CN102838667B - 一种蛋白琥珀酸铁的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其制备的蛋白琥珀酸铁具有酰化度高、载铁量大、溶解性好、质量稳定、杂质含量低和疗效显著等优点。

Description

一种蛋白琥珀酸铁的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种蛋白琥珀酸铁的制备方法。

背景技术

贫血(aniema)是指循环血液中的红细胞数或血红蛋白长期低于正常值的病理现象。通常贫血分为三类：缺铁性贫血(iron deficiency aneima，IDA)、巨幼红细胞性贫血和再生障碍性贫血。缺铁性贫血产生原因主要为血液损失或铁吸收不足所致，如女性月经过多、消化系统溃疡、痔疮等慢性失血性贫血，营养不良、妊娠、儿童生长期等缺铁性贫血。

理想的口服补铁药物，必须克服无机铁盐的胃肠道等副反应，使患者有好的顺应性；还要能被患者较好的吸收，最好是在十二指肠内吸收。

蛋白琥珀酸铁在胃内不被胃蛋白酶消化，在中性pH值时却能被胰蛋白酶水解。由于它具有这些独特的特性，蛋白琥珀酸铁受蛋白膜的保护而不被胃酸破坏和胃蛋白酶酶解，对胃黏膜不造成损伤。在进入肠道后，它重新溶解，并被胰蛋白酶所消化。蛋白保护膜被消化后，铁在十二指肠内开始释放。蛋白琥珀酸铁适应症为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍、急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血，妊娠与哺乳期贫血。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备蛋白琥珀酸铁的方法，所述方法制备的蛋白琥珀酸铁具有酰化度高、载铁量大、溶解性好、质量稳定、杂质含量低和疗效显著等优点，所述方法包括如下步骤：

(a)在反应釜中加入酪蛋白和15倍量水，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在9.0～10.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中按重量比酪蛋白∶丁二酸酐1∶1-5∶1分多次缓慢加入丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在9.0～10.0，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤，滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0～4.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加15倍量水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0～10.0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液；

(b)将上述琥珀酸蛋白溶液置于反应釜中，琥珀酸蛋白∶三氯化铁按重量比1∶0.1∶-1∶1称取三氯化铁，配制1.85％三氯化铁溶液，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0～10.0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤，得蛋白琥珀酸铁的滤液；

(c)将滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至1.0～4.0，离心，用水洗沉淀.，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0～10.0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0～4.0，离心，用水洗沉淀，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0～10.0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0～4.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀；

(d)将沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，沉淀在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10～30Pa，以每小时升高2-4℃升温至-20℃，保持8小时；再以每小时升高2-5℃升温至30℃，保持约6小时，破除真空，出箱，得蛋白琥珀酸铁。

本发明所述的步骤(a)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选为9.5。

本发明所述的步骤(a)中，酪蛋白∶丁二酸酐的重量比优选为2∶1。

本发明所述的步骤(a)中，3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2.0。

本发明所述的步骤(b)中，琥珀酸蛋白∶三氯化铁的重量比优选为1∶0.28。

本发明所述的步骤(b)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选为9.5。

本发明所述的步骤(c)中，3mol/L盐酸溶液调节pH值优选为2.0。

本发明所述的步骤(c)中，4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值优选至9.5。

本发明所述的蛋白琥珀酸铁的制备方法直接用酪蛋白为原料，反应收率高，产品纯度好。反复精制可以除去可能存在的酪蛋白、丁二酸、氯化钠等杂质。采用冷冻干燥，得到的蛋白琥珀酸铁蓬松，易粉碎，颜色均一，呈棕黄色。冷冻干燥后蛋白琥珀酸铁性状良好，其他指标均符合要求。

本发明的又一目的是提供所述的蛋白琥珀酸铁在制备治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病为绝对和相对缺铁性贫血，由于铁摄入量不足或吸收障碍导致的急性或慢性失血以及各种年龄患者的感染所引起的隐性或显性缺铁性贫血和妊娠与哺乳期贫血。

本发明的又一目的提供所述的蛋白琥珀酸铁用于制备药剂的用途，其中该剂型通常用于口服。

具体实施方式

以下的实施例用于说明和进一步解释本发明，但决不限制本发明。

如果没有特别指出，本发明中所述的百分比均指重量百分比。

一、实施例 蛋白琥珀酸铁的制备

实施例1

(a)制备琥珀酸蛋白

于500L反应釜中，加入约105kg水及7.0kg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入7kg丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。

滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约108L。

取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6.72kg)。

(b)载铁反应

根据琥珀酸蛋白∶三氯化铁按重量比1∶0.1，称取0.672kg三氯化铁，并配制1.85％三氯化铁溶液36.3L。

将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤。

(c)精制

滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至1.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至1.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。

(d)冷冻干燥

将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10Pa，以每小时升高2℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高2℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6.18kg，收率91.8％。

实施例2

(a)制备琥珀酸蛋白

于500L反应釜中，加入约105kg水及7.0kg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入1.4kg丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10.0，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。

滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约105L。

取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6.70kg)。

(b)载铁反应

根据琥珀酸蛋白∶三氯化铁按重量比1∶1，称取6.70kg三氯化铁，并配制1.85％三氯化铁溶液362L。

将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤。

(c)精制

滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调pH值至4.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至4.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。

(d)冷冻干燥

将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在30Pa，以每小时升高4℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高5℃升温至30℃，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6.02kg，收率89.9％。

实施例3

(a)制备琥珀酸蛋白

于500L反应釜中，加入约105kg水及7.0kg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入3.5kg丁二酸酐，边加边用4mo/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。

滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约110L。

取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6.92kg)。

(b)载铁反应

根据琥珀酸蛋白∶三氯化铁按重量比1∶0.28，称取1.93kg三氯化铁，并配制1.85％三氯化铁溶液104L。

将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤。

(c)精制

滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至2.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调pH值至2.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，使沉淀溶解，然后离心，滤液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。

(d)冷冻干燥

将去离子水洗涤后的沉淀置冻于箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在20Pa，以每小时升高3℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高4℃升温至30℃，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6.56kg，收率95.6％。

实施例4

(a)制备琥珀酸蛋白

于500L反应釜中，加入约105kg水及7.0kg酪蛋白，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中分多次缓慢加入3.5kg丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在10.0，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤。取滤液测定酰化度。

滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加约105kg水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液约115L。

取琥珀酸蛋白溶液适量，测定琥珀酸蛋白溶液的固含量，并计算琥珀酸蛋白的总重(6.83kg)。

(b)载铁反应

根据琥珀酸蛋白∶三氯化铁按重量比1∶0.5，称取3.42kg三氯化铁，并配制1.85％三氯化铁溶液185L。

将上述琥珀酸蛋白溶液置于500L反应釜中，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85％三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤。

(c)精制

滤液用3mol/L盐酸溶液调pH值至3.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3.0，离心，用水洗沉淀.，再加约192kg水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10.0，使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至3.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀。

(d)冷冻干燥

将去离子水洗涤后的沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，样品在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在20Pa，以每小时升高3℃升温至至-20℃，保持约8小时；再以每小时升高3℃升温至30℃，保持约6小时，破除真空，出箱得蛋白琥珀酸铁6.05kg，收率88.6％。

二、试验例

试验例1实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁及中间体的质量及稳定性研究采用实施例1-4所制备的蛋白琥珀酸铁样品进行研究。

(1)中间体琥珀酰蛋白的酰化度测定

本发明所述方法分两步，关键中间体为琥珀酸蛋白，酰化度的检测是为了检查酰化的程度，酰化度高有利于载铁反应的进行和样品的粘度、溶液均一性。所以酰化度是控制中间体琥珀酸蛋白的一个重要指标，对最终产物琥珀酸蛋白铁的质量具有至关重要的影响。我们进行了酰化度测定的方法学研究，并建立了中间体质量控制指标(酰化度大于94％)。

方法：参照茚三酮测氨基酸含量的经典方法。茚三酮溶液与蛋白质共热，茚三酮与蛋白质中游离的氨基反应生成氨，氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，可通过测定570nm波长处的吸光度，测定游离氨基的含量。仪器：UNICO UV-2102PC型紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司

测定法及计算方法：精密量取酪蛋白对照溶液和供试品溶液各2ml，分别置2个10ml试管，各加1ml显色剂，水浴15min，冷水中冷却至室温，各加40％乙醇5ml，然后分别用水定容至10ml量瓶，放置20min，在570nm波长处测定吸光度，同时做空白校正。

计算公式：

式中：Asp为琥珀酸蛋白供试品溶液的吸光度

Ap为酪蛋白对照溶液的吸光度

Csp为琥珀酸蛋白供试品溶液的浓度

Cp为酪蛋白对照溶液的浓度

结果：琥珀酸蛋白酰化度的结果见表1。

表1实施例1-4制备的中间体酰化度结果

(2)实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁的铁含量及杂质测定

2.1氯化物

取游离铁测定项下储备液10ml，加水10ml，然后加入0.05mol/L硫酸溶液调pH值至2.0～3.0使沉淀完全，过滤，并用水洗涤沉淀，洗液与滤液合并，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，依法检查(中国药典2005年版二部附录VIII A)，与标准氯化钠溶液5.0ml制成的对照液比较。

结果见表2。结果表明：实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁溶液显色均浅于5.0ml标准氯化钠溶液制成的对照液的显色，即样品中的氯化物均低于1.0％。

表2氯化物测定结果

2.2丁二酸

本发明的制备方法在制备过程中用到了丁二酸酐，在水中的形式是丁二酸，精制过程中可以除去大量残留的丁二酸，但仍有少许残留，为了保证安全性，采用高效液相色谱法检测原料中残留的丁二酸，方法如下：色谱仪：Agilent 1100Series HPLC仪，Agilent化学工作站色谱柱：AichromBond-AQ C18250mm×4.6mm，5μm。以0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH值至3.0)为流动相；检测波长为210nm，流速1.0ml/min，柱温30℃。理论板数按丁二酸计算应不低于2000。用高效液相色谱法作为丁二酸残留限度测定方法，精密度高、线性关系良好，样品测定处理方法回收率也符合要求，能够科学、合理、有效的控制本产品的质量。

测定结果见表3，实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁中的丁二酸含量均低于0.05％。

表3丁二酸含量限度测定结果

2.3游离铁

蛋白琥珀酸铁应是一种无离子状态的三价铁络合物，产品本身的降解和合成过程中的引入，都会导致游离铁的存在，它的存在会影响铁含量测定的准确性和产品质量，所以游离铁的测定和限值很重要。采用紫外-可见分光光度法测定。三价铁离子与巯基乙酸在碱性条件下形成紫红色的复合物，在535nm波长处有吸收，通过测定吸光度来得到其中的含量。仪器：UNICO 7200可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)。与标准铁溶液(中国药典2005年版二部附录VIII G)制成的对照液比较，供试品溶液的吸光度小于对照液的吸光度(0.1％)视为未检出。

结果见表4，实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁中的游离铁的限度均符合标准。

表4游离铁限度测定数据

2.4铁含量测定

采用炽灼-氧化还原滴定法对本发明实施例1-4制备的蛋白琥珀酸铁中的铁含量进行了研究。

取60℃减压干燥至恒重的原料约0.6g，精密称定，置50ml坩埚中，缓缓炽灼至完全炭化，放冷，加硫酸1ml使炭化物全部湿润，再低温加热至硫酸蒸气除尽，600℃炽灼5小时，使供试品完全灰化，放冷，加盐酸10ml微热使溶解，移置碘瓶中，坩埚用水50ml分数次洗涤，洗液合并，加碘化钾1g，摇匀，密塞，暗处静置10分钟，加水20ml，用硫代硫酸钠滴定液(0.05mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失。并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液(0.05mol/L)相当于2.7925mg的Fe。

计算方法： $\mathrm{Fe}(\%)=\frac{(V-V_0)\×C\×2.7925}{0.05\×W}\×100\%$

式中：V为滴定消耗的体积，ml

V₀为空白消耗的体积，ml

C为滴定液的浓度，mol/L

W为供试品的重量，mg

结果见表5。实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁的铁含量测定结果表明，含量均在8.0-9.5％左右，铁含量较高。

表5铁含量测定数据

(3)实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁的稳定性研究

3.1方法：参考中国药典2005年版二部附录XIX C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则的内容设计蛋白琥珀酸铁原料的稳定性试验条件。

3.1.1实施例1-4制备的蛋白琥珀酸铁进行了光照、高温(60℃、40℃)放置等影响因素试验。

3.1.2将实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁，分别置于40℃±2℃，相对湿度75％±5％的恒温恒湿烘箱内放置6个月。于贮藏期内第0、1、2、3、6个月各取样检测一次，检测项目包括性状、酸度、溶液的澄清度、干燥失重、丁二酸、游离铁、铁含量等。

3.1.3将实施例1-4的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁，置于25℃±2℃，相对湿度60％±10％的恒温恒湿烘箱内。于贮藏期内第0、3、6、9、12、18、24、36个月各取样检测一次，检测项目包括性状、酸度、溶液的澄清度、干燥失重、丁二酸、游离铁、铁含量等。

3.2、稳定性试验结果：

3.2.1光照试验结果表明(表6)：本发明实施例3制备的蛋白琥珀酸铁在4500Lx±500Lx光照射条件下考察10天，其性状、酸度、溶液的澄清度、干燥失重、丁二酸、游离铁、铁含量等考察项目均无明显变化，表明本品对光比较稳定，其它实施例制备的蛋白琥珀酸铁对光均比较稳定(数据未列出)。

表6光照试验结果(实施例3)

3.2.2高温试验结果表明(表7)：本发明实施例3制备的蛋白琥珀酸铁于60℃和40℃的恒温烘箱中考察10天，因为温度高的原因，水分丢失，干燥失重减少；其性状、酸度、游离铁、铁含量等考察项目无明显变化；丁二酸残留量有所增加，但符合标准。其它实施例制备的蛋白琥珀酸铁在高温试验中均比较稳定(数据未列出)。

表7高温试验结果(实施例3)

3.2.3加速试验结果表明(表8)：本发明实施例1-4制备的蛋白琥珀酸铁，在40℃±2℃，相对湿度75％±5％的条件下考察6个月，其性状、酸度、溶液的澄清度、干燥失重、游离铁、铁含量等考察项目均无明显变化，丁二酸残留量有所增加，符合拟定的质量标准。

表8加速试验结果

3.2.4长期试验结果表明(表9)：拟上市包装的蛋白琥珀酸铁原料，在25℃±2℃，相对湿度60％±10％的条件下长期考察36个月，其性状、酸度、溶液的澄清度、干燥失重、游离铁、铁含量等考察项目均无明显变化，丁二酸残留有所增加，但符合标准。

表9长期试验结果

试验例2实施例3的制备方法制备的蛋白琥珀酸铁对动物缺铁性贫血的干预效果

方法：60只SD大鼠按照廖氏方法制成贫血模型后随机分为空白组、对照组和实验组，空白组给予等量的生理盐水，对照组给予含等量蛋白琥珀酸铁的菲普利口服溶液(意大利马克大药厂)，实验组给予蛋白琥珀酸铁的溶液10ml(10mg/kg)，一个月后测定血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)、血清铁蛋白(SF)。

结果见表10，实验组较对照组Hb、SF、RBC含量显著性增加。实施例3制备的蛋白琥珀酸铁可明显改善缺铁性贫血大鼠铁营养状况，并且明显优于对照组。

表10蛋白琥珀酸铁对动物缺铁性贫血的干预效果

^**P＜0.01

虽然，本发明已通过以上实施例得到清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种蛋白琥珀酸铁的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)在反应釜中加入酪蛋白和15倍重量的水，加入4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在9.5使酪蛋白溶解，向酪蛋白溶液中按重量比酪蛋白：丁二酸酐为2：1称取丁二酸酐，分多次缓慢加入丁二酸酐，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液控制pH值在9.5，丁二酸酐加完后继续搅拌0.5h，离心过滤，滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，使琥珀酸蛋白沉淀，离心分离，用水洗沉淀，再加15倍重量的水，加4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值在 9.5，使沉淀溶解，然后离心，得琥珀酸蛋白溶液；

(b) 将上述琥珀酸蛋白溶液置于反应釜中，琥珀酸蛋白：三氯化铁按重量比1：0.28称取三氯化铁，配制1.85%三氯化铁溶液，在搅拌下缓慢加入配制好的1.85%三氯化铁溶液，边加边用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，三氯化铁溶液加毕，继续搅拌0.5h，离心过滤，得蛋白琥珀酸铁的滤液；

(c) 将滤液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，离心，用水洗沉淀.，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，使沉淀溶解，重复将溶液用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，离心，用水洗沉淀，再加水，用4mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.5，使沉淀溶解，然后离心，溶液经1.2μm陶瓷膜精滤后，再用3mol/L盐酸溶液调节pH值至2.0，使蛋白琥珀酸铁沉淀，离心分离，用去离子水洗涤沉淀；

(d) 将沉淀置冻干箱中，关闭箱门，开机制冷，沉淀在-40℃时，保持4小时；开启真空系统，保持真空度在10～30Pa，以每小时升高2-4℃升温至-20℃，保持8小时；再以每小时升高2-5℃升温至30℃，保持6小时，破除真空，出箱，得蛋白琥珀酸铁。

2.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的方法获得的蛋白琥珀酸铁，该制剂为口服制剂。