LU84672A1 - Derives de fer biodisponible non dommageables au systeme gastrique,leur procede de preparation et leur application en therapeutique - Google Patents

Description

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La présente invention a pour objet des protéines succinylées, avec un degré de succinylation compris entre 2Q et 100 %, contenant 0,1 à "20 % en poids de fer, et obtenues par le traitement de protéines succinylées avec des sels de fer dans des intervalles appropriés de pH. Les composés en cause, 5 parfaitement tolérés, sont caractérisés par une biodisponibîlité optimale du fer.

Le fer, qui est présent dans tous les tissus de l'organisme, joue un .

r5le physiologique irremplaçable- Il fait partie comme composant essentiel de ✓ · 7 l'hémoglobine, de la myoglobine..et des enzymes : catalase, fumarique-déhydro- 10 gènase, peroxydase, cytochromes, DPÏÏ-cytochromoréductase et mêtal-flavoprotéines, ' . comme la ferroflavîne. Les tissus d’un être humain adulte contiennent de 1,5 à 5 grammes de fer dont 60-65 f sont concentres dans les globules rouges, alors que 18-30 % sont liés aux protéines ferritîne et héinosidêrine, situées dans le foie, la rate, la moelle des os et les cellules du système réticûlo-15 endothélial- Ce qui reste est distribué dans les divers systèmes enzymatiques susmentionnés, dans la myoglobine (environ h %) et la transferrine (environ 0,1 %), la ß.j globuline chargée du transfert hématique du fer d’origine intestinale. Elle est en mesure de lier, de façon pratiquement inséparable, deux atomes de fer aux valeurs physiologiques de pH.

20 Le besoin en fer est satisfait, en partie par l'utilisation de fer endogène (dérivant de la destruction de globules rouges vieillis) , et en , partie par le fer exogène. L'absorption du fer exogène a lieu le long de tout le duodénum et de la partie supérieure du jéjunum et s'accumule principalement dans le foie. La première manifestation pathologique de la carence en fer est . 25 l'anémie hypochromique sidéropênienne dont les causes premières peuvent être . variées : hémorragies chroniques dérivant d’ulcères gastroduodenaux'ou néoplasies ; apport diététique insuffisant, ou bien mauvaise absorption comme " dans les états diarrhéiques ; augmentation de besoin en état de grossesse, allaitement,- maladies infectieuses, etc. utilisation métabolique défee-30 tueuse ; thérapies particulières comme par exemple celle par ACTH et de produits de la cortisone. La thérapie la plus appropriée est constituée par l’apport de fer ; elle est efficace pour réduire l'état d'anémie quand il dérive, évidemment, d’une carence en fer effective.

Toutefois, cette dernière est généralement accompagnée par des effets 35 secondaires non souhaités liés au type de vecteur utilisé pour le fer. Les /λ .

2 ψ préparations pharmaceutiques pour voie orale les plus diffusées sont à hase . des sels les pLus.divers d'acides organiques et inorganiques de plus en plus introduits dans la thérapeutique dans l'espoir de-réduire les effets secondaires déjà mentionnés. Ainsi, l'on trouve dans le commerce des spécialités 5 pour voie orale à hase de sels inorganiques type : chlorure ferrique, sulfate ferreux, phosphate ferrique, ou hien organiques, tels que ; citrate, colinate, aspartate, fumarate, gluconate, lactate, oxalate, succinate. Par voie intramusculaire profonde, on propose le complexe ferro-dextrane alors que, pour les traitements i.v. (pour les anémies sidéropéniennes où la thérapie par voie 10 orale a échoué), on utilise le complexe ferro-dextrine. Pour ces derniers types i de complexes, les effets*secondaires peuvent consister dans des réactions al lergiques, des hausses de température, tachycardie, leucocytose, lymphoadéno-pathie, pour le traitement intramusculaire, et même des chocs de type anaphylactique, thrombophlébites et collapsus cardio-vasculaire pour le traite-15 ment i.v. ; dans la thérapie par voie orale avec des formulations à hase des composés susmentionnés, apparaissent en général des dommages gastro-intestinaux, avec nécrose et perforation dés muqueuses parmi les plus graves, diarrhée - et vomissement. En outre, la médiocre tolérance rend difficile l'administra tion de quantités précises de fer. Pour minimiser les effets secondaires, on 20 suggère l'administration simultanée d'aliments, mais cela est en contradiction avec la variabilité prouvée d'absorption du fer en fonction de la composition des aliments mêmes- Il est prouvé, en effet, que 1*absorption du fer de médicaments n'est optimale que lorsque le sujet est à jeun.. A l'irritation gas-:’". trique, suit l'usage d'antiacides qui, à leur tour, réduisent l'absorption 25 avec aggravation de l'état anémique.

Un progrès considérable dans la thérapie par le fer,' évidemment par voie orale, a été réalise avec l'introduction sur le marché de spécialités à hase de ferritine.

La ferritine est une globuline ferrique, et représente, dans les * * < 30 organes des mammifères, la protéine de réserve du fer la plus importante. Le ; produit dans le commerce, en tant que matière première, est extrait de la rate du cheval. Sa teneur en fer est de 20 % sur la hase du poids sec ; la .part protéique, l’apoferritine, a un poids moléculaire d'environ ^5 000 et entoure le noyau de fer oxydo-phosphaté cristallin. Soluble dans l'eau, elle 35 est appropriée à l'administration par voie orale.

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La thérapie à bass.de ferritine ne presente pas les effets secondaires gastro-intestinaux relevés lors de l'usage des dérivés du fer, indiqués plus haut. Une grave limitation a l'utilisation des dérivés du fer dérive soit du coût très élevé de la matière première soit, surtout, de la disponibilité 5 limitée des sources d'extraction.

Les connaissances actuelles à ce sujet semblent indiquer que le support optimal du fer aux fins d'une administration exempte d'effets secondaires pourrait être un vecteur protéique. Plusieurs protéines présentent une i certaine affinité pour le fer. On a donc essayé d'utiliser comme vecteurs 10 quelques types de protéines d'origine animale (sérum-protéines, protéines - d'organe, v°varbumine, lacto-protéines) ou végétale (protéines de soja).

L'interaction entre sels ferriques inorganiques et les susdites protéines conduit à la formation de dérivés ferro-protéiques dont l'intérêt thérapeutique est toutefois infirmé par· une série de caractéristiques nëga-15 tives, parmi lesquelles » . - - la non solubilité des dérivés obtenus lorsque le pourcentage de fer lié à la protéine atteint des valeurs supérieures à 0,5 % ’ï - la difficulté ou même l'impossibilité d'évaluer dans ces conditions d'insolubilité quelle fraction du fer total est réellement liée à 20 la protéine et quelle fraction coprécipitê simplement sous forme d’oxydes hydratés, hautement dommageables pour le système gastro- .. intestinal ; .

- le défaut d'homogénéité et constance de composition en fer de ces dérivés.

25 En outre, pour certaines protéines, parmi lesquelles celles dérivées du lait, on a relevé la présence de dérivés de fer solubles avec une quantité considérable de dérivés insolubles, à diverses valeurs de pH, mais la composition de ces fractions soluble apparaît comme très variable en fonction de - variations minimes des paramètres expérimentaux.

30 Or, on a trouvé d'une façon surprenante qu'en soumettant à une succi- / nylation d'une manière appropriée ces protéines (un procédé utilisé normalement pour obtenir des dérivés succinylés des protéines pour usage alimentaire et pour aliments d'animaux), il est possible d'obtenir, par la réaction de celles-ci avec le fer, des dérivés ferro-protéiques même à teneur en fer élevée, qui 35 sont stables , solubles à des valeurs de pH supérieures à 5 , ayant des k . ; i teneurs en fer différentes mais reproductibles' ,· en mesure d’apporter du fer dans des organismes à sang chaud, lorsqu'ils sont administres par voie orale, sans produire des effets secondaires dommageables au système·gastro-intestinal. En effet, chez les rats 1 * administration quotidienne, par voie orale et pendant 5 20 jours consécutifs, n'a montré aucune manifestation d'effets dommageables pour le système gastro-intestinal, et a été bien tolérée.

En outre, toujours chez ce meme type d'animaux, la comparaison des siderêmies, après administration par voie orale, de quantités équivalentes de fer sous forme de sulfate ferreux, ferritine de rate chevaline (Sigma, 10 Saint Louis, Missouri) et d'un dérivé ferroprotêique de protéines succinylées * . de lait, préparé suivant la description dans l'exemple 1,'met en évidence que : a) les niveaux hématiques du fer* induits par le dérivé faisant l'objet de la présente invention, par rapport à ceux induits par le sulfate ferreux, sont plus prolongés dans le temps (voir tableau IX) ; 15 b) les ni veaux hématiques de fer induits par le dérivé faisant l'objet de la présente invention, par rapport à ceux induits par la ferritine témoin, sont plus élevés (environ 1,5-1 en moyenne) dans l'espace de temps des.six heures de durée de l'expérience (voir tableau X)‘.

Si l'on considère la tolérance optimale du produit, sa toxicité très 20 basse (plus grande de ^ 000 mg/kg chez le rat: Swiss), les taux hématiques élevés en fer réalisables et la facilité de trouver la matière première, . l'utilisation des dérivés, faisant l'objet de la présente invention, constitue une nette amélioration de l’état actuel de la thérapeutique par le fer.

Les caractéristiques physico-chimiques de ces dérivés succinyl-ferro-25 protéiques, comme il a été indiqué plus haut, sont reproductibles et constantes comme il résulte des exemples qui ne sont pas limitatifs. L’absence de fer non lié est démontrée par la solubilité totale en milieu alcalin (con-.ditions où l'ion fer précipite comme oxyde hydraté) des remèdes obtenus à / partir de protéines succinylées et d'un sel de fer.

30 L'objet de la présente demande de brevet est donc constitué par les -* dérivés, jusqu'à ce jour inconnus, caractérisés par le fait qu'ils contiennent une quantité de fer variable en pourcentage, des protéines animales ôu végétales succinyléesà des degrés divers de suceinylation et.qui se révélent appropriées à l'apport de fer, biodisponible, dans des organismes à sang 35 chaud, sans effets dommageables au système gastro-intestinal si elles sont 5 administrées par voie orale, suivant les exemples ci-dessous, qui sont indicatifs' et non limitatifs. Ces dérives s’avèrent propres, comme principes actifs, à la réalisation de préparations pharmaceutiques utilisables dans le traitement des anémies dérivant de carence de fer chez les animaux à sang chaud, et.

5 par conséquent toutes formes pharmaceutiques d’administration contenant ces dérivés comme principe actif, pour usage humain ou vétérinaire, constituent un objet ultérieur de ce brevet.

En outre, la présente invention a.pour objet un procédé pour la préparation des dérivés succinyl-ferro-protêiques en cause, ce procédé étant 10 , caractérisé par le fait qu’on fait réagir des protéines succinyléés (de manière connue en soi) avec des ions fer à un pH compris entre environ 2 et environ 10, de préférence à un pH voisin de la neutralité, dans des solvants aqueux, et par le fait que les produits obtenus sont isolés du milieu de réaction par précipitation a un pl de l’ordre de 2-h, ce dernier intervalle de pH étant 15 réalisé spontanément.ou-au moyen d’acidification. En alternative, le produit de réaction peut être isolé par élimination du solvant après réglage du pH à des valeurs proches de la neutralité.

‘ EXEMPLE 1 * · 2q Préparation de dérivés de fer à 5 à partir de protéines succinyléés du lait en poudre entier I kg de lait en poudre est mis en suspension dans. 6 litres de bicarbonate de soude 0,3M et, sous agitation mécanique et contrôle de pH, on ajoute 500 g d'anhydride succinique en portions successives, tout en maintenant le 25 pH dans un intervalle compris entre 7»5 et 8 par addition de KaOH A la fin de l'addition, on laisse sous agitation durant 2-3 heures à température ambiante ; pendant cette période la suspension passe totalement en solution. La solution opalescente est centrifugée ou filtrée jusqu'à arriver presque à la , limpidité, et ensuite acidifiée avec HCl, lentement, jusqu'à pH 3. Le préci- *» % 30 pité qui se forme est séparé par centrifugation ou filtration et mis à nouveau en suspension dans l'eau (environ 8 litres) ; on additionne une solution de NaOH jusqu'à dissolution complète (pïï environ 7»5) ; on centrifuge et la solu- . tion.; limpide est acidifiée de nouveau à pH 2,5-3 par addition de HCl.

Le précipité est récupéré par filtration ou centrifugation puis lave 35 avec une solution de HCl à pH 3.

L

6 I ' * ! j ,

Le résidu, constitué par les protéines succinylêes (dont le dëgrê de succinylation est variable en fonction de la quantité dfanhydride succinique utilisée ; pour l'exemple porté ici, il est de 90..% par rapport aux group.es qu'on peut succinyla?présents dans la proteine de départ comme il sera indi-5 que par la suite), est dispersé, après séchage sous vide, dans l'eau distillée ; il est dissous par addition de NaOH jusqu'à pH de 7,5 en diluant la solution de manière que la concentration finale de protéine's'élève environ à 0,0l· g/ml. On ajoute à cette solution une solution d'un sel de fer (exemple : FedL·) avec un rapport de FeJ /protéine succinylêe de 1:10 en poids. On obtient une sus-10 pension qui est dispersée finement par agitation mécanique pendant que le pH descend à environ 2,5. On laisse en agitation pendant 3 heures à température ambiante puis la suspension, est filtrée ; la partie solide est mise en suspension dans l’eau (environ trois volumes) et dissoute par addition de NaOH (pH 7,5). ' ‘ 15 La solution pas tout à fait limpide est filtrée, et la récupération du produit à l'état solide peut être indifféremment effectuée par deux voies : a) on acidifie la solution, et le précipité obtenu à pH 2,5 est filtré et séché sous vide ; b) la solution limpide est dialysée contre l'eau pour éliminer le chlorure 20 de sodium, puis lyophilisée ou séchée par- séchage-atomisation.

Dans les deux cas les rendements en produit final sont équivalents et s'élèvent à environ 20 % en poids du lait en poudre de départ. Les caractéristiques du produitrsont décrites dans le tableau I (exemple 1b). - EXEMPLE 2 -\ 25

Préparation de dérivés du fer à 5 % - de protéines succinylêes du lait

Comme il a été décrit dans l'exemple 1, avec la variante que le produit de départ est constitué par 350 grammes de protéines du lait, préalablement précipitées de la poudre de lait par dispersion de la poudre dans l'eau (en— 20 viron 5 litres), acidification à pH 2,5 par un acide minéral, puis filtration ou centrifugation du solide protéique et séchage -

La teneur en fer, comme indiqué ci-dessous (tableau I), pour les dérivés obtenus dans les exemples 1 et 2, s'élève a environ U-5 % en poids.

EXEMPLE 3

Préparation de dérivés de fer de protéines succinylêes du lait à diverses teneurs en fer.

îA - 7 .

En opérant suivant la description des exemples 1 et 2 en ce qui concerne la méthode et la quantité de poudre de lait ou les protéines du lait préalablement précipitées, mais avec un rapport en poids Fe /protéine succinylée de 0,1:10, 0,2:10 ; 0,5:10 et 1,5:10, on obtient des dérivés de 5 fer dont les caractéristiques sont portées dans le tableau I.

EXEMPLE b

Préparation de dérivés de fer de protéines succinylées d'oeuf (Ovalbumine)

On dissout 5 grammes d'ovalbumine dans 100 ml d'eau contenant 3 grammes .jq de KHCO^, on additionne à la solution limpide 2,5 g d'anhydride succinique par portions successives tout en maintenant le pH à des valeurs comprises entre 5 1 et 8, par addition de NaOH ; on laisse réagir pendant 2 heures à température ambiante ; après acidification de la solution à pH 3'à^» on obtient un précipité qui est isolé par centrifugation, purifié par dissolution a pH Ts5, par NaOH, puis reprécipitê à pH 3, U.

La partie solide est récupérée par centrifugation, et séchée sous vide. La partie solide séchée est mise en suspension dans l'eau distillée et dissoute par addition de ïîaOH (pH 8) de façon à obtenir une solution finale de 0,0^ g de protêine/ml. On additionne à cette solution très visqueuse O t „n une solution de sel de Fe (par ex, chlorure ferrique) de façon à avoir un rapport, en poids, protéines succinylées/Fe de 10:1 - Dans ces conditions le pïï chute à 2,6 avec formation d’un précipité qui est récupéré par filtration. Ce précipité est à nouveau dissous dans l'eau avec addition de HaOH jusqu'à dissolution complète (pH 7»5)· Après dialyse contre de l'eau, pour 2^ éliminer le chlorure de sodium, le produit solide est récupéré par lyophilisation ou séchage-atomisation. Le rendement en dérivé est égal à 33 % en poids de la protéine de départ. Le contenu en fer et les caractéristiques sont portés dans le tableau I.

* i ^ % 35 ' 8 EXEMPLE 5

Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de sérum bovin

On additionne à 50 millilitres de solution de sêroprotêines "bovines (teneur en protéines environ U g) 1,5 g de HaHCO^ et on traite avec 6 g d'anhydride succinique, en portions successives, en maintenant le pH entre les valeurs de 7,5 et 8 avec addition de îiaOH. A la fin de l’addition, on poursuit la réaction durant 2 heures à température ambiante puis on précipite • en acidifiant à pH 2,1* par un acide minéral ; le précipité est récupéré par centrifugation et purifié suivant la description de l'exemple 1*. Le produit : · solide est mis en suspension dans l'eau et porté à pH 7>5 par HaOH. ; la solution ainsi obtenue est additionnée d'une solution de sel de fer III (par ex; chlorure ferrique) jusqu'à atteindre un rapport, en poids, protéine succinylée/ Fe0 de 10:1. Le pH chute spontanément à 2,U et on obtient tin précipité qui, ^ lorsqu'il est porté à pH 7»5,ne se dissout qu'en partie. On sépare la solution du résidu par centrifugation, on dialyse contre de l'eau pour éliminer le chlorure de sodium, puis on lyophilise. Le rendement pondéral en dérivé de fer, par rapport à la protéine de départ, est d'environ 30 %. Pour la teneur en fer et les caractéristiques, on se reportera au tableau I.

20 EXEMPLE 6

Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de foie de porc

On homogénéise 1*00 grammes de foie de porc frais au moyen de l'homo- gênêisateur Silverson avec 800 ml de solution 0,2M de KHCO^, pH 8,3 ; apres 2^ centrifugation 1 9000 t.p.m. à 5 fîC, la partie qui .surnage est recueillie et filtrée sur membrane d'acétate de cellulose 0,1*5yb-· On ajoute à 50 xnillitres de solution limpide 1,2 g d’anhydride succinique, en portions successives, en

" ; -H

1 maintenant le pH entre J ,5 et 8 par addition de HaOH.

Après repos d'une heure à température ambiante, la solution est acidifiée par un acide minéral à pH 3, et on obtient un précipité qui est traité comme dans l'exemple U, si ce n'est que la récupération finale est 5 effectuée par lyophilisation de la solution, dialysée contre de l'eau. Le résidu de la lyophilisation est mis en suspension dans l'eau et porté à pH 8, au moyen de soude. On obtient une solution pas tout à fait limpide qui est centrifugée ; on ajoute à la partie qui surnage une solution de fer (par ex. Chlorure ferrique) de façon que le rapport (estimé) entre protêinë succinylée 10 et Fe^+ soit d'environ 10:1.

Le pH de la solution descend à 2,6, et on obtient un précipité qui est purifié comme dans les exemples précédents. Le produit solide obtenu par lyophilisation de la solution finale, dialysée contre de l'eau, a les caractéristiques et la teneur en fer répertoriées dans le tableau I.

EXEMPLE 7

Préparation de dérivés du fer de protéines succinylées de soja

On suspend 5 grammes de protéines de soja dans 100 ml d'eau contenant 3 g de NaHCO^ ; on laisse sous agitation jusqu'à dissolution complète ; tout 20 en maintenant le pH entre T,5 et 8 par addition de NaOH on ajoute par portions successives 2,5 g d'anhydride succinique- On laisse sous agitation pendant 2 heures à température ambiante et, par addition d'acide minéral, on porte le pH à 3,^ en obtenant un précipité qui est purifié comme dans les exemples précédents. Le résidu solide de la. lyophilisation finale est mis en suspension 25 dans 100 ml d'eau, on règle le pïï à 8 par addition de soude, puis on centrifuge la solution pas tout à fait limpide.

La partie limpide qui surnage est traitée par une solution de fer . (par ex. chlorure ferrique) de façon que le rapport entre protéine succinylée et Fe^+ soit de 10:1 en poids.

30 Lë pH de la solution chute spontanément à 2,6 et il se forme un préci pité qui est traité comme dans les exemples précédents. Le produit solide . obtenu par lyophilisation de la solution finale présente la teneur en fer et les caractéristiques répertoriées dans le tableau I- Le rendement en poids par rapport à la protéine de départ est de 22 %.

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CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE DES DERIVES DE FER DE PROTEINES SUCCINYLEES OBTENUS SUIVANT LES EXEMPLES! ~T

Les dérivés obtenus suivant' les exemples exposes ci-dessus ont êtê analysés suivant les méthodes précisées ci—après: ^ a) degré de suceinylation

Cette caractéristique est exprimée par le pourcentage de groupes suc-cinylés par rapport aux groupes pouvant être succinylés de la protéine de départ. On a appliqué la méthode décrite par S. Moore et W.H. Stein, J. Biol. Chem., 211, 907, 195¾ par réaction à.la ninhydrine des groupes aminés libres.

Les résultats sont donnés dans le table.au I.

b) teneur en fer ·

La teneur en fer a été déterminée, soit après extraction à chaud par HCl 2N, soit après digestion conplète de la protéine par l'acide sulfurique, ? suivant le protocole décrit dans Standard Methods, 1¾ ed., 1975 page 208, APHA-AWWA-WPCF (réaction à 1 ' o-phénanthroline). Les valeurs sont reportées r dans le tableau I. , c) données spectroscopiques

1) Spectroscopie RPE

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Tous les dérivés décrits dans les exemples exposés ci-dessus, présentent le meme comportement spectroscopique. Nous .décrivons, à titre d'exemple, le spectre RPE du dérivé succinyl-ferro-protéique préparé suivant l'exemple 1. Le spectre a êtê enregistré en poudre lyophilisée et présente gj. un signal très large, centré autour de g=2,0, avec une amplitude de signal d'environ 2000 G. On remarque un autre signal, très bien défini et centré., . lui aussi, à environ g=2,0. La forme des deux signaux est caractéristique des ‘ . centres paramagnétiques de Fe° liés en interaction (F. Reid et autres Inorg.

Chem. Jf, 119» 1968). L'ensemble de ces données semble indiquer la présence de -- structures protéiques fermées autour du ligand.

2) Dichroigne circulaire

Ici également le comportement des divers dérivés décrits est similaire ; nous décrivons, à titre d'exemple, le spectre de dichroisme circulaire du dérivé succinyl-ferro-protéique obtenu suivant l'exemple 1. Le spectre est 35 k - · 11 caractérise par une activité négative dans la zone U.V. ; on remarque une "bande négative intense avec un maximum autour de 225 um»·, avec un épaulement, toujours négatif, centré autour de 225 nm. Ces caractéristiques spectrales semblent indiquer la prédominance d’une structure protéique désordonnée 5 (entre autres : F. Ciardellî et P- Salvador! - Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism - Heyden & Son Ltd., London, 1973 -Chapitre ^«5)- 3) Spectres d’absorption U.V. -Visible

Le comportement au spectre électronique des divers dérivés décrits ‘ est similaire ; nousreportons 'dans la figure 1 le spectre U.V. -Visible pour le dérivé succinyl-ferro—protéique préparé suivant la'description de 1’. exemple 1-

Le spectre (ligne continue) ne présente pas de maximum d’absorption dans le visible, mais seulement im épaulement très faible autour de U50 nm.

Dans l’ultraviolet on remarque un épaulement assez défini centré au-^ tour de 270 nm et une absorption très intense avec un maximum au-dessous de 220 nm.

Dans la figure 1 est aussi reporté (ligne en tirets), pour comparaison ^ le spectre de la ferritine de rate chevaline (Boehringer-Hannheim).

Les spectres d’absorption dans le visible sont reportés sur la figure 1, et ils ont été effectués dans l’eau, pH 7· Est aussi reporté, pour comparaison le spectre de la ferritine de rate chevaline, réalisé dans les memes conditions (Boehringer-Mannheim).

Il·) Spectre d’émission de fluorescence

Les spectres d’émission de fluorescence sont portés sur la figure 2, où la ligne continue correspond aux dérivés succinyl-ferro-protéiques de D’invention, la ligne à points et tirets aux lacto-protéines telles quelles, et celle à tirets aux lacto-protéines suceinylêes.

On observe une extinction de la fluorescence de la protéine due à la / présence du-*mêtal. .

30 * ' d) électrophorèse

Les tracés électrophorétiques sur acétate de cellulose des divers dérivés en comparaison avec les protéines succinylées, les protéines d’origine et la ferritine sont portés sur les figures 3» U, 5 et 6.

35 La figure 3 illustre les résultats de l’électrophorèse réalisée sur - * t j b -

I J

des protéines de soja (tracé n. 1), protéines de soja succinylées (tracé n.2), dérivé de fer de protéines de soja non succinylées, fraction soluble (tracé I n. ^).

I La.figure U illustre les résultats de 1*électrophorèse réalisée sur I . 5 l’ovalbumine (tracé n.. 1), l’ovalbumine succinylée (tracé n. 2), un dérivé de I fer d’ovalbumine succinylée (tracé n. 3), un dérivé de fer d’ovalbumine (tracén.U) I La figure 5 illustre les résultats de l’électrophorèse réalisé sur des lacto-protêines (tracé n.1 ), lacto-protéines succinylées (tracé n. 2), dérivés l·; I * - de fer de lacto-protéines succinylées (tracé n- 3) , ferritine de rate chevaline I 10 (tracé n· Ij·).

I La figure 6 illustre les résultats de l’électrophorèse (lecture densi- tométrique à 550 nm) réalisée sur dérivé de fer de lacto-protéines succinylées I (ligne continue), dérivé de fer de protéines de soja succinylées (points et tirets) et dérivé de fer d’ovalbumine succinylée (ligne à tirets).

I e) gel filtration

Le profil de gel filtration sur Sephadex G 75 (Pharmacia, Uppsala); B- du dérivé de fer des protéines succinylées du lait (obtenu comme décrit dans l'exemple l) par comparàison aux protéines succinylées elles-mêmes, est illustré par la figure T-, dans laquelle la ligne continue concerne les lacto-protêines 20 succinylées, celle· à tirets le dérivé de fer correspondant ; en ordonnée est H reportée l'absorption à 2Ô0 nm, et en abscisse, le nombre progressif des frac- tions recueillies. D’après le profil, on constate que la présence du'fer fait naître un pie unique en sortie avec un temps de rétention analogue- à celui du volume mort de la colonne. Si l’on considère que l’exclusion moléculaire de la 25 Sephadex G 75 est d’environ 75 000 Daltons, le poids moléculaire minimum apparent de cet agrégat est supérieur à cette valeur. En outre, s'il y a une I , différence, dans les protéines succinylées on remarque un dédoublement de pic I , avec une "randomisation” plus grande. Ce fait est aussi vérifié au niveau de I " l’électrophorèse (figure 5)· Un tel comportement montre que le fer présent est I -30 un centre d'agrégation intermoléculaire du milieu protéique. Par le gel filtra- tion sur Sephadex G 200 on peut mettre en évidence d'autres informations, par H comparàison avec la ferritine (figure 8, dans laquelle les abscisses et les I ordonnées sont comme dans la figure 7, alors que la ligne continue correspond au dérivé du fer de lacto-protéines succinylées et celle à tirets concerne la H 35 ferritine de rate chevaline). Aussi dans ce cas, le pic est univoque alors que i

Ile temps de rétention est supérieur a celui de la ferritine. Cela semble montrer que le poids moléculaire apparent est inférieur à celui de la ferritine de rate chevaline. - .

f ) stabilité du suc gastrique

Cet essai est effectué sur le dérive de fer obtenu suivant 1 ' exemple 1. Il est réalisé par la dissolution de 25 mg de dérivé dans 0,5 ml d'eau distillée et l'addition de cette solution à 5 ml de suc gastrique de rat. On obtient un précipité et la suspension est incubée à 37°C durant 60' sous agitation.

^ Après cette période de temps, le précipité est séparé par centrifugation et le produit surnageant est analysé en vue de la délimitation de la teneur en fer. La quantité de fer cédé au nue gastrique était de 1 % du total initial” g) -précipitation du dérivé de fer -par le sulfate d'ammonium A une solution à 10 % (p/v) de dérivé de fer préparé suivant l'exemple 15 1, ôn additionne 30 % (p/v) de sulfate d'ammonium. On obtient un précipité de dérivé protéique du fer qui présente des caractéristiques identiques à celles du dérivé de départ et qui est encore soluble dans l'eau.

L'ensemble de données exposées' ci-dessus démontre que la capacité complexante des protéines succinylées à-JL!égard du fer n'est pas' typique ^ seulement des protéines succinylées du lait, mais qu'elle est •caractéristique des dérivés succinylês de protéines d'origine et de fonction physiologique diverses, animale et végétale.

Comme nous l'avons précisé ailleurs, beaucoup de protéines animales ou végétales non modifiées sont capables de lier du fer. En effet, quand £>n ^5 fait réagir des protéines non modifiées du lait, de l'ovalbumine et des protéines de soja,de sérum ou d'extraits d'organes, (foie) avec le fer dans des conditions similaires à celles décrites, pour obtenir les dérivés correspondants des succinyl-protéines, on obtient des produits ayant également des teneurs en”fer similaires, toutefois avec des caractéristiques de solubilité ^ et stabilité complètement différentes. En effet, à titre d’exemple, comme on voit sur le tableau I, la protéine de soja donne un produit final qui, une fois lyophilisé, est insoluble pour plus de T5 % et cède son fer après traitement avec un suc gastrique. Par conséquent, outre la capacité complexante à l'égard du fer, le comportement des dérivés ferro-protéines succinylées, ^ faisant l'objet de l'invention (à savoir solubilité en milieu alcalin, stabi- t/ .

14 lite en milieu acide et en présence de sucs gastriques même pour des teneurs en fer élevées), n’est pas attribuable aux protéines de "base, et n’était donc pas en tant que tel, prévisible.

TOXICITE

5 a) On a examiné la toxicité aiguë chez 'le rat Swiss, par voie orale, au moyen d'une sonde gastrique, de la ferro-succinyl-protêine de protéines de lait obtenue suivant la description de'l'exemple 1, 'véhiculée par de l’eau distillée. La DL,-q était supérieure à U 000 mg/kg.

10 b) La toxicité par administration répétée chez le rat, par voie orale, du - -s même dérivé de l'exemple 1 (appelé par la suite "Ferrolat") a été étudiée pendant 20 jours de traitement continu chez des rats males Wistar d’un poids initial de 200 grammes, en stabulation pendant 1U jours avant le traitement puis

''randomisés" et séparés en groupes de 10 (groupe I - témoins, groupes II, III

15 et IV Ferrolat à 30-100-300 mg/kg/jour). La préparation à tester, dissoute au moment de l'utilisation dans ÏÏ^O distillée a été administrée journellement, s.ans discontinuité et 1 la même heure de chaque jour, par sonde ; les témoins \ * ont reçu un volume égal (10 ml/kg) d'eau de source. Durant le traitement les rats ont été pesés journellement avant l'administration, et observés pendant 20 quelques heures après l'administration du produit. La quantité d'aliment consommé a été mesurée à la fin du traitement, 2k heures après la dernière administration, et après environ 20 heures de jeune,les rats anesthésiés par l'éther λ .

ont été sacrifiés par coupure des carotides ; une partie du sang a été-recueillie dans "une éprouvette contenant de l'EDTA (2 gouttes d’une solution à 4 5>J, le 25 restant a été laissé se transformer en sérum. Sur le sang total on ä effectué les examens hémochromocytométriques et sur le sérum les examens hématochimiques. ·· ·

RESULTATS

- «.

* 20 variâtions pondérales et consommation d'aliment

Sur la figure 9 sont représentées les courbes de l'accroissement pondéral obtenues durant le traitement jusqu'au jour précédent le sacrifice.

Λ 'Dans le tableau II et dans le tableau III, sont portées respectivement les valeurs inhérentes à l'accroissement pondéral et à là consommation d'ali-35 ment par les animaux en cours de traitement.

yk .

15

La courbe d'accroissement du groupe.de rats traites par Ferrolat à des doses de 300 mg/kg s'avérait ralentie d'une façon significative, par rapport à la courte d'accroissement du groupe de rats témoins, à partir du 15 ème jour du détut du traitement ; le même groupe de rats avait, en moyenne, 5 consommé moins d'aliment (-11,7 %)·

Des différences mineures, statistiquement non significatives, ont été otservêes chez les groupes restants de rats traités par Ferrolat.

Examens hématologiques .. Les résultats sont portés dans le tatleau IV.

10

Examens hématochimiques·

Les résultats sont portés dans le tableau V. Une modeste diminution de la phosphatase alcaline a été observée chez les rats traités par Ferrolat, 300 mg/kg/jour.

• 15

Examens des urines

Les résultats sont portés dans le tableau VI.

Examenà des organes 20 Dans le tableau VII sont portés les poids moyens absolus des organes principaux de rat, et dans le tableau VIII les poids moyens correspondants relatifs au poids corporel. . . .· .. .

Dans le groupe de rats traités par Ferrolat 100 mg/kg/j our on a constaté un accroissement significatif du poids relatif de la rate et des poumons. Dans 2,- le groupe de rats traités par Ferrolat 300 mg/kg/jour, outre une diminution significative du poids corporel apparaissait un accroissement significatif du poids moyen des testicules.

NIVEAUX HEMATIQUES APRES ADMINISTRATION ORALE a) Comparaison Ferrolat-sulfate ferreux 30

On a utilisé des rats mâles ¥istar d'un poids d'environ 200 grammes à jeun depuis 18 heures, "randomisés” et séparés par groupes de 5 ; chaque groupe a été sacrifié à l'heure déterminée et on a prélevé le sang de chaque animal par résection de la carotide ; sur le sang de chaque animal du groupe, 2^ la détermination du fer a -été effectuée speetrophotométriquement par mise en

L

y y jj ' · . ·1!^ ul ν' I 16 I oeuvre d’acide bathophénanthroTfrff sulfonique (Fe-Test,Wako) - L’administration B a été effectuée par sonde ï en solution aqueuse (5 ml/kg) - .Le dérive suecinyl— B ferro-protêique utilisé avait été préparé suivant la description de l’exemple

B 1 (Ferrolat) .Les doses* et les résultats sont portés dans le tableau IX. A

15 remarquer que la quantité de fer/kg était égale pour les deux dérivés (Fe : 1 mg/kg).

b) Comparaison Ferrolat — ferritine · ' i On a utilisé des rats mâles Wistar d’un poids d’environ 200 grammes à jeux depuis 18 heures, "randomisés” et séparés par groupes de 9 ; chaque groupe a été sacrifié à l’heure déterminée, et on a prélevé le sang de-chaque animal par resection de la -carotide ; sur le sang de chaque animal du groupe, la détermination du fer a été effectuée par specfcrçphotomêtrie en employant la Iron Colorimétrie Method (Boehringer-Mannheim)· L’administration a été effectuée par sonde · en solution aqueuse (5 ml/kg). Les doses ^ et les résultats sont portés dans le tableau X. A remarquer que la quantité de fer/kg pour le dérivé suecinyl-ferro-protêique désigné Ferrolat était la meme que celle de la Ferritine (Sigma, St. Louis Missouri),et égale à 1 mg/kg.

c) Comparaison entre dérivés succinyl-ferro-protéiques obtenus â partir *de • m 20 divers types de protéines

On a utilisé des rats mâles Wistar d’un poids d’environ 200 grammes, à jeun depuis 18 heures, "randomisés” et séparés par groupes de 5 (un pour l’administration du dérivé, et Tin groupe témoin). Chaque groupe a été sacrifié deux heures -après l’administration et, par résection de la carotide, on a 25 J prélevé le sang de chaque animal pour la détermination du fer, par mise en oeuvre de l’acide bathophénanthroLine sulfonique (Fe-Test ,Wako ). L * administra-· tion orale a été effectuée par sonde en solution aqueuse (5 ml/kg). Les doses de chaque dérivé utilisé.Λ ont été choisies de façon à administrer toujours j v 1 mg/kg de Fe.

Produits essayés : 1) protéines de soja suceinylêes + Fe (U,U2 %) 2) ovalbumine succinylee + Fe (3,57 %} - ’ 3) Séro protéines bovines suceinylêes + Fe (5» 78 %) 4) Protéines de lait suceinylêes + Fe (U,5 %)

Les résultats sont portés dans le tableau XI.

I ' : · 17. · TABLEAU I - i SOURCE ‘ SUCCINYLATION Fe RENDEMENT SOLUBILITE f) £- PROTEIQUE ?e ?r°apea ^ s) (% de la à pH> 5 5 succmylables) proteine ' suacinylée)

Lait a) 95 6,7 30 + - 11 b) " il,6 20 + « *' -3 2 18 + - 10 *' ' " _ " 2,5 18 + " eî " 0,8 13 + lactoprotéines 95 4,5 +

Ovalbumine 95 3,6 33 + Séroprotéines g (5,8 . + (bovines) \5,5 30 + - 15 (Soja) 92 4,4 22 + (Organe) ' (foie) n*d* 8’4 n*d* +" (Lait) 35 4,3 26 +

Lactoprotéines 0 4,8

Ovalbumine 0 il’! "* 20 l0’4 (Soja) oo" {m ' - Séroprotéines Λ (bovines) 0 °’5 (Organe) . .

25 . (foie) .. 0 n*d· n*d* ~ •r * fc a), b), c), d), e) échantillons avec rapport de Fe : protéines compris entre 0,1 : 1 et 5 : 1 (p:p).

2Q f) complète (+) ; partielle (+ -) ; insoluble (-).

4 .

18, ' .

TABLEAU II

ACCROISSEMENT PONDERAL

5 --;-Ί- TRAITEMENT Poids moyen Poids moyen Accroissement ng/Kg/jour initial final pondéral

moyenne - ET

Témoins 224,10 - 2,83 343,60 ~ 8,87 119,50 - 7,66 10 Ferrolat 30 224,40^3,03 325,50^4,56 101,20^4,35

Ferrolat 100 224,40 ^2,30 326,10 - 8,06 101,70 - 8,08 - . *. **+

Ferrolat 300 224,30 - 3,71. 307,00 I 10,15 82,77 - 8,28 * p <0,05 ** p <0,01 15 Signification par rapport aux témoins (calculée avec le "t" de Student)

TABLEAU III

CONSOMMATION D» ALIMENT

20 TRAITEMENT Consommation Variation nß/kg/jour moyenne ^ totale * Témoins 32,33 -

Ferrolat 30 · 30,42 - 5,9.1 25

Ferrolat 100 30,98 - 4,18

Ferrolat 300 28,54 -11,72

TABLEAU IV

-30 ; DONNEES HEMATOLOGIQUES

TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 35 Hémoglobine g % 12,11^0,47 11,77i0,37 12,39Î0,30 12,93^0,25 Hématocrite % 66,88+2,06 61,44^1,96 66,90^2,77 64,16Î1,80

Leucocytes 103/mn3 16,95+2,25 16,55Î1,65 23,46Î2,16 19,93^2,58

Erythrocytes 10b/mm3 5,76-^),51 6,12+0,66 5,91+0,68 6,2210,31 -- ~ y 19

TABLEAU V

DONNEES HEMATO-CHIMIQUES

_ TRAITEMENT mg/kg/jour 5 Témoins Ferrolat 30 Ferrolat. 100 Ferrolat 300

Glucose. 55,33- 5,75 52,8li«,38 63,61-5,58 ,60,70,97 10 - **________

Azotémie - 32,73-1,33 3^,59^2,25 28,6812,34 32,33^2,52 mg το G0T 110,51^7,10 130,81-8,59 109,09-5,21 113,36*7,29 mU/ml 15_____ f

f*PT

19,58+1,52 26,8613,43 30,1416,02 23,15Î2,57 mU/ml

Phosphatase - t 20 alcaline 255,65113,82 229,53117,03 257,53122,35 213,80Ϊ12,72 mU/ml

Protéines totales 6,19ÎD,12 6,02Î0,17 6,37^0,12 6,21^0,16 25 g % ·

Signification * P <0, 05 30 ** P<°,01 *** .. P <0,001

A

•20 TABLEAU VI ;

EXAMEN D'URINES

TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 pH 8,15^0,17 8,55-0,14 8,40-0,18 8,50^0,12 2 ^ protéines 21,- ^3,78 24,- ^3,05 63,- - 12,47 53,33-11,66 glucose abs. abs. abs. abs.

corps abs. abs. abs. abs.

cetoniques bilirubine abs. abs. abs. abs.

sang abs. abs. abs. abs.

Signification * p < 0,05 ** P < 0,01 *** p < 0,001 : L- .

2i : - J-

TABLEAU VII

POIDS FRAIS ABSOLU DES ORGANES DE RAT

5 TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat-100 Ferrolat-300 corporel g 310,60^7,53 300,33-3,6¾ 296,8^6,16 278,^8,89 , 10_______

Coeur g 1,15-0, Ö5L 1,10-0,03 1,14-0,04 1,09^0-,07

Poumon g 1,55-0,05 1,70-0,20 1,68^0,05 1,57-0,12 15------;--

Foie g 9,14^0,35 8,89^0,35 8,78-0,28 8,35-0,¾¾

Rate g 1,38-0,13 1,36^0,08 1,65-0,12 1,37-0,09

20 ~ ~~ + I

Reins g 2,28-0,07 2,21-0,09 2,22-0,08 2,09-0,10 -

Surrénales g 50,30-^55 56,33-7,69 51,80^6,07 " 37,^5,56 ?5 Cervelle g 1,77^0,03 1,70-0,03 1,67^0,05 1,68^0,06

Testicules g 3,30^0,05 3,12^0,10 3,08^0,16 3,25^0,07 ,· 30 Estomac g 1,77-0,09 1,77-0,05 1,75^0,07 1,53-0,09

Signification * 'p<0,05 ** p<0,01 - 35 *** p<.0,001 L - if . - I Μ 9 |h * 22

1 TABLEAU VIII

I POIDS FRAIS RELATIF DES ORGANES DE RAT

I TRAITEMENT mg/kg/jour Témoins Ferrolat 30 Ferrolat 100 Ferrolat 300 I Poids * I i . corporel 310,60^7,53 300,33^3,64 296,80-6,16 278,44^8,89 I ' ' Coeur % 0,37-0,01 0,37-0,08 0,39-0,09 0,39-0,02 I Poumons % 0,50-0,02 0,56-0,06 0,57^0,02 0,57-0,06 I Foie % 2,94^0,04 2,96Î0,10 2,96^0,06 2,99-0,08 ï Rate % 0,44*0,03 0,45-0,03 0,56^0,04 0,49-0,03 1 Reins· % 0,73-0,01 0,74-0,02 0,75-0,03 0,75-0,02 I Surrénales % 0,016-0,001 0,019-0,003 0,017^0,002 0,014^0,002 I Cervelle % 0,57-0,02 0,57-0,01 0-57-0,02 0,60^0,01 I Testicules % 1,06^0,02 1,04^0,03 1,0.4^0,05 1,1*8^0,04 I Estomac % 0,56-0,02 0,59^0,02 0,59-0,02 0,54^0,02

Signification I * P <0,05 I ** P <0,01 I *** p< 0,001 * 23

TABLEAU IX

NIVEAUX HEMATIQUES : COMPARAISON FERRQLAT - SULFATE FERREUX

I TRAITEMENT Fer sfri 5 heures apres traitement -__30*__1__2 4__6 Témoins HO 5 mi/kg 99,22 59,91 98,23 80,17 74,- £ . +24,92 +6,85 +13,28 +6,37 +10,10 (5) " (5) " (5) ~ (5) " (5) ** *H *** ** ** Ferrolat ; 22,37 mg/kg 227,45 275,28 269,61 203;16 148,18 (Fe égal à 1 mg/kg) +16,40 +18,91 +22,51 +27,74 +16,73 (5) " (5) ** (5) “ (5) " (5) *M H* *** fjty

FeS047H20:4,98 mg/kg 336,27 272,14 273,56 129,50 80,52 (Fe égal à img/kK p os) î27’79 î24’09 i19»32 ±6’21 ±5,65

Ue egai a lmg/Kg P-os> (5) (5) - (5) - (5) * (5)

Signification par rapport aux témoins : * p <0,05 ** p < 0,01 *** / P< 0,001

Signification entre deux préparations de fer : 30’ : p(0,01 ; 4h : p <0,05 ; 6h : p < 0,01.

TABLEAU X

NIVEAUX HEMATIQUES r COMPARAISON FERROLAT-FERRITINE

'TRAITEMENT . Fer serique/^g/100 ml heures apres le traitement 25 ; à i ” 6

Ferritine (F-4503 Sigma 168,79 170,66 148,08 89,22 * dilution .1,08% v/v, +ic ,c +1ii γο +ig gg +-jp 75 5ml/kg soit 1mg/kg de Fe) - +14,70 +lô,b9 +12,75 30 (soïff J/k!6d^Fe? 3“”07 26”81 223·72 ’06·21· il?»» î29*94 i18·5’ -î"’3° Témoins, eau distillée R**i

Smi/kg ^39 * p <0,05 35 ** p <0,01 *** p <0,001 , La signification est calculée avec le nt" de Student pour la Ferritine.

il : '· j-, * — - " ’ ' - -'s ·**« ;· · - - r .

• · ··>· “.

·. · 2U > .

TABLEAU XI

NIVEAUX HEMATIQUES : COMPARAISON ENTRE DERIVES SUCCINYL-FERRO-PROTEIQUES DE DIFFERENTS TYPES DE PROTEINES

. 5 ' - TRAITEMENT Fer sériqUe ^/^7100 ^

valeurs moyennes + ET

- * Témoins 83,99^7,56

Soja suce. 260,68Î 29,52 . * '10 Ovalbumine suce. 235,82Î ·46,06 . **

Seroprotéines suce. 277,63- 49,35 *** ·

Ferrolat 305,8l± 23,20

Signification par rapport aux témoins : * P <0,05 ** p < 0,01 *** p ^ 0,001

La présente invention se rapporte aussi à tous ses aspects applicables 20 industriellement et qui se rattachent à l'utilisation des dérivés succinyl- ferro—protéiques décrits ci—dessus et revendiqués, en tant qu’agents propres ( à la thérapie des anémies sidêropêniennes. Donc, un aspect- essentiel de lrinvention est constitué par des formulations pharmaceutiques pour usage humain ou vétérinaire contenant des quantités prédéterminées de l'un au moins de ces -25 dérivés. Ces derniers peuvent être administrés par voie orale, par exemple sous forme de comprimés, granulés en sachets, sirops, capsules, ampoules, et poudres· à ajouter au fourrage pour animaux, etc.

A titre d'exemples, nous citons les formulations suivantes : — ampoules contenant 5-10-4θ mg de fer sous forme de f erro-succinyl-protéines , 30 outre un’dissolvant aqueux, des stabilisants, des aromatisants, etc. communément employés dans la technique pharmaceutique ; *: - Comprimés à 5~10-Uo mg de fer sous forme de f erro-succinyl-protéines, outre les excipients désagrégeants, etc. communément employés dans la technique phar- .:. maceutique ; - 35 - Capsules à 5-10-40 mg de fer sous forme de succinyl-ferro-protéines ; fi - t Λ .

25 ' - Sachets d'une dose contenant un granulé effervescent à 5~10-Uo mg de fer sous forme de ferro-succinyi-protéines, outre un sucre, des aromatisants, des stabilisants, etc. communément employés dans la technique pharmaceutique ; - Poudre de lait à ajouter au fourrage de sevrage pour animaux, à 5 % ~ 20 % 5 en poids dé principe actif.

. fs ' .

\ y

Claims (9)

1. Protéines succinylées contenant du fer.

2. Protéines succinylées contenant de 0,1 à 20 % en poids de fer. I 3·.Protéines succinylées selon la revendication. 1 ou 2, caractérisées 5 par le fait que leur degré de succinylation est compris entre 20 et -100 %.

4. Protéines succinylées suivant la revendication 1,2 ou 3, caractérisées par le fait que la protéine de départ est une protéine d'origine végé- ’5. Protéine de lait avec un degré de succinylation supérieur à J0 % , 10 contenant plus de 4 % en poids de fer.

6. Ovalbumine avec un degré de succinylation supérieur à 70 %3 contenant plus de ^ % en poids de fer.

7- Protéine de soja avec degré de succinylation supérieur à 70 %, contenant plus de % en poids de fer.

8. Procédé pour la préparation de proteines succinylées contenant du fer suivant-llune quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'on fait réagir une protéine succinylêe avec des sels de fer dans un milieu aqueux, à un pïï compris entre environ 2 et environ 10, et qu'on . isole le produit ainsi obtenu par précipitation à un pH de l'ordre de 2-k, ce 20 dernier intervalle de pïï étant réalisé spontanément ou par acidification.

9· Procédé suivant la revendication 8, caractérisé par le fait que la réaction entre la protéine succinylêe et les sels de fer’ est réalisée à un pïï voisin de la neutralité.

10. Procédé pour la préparation de protéines succinylées contenant du 25 fer suivant l’une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu’on fait réagir une protéine succinylêe avec des sels de fer en milieu aqueux à un pïï compris entre environ 2 et environ 10, et qu'on isole le pro-duit de réaction par séparation du solvant après ajustage du pïï à des valeurs proches de*la neutralité*

11. Compositions pharmaceutiques pour la thérapie des anémies sidércpénienrKS chez l'animal et chez l'bonne, caractérisées par le fait qu'elles ccntierœnt ei tant que principe actif, au.moins l'une des protéines succinylées contenant du fer suivant l'une quelconque des revendications 1 à 7·