KR860001571B1

KR860001571B1 - 석시닐화된 단백질-철 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR860001571B1
Application number: KR1019830000820A
Authority: KR
Inventors: 스포톨레티 기안카를로; 기우 세페 파셀라 삐에르; 크레모네시 삐에트로
Original assignee: 이탈파마코 에스. 피. 에이.; 가스톤 드 샌티스
Priority date: 1982-03-02
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1986-10-08
Also published as: IE830428L; PT76318A; IT1150213B; SE8301129D0; MX9203631A; NL190399C; AR229805A1; NL8300757A; FI77574B; NO830707L; US4493829A; GB8305691D0; DK84883A; FR2522664B1; ES519944A0; HK56086A; CH653893A5; PT76318B; AU548034B2; DK84883D0

Abstract

내용 없음.

Description

석시닐화된 단백질-철 유도체의 제조방법

제 1 도는 석시닐 훼로프로테인 유도체에 대한 UV-가스 스펙트럼도.

제 2 도는 형광방사 스펙트럼도.

제 3 도 내지 제 6 도는 석시닐화된 단백질, 최초의 단백질 및 훼리틴과 비교하여, 셀롤로오스 아세테이트 상에서 여러가지 유도체들의 전기영동을 나타낸도.

제 7 도는 석시닐화된 단백질과 비교하여 세파덱스 G75상에서 석시닐화된 우유단백의 철 유도체의 겔여과를 나타낸도.

제 8 도는 제 7 도와 유사하나, 직선(―)은 석시닐화된 락토프로테인의 철 유도체를 나타내고, 점선(--)은 말의 비장으로 부터 수득된 훼리틴을 나타내는 도.

제 9 도는 치사전날까지 처리하는 동안 스득된 체중 증가곡선을 나타낸 도.

본 발명은 식시닐 페로프로테인의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 석시닐화된 단백질(succinylated protein)을 적절한 pH범위에서 철염으로 처리하여 수득한, 석시닐화된 정도가 20내지 100%이면서 0.1내지 20중량%의 철을 함유하는, 석시닐화된 단백질에 관한 것이다. 완전히 내성화된 이 화합물은 철이 생체내에서 최적으로 이용되는 특징이 있다.

모든 신체 조직내에 존재하는 철은 필수 불가결한 생체내 역할을 한다. 이는 헤모글로빈, 미오글로빈 및 효소 예를들면 카탈라제, 푸마릭-디하이드로 게나제, 퍼옥시다제, 시토크름, DPN-시토크롬리덕타제 및 메탈로풀라보프로테인(예 : 페로플라빈)의 일부 및 필수적인 구성 성분이다. 성인의 신체 조직은 1.5에서 5g의 철을 함유하며, 그중 60내지 65%는 적혈구에 농축되고 있고, 18내지 30%는 훼리틴 단백질(ferrtin proteins)및 간장, 비장, 골수 및 세망내피계의 세포내에 저장되어 있다. 나머지는 상기한 여러가지 효소 시스템에 분포되는데, 미오글로빈에 약 4% 및 트랜스훼린에 약 0.1%, 장기관의 철을 혈액에 수송하는 β₁글로부린에 분포된다. 생리적 pH치에서는, 실제적으로 해리되지 않는 방법으로 2개의 철원자를 서로 연결시킬 수 있다. 필요한 철은 일부는 내인성 철(오래된 적혈구의 파괴로 유도된)을 이용하고, 일부는 외부에서 철을 흡수하여 충족한다. 외부에서 철을 흡수하면 십이지장 및 공장의 상부를 따라 흡수되며, 간에 우선적으로 축적된다. 철겹핀의 1차적인 병 증상은 원발성 요인이 다양한 고색소성 빈혈이며 그 요인은 위십이지장궤양 또는 네오플라지아(neoplasia)로 인한 만성출혈 ; 영양 부족 또는 설사로 인한 흡수불량 ; 임신, 수유, 전염병의 경우와 같이 요구량의 증가 ; 대사불량 ; ACTH 및 코르티존의 투여와 같은 특별한 치료가 있다.

가장 적절한 치료법은 철의 투여이다. 실제적으로 철의 결합으로 인한 상태일때는 이 요법은 매우 효과적으로 빈혈상태를 감소시킨다. 그러나, 철을 이용하면 벡터타입(type of vector)과 관련된 바람직하지 못한 부작용이 통상 수반된다. 가장 널리 사용되는 약제학적 경구용 제제는 다양한 유기 및 무기산염에 기초하며 점차로 상기한 부작용을 줄일수 있도록 치료에 도입한다. 경구용 제형으로, 염화제이철, 황산제일철, 인산 제이철등의 무기염 또는 시트레이트, 콜리네이트, 아스파르테이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글리시네이트, 락테이트, 윽살레이트, 석시네이트 같은 유기염등이 시판되고 있다. 근육내 투여시 훼로-텍스트란 콤플렉스가 추천되고, 정맥내 치료용(경구치료가 실패한 철결핍성 빈혈의 경우)으로는 훼로-덱스트린 콤프렉스가 이용된다.

후자의 복합체형의 경우 알레르지 반응, 체온상승, 빈박, 백혈구증, 근육내 치료시의 임파선증 및 과민성쇼크, 정맥내치료시 혈전성정맥염 및 순환기장애의 부작용을 일으킬 수 있다. 상기한 화합물을 제형으로 하여 경구치료할 경우, 부작용은 일반적으로 심한 경우 괴사 및 점막의 천공(perforation)을 수반하는 위장관 병변, 설사 및 구토이다. 또한 , 내성이 낮은 것은 적당량의 철 투여가 어렵다. 부작용을 감소시키기 위해 동시에 음식을 섭취해야 함이 제안되었지만, 이는 음식물 자체의 조성물의 함수로서 철의 흡수의 변수와는 상반된다. 사실상 철 제형을 흡수하는 것이, 환자가 단식시에 적절함이 확인되었다. 또한, 제산제를 사용하므로서 위장 자극이 따르고, 이어서 흡수를 감소시켜 빈혈상태를 악화시킨다.

철요법으로서 특히 경구투여시 훼리틴에 기반을 둔 시판되는 제제는 상당히 개발되었다.

훼리틴은 훼릭 글로부린으로, 포유동물의 체내에서 가장 중요한 철 함유 단백질을 나타낸다. 시판물은 원료물을 말의 비장으로부터 추출한 것이다.

시판물의 철 함유량은 20건조중량 퍼센트이다. 단백질 부위인 아포페리틴은 분자량이 약 445.00으로 결정성의 옥사이드-포스페이트 철의 "핵"(core)를 둘러싸고 있다. 이는 물에 가용성이므로 경구투여에 적합하다.

상기한 철 유도체를 사용하는 동안 훼리틴을 기초로 치료시 위장관의 부작용을 일으키지는 않는다. 그러나 이것의 사용은 원료물질이 고가이며, 특히 추출한 물질의 출처가 제한되므로 한정된다.

전술한 바로 부작용없이 철의 흡수를 위한 적절한 담체는 단백질 담체일 수 있다. 많은 단백질은 확실히 철에 친화성을 갖고 있다. 동물에 기원한 특정단백질(혈청단백, 조직단백, 오브알부민, 락토프로테인)또는 직물에 기원한 단백질(콩단백)의 담체로서의 사용을 시험하였다.

무기 3가 철염 및 상기한 단백질과의 상호작용으로 훼로프로테인 유도체를 형성하는데, 이 유도체들의 치료효과는 일련의 바람직하지 못한 특성으로 감소된다 :

-단백질에 결합된 철의 퍼센트치가 0.5%이상에 달할 경우 수득된 유도체의 불용성 ;

-그런 불용성의 조건하에서, 철분 총 함유량중에 어떤 획분이 실제로 단백질에 결합되고, 어떤획분이 심한 위장 병변을 일으킬지도 모르는, 수화된 옥사이드형으로 공침되어 있는지를 평가하기가 어렵거나 심지어는 불가능함 ;

-이 유도체들중의 철에 대해 동종성 및 성분적 안정성의 결핍등.

또한, 우유로부터 유래한 단백질의 경우에는, 가용성 철 유도체가 여러가지 pH치에서 상당랴의 불용성 유도체악 함께 존재함이 관찰되었고, 이러한 가용성 분획의 조성은 실험적 파라미터가 조금만 변해도 매우 심하게 변화한다.

적절한 조건(사료 또는 동물먹이로 사용하기 위해 단배질 석시닐 유도체를 수득하는데 통상 사용되는 공정)하에서 상기한 단백질을 석시닐화함으로써, 상기한 단백질을 pH가 5이상에서 안정하고 가용성이고, 다양하나 철 함량을 재현시킬 수 있으며, 포유동물에 경구투여하였을때 위장 장해등의 부작용을 야기시키지 않는 고농도의 철을 함유한 훼로 프로테인 유도체와 반응시킴으로 수득할 수 있다는 것을 놀랍게도 확인하였다. 쥐에서는, 20일동안 계속하여 매일 경구투여한 결과, 어떠한 위장장해도 나타내지 않았고, 높은 정도의 내성을 나타냈다.

쥐의 경우에 있어서, 철 결핍성 빈혈의 상태하에서 황산제일철, 말의 비장이 훼리틴(Sigma, Saint, Louis Missouri)및 실시예 1에서 기술된 바대로 제조한 석시닐화된 우유단백에서 유래한 훼로프로테인 유도체의 형태로 철을 동량 경구투여한후 비교한 바는 다음과 같다 :

a) 황산제일철로 생성된 것에 대해, 본 발명의 유도체로 생성된 혈중 철 농도는 조만간 지속이 되고 ; (표 Ⅸ참조).

b) 표준 훼리틴에 대해, 본 발명의 유도체로 생성된 혈중 철 농도는 6시간의 시험 시간중에 더 높다(평균 약 1.5 : 1)(표Ⅹ참조).

생성물의 고도의 내성과, 낮은 독성(스위스 마이스에 있어서 4000mg/kg이상) 및 고농도이 철을 수득할 수 있으며 원료물질의 공급이 용이함에 따라, 본 발명의 유도체를 사용하여서 철의 치료 분야에서는 명백한 향상이 있었다.

상기한 바와같이 이 석시닐 훼로프로테인 물리화학적 특성은 무제한의 실시예(non-limiting examples)에서 나타내듯이 재생이 가능하고 안전하다. 비결합한 철이 없다는 것은 석시닐화된 단백질 및 철염으로 부터 수득한 제제가 알칼리 매질(철이온이 수화된 옥사이드로 침전되는 조건)에서 완전히 용해됨을 나타낸다.

따라서 본 발명은 지금까지 알려지지 않았으며, 퍼센트로 변화시킬 수 있는 철의 양 및 다양하게 석시닐화된 동물 또는 식물단백량을 포함하고, 제한되지 않은 다음의 실시예에서 보는 바와같이 포유동물에 경규로 투여할때 위장관에 장해를 일으키지 않으면서 생체에 유효한 철을 공급함을 특징으로 하는 유도체에 관한 것이다.

이러한 유도체들은 포유동물에서 철 결핌으로 인한 빈혈의 치료시 약 제학적 제형의 제조에 있어, 활성 성분으로 사용될 수 있으며, 따라서 이 특허는 사람 또는 가축용의 활성 성분으로 이 유도체들을 함유하는 약제학적 투여형태에 관한 것이다.

또한 본 발명은 약 2내지 10사이의 pH, 바람직하게는 중성에 가까운 pH의 , 수용성 용매에서 석시닐화된 단백질을 철이온과 반응시키고(공지된 방법으로)수득한 생성물을 2내지 4의 범위의 pH에서 침전시켜 반응 매질로부터 분리하고, 이때 후자의 pH범위는 자발적으로 또는 산성화시켜서 제공될 수 있음을 특징으로 하는 석시닐 훼로프로테인 유도체들의 제조방법에 관한 것이다. 다른 방법으로서, 반응 생성물을 pH를 중성에 가깝게 조정한 후 용매를 제거하여 분리시킬 수 있다.

[실시예 1]

전지분유의 석시닐화된 단백질로부터 5%철 유도체의 제조

분유 1kg을 0.3M중탄산나트륨 6리터에서 기계적 교반 및 pH조절을 하면서 현탁화시키고, 500g의 석신산 무수물을 연속적으로 소량씩 가하고, pH를 4N NaOH를 가하여 7.5 및 8사이의 범위로 유지시킨다. 가한후 혼합물을 주위온도에서 2내지 3시간 동안 교반시킨다. 이 시간동안 현탁액을 완전히 용해시킨다. 젖빛 용액을 거의 투명해 질때까지 원심분리 또는 여과하고 서서히 HC1로 pH를 3까지 산성화한다. 생성된 침전물을 원심분리 또는 여과로 분리하고, 물에서(약 8리터)재현탁시킨다. 완전히 용해될때까지 NaOH용액을 가한다. (pH 약 7.5). 원심분리하고, 투명한 용액을 HCI을 가하여 pH를 2.5내지 3으로 재산성화시킨다. 침전물을 여과 또는 원심분리하여 회수하고, pH가 3인 HC1용액으로 세척한다. 석시닐화된 단백질(석시닐화된 정도는 사용된 석신산 무수물의 양의 함수로 변화될 수 있으며, 여기에서의 경우는, 하기에서와 같이 초기 단백질에서 석시닐화될 수 있는 그룹에 대해서 90%이다)을 함유한 잔사를 진공하에서 건조시킨후 증류수에 분산시킨다. pH 7.5까지 NaOH를 가하여 용해시키고 최종 단백질 농도가 약 0.04g/ml가 되도록 용액을 희석시킨다. 중량비로 Fe³⁺대 석시닐화된 단백질이 1 : 10인 철염의 용액을(예를들면 FeC1₃)이 용액에 가한다. 현탁액을 기계적으로 교반시켜 미세하게 분산시키고 반면 pH는 약 2.5로 떨어뜨린다. 주위온도에서 3시간동안 계속 교반시킨후 현탁액을 여과한다. 고체를 물(약 3용량)에 현탁시키고 NaOH(pH705)를 가하여 용해시 킨다.

완전히 투명하지 않은 용액을 여과하고, 고체상태의 생성물을 다음 방법의 어느 하나를 사용하여 회수한다 ;

a) 용액을 산성화하고 pH 2.5에서 수득된 침전물을 여과하고 진공하에 건조시키거나 ;

b) 투명한 용액을 염화나트륨을 제거시키기 위해 물로 투석시키고, 동결건조 또는 부문건조기로 건조시킨다.

최종 생성물의 수율은 같고, 초기 분유의 약 20중량퍼센트이다. 생성물의 특징은 표1(실시예1b)에 기술되어 있다.

[실시예 2]

석시닐화된 우유단백으로부터 5%철 유도체의 제조

실시예 1에서 기술된 것과 같이, 미리 물(약 5리터)에 분유를 분산시켜 분유로부터 침전시킨 350g의 우유단백질을 함유한 초기의 생성물을 무기산으로 pH를 2.5로 산성화시킨후 고체 단백질을 여과 또는 원심분리한 후 건조시킨다.

하기 표 Ⅱ에서와 같이 실시에 1 및 2에서 수득된 유도체의 철 함량은 약 4내지 5중량 퍼센트이다.

[실시예 3]

철 함량이 다른 석시닐화된 우유 단백으로부터 철 유도체의 제조

실시예 1 및 2에서 기술된 방법과 같이 동량의 분유 또는 미리 침전시킨 우유단백을 사용하며 Fe³⁺대 석시닐화된 단백질의 중량비는 0.1 : 10, 0.2 : 10, 0.5 : 10 및 1.5 : 10으로 변화시켜 수득한 철 유도체의특성은 표 I에 나타나 있다.

[실시예 4]

석시날화된 난단백(오브알부민)으로 부터 철 유도체의 제조

5g의 오브알부민을 3g의 KHCO₃를 함유한 100ml의 물에 용해시키고, 2.5g의 석신산 무수물을 투명한 용액에 계속 소량씩 가하며 이때 pH를 NaOH를 가해 5 및 8사이로 유지시킨다. 혼합물을 주위온도에서 2시간 동안 반응하도록 방치한다. 용액을 pH를 3.4로 산성화한후 침전을 수득하고, 원심분리로 분리시켜 pH7.5에서 NaOH로 분해정제한 후 pH 3.4에서 재침전 시킨다. 고체를 원심분리하여 회수하고 진공하에 건조시킨다. 건조한 고체를 증류수에서 현탁화시키고 NaOH(pH 8)를 가해 용해시켜 0.04g 단백질 / ml의 최종 용액을 수득한다.

Fe⁺³(예 : 염화제이철)염 용액을 중량비로 석시날화된 단백질/Fe⁺³이 10 : 1이 되도록 점착성의 용액에 가한다. 이 조건하에서는 pH는 2.6 으로 떨어지며 침전을 생성하면 여과하여 회수한다. 이 침전을 물에 재용해시키고 완전히 용해될 때까지 NaOH를 가한다(pH 7.5)염화나트륨을 제거하기 위해 물로 투석한 후에, 고체 생성물을 동결 건조 또는 분무 건조하여 수득한다. 유도체의 수율은 초기의 단백질의 33중량%이다. 유도체의 철 함량 및 특성은 표 1에 기술되어 있다.

[실시예 5]

소의 혈청의 석시닐화된 단백질로 부터 철 유도체의 제조

1.5g의 NaHCO₃를 50ml의 소의 혈청단백에 가하고, 혼합물을 6g의 석신산 무수물을 연속적으로 소량씩가하며 처리하고 이때, pH는 NaOH를 가하면서 7.5 및 8사이로 유지시킨다. 완전히 가한 후에 반응물을 주위온도에서 2시간 동안 방치한후 무기산으로 pH를 2.4로 산성화하여 침전을 생성시킨다. 침전을 원심분리로 회수하여 실시예 4에서 기술된 방법으로 정제한다.

고체 생성물을 물에서 현탁화시키고 NaOH로 pH를 7.5로 한다. 이렇게 수득된 용액을 석시닐화된 단백질/Fe⁺³의 중량비가 10 : 1에 이를까지 철(Ⅲ)염(예 : 염화제이철)용액에 가한다. pH는 저절로 2.4로 떨어지고, pH를 7.5로 하였을때 일부분만이 용해된 침전을 수득한다. 용액을 원심분리하여 잔사로 부터 분리하고 염화나트륨을 제거하기 위해 물에 투석한후 동결건조한다. 초기의 단백질에 대하여 철 유도체의 수율은 약 30중량%이다. 철 함량 및 특성은 표 I에 기술되어 있다.

[실시예 6]

돼지의 간의 석시닐화된 단백질로 부터 철 유도체의 제조

400g의 신선한 돼지의 간을 pH 8.3의 0.2M KHCO₃용액 800ml존재하에서 실버손 균질화기(siverson homogenizer)로 균질화시킨다. 900rpm, 5℃에서 원심분리한후 상층액을 모으고 0.45μ셀롤로오스 아세테이트 막을 통해 여과한다. 1.2g의 석신산 무수물을, NaOH를 가하면서 pH를 7.5 및 8로 유지되었나 확인 하면서 50ml의 투명한 용액에 계속적으로 소량씩 가한다.

용액을 주위온도에서 1시간 동안 방치한후 무기산으로 pH를 3으로 산성회시켜 침전을 수득하고, 실시예 4에서와 같은 방법으로 진행시키되, 최종 회수방법을 용액을 동결 건조하고 물에 대해 투석하는 것만 다르게 한다.

동결 건조된 잔사를 물에 현탁시킨후 소다르 사용하여 pH를 8로 한다. 이렇게 하면 완전히 투명하지 않은 용액을 수득하는데 이 용액을 원심분리한다. 석시닐화된 단백질/Fe⁺³의 비가 약 10 : 1이 되도록 철용액 예 : 염화제이철)을 투명한 상충액에 가한다. 용액의 pH가 2.6으로 떨어지면 침전이 생성되는데 이 침전을 전술한 실시예에서와 같은 방법으로 정제한다. 최종 용액을 동결 건조하고 투석시켜, 표 1에서와 같은 특성및 철 함량을 갖는 고체를 수득한다.

[실시예 7 ]

석시닐화된 콩 단백으로부터 철 유도체의 제조

5g의 콩단백을 3g의 NaHCO₃를 함유한 100ml의 물에 현탁시킨다. 혼합물을 NaOH를 가해 pH를 7.5 및 8로 유지시키면서 완전히 용해될때까지 교반한 후 2.5g의 석신산 무수물을 연속적으로 소량씩 가한다. 혼합물을 주위온도에서 2시간 동안 교반하고 무기산을 가해 pH를 3.4로 하면, 침전이 생성된는데 이 침전을 전술한 실시예에서와 같은 방법으로 정제한다. 최종 동결 건조한 고체잔사를 100ml의 물에 현탁화시키고, 소다를 가해 pH를 8로 하고, 완전히 투명하지 않은 용액을 원심분리한다.

투명한 상층물질을 식시닐화된 단백질/Fe³+의 중량비가 10 : 1이 되도록 철용액(예 : 염화제이철)으로 처리 한다. 용액의 pH는 저절로 2.6으로 떨어지며 침전이 생성되면, 전술한 실시예에서와 같은 방법으로 처리한다. 최종 동결 건조하여 수득한 고체는 표 1에서와 같은 특성과 철 함량을 갖는다. 초기의 단백질에 대해 수율은 22중량%이다.

실시예 1-7에 의해 수득된 석시닐화된 단백질로 부터 철 유도체들의 물리화학적 특성.

상기한 실시예에 따라 수득된 유도체들을 하기의 방법에 따라 분석하였다 ;

a) 석시날화의 정도

이 특성은 초기의 단백질중 석시닐화가 가능한 그룹에 대해 석시닐화된 퍼센트로 나타낸다. 방법은 하기에 기술되어 있는데 유리아민 그룹과 닌히드린의 반응을 포함한다. 결과는 표 1에 기술되었다. (참조 ; S.Moore ＆ W.H. Stein, J. Biol.Chem., 211, 907, 1954)

b) 철의 함량

2N HC1로 은시 추출한후 또는 황산으로 단백질을 완전히 침지시킨 후에 다음에 기술된 표준 방법으로 철함량을 계산한다[참조 : Standard Methods, 14th Ed., 1975, p.208, APHA-AWWA-WPCF(0-페난쓰를린과 반응시킴)]. 결과는 표 I에 기술되어 있다.

c) 분광학적인 데이타.

1) EPR 스펙트로스코피

상기 실시예에서 기술된 모든 유도체들은 동일한 분광학적 특성을 나타낸다. 실시예 1에 따라 제조된 석시닐 훼로프로테인 유도체의 EPR 스펙트럼이 예로써 플롯되었다. 동결건조한 분말의 스펙트럼이 기록되었는데, 매우 넓은 시그날을 갖고, 중심 g가 약 2.0이며, 시그날의 진폭은 약2000G이다. 더 잘 분리된 시그날이 존재하는데 역시 중심 g가 약 2.0이다. 두 시그날들의 형태는 상호 작용하는 Fe⁺³상자성 중심의 특성이다. (참조 : F. Reid et al. Inorg. Chem.7, 119, 1968). 이 모든 데이타는 주위에 둘러싼 단백질 구조의 존재를 보여준다.

2. 원편광 이색성

기술된 여러가지 유도체들의 특성은 이 경우에도 유사하다. 실시예 1에 따라 수득된 석시닐 훼로프로테인 유도체의 원편광 이색성 스펙트럼을 예로써 플롯하였다. 스펙트럼은 UV대에서 음성작용을 나타낸다. 이는 약 200mm의 피크에서 강한 음성 밴드를 보이고, 쇼울더(Shoulder)에서도 역시 음성이고, 중심이 약 225nm이다. 이 스펙트랄 특성은 주로 "랜덤"(randum)한 단백질 구조를 보여준다(참조 : interalia; F. Ciardelli ＆ P.Salvadori-Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichroism-Heyden ＆ Son Ltd., London, 1973-Chapter 4,5).

3. UV-가시 흡수 스펙트라.

기술된 여러가지 유도체들의 전자 스펙트럼의 특성은 유사한다. 제 1 도는 실시예 1에 따라 제조된 석시닐 훼로프로테인 유도체에 대한 UV-가시 스펙트럼을 나타낸다.

스펙트럼(Continuous line)은 흡수피크를 보이지 않고 단지 450nm주위에 약한 쇼울더(Shouler)를 보인다. UV하에서 중심이 270nm근방에 있는 정확히 정의 된 쇼울더가 있고, 220nm이하에서는 강력한 흡수피크가 있다. 또한 제 1 도는 비교군으로(Boehrnger-Mannheim)말의 비장으로부터 유래한 훼리틴의 스펙트럼을 보인다.

가시 영역에서 흡수 스펙트라는 제 1 도에 나타나 있고 pH 7에서 물에서 수행되었다. 역시같은 조건하에서 말의 비장의 훼리틴 스펙트럼을 비교군(Boehringer-Mannheim)으로 한다.

4. 형광 방사 스펙트럼

형광 방사 스펙트라가 제 2 도에 나타나 있는데, 여기서 직선(―)은 본 발명의 석시닐 훼로프로테인 유도체와 일치하고, 접직선(-.-.)은 락토프로데인, 점선(……)은 석시날화된 락토프로테인과 일치한다.

금속이 존재시 단백질의 형광이 소실됨을 알 수 있다.

d) 전기영동

석시닐화된 단백질 최초의 단백질 및 훼리틴을 비교하여, 셀롤로오스 아세테이트상에서 여러가지 유도체들의 전기영동 흔적(electrophoretic traces)을 제 3 도에서 6도에 나타내었다.

제 3 도는 전기영동을 콩단백상에서 (흔적1)수행하고, 석시닐화된 콩단백질(흔적2)에서 수행하고, 석시닐화된 공단백질의 철 유도체(흔적3)에서 수행하며, 가용성분획(흔적 4)에서 수행한 결과를 나타낸다. 제 4 도는 전기영동을 오브알부민(흔적 1)에서 수행하고, 석시닐화된 오브알부민(흔적 2)에서 수행하고, 석시닐화된 오브알부민의 철 유도체(흔적 3)에서 수행하며, 오브알부민의 철 유도체(흔적 4)에서 수행할 결과를 나타낸다.

제 5 도는 전기영동을 락토프로테인(흔적 1)에서 수행하고, 석시닐화된 락토프로테인(흔적 2)에서 수행하고, 석시닐화된 락토프로테인의 철 유도체(흔적 3)에서 수행하며, 말의 비장의 훼리틴(흔적 4)에서 수행한 결과를 나타낸다. 제 6 도는 전기영동(densitometric reading at 550nm)을 석시닐화된 락토프로테인의 철 유도체(직선-)에서 수행하고, 석시닐화된 콩단백의 철 유도체(점직선-.-)에서, 석시닐화된 오브알부민의 철 유도체(점선……)에서 수행한 결과를 나타낸다.

e) 겔 여과

석시닐화된 단백질과 비교하여 세파덱스 G75(Pharmacia, Uppsala)상에서 석시닐화된 우유단백의 철 유도체(실시예 1에서 기술된 바와 같이 수득한)의 겔 여과 프로필(Profile)이 제 7 도에 나타나 있는데, 여기서 직선(―)은 석시닐화된 락토프로테인을 나타내고, 점선(…)은 상응하는 철 유도체를 나타낸다. 종 좌표는 280nm에서 흡수를 나타내고, 횡 좌표는 모은 연속한 획분수를 나타낸다. 프로필로 부터 철이 존재하면 칼럼이 없는 경우와 유사한 체류시간(retention time)을 갖는 단 하나의 피크를 나타낸다. 세파덱스 G75의 분자배제량은 약 75,000달톤이고, 세파덱스 G75의 명백한 최소 분자량의 총양은 상기 수치보다 더 크다. 더구나, 다른 일면은 석시닐화된 단백질은 더불피크가 무작위하게 많다는 것이 주목된다. 또한 이 팩터는 전기영동에서 관찰된다. [제 5 도]. 이러한 특성의 형태는 철이 존재하여 단백질 매질의 분자내 결합의 중심(focus)을 이룬다. 그외의 데이타는 훼리틴과 비교하여 세파덱스 G200상에서 여과겔(filter gel)로 부터 얻어진다(제8도의 종축 및 횡축은 제 7 도와 유사하나, 직선(―)은 석시닐화된 락토프로테인의 철 유도체를 나타내고, 점선(--)은 말의 비장으로 부터 수득된 훼리틴을 나타낸다). 이 경우 피크는 모호하지만 체류 시간은 훼리틴보다 더 크다, 이 사실은 정확한 분자량이 말이 비장으로 부터 유래한 훼리틴보다 낮다는 것을 보여준다.

f) 위액에서의 안정성

본 시험은 실시예 1에서 수득한 철 유도체에 대해 수행되며, 유도체의 25mg을 0.5ml의 증류수에 용해시키고, 이 용액을 5ml의 쥐의 위액에 가함으로 수행된다. 첨전을 수득하고, 현탁액을 교반하며 37℃에서 60분동안 배양한다. 60분후, 침전을 원심분리하여 분리시키고 철 함량을 알기위해 상등액을 분석한다. 위액에 주어진 철의 양은 최초의 총량의1%이다.

g) 철 유도체를 황산 암모늄으로 침전화

30%(w/v)의 황산 암모늄을 실시예 1에 따라 제조된 10%(w/v)의 철 유도체 용액에 가한다. 철의 단백질 유도체의 침전을 수득하는데 최초의 특성과 똑같은 특성을 가지며, 또한 물에 가용성이다. 용액에는 철이 존재하지 않는다.

상기의 데이타는 철에 대해 석시닐화된 단백질의 결합 능력(Complexing Capacity)이 석시닐화된 우유단백의 전형일 뿐만 아니라, 동물 또는 식물의 여러가지 기원 및 생릭적 기능의 석시닐화된 단백질 유도체의 특성이기도 하다.

상기 기술에서와 같이 변형되지 않은 형태의 많은 동물 또는 식물단백질을 철과 결합하기에 적합하다. 변형되지 않은 우유단백질, 오브알부민, 콩단백질, 혈청단백질, 조직으로 부터 추출한 단백질(간)을 기술한 조건하에서 상용하는 석시닐-프로테인 유도체를 제도하기 위해 반응시키면, 유사한 철 함량을 가지나 용해도 및 안정도가 완전히 다른 특성을 가진 생성물을 수득한다. 예를들어 표 1에서 보는 바와 같이 콩 단백질은 동결 건조할때 75%이상이 불용성인 최종 생성물이며, 위액으로 처리시 철을 잃어버린다. 또한 철에 대한 결합특성은 본 발명의 석시닐화된 훼로-프로테인 유도체의 특성(예 : 알칼리성 미디움에서의 용해성, 산성 미디움 및 고농도의 철을 함유할때 위액의 존재에서의 안정성)이 기본 단백질에 기인하지 않으므로 예견 할 수가 없다.

독 성

a) 급성 독성은 실시예 1에 따라 수득된 우유 단백질의 훼로석시일 프로테인에 대해 스위스 마이스에게 담체로 증류수를 사용하여 경구투여한후 위를 검사하여 시험한다. LD₅₀은 4,000mg/kg보다 크다.

b) 쥐에게 실시예 1에서와 같은 유도체(하기에서는 Ferrolat으로 함)을 연속적으로 경구투어한후, 최초 체중이 200g인 숫 위스타르쥐를 처리하기전 14일동안 가둔후 20일동안 연속적으로 처리하여 독성을 기록하고 무작위로 10그룹으로 분리한다(참조 : Group I : Controls;Ⅱ,Ⅲ and IV Ferrolat at 30-100-300mg/kg/die).

사용시 증류수에 용해한 제제를 동시에 매일 갭(gap)이 없이 투여한다. 대조군으로는 동량의 수도물(10ml/kg)을 투어한다. 처리하는 동안, 투여하기전에 쥐의 체중을 매일 재고, 생성물을 투여한후 여러 시간동안 관찰한다. 처리하는 끝무렵 및 최종 투여후 24시간후 사료 소비정도를 측정하며, 단식 20시간후에 쥐들을 에테르로 마취시키고, 경동맥을 절단하여 치사 시킨다. 피의 일부를 EDTA(4%용액 2적)를 함유한 시험관에 모으고, 나머지는 남겨서 혈청으로 한다. 혈색소 시험을 전혈에 대해 수행하고 혈액 화학적 시험을 혈청에 대해 수행한다.

결 과

체중 및 사료소비의 변화

제 9 도는 치사전날까지 처리하는 동안 수득된 체중 증가곡선을 보여준다.

표 Ⅱ 및 Ⅲ은 처리하는 동안 체중증가 및 동물의 사료소비에 관한 수치를 보여준다.

300mg/kg용량으로 훼로렛(Ferrolat)으로 처리한 쥐의 그룹의 체중증가 곡섬은 대조용 그룹의 쥐의 체중증가 곡선에 대해 처리시작으로 부터 15일부터 기울기가 현저히 감소하였고, 동일실험군은 평균보다 사료소비가 11.7% 감소하였다.

통계학적으로 견지에서는 그리 중요하지는 않은 약간의 차이를 훼로렛으로 처리한 남은 쥐의 그룹에 대해서 관찰할 수 있다.

혈청학적 시험

결과는 표 Ⅳ에 나타나 있다.

혈액 화학적 시험

결과는 표 V에 나타나 있다.

알칼리성 포스파타제가 훼로렛, 300mg/kg/1일로 처리한 쥐에서는 약간 감소함을 관찰할 수 있다.

뇨검사

결과는 표 VI에 나타나 있다.

조직검사

표 Ⅶ는 중요한 쥐의 조직의 절대 평균 중량을 나타내고, 표 Ⅷ는 체중에 관한 상응하는 평균 중량을 나타낸다.

비장 및 폐의 상대 중량이 현저히 증가한 것이 훼로렛 100mg/kg/1일로 처리한 쥐의 그룹에서 기록되었다 또 체중의 현저한 감소, 교환의 평균 중량의 현저한 증가가 훼로렛 300mg/kg/1일로 처리한 쥐의 그룹에서 관찰되었다.

경구투여후 혈중농도

a) 훼로렛-황산제일철 비교

체중이 약 200그람이고 18시간 동안 굶긴 숫 위스타르 쥐를 무작위로 5그룹으로 분리하고 ; 각 그룹을 결정된 시간에서 치사시키고, 경동맥을 잘라서 각 동물로부터 피를 취하는데 ; 각 그룹의 동물의 혈중 철의 양은 분광학적으로 배토 페난쓰로린술폰산(bathophenanthrdisulphonic iacd ; Fe-test, Wako)으로 결정된다. 투여는 수용액(5ml/kg)의 형태로 수행한다. 사용된 석시닐 훼로프로테인 유도체는 실시예 1(Ferrolat)에서와 같이 제조한다. 용량 및 결과는 표 IX에 나타나 있다. 철/kg의 양은 두 유도체에서 같다. (Fe : 1mg/kg).

b) 훼로렛-훼리틴 비교

체중이 약 200그람이고 18시간 동안 굶긴 숫 위스타르 쥐를 무작위로 9그룹으로 분리하고 ; 각 그룹을 결정된 시간에서 치사시키고, 경동맥을 잘라서 각 동물로 부터 피를 취한다. 각 그룹의 동물의 혈중 철의 양은 철색도법(Iron Colorimetric Method(Boehringer-Mannheim)으로 분광학적으로 결정된다. 투여느 수용액(5ml/kg)의 형태로 수행한다. 용량 및 결과는 표 X에 나타나 있다. 훼로렛으로 표신된 식시닐 훼로프테로인 유도체의 철/kg 양은 훼리틴과 같이 1mg/kg임을 알 수 있다.

c) 여러가지 형태의 단백질로부터 수득된 석시닐 훼로프로테인 유도체의 비교

체중이 약 200그람이고 18시간 동안 굶긴 숫 위스타르 쥐를 무작위로 5그룹으로 분리한다(유도체 용량당 하나 및 대조그룹). 각 그룹을 투여후 2시간후 경동맥을 잘라서 치사시키고 피를 각 동물로부터 취하고, 혈중 철의 함량을 배토페난쓰로린술폰산(bathophenanthrolinsulphonic acid ; Fe-test, Wako)으로 결정한다. 경구투여는 수용액의 형태로(5ml/kg)수행된다. 사용한 각 유도체의 투여용량을 Fe가 항상 1mg/kg이 되도록 한다.

시험되는 생성물 : 1) 석시닐화된 콩 단백질+Fe (4.42%)

2)석시닐화된 오브알부민+Fe (3.57%)

3) 석시닐화된 소의 혈청단백 +Fe (5.78%)

4) 석시닐화된 우유단백 + Fe (4.5%) (Ferrolat).

결과는 표 XI에 나타나 있다.

[표 I]

a),b),c),d,e) Fe³⁺: 석시닐화된 단백질의 비가 0.1 : 1 0.1 : 1 및 5 : 1(w : w)인 샘플

f) 완전용해 (+); 부분적용해(+-);볼용성(-)

[표 Ⅱ]

체증증가

*p<0.05 **<0.01

대조군에 대해 유의성이 있음(스튜던트 티 테스트로부터 계산함)

[표 Ⅲ]

사료소비

[표 Ⅳ]

혈청학적 데이타

[표 Ⅴ]

혈액 화학적 데이타

유 의 성

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

[표 Ⅵ]

뇨 시 험

유 의 성

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

[표 Ⅶ]

쥐조직의 절대 초기중량

유 의 성

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

[표 Ⅷ]

쥐의 조직의 상대 초기중량

유 의 성

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

[표 Ⅸ]

혈중농도 : 훼로렛-황산제일철 비교

(대조군에 대해 유의성이 있음)

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

(두가지 철제제의 유의성)

30' : p<0.01; 4h : p<0.05; 6h : p<0.01

[표 Ⅹ]

혈중농도 : 훼로렛-훼리틴 비교

* p<0.05 (훼리틴에 대해 스튜던트티 테스트로부터 계산된 유의성)

**p<0.01

***p<0.001

[표 XI]

혈중농도 : 다른 형태의 단백질는부터 수득한 석시닐 훼로프로데인 사이의 비교

(대조군에 대해 유의성이 있음)

* p<0.05

**p<0.01

***p<0.001

또한 본 발명은 철 결핍성 빈혈의 치료에 적합한 시료로 여기에서 기술되고 주장된 석시닐 훼로 프로테인 유도체의 사용에 관련된 적절한 산업적인 면에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 특히 미리 결정된 이 유도체들의 양을 포함하는 사람 및 가축용으로 사용하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 후자는 경구로 투여할 수 있는데, 예를들면 정제, 캡슐, 앰플 ; 과립을 함유하는 사켓(Sachets); 시럽게 ; 동물사료에 가하는 분말등의 형태이다.

다음의 제형은 예로 주어진 것이다.

-훼로석시닐 프로테인의 형태로 철을 5-10-40mg함유하고, 또한 약제분야에서 통상적으로 사용되는 수용매, 안정제, 향미제를 함유한 앰플 ;

-훼로석시닐 프로테인의 형태로 철을 5-10-40mg함유하고, 또한 약제분야에서 통상적으로 사용되는 부형제, 분산제를 함유한 정제 :

-훼로 석시닐 프로테인의 형태로 철을 5-10-40mg함유한 캡슐 ;

-훼로 프로테인의 형태로 5-10-40mg의 철과 동등한, 발포과립을 함유하고, 약제분야에서 통상적으로 사용하는 서당, 향미제, 안정제들을 함유한 단위용량 사켓(Sachets);

-활성성분으로 5내지 20중량퍼센트로 이유(weaning)시키는 동물사료에 가하는 분말우유.

Claims

석시날화된 단백질을 pH 약 2내지 10의 수용성 매질내에서 철염과 반응시키고, 수득된 생성물을 pH 2 내지 4에서 침전에 의해 분리시키며 이때, 후자의 pH범위는 저절로 형성되거나 산성화시켜 형성시킴을 특징으로 하는, 철을 함유하는 석시닐화된 단백질의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 중성에 가까운 pH에서 석시닐화된 단백질 및 철염을 반응시킴을 특징으로하는 방법.
석시날화된 단백질을 pH 약 2내지 약 10의 수용성 매질내에서 철염과 반응시키고, 반응생성물을 pH를 중성에 가깝게 조정한후 용매를 제거함으로써 분리시킴을 특징으로 하는, 철을 함유하는 석시닐화된 단백질의 제조방법.