerd bij soya-eiwitten (spoor 1), gesuccinyleerd soya-eiwit (spoor 2), ijzer-derivaat van gesuccinyleerd soya-eiwit (spoor 3), ijzerderivaat van niet-gesuccinyleerd soya-eiwit, oplosbare fractie (spoor 4). Fig. 4 geeft de resultaten weer van een elektroforese uitgevoerd bij oval-10 bumine (spoor 1), gesuccinyleerd ovalbumine (spoor 2), ijzerderivaat van gesuccinyleerd ovalbumine (spoor 3) en ijzerderivaat van ovalbumine (spoor 4).

Fig. 5 geeft de resultaten weer van elektroforesen uitgevoerd bij lactoproteinen (spoor 1), gesuccinyleercë lactoproteinen (spoor 2), 15 ijzerderivaat van gesuccinyleerd lactoproteinen (spoor 3), en paarde-milt-ferritine (spoor 4). Fig. 6 geeft de resultaten weer van een elektroforese (densitometrische aflezing bij 550 nm) uitgevoerd bij het ijzerderivaat van gesuccinyleerd lactoprotelne (continue lijn), het ijzerderivaat van gesuccinyleerd soya-eiwit (streep-punt) en het 20 ijzerderivaat van gesuccinyleerd ovalbumine (stippellijn).

e) Gelfiltratie

Het gelfiltratieprofiel op Sephadex G 75 van Pharmacia, te Uppsala van het ijzerderivaat van de gesuccinyleerde melkeiwitten (verkregen volgens voorbeeld I), vergeleken met de gesuccinyleerde 25 eiwitten zelf is weergegeven in fig. 7, waarbij de continue lijn de gesuccinyleerde lactoproteinen betreft en de stippellijn het corresponderend ijzerderivaat. De ordinaat geeft de absorptie weer bij 280 nm en de abscis het opgetelde aantal opgevangen fracties. Uit het profiel blijkt dat de aanwezigheid van ijzer één enkele piek vertoont 30 met een retentietijd die overeenkomt met de kolomholte. In verband met het feit, dat de moleculaire exclusie van Sephadex G 75 ca.

75.000 Dalton bedraagt, is het schijnbare minimale moleculaire gewicht van dit aggregaat groter dan deze waarde. Bovendien werd op een andere wijze een dubbele piek met grotere willekeur waargenomen bij de ge-35 succinyleerde eiwitten. Deze factor werd eveneens waargenomen bij elektroforese (fig. 5). Dit soort gedrag toont aan dat het ijzer aanwezig 8300757 -13- is in een brandpunt van intermoleculaire aggregatie van het eiwit-medium. Verdere gegevens werden gehaald uit het filtergel op Sephadex G 200 vergeleken met ferritine (fig. 8, waarbij de abscis en de ordinaat overeenkomen met die van fig. 7, terwijl de continue lijn corres-5 pondeert met het ijzerderivaat van gesuccinyleerd lactqproteine en de stippellijn een ferritine betreft verkregen uit paardemilt). Ook in dit geval was de piek ondubbelzinnig, terwijl de retentietijd langer was dan die voor ferritine. Dit lijkt te bewijzen dat het schijnbare moleculaire gewicht lager is dan dat van ferritine uit paardemilt. 10 f) Stabiliteit in maagzuur

Deze proef werd uitgevoerd bij het ijzerderivaat volgens voorbeeld X, waarbij 25 mg van het derivaat werd opgelost in 0,5 cm^ gedestilleerd water en dit geheel werd toegevoegd aan 5 cm^ van het maagsap van een rat. Er ontstond een neerslag en de suspensie werd 60 min 15 onder roeren bij 37°C gelncubeerd. Hierna werd het gevormde neerslag afgecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistof op zijn ijzer-gehalte geanalyseerd. De hoeveelheid ijzer, afgegeven aan het maagzuur bedroeg . 1% van de aanvankelijke hoeveelheid.

g) Neerslag van het ijzerderivaat met ammoniumsulfaat 20 30% (g/v) ammoniumsulfaat werd toegevoegd aan een 10%'s oplos sing (g/v) van het ijzerderivaat verkregen volgens voorbeeld I.

Een neerslag van het eiwitderivaat van het ijzer werd daarbij verkregen en had eigenschappen die identiek waren met zijn aanvankelijke eigenschappen en was nog steeds oplosbaar in water. In de oplossing was 25 geen ijzer aanwezig.

De bovenweergegeven cijfers tonen aan dat het complexvormend vermogen van de gesuccinyleerde eiwitten jegens het ijzer niet slechts typerend is voor gesuccinyleerde melkeiwitten maar ook een karakteristiek is van gesuccinyleerde eiwitderivaten van andere herkomst en 30 fysiologische functies, zowel dierlijk als plantaardig.

Als eerder gezegd zijn vele dierlijke en plantaardige eiwitten van het niet gemodificeerde type geschikt voor het binden van ijzer. Wanneer niet» gemodificeerde melkeiwitten, ovalbumine, soya-eiwitten, serumeiwitten, orgaanextracteiwitten (lever) worden omgezet met ijzer 35 onder de weergegeven voorwaarden voor het bereiden van de overeenkomstige succinyleiwitderivaten, dan wordt een produkt verkregen met 8300757 -14- een nagenoeg gelijk ijzergehalte, maar met volledig verschillende eigenschappen wat betreft oplosbaarheid en stabiliteit. Bijvoorbeeld levert als weergegeven in tabel A soya-eiwit een eindprodukt dat na vriesdrogen voor meer dan 75% onoplosbaar is en zijn ijzer bij behan-5 deling met maagzuur afgeeft. Naast het complexvormend gedrag jegens ijzer worden het gedrag van de gesuccinyleerde ferro-eiwitderivaten volgens de uitvinding (d.w.z. oplosbaarheid in een alkalisch medium, stabiliteit in een zuur medium en bij aanwezigheid van maagsap zelfs bij hoge ijzergehalten) niét toegeschreven aan de basiseiwitten en 10 zij konden dus niet van tevoren worden voorzien.

GIFTIGHEID

a) De acute giftigheid werd oraal nagegaan bij Swiss-muizen via een maagproef wat betreft het ferrosuccinyleiwit van melkeiwitten, verkregen volgens voorbeeld I met gedestilleerd water als drager.

15 De LD^q bleek meer dan 40ÖDmg/kg te bedragen.

b) Giftigheid bij herhaalde toediening van hetzelfde derivaat volgens voorbeeld I (hieronder aangeduid als Ferrolaat) bij ratten per os. Deze werd gedurende 20 dagen bij een opeenvolgende behandeling bij manlijke Wistar-ratten met een aanvankelijk gewicht van 20 200 g opgenomen, die 14 dagen voor de behandeling in kooien waren op- .

gesloten en vervolgens verdeeld in groepen van 10 (groep I: blanco; II, III en IV Ferrolaat met doses van 30-100-300 mg/kg/dag).

Het preparaat, opgelost vlak voor gebruik in gedestilleerd water, werd dagelijks zonder onderbreking op dezelfde tijd van de dag 25 via een sonde toegediend. De blanco's ontvingen een gelijke hoeveel- 3 heid leidingwater (10 cm /kg). Tijdens de behandeling werden de ratten dagelijks gewogen en vóór de toediening, en gedurende een aantal uren na de toediening van het produkt geobserveerd. Het voederverbruik werd na afloop van de behandeling gemeten en 24 uur na de laatste 30 toediening en na een vastenperiode van 20 uren werden de ratten met ether geanaesthetiseerd en gedood door de carotis door te snijden.

Een deel van het bloed werd in een reageerbuis met EDTA (2 druppels van een 4%'s oplossing) opgevangen en de rest als serum bewaard.. Haemochromocytometrische proeven werden met het totale bloed uitge-35 voerd en haematochemische proeven met het serum.

8300757 -15- RESOLT&TEN:

Variaties in gewicht en verbruik van het voeder.

Fig. 9 geeft de gewichtstoenamekrommen weer die werden verkregen tijdens de behandeling tot de dag voorafgaande aan het doden van de 5 proefdieren.

De tabellen B en C geven de cijfers weer omtrent de gewichts-toename en de voederconsumptie van de dieren tijdens de behandeling.

De gewichtstoenamekromme van de met Ferrolaat in een dosis van 300 mg/kg behandelde ratten bleek significant achter te blijven bij de 10 gewichtstoenamekromme voor de blanco groep ratten vanaf de 15e dag na het begin van de behandeling; dezelfde groep ratten consumeerde gemiddeld minder voeder (-11,7%).

Geringe verschillen die statistisch niet significant zijn kunnen worden waargenomen wat betreft de overige met Ferro laat behandelde 15 groepen.

Haematologische proeven

De resultaten zijn weergegeven in tabel D.

Haematochemische.proeven

De resultaten zijn weergegeven in tabel E. Een geringe vermin-20 dering in de alkalische fosfatase werd waargenomen bij de met Ferrolaat 300 mg/kg/dag behandelde ratten.

Urineproeven

De resultaten zijn weergegeven in tabel F.

Orgaanproeven 25 Tabel G geeft de absolute gemiddelde gewichten van de belang rijkste rattenorganen weer en tabel H de overeenkomende gemiddelde gewichten wat betreft het lichaamsgewicht.

Een significante toename in het relatieve gewicht van de milt / en de longen werd waargenomen bij de groep ratten die was behandeld 30 met 100 mg/kg/dag Ferrolaat. Naast een significante afname in het lichaamsgewicht kon een si nificante toename in het gemiddelde gewicht van de testicels worden waargenomen bij de groep ratten die behandeld werd met 300 mg/kg/dag Ferrolaat.

83 0 0 75 7 -16-

BLOEDSPIEGELS NA ORALE TOEDIENING

a) Ferrolaat-ferrosulfaatvergelijking

Manlijke Wistar-ratten van ca. 200 g die 18 uur hadden gevast werden willekeurig uitgekozen en in groepen van vijf verdeeld; elke 5 groep werd op het daartoe bepaalde tijdstip gedood en van elk dier werd bloed afgenomen door de carotis in te snijden; de hoeveelheid ijzer in het bloed van elk dier van de groep werd spectrofotometrisch met behulp van bathofenantrolinesulfonzuur bepaald (Fe-proef, Wako).

De toediening werd uitgevoerd via een sonde en met een waterige oplos-10 sing (5 cm/kg). Het gebruikte succinylferroproteine was bereid volgens voorbeeld I-(Ferrolaat) .De doseringen en resultaten zijn weergegeven in tabel I. Hieruit kan worden gelezen dat de hoeveelheid ijzer/kg gelijk was voor beide derivaten (Fe : 1 mg/kg).

b) Ferrolaat-ferritine-vergelijking 15 Manlijke Wistar-ratten van ca. 200 g liet men 18 uur vasten en werden vervolgens willekeurig in groepen van negen verdeeld. Elke groep werd op het daartoe bepaalde uur gedood waarna bloed uit elk dier werd gewonnen door de carotis in te snijden. De hoeveelheid ijzer in het bloed van elk dier van de groep werd spectrofotometrisch bepaald 20 via de ijzer-colorimetrische methode van Boehringer-Mannheini. De toediening werd uitgevoerd via een sonde en met een waterige oplossing 3 (5 cm /kg). Doseringen en resultaten zijn weergegeven in tabel J.

Hieruit blijkt dat de hoeveelheid ijzer/kg voor het succinylferro-proteïnederivaat aangeduid als Ferrolaat gelijk was aan die voor 25 ferritine (Sigma, St. Louis Missouri) en gelijk aan 1 mg/kg.

c) Vergelijking tussen succinyl-ferroproteinederivaten verkregen uit diverse typen eiwitten

Manlijke Wistar-ratten van ca. 200 g liet men 18 uur vasten en werder daarna willekeurig in groepen van vijf verdeeld (1 per dosis 30 derivaat en een blanco groep). Elke groep werd 2 uur na toediening gedood en door insnijden van de carotis het bloed van elk dier opgevangen en het ijzergehalte van dit bloed bepaald via de bathofenan-trolinesulfonzuur Fe-proef, Wako). De orale toediening werd uitgevoerdvia< een sonde en met een waterige oplossing (5 cm^/kg). De doses van af-35 zonderlijke derivaten die werden gebruikt werd zo gekozen, dat telkens 1 mg/kg ijzer werd toegediend.

8300757 -17-

Onderzochte produkten: 1) gesuccinyleerd soya-eiwit + Fe (4,42%) 2) gesuccinyleerd ovalbumine + Fe (3,75%) 5 3) gesuccinyleerd runderserum- eiwit + Fe (5,78%) 4) gesuccinyleerd melkeiwit + Fe (4,5%) (Ferrolaat).

De resultaten zijn weergegeven in tabel K.

8300757 -18-

TABEL A

I *

Proteïne- Succinylering Fe Opbrengst Oplosbaarheid bron (% groepen, (% gesucci- bij die gesucciny- (% g) nyleerd H > 5 f^ leerd kunnen proteïne) * worden

Melk a) 95 6,7 30 + - " b) " 4,6 20 + " C) " 3,2 18 + d) " 2,5 18 + " Θ) " 0,8 13 +

Lactoproteinen' 95 4,5 + | Ovalbumine 95 3,6 · 33 + I Serumproteïnen __ ,5,8 + ΐ (rund) *5,5 30 +--- j j (soya) 92 4,4 22 + i (Orgaan n.a. 8,4 . n.a. + - j lever) i I Melk 35 4,3 26 + t

J

Lactoproteinen 0 4,8 7 7 -

Ovalbumine 0 + soya 0 {o^ +’-

Serumprotelnen q ^ ^ + (rund) ’ (orgaan n . r , 0 n.a. n.a.

lever) a), b), c), d), e) monster met een Fe^+: gesuccinyleerd proteïne- houding tussen 0,1 : 1 en 5 : 1 (g : g); f) volledig (+); gedeeltelijk (+ -); onoplosbaar (-).

8300757 -19-

TABEL B

Gewichtstoename

Behandeling Aanvankelijk üiteindelijk Gewichts-gemiddeld gemiddeld toename

mg/Jcg/ g gewicht gewicht gemiddeld SE

Blanco's 224,10*2,83 345,60*8,87 119,50*7,66

Ferrolaat 30 224,40*3,03 325,50±4,56 101,20±4,35

FerrolaatlOO 224,40+2,30 326,10±8,06 101,70±8,08

Ferrolaat 300 224,30±3,71 307,00±10,15 82,77±8,28 * p < 0,05 ** p < 0,01

Significantie'vergeleken met blanco's(berekend met Student's 't') TABEL C Voederverbruik

Behandeling Totale gemid- Verschil mg/kg/dag delde^consuns- ^

Blanco'.s 32,33

Ferrolaat 30 30,42 - 5,91

FerrolaatlOO 30,98 - 4,18

Ferrolaat 300 28,54 -11,72

TABEL D

Hematologische cijfers -

Behandeling mg/kg/dag________

Blanco's Ferrolaat 30 Ferrolaat 100 Ferrolaat 300

Hemoglobine g% 12,11±0,47 11,77±0,37 12,39±0,30 12,93*0,25

Hematocriet % 66,88±2,06 61,44±1,96 66,90*2,77 64,16*1,80

Leucocyten 16,95*2,25 16,55*1,65 23,46*2,16 19,93*2,58 103/mm3

Erythrocyten 5,76*0,51 6,12*0,68 5,91*0,68 6,22*0,31 10^/mm3 8300757 -20-

TABEL E

Hematochemische gegevens / Behandeling mg/kg/dag / Blanco's Perrolaat 30 Ferrolaat 100 Ferrolaat 300

Glucose mg% 55,33+5,75 52,81+4,38 63,61+5,58 60,74+4,97

Azotemie mg% 32,73+1,33 34,59+2,25 28,68+2,34 32,33+2,52 mü/ml 110,51+7,10 130,81+8,59 109,09+5,21 113,36+7,29 mU/ml 19,58+__1,52 26,86+_3,43 30,14+6,02 23,15+2,-57 fosfatase 255,65+13,82 229,53+17,03 257,53+22,35 213,80+12,72 mü/ml

Totaal proteïnen 6,19+0,12 6,02+0,17 6,37jO,12 6,21+0,16 g%

Significantie * P <0,05 ** P <0,01 **^P^<0^^ 8300757 -21- TABEL F Urine proeven

Behandeling mg/kg/dag

Blanco's Ferrolaat 30 Ferrolaat 100 Ferrolaat 300 pH ·; ----- 8,15+0f17 8,55+0f14 8,40+0,18 8,50jO,12 ** *

Proteïnen 21,-+3,78 24,-+3,05 63,-+12,47 53,33+11,66

Glucose nil nil nil nil

Ketonlichamen nil nil nil nil

Bilirubine nil nil nil nil

Bloed nil nil nil nil

Significantie * p < 0,05 ** p < 0,01 8300757 -22-

TABEL G

Absoluut vers gewicht van de ratte-organen Behandeling mg/kg/dag

Blanco's Perrolaat 30 Perrolaat 100· Perrolaat 300

Lichaams- 310,60+7,53 300,33+3,64 296,8+6,16 278,44+8,89 ' gewicht g. ; — — —

Hart g i,15jKJ,05 1,10+0,03 1,14+0,04 1,09+0,07

Longen g 1,55+0,05 1,70+0,20 1,68+0,05 1,57+0,12

Lever g 9,14+0,35 8,89+0,35 8,78+0,28 8,35+0,44

Mild g 1,38+0,13 1,36+0,08 1,65+0,12 1,37+0,09

Nieren g 2,28+0,07 2,21+0,09 2,22+0,08 2,09+0,10

Bijnier- 50,30+4,55 56,33+7,69 ' 51,80+6,07 37,44+5,56 klieren mg — — — —

Hersenen g l,77jjD,03 l,70jH3,03 l,67jj3,05 l,68jjD,06

Testicels g 3,30jO,05 3,12+0,10 3,08+0,16 3,25+0,07

Maag g 1,77+0,09 ' 1,77jO,05 1,75+0,07 1,53+0,09 '

Significantie * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 8300757 -23-TABEL Η

Relatief vers gewicht van de ratte-organen Behandeling mg/kg/dag

Blanco's Ferrolaat 30 Ferrolaat 100 Ferrolaat 300

Lichaams- 310,60+7,53 300,33+3,64 296,80+6,16 278,44+8,89 gewicht — — — —

Hart % 0,37+3,01 0,37+3,08 0,39+3,09 0,39+3,02 *

Longen % 0,50+3,02 0,56+0,06 0,57+,02 0,57+0,06

Lever % 2,94+3,04 2,96+0,10 2,96+3,06 2,99+3,08 *

Mild 0,44+0,03 0,45+0,03 0,56+),04- 0,49+0,03

Nieren % 0,73+0,01 0,74+0,02 0,75+1,03 0,75+3,02

Bijnier- 0,016+0,001 0,019+0,003 0,017+0,002 0,014+ 0,002 klieren % — — — —

Hersenen % 0,57+0,02 0,57.+.0,01 0,57+0,02 0,60+3,01

Testicels % 1,06+3,02 1,04+),03 1,04+),05 1,1*8+3,04

Maag % 0,56+3,02 0,59+),02 0,59+3,02 0,54+3,02 _________________—J·__

Significantie * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 8300757 -24-

TABEL I

Bloedspiegels: vergelijking Ferrolaat - Ferrosulfaat

Serum ijzer ug% . . . Uren na behandeling

Behandeling---—---- __· 30'_1_2_4_6_

Blanco's BLO 5 ml/kg 99,22 59,91 98,25 80,17 74,- 1 ±24,92 ± 6,85 ±13,28 ± 6,37 ±10,10 (5) (5) (5) (5) (5) ieitie ieieie ieif

Ferrolaat: 22,37 mg/kg 227,45 275,28 269,61 203,16 148,18 (Fe 1 mg/kg) ±16,40 ±18,91 ±22,51 ±27,74 ±16,73 (5) (5) (5) (5) (5) : ieieie ieieie ieieie if ie if

FeS047H20: 4,98 mg/kg 336,27 272,14 273,56 129,50 80,52 , ±27,79 ±24,09 .±19,32 ± 6,21 ± 5,65 (Fe = 1 mg/kg p.os) (5) (5) (5) (5) (5)

Significantie vergeleken met blanco1s * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001

Significantie van de twee ij zer-preparaten: 30': p <0,01; 4h: p <0,05; 6h: p <0,01

TABEL J

Bloedspiegels: vergelijking Ferrolaat - Ferritine , .

Serum ijzer ug/100 ml Uren na behandeling

Behandeling — 1 — ....... .................— 1 2 4 6

Ferritine (F-5403 Sigma 168,79 170,66 148,08 89,22 1,08% v/v ±15,35 ±14,70 ±18,69 ±12,75 : 5 ml/kg = 1 mg/kg dag Fe) ieieie ie ie

Ferrolaat 21,46 mg/kg 302,07 269,81 223,72 106,24 ( - 1 mg/kg dag Fe) ±15,59 ±29,94 ±18,51 ±11,30 in 5 ml/kg **★

Blanco's, gedestilleerd water 80,40 5 ml/kg ±6,39 * p <0,05 Significantie berekend met Student's I 7 Λ Π 7 S 7 ** p <0,01 "t" jegens ferritine.

> J \J \J / J / *** p <0,001 t -25-

TABEL K

BLOEDSPIEGELS: VERGELIJKING TUSSEN SUCCINYL-

FERROPROTEINEN VERKREGEN UIT DIVERSE TYPEN

Behandeling Serum ijzer in^ig/100 ml

5 gemiddelde cijfers ± SE

Blanco's S3. 99±7. 56

Succ. soya 260. 68±29. 52***

Succ. ovalbumine' 235. 82±46 . 06*

Succ. serum proteïne 277. 63±49. 35** 10 Ferrolaat 305. 81±23. 20***

Sifnificantie vergeleken met de blanco's * p<0,05 ** p<0,01 *** p<0,001 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 8300757

De uitvinding betreft tevens alle toepasbare industriële 2 aspecten van de toepassing van de onderhavige succinyl-ferroprotelne- 3 derivaten als middelen voor het behandelen van sideropenische anaemie.

4

Een belangrijk aspect van de uitvinding is derhalve gelegen in farma 5 ceutische preparaten voor humane en veterinaire doeleinden 6 met daarin bepaalde hoeveelheden van deze derivaten. Deze preparaten 7 kunnen oraal, bijvoorbeeld in de vorm van tabletten, capsules, ampul 8 len, sachets met granulaten, stropen, vouwpoeders en toegevoegd aan 9 dierlijk voeder worden toegediend.

10

De volgende recepten worden zuiver bij wijze van voorbeeld 11 , gegeven: 12 - ampullen met daarin 5, 10 of 40 mg ijzer in de vorm van ferro- 13 succinyl-eiwiften met daarnaast waterige oplosmiddelen, stabilisatoren, 14 slaapmiddelen, enz. als gewoonlijk gebruikt in de farmacie; 15 - tabletten met daarin 5, 10 of 40 mg ijzer in de vorm van ferro- 16 succinyl-eiwitten met daarnaast excipiëntia, uiteenvalmiddelen enz.

als gewoonlijk gebruikt in farmaceutica? « -26- a - capsules met daarin 5, 10 of 40 mg ijzer in de vorm van ferro-succinyl-eiwitten ? - doseringseringseenheidsachets met daarin een opbruisend granulaat overeenkomend met 5, 10 of 40 mg ijzer in de vorm van ferro- 5 succinyl-eiwitten met daarnaast suiker, slaapmiddelen en stabilisatoren die gewoonlijk in de farmacie worden gebruikt; - poedervormige melk toe te voegen aan voeder voor jonge dieren met daarin 5-20 gew.% actieve stof.

8300757

Claims (11)

1. Gesuccinyleerde eiwitten die ijzerhoudend zijn.

2. Gesuccinyleerde eiwitten met daarin 0,1-20 gew.% ijzer.

3. Gesuccinyleerde eiwitten volgens conclusies 1 of 2, met het kenmerk, dat de mate van succinylering is gelegen tussen 20 en 100%.

4. Gesuccinyleerde eiwitten volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het uitgangseiwit een plantaardig of dierlijk eiwit is.

5. Melkeiwit met een succinyleringsgraad van meer dan 70% met daarin meer dan 4 gew.% ijzer.

6. Ovalhumine met een succinyleringsgraad van meer dan 70% en met 10 meer dan 4 gew.% ijzer.

7. Soya-eiwit met een succinyleringsgraad vein meer dan 70% met daarin meer dan 4 gew.% ijzer.

8. Werkwijze voor het bereiden van gesuccinyleerde eiwitten met daarin ijzer volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat een gesucci- 15 nyleerd eiwit wordt bereid en vervolgens met ijzerzouten in een waterig medium wordt omgezet bij een pH tussen ca. 2 en 10 en het gevormde produkt wordt geïsoleerd door neerslaan bij een pH tussen 2 en 4, welke laatste pH spontaan of door kunstmatig aanzuren ontstaat.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de reactie 20 tussen het gesuccinyleerde eiwit en de ijzerzouten bij nagenoeg neutrale pH wordt uitgevoerd.

10. Werkwijze voor het bereiden van gesuccinyleerde eiwitten met ijzer daarin volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat het gesuccinyleerde eiwit met ijzerzouten in een waterig medium bij een pH 25 tussen ca. 2 en 7 wordt omgezet en reactieprodukt wordt geïsoleerd door het oplosmiddel na regeling van de pH op nagenoeg neutrale waarde te verwijderen.

11. Farmaceutische preparaten voor het behandelen van een sideropene anaemie bij mensen en dieren, met het kenmerk, dat zij gesuccinyleerde 30 eiwitten met ijzer daarin als actief bestanddeel volgens conclusies 1-7 bevatten. 8300757