NO163859B - Fremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive succinylerte jernholdige proteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av succinylerte jernholdige proteiner som kan anvendes som legemiddel. Succinyleringsgraden er mellom 20

og 100% og proteinene inneholder fra 0,1 til 20 vekt% jern fremstilt ved behandling av succinylerte proteiner med jernsalter ved formålstjenlige pH-områder. De foreliggende forbindelser, som tolereres fullstendig, er karakterisert ved en optimal biologisk tilgjengelighet av jernet.

Jern^som foreligger i alt kroppsvev, spiller en fullstendig uunnværlig fysiologisk rolle. Det er en del av en vesentlig bestanddel av hemoglobin, myoglobin og enzymene: katalase, fumarsyre-dehydrogenase, peroksydase, cytokromer, DPN-cytokromreduktase og metalloflavoproteiner såsom ferro-flaviner. Et voksent menneskes kroppsvev inneholder fra 1,5 til 5 g jern hvorav 60-65% er konsentrert i de røde blode-legemer, mens 18 til 30% er bundet til ferritinproteinene og hemosiderin som befinner seg i leveren, milten, benmargen og cellene i det endoteliale retikulære system. Resten er fordelt i de forskjellige ovenfor nevnte enzymsystemer,

i myoglobin, (ca. 4%) og i transferrin (ca. 0,1%), Globu-linet for hematisk transport av jern er av intestinal opprinnelse. Det kan binde,.ved fysiologiske pH-verdier, 2 jernatomer på en praktisk talt ikke dissosierbar måte.

Jernbehovet tilfredsstilles delvis ved bruk av endogent

jern (som stammer fra ødeleggelse av gamle rød blodlegemer) og delvis ved absorpsjon av eksogent jern. Absorpsjonen av eksogent jern finner sted gjennom tolvfingertarmen og den øvre del av hungertarmen og det akkumuleres overveiende i leveren. Det første patologiske symptom på jernmangel er hyperkrom sidropen anemi hvis primære grunner kan være forskjellige: kroniske blødninger som finner sted ved gastro-duodenale mavesår eller neoplasier, feilaktige dietter,

eller dårlig absorpsjon slik tilfellet er ved diaré; økede behov for eksempel ved svangerskap, diegivning, infeksjons-sykdommer osv.; dårlig metabolisk utnyttelse; spesielle behandlinger såsom administrering av ACTH og kortisoner.

Den mest hensiktsmessige terapi er administrering av jern.

Dette reduserer effektivt den anemiske tilstand når denne tilstand skyldes en virkelig jernmangel. Imidlertid følges den i allminnelighet av uønskede bivirkninger i forbindelse med den type bærer som brukes for jernet. De mest utbredte farmasøytiske per os preparater er basert på meget varierte organiske og uorganiske syresalter, gradvis innført i terapi med håp om å redusere de ovenfor nevnte bivirkninger. Per os spesialpreparater markedsføres derfor basert på uorganiske salter av typen: jern(III)klorid, jern(II)sulfat, jern(III)fosfat, eller også uorganiske salter såsom citrater, kolinater, aspartater, fumarater, glukonater, glycinater, laktater, oksalater, succinater. Ved dyp intramuskulær administrering er ferrodekstrankomplekset foreslått, mens det for iv. behandlinger (for siderofen anemi i hvilket per os behandling ikke virker), gjøres bruk av ferrodekstrinkomplekset.

Ved de siste typer av komplekset kan bivirkninger forekomme

i form av allergiske reaksjoner, temperaturstigninger, takykardi, leukocytosis, lymfadenopati ved intramuskulær behandling og også anfylaktisk sjokk, tromboflebitt og sirkulasjonskollaps ved i.v. behandling. Ved per os behandling ved bruk av formuleringer basert på ovenfor nevnte forbindelser, er bivirkningene i allminnelighet gastrointestinale lesjoner med nekrose og perforering av slim-membranene i alvorligere tilfeller, samt diarré og oppkast.

I tillegg gjør lave toleransegrenser administrering av riktige mengder jern vanskelig. For å minimalisere bivirkningene er det foreslått at mat bør inntas samtidig, men dette står i motsetning til den beviste variabilitet av absorpsjonen av jernet som en funksjon av sammensetningen av selve maten. Det er faktisk fastslått at absorpsjonen av jernet fra preparater er optimal når pasienten har fastet. Dertil følges gastrisk irritasjon av bruk av antacider som igjen reduserer absorpsjon og forsterker den anemiske tilstand.

Imidlertid er betydelig fremgang i jernterapi, spesielt ved per os administrering, oppnådd med innføring av ferritin-baserte spesialpreparater på markedet.

Ferritin er et jern(III)globulin og er det viktigste jernholdige protein i legemet hos pattedyr. Handelsproduktet ektraheres fra hestemilt som råmateriale.

Dets jerninnhold er 20% på tørrvektsbasis. Dets protein-andel, apoferritin, har en molekylvekt på ca. 445.000

omgir en "kjerne" av krystallinsk oksyd-fosfatjern. Dette er egnet for per os administrering ettersom det er løselig i vann.

Ferritinbasert behandling fører ikke til gastrointestinale bivirkninger under bruk av de ovenfor nevnte jernderivater. Bruken derav er imidlertid begrenset både som følge av rå-materialets meget høye pris og spesielt som følge av den begrensede tilgjengelighet på ekstraksjonskildene.

Tidligere har man funnet at den optimale bærer for jernet for absorpsjonsformål uten bivirkninger kan være en protein-bærer. Mange proteiner har en viss affinitet til jern.

Visse typer animalsk protein (serumproteiner, organproteiner, ovalbuminer, laktoproteiner) eller vegetabilsk opprinnelse (soyaprotein) har derfor vært undersøkt for bruk som bærere.

Reaksjonen mellom uorganiske jern(III)salter og ovenfor nevnte proteiner fører til dannelse av ferroproteinderivater hvis terapeutiske interesse imidlertid undergraves av en rekke negative egenskaper såsom: - uløselighet av de erholdte derivater når jernandelen som er bundet til proteinet når verdier over 0,5%; - vanskelighet eller umulighet av å bestemme hvilken fraksjon av det totale jerninnhold under slike uløselighets-tilstander faktisk er bundet til proteinet og hvilken fraksjon som nedfelles i form av hydratiserte oksyder hvilket kan forårsake sterke gastriske lesjoner; - mangel på homogenitet og komposisjonen stabilitet med hensyn til jern i disse derivater.

Dertil har ved slike proteiner, innebefattet sådanne som stammer fra melk, nærvær av løselige jernderivater med en betydelig andel uløselige derivater blitt observert ved forskjellige pH verdier, og sammensetningen av disse løselige fraksjoner er ekstremt varierende som følge av meget små variasjoner i de eksperimentelle parametere.

Det er nå overraskende fastslått at ved å utføre syccinylering av ovenfor nevnte proteiner under riktige betingelser (den prosess som normalt brukes for å fremstille proteinsuccinyl-derivater for bruk i næringsmidler eller dyrefor) er det mulig å oppnå ved omsetning av disse med jern, ferroproteinderivater med et høyt jerninnhold som er stabilt, løselig ved pH verdier på mer enn 5, har forskjellige, men reproduserbare jerninnhold, kan tilføre pattedyr jern ved oral administrering uten å forårsake bivirkninger av gastrisk lesjonstype. I rotter ga daglig oral administrering i 20 påfølgende dager ingen tegn på gastriske lesjoner og viste en høy toleransegrad.

I rotter viste sammenligning mellom tilstander av sideranemi etter oraladministrering av ekvivalente mengder av jern i form av jern(II)sulfat, hestemiltferritin (Sigma, Saint Louis Missouri) og ferroproteinderivater fra succinylerte melkeproteiner fremstilt som beskrevet i eksempel 1, at: a) de hematiske jernkonsentrasjoner frembragt av derivatet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse 1 forhold til sådanne frembragt ved jern(II)sulfat, forlenges i tid (se tabell IX); b) de hematiske jernkonsentrasjoner som frembringes av derivatet ifølge foreliggende oppfinnelse i forhold til

standardferritin er høyere (ca. 1,5:1 gjennomsnittlig) i løpet av seks timers eksperimentell periode (se tabell X).

Når man tar hensyn til den høye toleransen av produktet, dets lave toksisitet (LD5Q høyere enn 4000 mgAg på sveitsiske mus)., de høye jernkonsentrasjonene som kan oppnås og hvor lett det er å få fatt i råmaterialet, utgjør bruk av derivatene ifølge foreliggende oppfinnelse en klar forbedring overfor teknikkens stand ved jernbehandlinger.

De fysikalsk-kjemiske egenskapene til disse succinylferro-proteiner er,som ovenfor nevnt, reproduserbare og stabile som vist i de ikke begrensende eksempler. Fravær av ikke-bundet jern er vist den fullstendige oppløsningsgrad i alkalisk medium.(tilstander hvori jernionet utfelles som hydratisert oksyd) for preparatene erholdt fra succinylerte proteiner og et jernsalt.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor fremstilling av derivater som tidligere ikke er kjente og er særpreget ved at de inneholder jernmengder som kan variere i prosentdeler, og mengder av animalske eller vegetabilske proteiner som er blitt succinylert i forskjellige grader, og ved at de er utformet for å tilføre pattedyr biologisk utnyttbart jern uten å forårsake gastrointestinale lesjoner ved oraladministrering som vist i de følgende ikke begrensende eksempler.

Disse derivater kan brukes som det aktive prinsipp i frem-stillingen av farmasøytiske spesialiteter for bruk i behandling av anemi forårsaket av jernmangel hos pattedyr, og foreliggende oppfinnelse vedrører derfor også enhver farma-søytisk administreringsform som inneholder disse derivater som aktivt prinsipp for bruk på mennesker eller dyr.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av syccinylferroproteinderivater som er karakterisert ved de trekk som er angitt i krav 1<1>s karakteriserende del. De omsettes (på i og for seg kjent måte) med jernioner ved en pH mellom ca. 2 og 10, fortrinnsvis ved nær nøytral pH, i vandige løsningsmidler, og de erholdte produkter isoleres fra reaksjonsmediet ved utfelling ved en pH i området 2-4, idet siste pH-område oppstår spontant eller ved surgjøring. Alternativt kan reaksjonsproduktet isoleres ved å fjerne løsningsmidlet etter at pH er justert til nær nøytral.

Eksempel 1

Fremstilling av 5% jernderivater fra succinylerte proteiner av helt melkepulver 1 kg melkepulver ble oppslemmet i 6 liter 0,3M natrium-bikarbonat og under mekanisk røring og pH kontroll ble 500 g ravsyreanhydrid tilsatt i påfølgende porsjoner, pH ble holdt mellom 7,5 og 8 ved hjelp av tilsetning av 4N NaOH. Etter tilsetningen ble blandingen rørt i 2 til 3 timer ved romtemperatur. I løpet av denne tiden ble suspensjonen fullstendig oppløst. Den opalescente løsning ble sentrifugert eller filtrert inntil den var nesten klar og langsomt surgjort med HC1 opptil pH 3.

Den dannede felling ble skilt fra ved sentrifugering eller filtrering og oppslemmet på nytt i vann (ca. 8 liter)..

NaOH løsning ble tilsatt inntil det var fullstendig oppløst (pH ca. 7,5). Man sentrifugerte og den klare løsning ble igjen surgjort til pH 2,5 til 3 ved hjelp av tilsetning av HC1.

Fellingen ble gjenvunnet ved filtrering eller sentrifugering og vasket med en HC1 løsning med pH 3. Resten som bestod av de succinylerte proteiner (hvis succinyleringsgrad kunne varieres som en funksjon av mengden anvendt ravsyreanhydrid; i foreliggende tilfelle var denne 90% med hensyn til de grupper som kunne succinyleres i det opprinnelige protein som beskrives nedenfor)., ble etter tørking i vakuum dispergert i destillert vann. Det ble oppløst ved tilsetning av NaOH opptil pH 7,5 ved fortynning av løsningen slik at den endelige proteinkonsentrasjon var ca. 0,04 g pr. ml. En løsning av et jernsalt (f.eks. FeCl^) med et vektforhold Fe<3+> / succinylert protein på 1:10, ble satt til denne løs-ningen. Dette ga en suspensjon som ble finfordelt ved hjelp av mekanisk røring mens pH falt til ca. 2,5. Man fortsatte å røre i 3 timer ved romtemperatur og oppslemmingen ble så filtrert. Det faste stoff ble oppslemmet i vann (ca. 3 volum-deler) og oppløst ved tilsetning av NaOH (pH 7,5).

Løsningen som ikke var fullstendig klar,ble filtrert, og produktet gjenvunnet i fast tilstand ved bruk av en av de følgende metoder: a) løsningen ble frigjort og den erholdte felling ved en pH på 2,5 ble filtrert fra og tørket i vakuum; b) den klare løsning ble dialysert mot vann for å fjerne natriumkloridet og så frysetørket eller tørket i en spray-tørker.

De endelige produktutbytter var de samme og nådde ca. 20 vekt% av det opprinnelige melkepulver. Produktets egenskaper er beskrevet i tabell I (eksempel lb)..

Eksempel 2

Fremstilling av 5% jernderivater fra succinylerte melkeproteiner

Som beskrevet i eksempel 1 med den forskjell at utgangs-produktet bestod av 3 50 g melkeproteiner forut utfelt fra melkepulver ved dispersjon av pulvere i vann (ca. 5 liter), surgjøring til pH 2,5 med mineralsyre og så filtrering eller sentrifugering av det faste protein og tørking.

Jerninnholdet var som senere vist (tabell I) for derivatene fremstilt i eksempel 1 og 2 ca. 4-5 vekt%.

Eksempel 3

Fremstilling av jernderivater fra succinylerte melkeproteiner med forskjellige jerninnhold

Fremgangsmåtetrinnene som er beskrevet i eksempel 1 og 2 ble brukt med smame mengder melkepulver eller forut utfelte melkeproteiner, mens Fe <+>/succinylert protein vektforhold ble modifisert til 0,1:10, 0,2:10, 0,5:10 og 1,5:10, som ga jernderivater hvis egenskaper er vist i tabell I.

Eksempel 4

Fremstilling av jernderivater fra succinylerte eggeprotei-ner ( ovalbumin).

5 g ovalbumin ble oppløst i 100 ml vann inneholdende 3 g

KHC03, og 2,5 g ravsyreanhydrid ble tilsatt i påfølgende porsjoner til den klare løsning som ble holdt på pH mellom 5 og 8 ved tilsetning av NaOH. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i 2 timer. Etter surgjøring av løsningen til pH 3.4 fikk man en felling som ble isolert ved sentrifugering, resnet ved oppløsning ved pH 7,5 med NaOH og deretter felt igjen ved pH 3,4. Det faste stoff ble isolert ved sentri-fuger ing og tørket i vakuum. Det tørre faste stoff ble oppslemmet i destillert vann og oppløst ved tilsetning av NaOH (pH 8) og ga en sluttløsning med 0,04 g pr. protein/ml.

En løsning av et salt av Fe<3+> (f.eks. jern(III)klorid) ble tilsatt den meget viskøse løsning for å gi et vektforhold

3+

av succinylerte proteiner/Fe pa 10:1. Under disse betingelser falt pH til 2,6 under dannelse av en utfelling som ble isolert ved filtrering. Denne utfelling ble løst igjen i vann og NaOH tilsatt inntil den var fullstendig oppløst (pH 7,5). Etter dialyse mot vann for å fjerne natriumkloridet ble det faste produkt isolert ved frysetørking eller med en spraytørker. Utbyttet av derivatet var 33 vekt% av det opprinnelige protein. Dets jerninnhold og egenskaper er angitt i tabell I.

Eksempel 5

Fremstilling av jernderivater fra succinylerte proteiner

fra storfeserum

1.5 g NaHCO^ ble satt til 50% av en løsning av storfeserumproteiner og blandingen ble behandlet med 6 g ravsyreanhydrid som ble tilsatt i påfølgende porsjoner, mens pH ble holdt mellom 7,5 og 8 ved tilsetning av NaOH. Når tilsetningen var ferdig, fikk reaksjonsblandingen stå to timer ved romtemperatur og deretter ble en utfelling dannet ved surgjøring til pH 2,4 med en mineralsyre. Utfellingen ble isolert ved filtrering og renset som beskrevet i eksempel 4 .

Det faste produkt ble oppløst i vann og bragt til pH 7,5

med NaOH. Den på denne måte erholdte løsning ble tilsatt en løsning av et salt av jern(III). (f.eks. jern (III) klorid)

inntil det nådde et succinylert protein/Fe 3 + vektforhold på 10:1. pH falt spontant til 2,4 og man fikk en felling som bare delvis gikk i oppløsning ved pH 7,5. Løsningen ble skilt fra resten ved sentrifugering, dialysen mot vann ble utført for å fjerne resten av natriumkloridet og deretter frysetørket man. Vektutbyttet av jernderivatet i forhold til utgangsproteinet var ca. 3 0%. Jerninnholdet og egenskapene er oppført i tabell I.

Eksempel 6

Fremstilling av jernderivater fra succinylerte proteiner

av griselever

400 g fersk griselever ble homogenisert i en Silverson homogenisator i nærvær av 8 00 ml 0,2M KHC03 løsning, pH 8,3. Etter sentrifugering med 9000 opm ved 5°C ble supernantanten samlet og filtrert gjennom en 0,4 5 cellulose-acetatmembran. 1,2 g ravsyreanhydrid ble tilsatt i sukse-sive porsjoner til 50 ml klar løsning idet man passet på at pH forble mellom 7,5 og 8 ved tilsetning av NaOH.

Løsningen fikk stå i 1 time ved romtemperatur og ble deretter surgjort med mineralsyre til en pH på 3, hvilket ga en utfelling som ble behandlet på samme måte som i eksempel 4 med den modifikasjon at den endelige isolering ble utført ved frysetørking av løsningen som var blitt dialysert mot vann.

Den frysetørkede rest ble oppslemmet i vann og bragt til pH 8 ved bruk av soda. Dette ga en løsning som ikke var fullstendig klar og som ble sentrifugert. En løsning av jern (f.eks. jern(III)klorid) ble satt til den klare supernantanten slik at (beregnet) succinylert protein/Fe<3+> forhold var ca. 10:1.

Løsningens pH falt til 2,6 hvilket ga en utfelling som ble renset på samme måte som i de foregående eksempler. Det erholdte faste stoff fra frysetørkingen av sluttløsningen, dialysert mot vann, hadde de egenskaper og jerninnhold som angitt i tabell I.

Eksempel 7

Fremstilling av jernderivater fra succinylerte soyaproteiner 5 g soyaproteiner ble oppslemmet i 100 ml vann inneholdende 3 g NaHCO^. Blandingen ble rørt til fullstendig oppløsning, pH holdt mellom 7,5 og 8 ved tilsetning av NaOH og 2,5 g ravsyreanhydrid ble tilsatt porsjonsvis. Blandingen ble rørt 2 timer ved romtemperatur og bragt til pH 3,4 ved tilsetning av mineralsyre, hvilket ga en utfelling som ble renset på samme måte som i de foregående eksempler. Den faste rest fra den endelige frysétørking ble oppslemmet i 100 ml vann, pH ble korrigert til 8 ved tilsetning av soda og så ble løsningen som ikke var fullstendig klar sentrifugert.

Den klare substans supernantant ble behandlet med en jern-løsning (f.eks. jern(III)klorid), slik at vektforholdet av succinylert protein/Fe + var 10:1. Løsningens pH falt spontant til 2,6 og en utfelling ble dannet og behandlet på samme måte som i de foregående eksempler. Det erholdte faste stoff fra den avsluttende frysetørking hadde de samme egenskaper og jerninnhold som angitt i tabell I. Vektutbyttet i forhold til utgangsproteinet var 22%.

Kjemisk- fysikalsk karakterisering av jernderivatene fra succinylerte proteiner fremstilt ifølge eksemplene 1- 7

Derivatene som ble fremstilt ifølge de ovennevnte eksempler ble analysert ved de følgende metoder:

a) Succinyleringsgrad

Disse karakteristika ble uttrykt som andel av de succinylerte

grupper i forhold til gruppene som kunne succinyleres i ut-gangsproteinene. Metoden som er beskrevet av S. Moore & W.H. Stein, J. Biol. Chem., 211, 907, 1954 ble anvendt innebe-fattende omsetning av frie aminogrupper med ninhydrin. Resultatene er angitt i tabell I.

b) Jerninnhold

Jerninnholdet ble bestemt etter varmekstraksjon med 2N HC1

eller etter fullstendig oppslutning av proteinet med svovel-syre som beskrevet i Standard Methods, 14th Ed., 1975,

s. 208, APHA-AWWA-WPCF (reaksjon med o-fenantrolin). Verdiene er gitt i tabell I.

c) Spektroskopiske data

1) EPR spektroskopi

Alle derivatene som er beskrevet i de ovennevnte eksempler viste de samme spektroskopiske egenskaper. EPR spekteret til succinylferroproteinderivatet fremstilt ifølge eksempel 1 ble plottet som eksempel. Spekteret ble opptatt som fryse-tørket pulver og hadde et meget bredt signal sentrert ved ca. g = 2,0, med en signal-amplitude på ca. 2000 G. Et ytterligere godt oppløst signal var tilstede og var også sentrert rundt g = 2,0. Formen til begge signalene var

3+

karakteristiske for samvirkende Fe paramagnetiske sentere (F. Reid et al., Inorg. Chem. 7, 119, 1968). Alle disse data viste at det forelå en proteinstruktur som var lukket rundt det sammenbindende middel.

2. Sirkulær dikroisme

Egenskapene til de forskjellige beskrevne derivater var også lignende i dette tilfellet. Sirkulære dikroismespek-tere til succinylferroproteinderivatet som ble fremstilt ifølge eksempel l/ble plottet som eksempel. Spekteret var karakterisert ved negativ aktivitet i UV sonen. Dette viste et intenst negativt bånd med en topp ca. 200 nm og en skulder, også negativ, sentrert rundt 225 nm. Disse spek-trale karakteristika viste overveiende en "statistisk" proteinstruktur (inter alia: F. Ciardelli & P. Salvadori - Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism - Heyden

& Son Ltd., Londin. 1973 - Chapter 4,5).

3. UV - synlig absorpsjonsspektra

Egenskapene med hensyn til det elektroniske spektrum for

de forskjellige beskrevne derivater var lignende. Fig. 1 viser UV - synlig spektrum for succinylferroproteinderivatet fremstilt ifølge eksempel 1.

Spekteret (kontinuerlig linje) viser ikke absorps jonstopper, men bare en svak skulder rundt 450 nm. I UV var det bare en forholdsvis definert skulder sentrert rundt 270 nm og en meget intens absorpsjon med en topp under 220 nm.

Fig. 1 viser også (brutt linje) spekteret for ferritin fra hestemilt som sammenligning (Boehringer-Mannheim).

Absorpsjonsspekteret i det synlige området er gitt i

fig. 1 og ble opptatt i vann, pH 7. Spekteret for hestemiltferritin under de samme betingelser er også angitt som sammenligning (Boehringer-Mannheim).

4. Fluorescens emisjonsspektrum

Fluorescens emisjonsspektra er oppført i fig. 2, i hvilken den sammenhengende linje tilsvarer succinylferroprotein-derivatene i oppfinnelsen, den trykkstrekede linje laktoproteiner som sådanne og den brutte linje i succinylerte laktoproteiner.

Undertrykning av proteinets fluorescens som skyldes metallets tilstedeværelse kan sees.

d) Elektroforese

De elektroforetiske spor på celluloseacetat for de forskjellige derivater i sammenligning med de succinylerte proteiner, de opprinnelige proteiner og ferritin^er angitt i fig. 3-6.

Fig. 3 viser resultatene fra elektroforese utført med soyaproteiner (spor 1),succinylerte soyaproteiner (spor 21, jernderivat av succinylerte soyaproteiner (spor 3), jernderivat av ikke-succinylerte soyaproteiner, oppløselig fraksjon (spor 4). Fig. 4 viser resultatene fra elektroforese utført på ovalbumin (spor 1), succinylert ovalbumin (spor 2), jernderivat av succinylert ovalbumin (spor 3), jernderivat av ovalbumin (spor 4).

Fig. 5 viser resultatene av elektroforese utført på laktoproteiner (spor 1), succinylerte laktoproteiner (spor 2), jernderivat av succinylert laktoproteiner (spor 3), hestemiltferritin (spor 4). Fig. 6 viser resultatene av elektroforese (sensitometrisk avlesning ved 550 nm) utført på jernderivatet av succinylerte laktoproteiner (sammenhengende linje), jernderivatet av succinylerte soyaproteiner (trykk-strek) og jernderivatet av succinylert ovalbumin (brutt linje).

e) Gelfiltrer. ing

Gelfiltreringsprofilen på "Sephadex" G 75 (Pharmacia,

Uppsala) av jernderivatet av de succinylerte melkeproteiner (fremstilt som beskrevet i eksempel 1) i sammenligning med succinylerte proteiner i seg selv er angitt i fig. 7, hvor den kontinuerlige linje svarer til succinylerte laktoproteiner, den brutte linje til det tilsvarende jernderivat. Ordinaten viser absorpsjon ved 280 nm og abscissen de på-følgende nummere for oppsamlede fraksjoner. Man kan se fra profilen at jern er tilstede og forårsaker en enkel utløps-topp med en retensjonstid i likhet med for tom kolonne. Under hensyntagen til at den molekylære eksklusjon for "Sephadex" G-75 er ca. 75000 Daltons, er den tilsynelatende minimale molekylvektverdi for dette aggregat større enn denne verdien. Videre ble på en annen måte en dobbel topp med større fordeling funnet med de succinylerte proteiner. Denne faktor ble også observert ved elektroforese (fig. 5). Denne opptreden viser at det tilstedeværende jern er et samlingspunkt for intermolekylær aggregering av proteinmediet. Videre data fikk man fra filtergel med "Sephadex" G 200 i sammenligning med ferritin (fig. 8, hvori abscissen og ordinaten er tilsvarende som i fig. 7, mens den kontinuerlige linje tilsvarer jernderivatet for succinylerte laktoproteiner og den brutte linje tilsvarer ferritin fra hestemilt). Også i dette tilfellet var toppen tydelig, mens retensjonstiden var større enn for ferritin. Dette skulle vise at den tilsynelatende molekylvekt er lavere enn for ferritinet fra hestemilt.

f) Stabilitet i magesaft

Denne prøven ble utført på jernderivatet fra eksempel 1

og ble utført ved å oppløse 25 mg av derivatet i 0,5 ml destillert vann og ved å sette denne løsningen til 5 ml magesaft fra en rotte. En utfelling ble oppnådd,og suspensjonen ble inkubert ved 37°C i 60 minutter under røring. Etter dette tidsrommet ble utfellingen skilt fra ved sentrifugering og supernantanten ble analysert med hensyn til jerninnhold. Jernmengdetapet med magesaften var 1% av den opprinnelige totalverdi.

g) Utfelling av jernderivatet med ammoniumsulfat

30% (vekt/volum), ammoniumsulf at ble satt til en 10% løs-ning (vekt/volum) av jernderivatet fremstilt ifølge eksempel 1. En utfelling av proteinderivatet av jernet erholdtes og hadde identiske karakteristika med sine opprinnelige karakteristika og var fortsatt oppløselig i vann. Jern var ikke tilstede i løsningen.

De ovenfor angitte data viser at komplekseringskapasiteten til de succinylerte proteiner med hensyn til jern ikke bare er typisk for succinylerte melkeproteiner, men er karakteristisk for succinylerte proteinderivater av forskjellig opprinnelse og fysiologiske funksjoner, enten de er animalske eller vegetabilske.

Som ovenfor nevnt er mange animalske eller vegetabilske proteiner av ikke modifisert type egnet for binding med jern. Når ikke modifiserte melkeproteiner, ovalbumin, soyaproteiner, serumproteiner, organekstraktproteiner (lever) omsettes med jern under de beskrevne betingelser for fremstilling av de tilsvarende succinylproteinderivater, oppnås et produkt med et lignende jerninnhold, men med fullstendig forskjellig løselighet og stabilitetsegenskaper. Som vist i tabell I f.eks. gir soyaprotein et sluttprodukt som ved frysetørking er uoppløselig over 75% og mister sitt jerninnhold ved behandling med magesyre. I tillegg til komplekseringsegenskapene i forhold til jern skyldes egenskapene til de succinylerte jern-proteinderivater i oppfinnelsen (dvs. oppløselighet i et alkalisk medium, stabilitet i et surt medium og i nærvær av magesafter selv ved høye jerninnhold). ikke basisproteinene og kunne derfor ikke forutsees.

Toksisitet

a)

Akutt toksisitet ble prøvet oralt på sveitsiske mus med

gastrisk sonde med hensyn til ferrosuccinylprotein fra melkeproteiner fremstilt ifølge eksempel 1 med destillert vann som bærer. LD^q var større enn 4000 mg/kg.

b)

Toksisiteten under gjentatt administrering av det samme

derivat fra eksempel 1 (i det følgende kalt Ferrolat) i rotter per os ble undersøkt i 20 dager med påfølgende behandling på han Wistar rotter med en begynnelsesvekt på 200 g, buret i 14 dager før behandlingen og deretter adskilt statistisk i grupper på 10 (Gruppe I: kontroller; II, III og IV Ferrolat ved 30-100-300 mg/kg/dag)..

Preparatet som ble oppløst på brukestidspunktet i destillert vann, ble gitt daglig uten avbrudd til samme tid hver dag ved hjelp av en sonde. Kontrollene fikk samme volum springvann (10 ml/kg).. Under behandlingen ble rottene veiet daglig før administrering, og observert flere timer etter administrering av produktet. Næringsforbruket ble målt ved behandlingens slutt, og 24 timer etter den siste administrering, og etter en faste på 20 timer ble rottene bedøvet med eter og avlivet ved å skjær over halspulsåren. En del av blodet ble oppsamlet i et prøverør inneholdende EDTA (2 dråper av en 4% oppløsning) og resten fikk stå som serum. Hemokromocytometriske prøver ble utført på det totale blod og hematokjemiske prøver ble utført på serumet.

Resultater

Variasjoner i vekt og næringsforbruk

Fig. 9 viser vektøkningskurver oppnådd under behandlingen inntil dagen før avlivning.

Tabell II og III viser verdiene for vektøkning og forfor-bruk hos dyrene under behandlingen.

Vektøkningskurven til rottegruppen som ble behandlet med Ferrolat i en dosering på 300 mg/kg,vises å være vesentlig langsommere i forhold til vektøkningskurven til kontroll-rottegruppen fra den 15. dag etter behandlingens start,

og den samme rottegruppe forbrukte gjennomsnittlig mindre for (-11,7%).

Små forskjeller som ikke er signifikante ut fra et statistisk synspunkt ,kan observeres med hensyn til de gjenvær-ende rottegrupper behandlet med Ferrolat.

Hematologiske prøver

Resultatene er vist i tabell IV.

Hematokjemiske prøver

Resultatene er vist i tabell V. En svak reduksjon i alkali-fosfatet ble observert hos rotter som var behandlet med Ferrolat, 300 mg/kg/dag.

Urinprøver

Resultatene er vist i tabell VI.

Organprøver

Tabell VII viser de absolutte gjennomsnittsvekter for hovedrotteorganene og tabell VIII de tilsvarende gjennomsnittsvekter med hensyn til kroppsvekten.

En signifikant økning i den relative vekten til milten og lungene ble funnet i den gruppe rotter som var behandlet med Ferrolat 100 mg/kg/dag. I tillegg til en signifikant reduksjon i kroppsvekten, ble en signifikant økning i gjen-nomsnittsvekten til testiklene funnet i den gruppe rotter som var behandlet med Ferrolat 300 mg/kg/dag.

Hematiske nivåer etter oral administrering

a) Ferrolat- jern( II) sulfat sammenligning

Wistar hanrotter som veide ca. 200 g og fastet 18 timer

ble tatt, statistisk fordelt og skilt i grupper på 5,

hver gruppe ble avlivet på den fastsatte time og blod ble tatt fra hvert dyr ved å resektere halspulsåren, og mengden av jern i blodet til hvert dyr fra gruppen ble målt spektrofotometrisk ved hjelp av batofenantrolinsulfon-syre (Fe-prøve, Wako). Administreringen ble utført med en sonde i en vandig løsning (5 ml/kg).

Succinylferroproteinderivatet som ble brukt,var fremstilt som i eksempel 1 (Ferrolat). Doseringer og resultater er vist i tabell IX. Man kan se at mengden jern pr. kg var den samme for begge derivatene (Fe: 1 mg/kg).

b) Ferrolat - ferritin sammenligning

Wistar hanrotter som veide ca. 200 g og fastet i 18 timer

ble tatt, statistisk fordelt og delt i grupper på 9,

hver gruppe ble avlivet på den fastsatte time og blod ble tatt fra hvert dyr ved å resektere halspulsåren. Jern-mengden i blodet fra hvert dyr fra gruppen ble målt spektrofotometrisk ved hjelp av Iron Colorimetric metoden (Boehringer-Mannheim). Administreringen ble utført ved en sonde i en vandig løsning (5 ml/kg). Doseringer og resultater er vist i tabell X. Man kan se at mengden jern pr.

kg for succinylferroproteinderivatet angitt som Ferrolat var som for ferritin (Sigma, St. Louis Missouri) og lik 1 mg/kg.

c) Sammenligning mellom succinylferroproteinderivater fremstilt fra forskjellige typer proteiner

Wistar hanrotter som veide ca. 200 g og fastet i 18 timer ble tatt, statistisk fordelt og delt i grupper på 5 (en pr. dose derivat og en kontrollgruppe). Hver gruppe ble avlivet to timer etter administrering og ved resektering av halspulsåren ble blod tatt fra hvert dyr og jerninnholdet i blodet ble bestemt ved hjelp av batofenantrolinsulfon-syre Fe-prøven, Wako). Oraladministringen ble utført ved en sonde i en vandig løsning (5 ml/kg). Doseringene av enkelte derivater som ble brukt ble valgt slik at man all-tid ga 1 mg/kg Fe.

Undersøkte produkter: 1) succinylerte soyaproteiner + Fe

(4,42%)

2) succinylert ovalbumin + Fe (3,57%)

3) succinylert storfeserumproteiner

+ Fe (5,78%) 4) succinylerte melkeproteiner + Fe (4,5%). (Ferrolat)..

Resultatene er vist i tabell XI.

a), b), c), d), e) prøver med forhold Fe : succinylerte proteiner mellom 0,1:1 og 5:1 (w:w). f) fullstendig (+), partielt (+ -), uoppløselig (-).

Forbindelsene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som farmasøytiske formuleringer til humanmedisinsk og veterinærmedisins bruk og inneholder forutbestemte mengder av disse derivater. Derivatene kan gis oralt, f.eks. i form av tabletter, kapsler, ampuller, poser inneholdende granulater, siruper, pulvere for tilsetning til dyrefor osv.

De følgende formuleringer er bare angitt som rene eksempler : - ampuller inneholdende 5-10-40 mg jern i form av jern(II) succinylproteiner i tillegg til vandige løsningsmidler, stabilisatorer, smaksmidler osv. som vanlig brukes i farmasien; - tabletter fra 5-10-40 mg jern i form av jern(II)succinylproteiner i tillegg til eksipienter, dispergerings-midler osv. som normalt brukes i farmasøytika; - kapsler fra 5-10-40 mg jern i form av jern(II)succinylproteiner ; - enhetsdoseringsdoser inneholdende et brusende granulat tilsvarende 5-10-4 0 mg jern i form av jern(II)proteiner i tillegg til sukker, smaksmidler, stabilisatorer osv.

som normalt brukes i farmasien;

- pulverformig melk som skal tilsettes dyreungefor i 5

til 20 vekti av det aktive prinsipp.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av succinylerte jernholdige proteiner som kan anvendes som legemiddel, karakterisert ved at man succinylerer et ugangsprotein ved hjelp av et derivat av ravsyre som bringes til å reagere med jernsalter i et vandig medium ved en pH-verdi fra 7,5 til 8, og at man separerer det erholdte produkt ved utfelling ved pH-verdien 2-4, hvorved sistnevnte pH-område dannes spontant eller ved surgjøring.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonen mellom de succinylerte proteiner og jernsaltene blir foretatt ved en pH-verdi nær nøytralpunktet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man bringer det succinylerte protein til å reagere med jernsalter i vandig medium ved en pH-verdi fra 7,5 til 8, og at reaksjonsproduktene separeres ved å fjerne løsningsmiddelet etter at pH-verdien har blitt regulert til en verdi nær nøytralpunktet.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at man fremstiller succinylerte proteiner som inneholder 0,4-6,7 vekt% jern, ved å variere forholdet mellom jernsaltet og det succinylerte protein mellom 0,4-6,7.

5:..Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 4, karakterisert ved at utgangsproteinet succinyleres til en succinyleringsgrad på 20-100% ved å variere mengden av succininsyrederivater i forhold til gruppene i utgangsproteinet som kan succinyleres.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at man fremstiller melkeprotein hvis succinyleringsgrad er over 70% og som inneholder over 4 vekt% jern.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at man fremstiller eggalbumin hvis succinyleringsgrad er over 70% og som inneholder over 4 vekt% jern.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at man fremstiller soyaprotein hvis succinyleringsgrad er over 70% og som inneholder over 4 vekt% jern.