DK159824B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af succinylferroproteiner - Google Patents

Description

i

DK 159824 B

Den foreliggende opfindelse angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af succinylerede proteiner med en succinylerings-grad på mellem 20 og 100%, indeholdende fra 0,1 til 20 vægt% jern, opnået ved behandling af succinylerede proteiner med 5 jernsalte ved passende pH-værdiintervaller. De involverede forbindelser, som tåles fuldstændigt, udmærker sig ved en optimal biotilgængelighed af jernet.

Jern, som indgår i alle legemsvæv, spiller en fuldstændig u-10 undværlig fysiologisk rolle. Det er en væsentlig bestanddel af hæmoglobin, myreglobin og enzymerne: katalase, fumarsyre-dehy-drogenase, peroxidase, cytokromer, DPN-cytokromreduktase og metalflavonproteiner, såsom ferroflavin. Et voksent menneskes legemsvæv indeholder fra 1,5 til 5 g jern, hvoraf 60 - 65% er 15 koncentreret i de røde blodlegemer, medens 18 - 30% er bundet til ferri tinproteinerne og hæmosiderin, der er lokaliseret i leveren, milten, benmarv og celler af endotelnetsystemet (endothelial reticlar system). Resten er fordel i de forskellige ovennævnte enzymsystemer, i myoglobin (ca. 4%) og i transfer-20 rin (ca. 0,1%), Øj-globul inet til den hæmatiske transport af jernet af intestinal oprindelse. Transferrin er ved fysiologiske pHværdier i .stand til at binde to jernatomer på en praktisk taget ikke-dissocierbar måde.

25 Jernkravet opfyldes delvist ved anvendelse af endogent jern (der stammer fra nedbrydningen af gamle røde blodlegemer) og delvis af absorptionen af eksogent jern. Absorptionen af det eksogene jern finder sted langs duodenum og den øerste del af jejunum og akkumuleres i overvejende grad i leveren. Det før-30 ste patologiske symptom på jernmangel er hyperkromisk, side-ropenisk anæmi, hvis hovedårsager kan variere: Kroniske blødninger, som findes ved gastroduodenal ulcus eller neoplasi, fejlernæringer og dårlig absorption, som i tilfældet med diarré, forøgede krav, f.eks. graviditet, diegivning, infektions-35 sygdomme etc., dårlig metabolisk udnyttelse, særlige behandlinger, såsom administration af ACTH og cortisoner.

2

DK 159824B

Den mest velegnede behandling er tilførsel af jern. Dette nedsætter effektivt den anæmiske tilstand, når denne tilstand skyldes en akut jernmangel. Den ledsages imidlertid i almindelighed af uønskede bivirkninger, som hænger sammen med vektor-5 typen, der anvendes for jernet. De i størst udstrækning an vendte farmaceutiske orale præparater er baseret på meget va-rierde organiske og uorganiske syresalte, lidt efter lidt indført i terapien med henblik på at reducere de ovennævnte bivirkninger. Der er derfor markedsført orale specialiteter ba-10 seret på uorganiske salte af typen: ferrichlorid, ferrosulfat, ferriphosphat eller endog organiske salte, såsom citrater, cholinater, aspartater, fumarater, gluconater, glycinater, lactater, oxalater og succinater. I tilfældet med dyb intra-muskulær administration foreslås ferro-dextran-komplekset til 15 intravenøse behandlinger (til sideropenisk anæmi, hvor oral behandling er slået fejl) gøres der brug af ferro-dextri n-komplekset.

I tilfældet med den sidstnævnte komplekstype kan bivirkninger-20 ne optræde i form af allergiske reaktioner, temperaturstigninger, tachycardi, leucocytose, lymfadenopati i tilfælde af in-tramuskulær behandling, og endog anafylaktisk chock, thrombophlebitis og kredsløbskollaps i tilfældet med intravenøs behandling. I tilfældet med oral behandling under anvendelse af 25 formuleringer baseret på de ovennævnte forbindelser er bivirkningerne almindeligvis gastrointestinale læsioner med necrose og perforering af slimhinderne i mere alvorlige tilfælde og diarré og opkastning. Den lave tålelighed gør desuden administrationen af passende mængder jern vanskelig. For at formind-30 ske bivirkningerne er det blevet foreslået, at man indtager ernæring samtidigt, men dette strider mod den godtgjorte varierede absorption af jern som en funktion af sammensætningen af næringsmidlerne selv. Det er i virkeligheden blevet konstateret, at absorptionen af jernet fra præparater er optimal, når 35 patienten har fastet. Gastrisk irritation efterfølges desuden af anvendelsen af antacider, som igen reducerer absorption og forværrer den anæmiske tilstand.

DK 159824B

3

Man har opnået væsentlige fremskridt med hensyn til jernterapi, specielt oral administration, ved, at der på markedet er blevet indført ferriti nbaserede specialiteter.

5 Ferritin er et ferriglobul in og repræsenterer det vigtigste jernholdige protein i pattedyrs legemer. Det kommercielle produkt ekstraheres fra hestemilt som råmateriale.

Dets jernindhold er 20%, baseret på tørvægt. Dets proteindel, 10 apoferritin, har en molekylvægt på ca. 445,00 og omgiver en "kerne" af krystallinsk oxid-phosphatjern. Det er velegnet til oral administration, da det er opløseligt i vand.

Ferriti n-baseret behandling resulterer ikke i de gastrointe-15 stinale bivirkninger, som opstår ved anvendelse af de ovennævnte jernderivater. Dets anvendelse er imidlertid begrænset både på grund af en meget høj pris på råmaterialet og specielt på grund af den begrænsede tilgængelighed af ekstraktionskilder .

20

Den kendte teknik synes at vise, at den optimale bærer for jernet til absorptionsformål uden bivirkninger kan være en proteinbærer. Mange proteiner har en bestemt affinitet over for jern. Visse proteintyper af animalsk oprindelse (serum-25 proteiner, organproteiner, ovalbuminer, lactoproteiner), eller af vegetabilsk oprindelse (sojaprotein) er derfor blevet undersøgt med hensyn til anvendelighed som bærere.

Reaktionen mellem uorganiske ferrisalte og de ovennævnte pro-30 teiner fører til dannelsen af ferroproteinderivater, hvis terapeutiske interesse imidlertid undermineres af en række negative egenskaber herunder: - uopløseligheden af de opnåede dérivater, når den til prote-35 inet bundne jernprocent når værdier over 0,5%, - vanskeligheden eller endog umuligheden af at vurdere, hvilken brøkdel af det samlede jernindhold, der under sådanne uop-

DK 159824 B

4 løselighedsbetingelser faktisk er bundet til proteinet, og hvilken brøkdel, der medudfældes i form af hydratiserede oxider, der kan forårsage alvorlige mavelæsioner, 5 - den manglende homogenitet og sammensætningsstabilitet med hensyn til disse derivaters jern.

I forbindelse med nogle proteiner, herunder de af mælk afledte, er der desuden blevet konstateret nærværelsen af opløse-10 lige jernderivater med en væsentlig mængde af uopløselige derivater ved forskellige pH-værdier, idet sammensætningen af disse opløselige fraktioner varierer voldsomt, som en funktion af meget ringe variationer i eksperimentelle parametre.

15 Det har nu overraskende vist sig, at det ved omsætning af et succinyleret protein med jernsalte i vandig opløsning er muligt at opnå ferroproteri nderivater med et højt jernindhold, som er stabile, opløselige ved pH-værdier på over 5, og har forskellige men reducerbare jernindhold, hvilke ferroprotein-20 derivater giver mulighed for at levere jern til pattedyr ved oral administration uden at forårsage bivirkning af mavelæsi-onstypen. Hos rotter gav en daglig oral administration i 20 på hinanden følgende dage ikke tegn på mavelæsioner, og tolerancegraden var høj.

25 I tilfældet med rotter vistes sammenligningen mellem sideræmi-betingelser efter den orale administration af ækvivalente mængder af jern i form af ferrosulfat, hestemiItferritin (Sigma, Saint Louis, Missouri) og ferroproteinderivater fra suc-30 cinylerede mælkeproteiner, fremstillet som beskrevet i eksempel 1, at: a) koncentrationen af hæmatisk jern, frembragt ved hjælp af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede deri-35 vat sammenlignet med den som blev frembragt ved hjælp af ferrosulfat forbliver længere på et højt niveau (se tabel IX); 5

DK 159824 B

b) koncentrationen af hæmatisk jern, frembragt ved hjælp af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede derivat sammenlignet med den, der blev frembragt ved hjælp af standardferritin er højere (ca. 1,5:1) ved forsøg med 6 ti-5 mers varighed (se tabel X).

Når man husker på produktets høje tolerancegrad, dets lave toksicitet (over 4.000 mg/kg i schwiezermus), de høje jernniveauer, der kan opnås og den lette tilførsel af råmaterialet, 10 udgør anvendelsen af derivaterne ifølge den foreliggende opfindelse en klar forbedring i forhold til den kendte teknik i forbindelse med jernbehandlinger.

De fysisk-kemiske egenskaber af disse succinylferroproteiner, 15 som nævnt ovenfor, er reproducerbare og stabile, således som det fremgår af eksemplerne. Fraværelsen af jern, som ikke er bundet, vises af den fuldstændige opløselighed i et alkalisk medium (tilstande, hvorunder jernionen udfældes som hydrati-seret oxid) af de præparater, der blev opnået ud fra succi-20 nylerede proteiner.

Formålet med den foreliggende opfindelse er således at angive en analogi fremgangsmåde til fremstilling af succinylferropro-tein, der er karakteriseret ved, at det indeholder jernmæng-25 der, som kan variere som procentdele, og mængder af animalske eller vegetabilske proteiner, som er blevet succinyleret til forskellige grader, og ved at det er beregnet til at levere biotilgængeligt jern til pattesyr uden at forårsage gastroin-testinale læsioner, når det administreres oralt.

30

Disse derivater kan anvendes som den aktive bestanddel ved fremstillingen af farmaceutiske specialiteter til brug ved behandlingen af anæmi forårsaget af jernmangel hos pattedyr.

35 Opfindelsens formål opnås ved hjælp af en analogifremgangmåde til fremstilling af succi nylferroprotein, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at succinylerede proteiner omsættes

DK 159824 B

6 (på i og for sig kendt måde) med jernioner ved en pH-værdi mellem 7,5 og 8, i vandige opløsningsmidler, og at de opnåede produkter isoleres fra reaktionsblandingen ved udfældning ved en pH-værdi i intervallet 2-4, idet sidstnævnte pH-værdiin-5 terval tilvejebringes spontant eller ved syrning. Alternativt kan reaktionsproduktet isoleres, ved at fjerne opløsningsmidlet efter at pH-værdien er blevet indstillet til en værdi nær neutral.

10 I det følgende gives en oversigt over tegningens figurer: fig. 1 viser det UV-synlige spektrum for succinylferroprotein-derivatet fremstillet ifølge eksempel 1 (kontinuert linie) og det tilsvarende spektrum for ferritin fra he-15 stemilt (punkterede linier), fig. 2 viser fluorescerende emissionsspektre, kontinuert linie: succinylferroproteinderivat ifølge opfindelsen, stiplet linie: 1actoproteiner og punkteret: linie suc-20 cinylerede lactoproteiner, fig. 3-6 viser resultater fra elektroforese: fig. 3 viser elektroforese med sojaproteiner (spor 1), succi- 25 nylerede sojaproteiner (spor 2), jernderivat af succi- nylerede sojaproteiner (spor 3) og jernderivat af ikke-succinylerede sojaproteiner, opløselig fraktion (spor 4), 30 fig. 4 viser elektroforese for albumin (spor 1), succinyleret ovalbumin (spor 2), jernderivat af succinyleret ovalbumin (spor 3) og jernderivat af ovalbumen (spor 4), fig. 5 viser elektroforese af lactoproteiner (spor 1), succi-35 nylerede lactoproteiner (spor 2), jernderivat af succi- nylerede lactoproteiner (spor 3) og hestemi 1tferritin (spor 4), 7

DK 159824B

fig. 6 viser den densitometriske aflæsning ved 550 nm ved elektroforese gennemført på jernderivatet af succinyle-rede lactoproteiner (kontinuert linie), jernderivatet af succinylerede sojaproteiner (stiplet linie) og jern-5 derivatet af succinyleret ovalbumin (punkteret linie), fig. 7 viser gelfi 1 trer ingsprofi 1 for succinylerede lactoproteiner (kontinuer linie) og det tilsvarende jernderivat (punkteret linie), 10 fig. 8 viser gelf iIteringsprofi 1 for jernderivatet af succinylerede lactoproteiner (kontinuer linie) og for ferritin opnået fra hestemilt (punkteret linie), og 15 fig. 9 viser vægtforøgelsen hos rotter, der modtager forskellige mængder af det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede succinylferroprotein sammenlignet med en kontrolgruppe.

20 Eksempel 1

Fremstilling af 5 vægt% jernderivater af succinylerede proteiner af fuldmælkspulver.

25 1 kg mælkepulver blev suspenderet i 6 liter 0,3M natriumbicar- bonat og under mekanisk omrøring og pH-værdi kontrol blev der tilsat 500 g ravsyreanhydrid i form af efter hinanden følgende portioner, idet pH-værdien blev holdt inden for et interval mellem 7,5 og 8 ved hjælp af tilsætning af 4N NaOH. Efter til- 30 sætningen blev blandingen omrørt i 2 -3 timer ved omgivelsernes temperatur. I løbet af dette tidsrum blev suspensionen opløst fuldstændigt. En opaliserende opløsning blev centrifugeret og filtreret, indtil den var næsten klar, og langsomt syrnet til en pH-værdi på 3 med HC1.

Det dannede bundfald blev skilt fra ved centrifugering eller filtrering og suspenderet igen i vand (ca. 8 liter). Na0H-op- 35 8

DK 159824 B

løsning blev tilsat, indtil det var fuldstændigt opløst (pH-værdi ca. 7,5). Centrifugeringen blev gennemført og den klare opløsning syrnet igen tiV pH-værdi 2,5 - 3 ved hjælp af HC1-tiIsætning.

5

Bundfaldet blev udvundet ved filtrering eller centrifugering og vasket med en HC1-opløsning med en pH-værdi på 3. Resten, som bestod af de succinylerede proteiner (hvis succinylerings-grad kan variere som en funktion af den anvendte mængde rav-10 syreanhydrid; i det her foreliggende tilfælde var den 90% med hensyn til grupperne, som kunne succinyleres i udgangsproteinet som angivet nedenfor), blev efter tørring under vakuum dispergeret i destilleret vand. Den blev opløst ved tilsætning af NaOH indtil pH-værdi 7,5, idet opløsningen blev 15 fortyndet således, at den endelige proteinkoncentration var ca. 0,04 g/ml. En opløsning af et jernsalt (f.eks. FeCl3) med et Fe3+/succinyleret protein-forhold på 1:10 efter vægt blev sat til denne opløsning. Denne giver en suspension, som blev fint dispergeret ved hjælp af mekanisk omrøring, medens pH-20 værdien faldt til ca. 2,5. Omrøringen blev fortsat i 3 timer ved omgivelsernes temperatur, og suspensionen blev derpå filtreret. Det fast stof blev suspenderet i vand (ca. 3 volumener) og blev opløst ved tilsætningen af NaOH (pH-værdi 7,5).

25 Opløsningen, som ikke var hel klar, blev filtreret, og produktet udvundet som fast stof under anvendelse af én af de følgende metoder: a) opløsningen blev syrnet, bundfaldet opnået ved en pH-værdi 30 på 2,5 blev filtreret fra og tørret under vakuum, b) den klare opløsning blev dialyseret mod vand for at eliminere natriumchloridet og derpå frysetørret eller tørret ved hjælp af et sprøjtetørringsanlæg.

Udbytterne af det færdige produkt var den samme og udgjorde ca. 20 vægt% af det oprindelige mælkepulver. Produktets egenskaber er angivet i tabel H (eksempel Ib).

35 9

DK 159824 B

Eksempel 2

Fremstilling af 5 vægt% jernderivater af succinylerede mælkeproteiner.

5

Som beskrevet i eksempel 1 med den forskel at udgangsproduktet udgjordes af 350 g mælkeproteiner, forud udfældet af mælkepulver ved dispergering af pulveret i vand (ca. 5 liter), syrning til pH-værdi 2,5 med end mineralsyre og derpå fil-10 trering eller centrifugering af proteintørstof og tørring.

Jernindholdet var som angivet nedenfor (tabel I), og de i eksemplerne 1 og 2 opnåede derivater ca. 4-5 vægt%.

15 Eksempel 3

Fremstilling af jernderivater ud fra succinylerede mælkeproteiner med forskellige jernindhold.

20 De i eksemplerne 1 og 2 beskrevne fremgangsmådetrin blev anvendt med de samme mængder af mælkepulver eller forud udfældede mælkeproteiner, medens vægtforholdet Fe3+/succinylerede protein blev modificeret til værdierne 0,1:10, 0,2:10, 0,5:10 og 1,5:10, hvilket giver jernderivater, hvis egenskaber er 25 vist i tabel I.

Eksempel 4

Fremstilling af jernderivater af succinylerede ægproteiner 30 (ovalbumin) .

5 g ovalbumin blev opløst i 100 ml vand i ndeho Idende 3 g KHCO3, og 2,5 g ravsyreanhydrid blev tilsat i efter hinanden følgende portioner til den klare opløsning, medens pH-værdi-35 erne blev holdt mellem 5 og 8 ved tilsætningen af NaOH. Blandingen fik lov til i 2 timer at reagere ved omgivelsernes temperatur. Efter syrning af opløsningen til pH-værdi 3,5 blev 10

DK 159824 B

der opnået et bundfald, der blev isoleret ved centrifugering, renset ved opløsning ved pH-værdi 7,5 med NaOH og derpå udfældet igen ved pH-værdi 3,4. Det faste stof blev udvundet ved centrifugrering og tørret under vakuum. Det tørre stof blev 5 suspenderet i destilleret vand og opløst ved tilsætningen af NaOH (pH-værdi 8) til opnåelse af en slutopløsning på 0,04 g protei n/ml.

En opløsning af et salt af Fe3+ (f.eks. ferrichlorid) blev sat 10 til den meget viskose opløsning til frembringelse af et vægtforhold af succinylerede proteiner/Fe3+ på 10:1. Under disse betingelser faldt pH-værdien til 2,6 under dannelse af et bundfald, der blev filtreret fra. Dette bundfald blev opløst i vand igen, og NaOH blev tilsat indtil fuldstændig opløsning 15 (pH-værdi 7,5). Efter dialyse mod vand, for at fjerne natrium-chlirdet, blev det faste produkt udvundet ved frysetørring eller ved hjælp af et sprøjtetørringsanlæg. Udbyttet af derivatet var 33 vægt% af det oprindelige protein. Dets jernindhold og egenskaber er anført i tabel I.

20

Eksempel 5

Fremstilling af jernderivater af succinylerede proteiner af bovinserum.

25 1,5 g NaHC03 blev sat til 50 ml af en opløsning af bovinserum-proteiner, og blandingen blev behandlet med 6 g ravsyreanhy-drid tilsat i efter hinanden følgende portioner, medens pH-værdien blev holdt mellem værdierne 7,5 og 8 ved tilsætning af 30 NaOH. Efter endt tilsætning fik reaktionsblandingen lov til at henstå i 2 timer ved omgivelsernes temperatur og derpå blev der dannet et bundfald ved syrning til en pH-værdi på 2,4 ved hjælp af en mineralsyre. Bundfaldet blev udvundet ved centrifugering og renset som beskrevet i eksempel 4.

Det faste produkt blev suspenderet i vand og pH-værdien ind stillet på 7,5 ved hjælp af NaOH. Den på denne måde opnåede 35

DK 159824E

π opløsning fik tilsat en opløsning af et jernsalt (III) (f.eks. ferrichlorid) indtil det nåede et forhold af syccinyleret pro-tein/Fe3+ efter vægt på 10:1. pH-værdien faldt øjeblikkeligt til 2,4, og der blev opnået et bundfald, som, efter indstil-5 ling til pH-værdi 7,5, kun opløstes delvis. Opløsningen blev skilt fra resten ved centrifugering, dialyse mod vand blev gennemført for at fjerne natriumchloridet, og frysetørring blev derpå gennemført. Udbyttet af jernderivatet med hensyn til det oprindelige protein var ca. 30 vægt%. Jernindholdet og 10 egenskaber er anført i tabel I.

Eksempel 6

Fremstilling af jernderivater af succinylerede proteiner af 15 svinelever.

400 g frisk svinelever blev homogeniseret i en Si 1verson-homo-genisator i nærværelse af 800 ml 0,2M KHC03-opløsning, pH-vær-di 8,3. Efter centrifugering ved 9.000 omdrejninger pr. minut 20 ved 5°C blev den overliggende væske opsamlet og filtreret igennem en 0,45 pm cel 1u1oseacetatmembran. 1,2 g ravsyreanhy-drid blev tilsat i efter hinanden følgende portioner til 50 ml klar opløsning, idet man sikrede, at pH-værdien blev 7,5 og 8 ved tilsætning af NaOH.

25

Opløsningen blev henstillet 1 time ved omgivelsernes temperatur og derpå syrnet med mineralsyre til en pH-værdi på 3, hvorved der blev opnået et bundfald, som blev behandlet på samme måde som i eksempel 4, med den modifikation, at den en-30 delige udvinding blev gennemført ved frysetørring af opløs ningen, som var blevet dialyseret mod vand.

Den frysetørrede rest blev suspenderet i vand og indstillet til pH-værdi 8 ved anvendelse af soda. Dette gav en opløsning, 35 som ikke var helt klar, og som blev centrifugeret. En opløs ning af jern (f.eks. ferrichlorid) blev sat til den klare overliggende væske, således at det (bestemte) succinyleret protein/Fe3+-vægtforhold var ca. 10:1.

DK 159824 B

12

Opløsningens pH-værdi faldt til 2,6, hvilket gav et bundfald, der blev renset på samme måde som i de foregående eksempler.

Det faste stof, der blev opnået ved frysetørring af den færdige opløsning, dialyseret mod vand, havde egenskaberne og 5 jernindholdet, som er anført i tabel I.

Eksempel 7

Fremstilling af jernderivater af succiny1erede sojaproteiner.

10 5 g sojaproteiner blev suspenderet i 100 ml vand indeholdende 3 g NaHC03. Blandingen blev omrørt indtil fuldstændig opløsning, idet pH-værdien blev holdt mellem 7,5 og 8 ved tilsætningen af NaOH, og 2,5 g ravsyreanhydrid blev tilsat i form 15 af efter hinanden følgende portioner. Blandingen blev omrørt i 2 timer ved omgivelsernes temperatur og indstillet til en pH-værdi på 3,4 ved tilsætningen af mineralsyre, hvorved der blev dannet et bundfald, der blev renset på samme måde som i de foregående eksempler. Den fast rest fra den sidste frysetørring 20 blev suspenderet i 100 ml vand, pH-værdien blev indstillet til 8 ved tilsætningen af soda, og opløsningen, som ikke var fuldstændig klar, blev derpå centrifugeret.

Den klare overliggende fraktion blev behandlet med en jernop-25 løsning (f.eks. ferrichlorid), således at forholdet succinyle-ret protein/Fe3+ var 10:1 efter vægt.

Opløsningens pH-værdi faldt øjeblikkeligt til 2,6, og der dannedes et bundfald, der blev behandlet på samme måde som i de 30 foregående eksempler. Det faste stof, som blev opnået efter frysetørri ngen til sidst, havde egenskaberne og jernindholdet som er anført i tabel I. Udbyttet med hensyn til det oprindelige protein var 22%.

35 Kemisk-fysisk karakterisering af jernderivaterne ud fra suc- cinylerede proteiner opnået i overensstemmelse med eksemplerne 1 - 7:

DK 159824 E

13

De i overensstemmelse med de ovenfor anførte eksmpler opnåede derivater blev analyseret ved hjælp af de neden for anførte metoder: 5 a) Succinyleringsgrad.

Denne egenskab blev udtrykt som en procentdel af de succinyle-rede grupper med hensyn til grupperne i det oprindelige protein, der kan succinyleres. Den af S. Moore & W. H. Stein be-10 skrevne metode, J. Biol. Chem., 211, 907, 1954, blev anvendt og omfatter reaktionen af de frie amingrupper med ninhydrin. Resultaterne er anført i tabel I.

b) Jernindhold.

15

Jernindnoldet blev bestemt enten efter varm ekstraktion med 2N HC1 eller efter fuldstændig digestion af proteinet ved hjælp af svovlsyre, som beskrevet i Standard Methods, 14. udgave, 1975, p. 208, APHA-AWWA-WPCF {reaktion med o-phenanthrolin).

20 Værdierne er anført i tabel I.

c) Spektroskopiske data.

1) EPR-spektroskopi .

25 EPR-spektret af det i overensstemmelse med eksempel 1 fremstillede succinylferroproteinderivat blev aftegnet. Spektret blev optaget i frysetørret pulver og havde et meget bredt signal centreret omkring g = 2,0 med en signalamplitude på ca.

30 2.000 G. Et yderligere velopløst signal fandtes og var også centreret omkring g - 2,0. Formen af begge signaler var karakteristisk for reagerende Fe3+ paramagnetiske centre (F. Reid et al., Inorg. Chem. .7, 119, 1968). Alle disse data viste nærværelsen af proteinstrukturer; lukket omkring bindingsmid-35 let. De andre succinylferroproteiner har til svarende spektre.

2. Cirkulær dikro isme.

DK 159824 B I

) i

14 I

j

Det cirkulære dikroismespektrum af det i overensstemmelse med eksempie 1 opnåede succinylferroproteinderivat blev aftegnet. j

Spektret var karakteriseret ved negativ aktivitet i UV-zonen. j

Dette viste et intenst negativt bånd med et maksimum omkring j 5 200 nm, og en skulder, ligeledes negativ, centreret omrking j 225 nm. Disse spektral-karakteristika viste dominansen af en j "tilfædig" (random) -proteinstruktur (bl.a. F. Ciardelli & P. Salvadori - Optical Rotatory Dispersion and Circular Dichrosim - Heyden & Son Ltd., London, 1973 - Chapter 4,5). De andre 10 succinylferroproteiner har tilsvarende spektre.

3. UV-synlige absorptionsspektre.

Fig. 1 viser det UV-synlige spektrum for succinyIferroprotein-15 derivatet fremstillet i overensstemmelse med eksempel 1.

«

Spektret (kontinuert linie) viser ikke absorptionsmaksima, men kun en meget svag skulder omkring 450 nm. Under UV var der en svag defineret skulder centreret omkring 270 nm og en meget 20 intens absorption med et maskimum under 220 nm.

Fig. 1 viser også (punkteret linie) spektret af ferritin fra hestemilt, som en sammenligning (Boehringer-Mannheim).

25 Absorptionsspektrene i det synlige område er vist i f i g - 1 og blev gennemført i vand, pH 7. Spektret af hestemi 1tferri tin under de samme betingelser er også anført til sammenligning (Boehringer-Mannheim). De andre succinylferroproteiner har tilsvarende spektre som spektret for forbindelsen ifølge ek-30 sempel 1.

4. F1uorescerende emissionsspektrum.

De f1uorescerende emissionsspektre er anført i fig. 2, hvor 35 den kontinuerte linie svarer til succiny1ferroproteinderivaterne ifølge opfindelsen, den stiplede linie svarer til lac-toproteiner, som sådanne, og den punkterede linie til de suc-cinylerede lactoproteiner.

18

DK 159824 B

Undertrykkelse af fluorescensen af proteinet på grund af nærværelsen af metal kan ses.

d) Elektroforese.

5

De elektroforetiske spor på celluloseacetat af forskellige derivater i sammenligning med de succi ny1erede proteiner, de oprindelige proteiner og ferritin er anført i fig. 3-6.

10 15 20 25 30 35

DK 159824B

16

Fig. 3 viser resultaterne af elektroforese gennemført på sojaproteiner (spor 1), succinylerede sojaproteiner (spor 2), jernderivat af succinylerede sojaproteiner (spor 3), jernderivat af ikke-succinylerede sojaproteiner, opløselig fraktion (spor 4). Fig. 4 viser resultaterne af elektroforese gennemført på ovalbumin (spor 1), succinyleret 5 ovalbumin (spor 2), jernderivat af succinyleret ovalbumin (spor 3), jernderivat af ovalbumin (spor 4).

Fig. 5 viser resultaterne af elektroforese gennmført på lactoproteiner (spor 1), succinylerede lactoproteiner (spor 2), jernderivat af succinylerede lactoproteiner 10 (spor 3), hestemiltferritin (spor 4). Fig. 6 viser resultaterne af elektroforese (densitometrisk aflæsning ved 550 nm) gennemført på jernderivatet af succinylerede lactoproteiner (kontinuert linie), jernderivatet af succinylerede sojaproteiner (stiplet) og jernderivatet af suc-15 cinyleret ovalbumin (punkteret).

e) Gelfiltrering.

Gelfiltreringsprofilet på "Sephadex" G 75 (Pharmacia, Uppsala) af jernderivatet af de succinylerede mælkeproteiner (opnået som beskrevet i eksempel 1) i sammenligning med de suc-20 cinylerede proteiner selv er vist i fig. 7, hvor den kontinuerte linie refererer til succinylerede lactoproteiner, den punkterede linie til det tilsvarende jernderivat. Ordinaten viser adsorption ved 280 nm, og abscissen det progressive tal af opsamlede fraktioner. Det kan ses fra pro-25 filet at nærværelsen af jern giver et enkelt maksimum med en retentionstid svarende til søjlehulrummets. Når man husker at den molekylære eksklusion af "Sephadex" G 75 er ca. 75.000 Daltons, er den tilsyneladende minimale molekylvægtsværdi af dette aggregat større end denne værdi.

30 Desuden blev der på en anden måde konstateret en dobbeltspids med større randomisering med de succinylerede proteiner. Denne faktor blev også observeret i elektroforese (fig. 5). Denne type opførsel viser at det tilstedeværende

DK 159824 B

17 jern er et fokus af intermolekylær aggregation af protein-mediet. Yderligere data blev uddraget fra filtergelen på "Sephadex" G 200 i sammenligning med ferritin (fig. 8,-hvor abscissen og ordinaten er som i fig. 7, medens den 5 kontinuerte linie svarer til jernderivatet af succinylerede lactoproteiner, og den punkterede linie svarer til ferritin opnået ud fra hestemilt). Ligeledes i dette tilfælde var spidsen eller maksimet utvetydigt, medens retentionstiden var større end for ferritin. Dette synes at vise, at 10 den tilsyneladende molekylvægt er lavere end for ferritin fra hestemilt.

f) Stabilitet i mavesaft.

Dette forsøg blev gennemført på det i eksempel 1 opnåede jernderivat og blev gennemført ved, at opløse 25 mg af 15 derivatet i 0,5 ml destilleret vand og ved at sætte denne opløsning til 5 ml mavesaft fra en rotte. Der blev opnået et bundfald, og suspensionen blev inkuberet ved 37°C i 60minutter under omrøring. Efter dette tidsrum blev bundfaldet skilt fra ved centrifugering, og den overliggende 20 væske blev analyseret med hensyn til jernindhold. Jernmængden afgivet til mavesaften var 1% af den samlede mængde i begyndelsen.

g) Udfældning af jernderivatet med ammoniumsulfat.

30% (w/v) ammoniumsulfat blev sat til en 10% opløsning (w/ 25 v) af det ifølge eksempel 1 fremstillede jernderivat. Et bundfald af proteinderivatet af jernet blev opnået og havde egenskaber svarende til begyndelsesegenskaberne heraf, og det var stadigt opløseligt i vand. Der indgik ikke jern i opløsningen.

30 De ovenfor anførte data viser, at de succinylerede proteiners kompleksdannelsesevne med hensyn til jern ikke blot er typisk DK 159824 B j 18 i ! for succinylerede mælkeproteiner, men er karakteristisk for succinylerede proteinderivater af forskellig oprindelse og fysiologiske funktioner, det være sig animalske eller vegetabilske.

5 Som nævnt ovenfor er mange animalske eller vegetabilske proteiner af en ikke-modificeret type velegnet til binding med jern. Når ikke-modificerede mælkeproteiner, ovalbumin, sojaproteiner, serumproteiner, organekstraktproteiner (lever) omsættes med jern under de beskrevne betingelser til frem-10 stilling af de tilsvarende succinyl-protein-derivater fås et produkt med lignende jernindhold, men med helt andre opløseligheds- og stabilitetsegenskaber. Som det er vist i tabel 1 giver f.eks. sojaprotein et slutprodukt som efter frysetørring er uopløseligt udover 75% og afgiver sit jern 15 ved behandling med mavesaft. Foruden kompleksdannelsestilførslen med hensyn til jern tilskrives opførslen af de .succinylerede ferro-proteinderivater ifølge opfindelsen (dvs. opløselighed i alkalisk medium, stabilitet i et surt medium og i nærværelse af mavesaft, selv ved høje jern-20 indhold) ikke basi-sproteinerne og kan derfor ikke forudses.

Toksicitet.

a) akut toksicitet blev afprøvet oralt i schweizermus ved hjælp af mavesonde med hensyn til ferrosuccinylproteinet af mælkeproteiner opnået ifølge eksempel 1, med destilleret 25 vand som bærer. LD^Q-værdien var over 4.000 mg/kg.

b) toksiciteten under gentagen administration af det samme derivat ifølge eksempel 1 (angivet nedenfor som ferrolat) i rotter, per os, blev optegnet i 20 dage med vedvarende behandling af Wistar-hanrotter med en begyndelsesvægt på 30 200 g, anbragt i bur 14 dage før behandling og derpå op delt i tilfældige grupper på 10 (gruppe I: kontrol, II, 19

DK 159824 B

III og IV ferrolat ved 30-100-300 mg/kg/diæt).

Præparatet, opløst på anvendelsestidspunktet i destilleret vand, blev dagligt administreret uden ophold på samme tidspunkt hver dag ved hjælp af en sonde. Kontroldyrene fik 5 et tilsvarende volumen ledningsvand (10 ml/kg). Under behandlingen blev rotterne vejet dagligt, før administration, og overvåget i adskillige timer efter produktets administration. Fødeindtagelsen blev målt efter behandlingens afslutning, og 24 timer efter den sidste administration 10 og efter en faste på 20 timer blev rotterne bedøvet med ether og aflivet ved udskæring af carotidet. En del af blodet blev opsamlet 1 prøverør indeholdende EDTA (2 dråber af en 4% opløsning) og resten blev henstillet som serum. Hæmokromocytometriske undersøgelser blev gennemført på total-15 blodet, og hæmatokemiske undersøgelser blev gennemført på serumet.

Resultater.

Ændringer i vægt og fødeoptagelse.

Fig. 9 viser vægtforøgelseskurverne opnået under behandlingen 20 indtil dagen forud for aflivningen.

Tabellerne II og III viser værdierne som svarer til vægtforøgelsen og dyrenes foderindtagelse under behandlingen.

Vægtforøgelseskurven for den rottegruppe, der blev behandlet med ferrolat med en dosis på 300 mg/kg, viser sig at være 25 signifikant dæmpet med hensyn til vægtforøgelseskurven af kontrolgruppen af rotter fra 15. dag efter behandlingens start; den samme rottegruppe indtog gennemsnitligt mindre foder (-11,7%).

DK 159824 B

20

Små forskelle som ikke er signifikante ud fra et statistisk synspunkt, kan ses med hensyn til de resterende grupper af rotter behandlet med ferrolat.

Hæmatologiske undersøgelser.

5 Resultaterne er vist i tabel IV.

Hæmatokemiske undersøgelser.

Resultaterne er vist i tabl V. Et svagt fald i den alkaliske phosphotase blev set i rotterne behandlet med ferrolat, 300 mg/kg/diæt.

10 Urinundersøgelser.

Resultaterne er vist i tabel VI.

Organundersøgelser.

Tabel VII viser de absolutte gennemsnitsvægte af de væsentligste rotteorganer, og tabel VIII de tilsvarende gennem-15 snitsvægte svarende til legemsvægten.

En signifikant forøgelse i den relative vægt af milten og lungerne blev set i den grupper rotter, der var behandlet med ferrolat 100 mg/kg/diæt. Foruden en signifikant reduktion af legemsvægten blev der observeret en signifikant 20 forøgelse af gennemsnitsvægten af testiklerne i den gruppe rotter, der er behandlet med ferrolat 300 mg/kg/diæt.

Hæmatiske koncentrationer efter oral administration.

a) Ferrolat-ferrosulfatsammenligning.

Wistar-hanrotter, der vejede ca. 200 g og fastede i 18 timer, 21

DK 159824B

blev udtaget, randomiseret og delt i 5 grupper. Hver gruppe blev aflivet på det bestemte tidspunkt og blod udtaget fra hvert dyr ved at udskære carotidet; jernmængden i blodet af hvert dyr i gruppen blev bestemt spektrofotometrisk 5 ved hjælp af bathophenanthrolinsulfonsyre (Fe-test, Wako). Administrationen blev gennemført ved hjælp af en sonde i en vandig opløsning (5 ml/kg). Succinylferroproteinderivatet, der var blev anvendt, blev fremstillet som i eksempel 1 (ferrolat). Doser og resultater er vist i tabel IX. Det 10 kan ses, at mængden af jern/kg var den samme for begge derivater (Fe: 1 mg/kg).

b) Ferrolat-ferritinsaromenligning.

Wistar-hanrotter, der vejede ca. 200 g og fastede i 18 timer, blev udtaget, randomiseret og delt i grupper på 9. Hver 15 gruppe blev aflivet på det bestemte tidspunkt og blod udtaget fra hvert dyr ved at resektere carotidet. Jernmængden i blodet af hvert dyr i gruppen blev bestemt spektrofotometrisk ved hjælp af den jernkolorimetriske metode (Boeh= ringer-Mannheim). Administrationen blev gennemført ved hjælp 20 af en sonde i en vandig opløsning (5 ml/kg). Doser og resultat er vist i tabel X. Det kan ses, at mængden af jern/ kg for succinylferroproteinderivatet angivet som ferrolat var mængden af ferritin (Sigman, St. Louis, Missouri) og lig med 1 mg/kg.

25 c) Sammenligning mellem succinylferroproteinderivater opnået ud fra forskellige proteintyper.

Wistar-hanrotter, der vejede ca. 200 g og fastede i 18 timer, blev udtaget, randomiseret og delt i grupper på 5 (1 pr. derivatdosis og 1 kontrolgruppe)· Hver gruppe blev aflivet 30 2 timer efter administration og ved resektering af carotidet blev der udtaget blod fra hvert dyr og jernindholdet i blodet blev bestemt ved hjælp af bathophenanthrolinsulfon-

DK 159824B

22 syre (Fe-test, Wako). Den orale administration blev gennemført ved hjælp af en sonde i en vandig opløsning (5 ml/kg). Doserne af de enkelte derivater, der blev anvendt, blev udvalgt således, at der altid blev indgivet 1 mg/kg Fe.

5 Afprøvede produkter: 1) Succinylerede sojaproteiner + Fe, (4, 42%), 2) succinyleret ovalbumin + Fe (3, 57%), 3) succinylerede bovinserumproteiner + Fe (5, 78%), 4) succinylerede mælkeproteiner + Fe (4, 5%) (ferrolat).

Resultaterne er vist i tabel XI.

23

DK 159824 B

TABEL I

PROTEIN- SUCCINYLEEING Fe UDBYTTE OPIØSELIGHED

-S™ (% af grupper, , (¾ af sue- ved ξ) der kan sucT (væ^%) hyleret I* > 5 __cinyleres)_protein)_'

IteLk a) 95 6,7 30 ♦ - " ^ " 4.6 20 ♦ C) ·' 3.2 IS * " M 2,S 18 ♦ " " 0,3 13 ♦

Lactoproteinsr 95 4^5 +

Ovalbumin ·. 95 3,6 33 + CO +

Serum proteiner a? < (bovine) U'3 ^ + ” (Soja) 92 4.4 22 + (Organ) n.a· 8,4 n.a. + ~ (Lever) ivtolk 35 4*3 26 *

Lactoproteinsr O 4,8 . 17f 7

Ovalbumin 0 i 0.4 M.s

Soya 0 j 0,4

Serum proteiner 0 °*5 + ~ ( bovine) · (Organ) O na. n.a.

(lever)__·__.

3+ a) b) c), d), e) prøver med vaegtforhold Fe :succmylerede proteiner mellem o, 1:10 og 1/5:10 f) fialdstændig(+) 5 partiel (+ -); uopløselig (-)

DK 159824B

TABEL II

24

VfflGTEORØGELSE

BEHANDLING GENNEMSNITS- GENNEMSNITS- VÆGTFORØGELSE

me/kg/diæfc X®GT7I BE- 3ÆEGF TIL

__sim . atmr+se ' Kontrol 224,10*2.83 343,60*8,87 119.50*7.66 4

Ferrolat % 224.40+3,03 325*50+4.56 101,20+4.3S

Ferro lat 10C 224.40+2.30 326,10+8,06 101* 7()+8.08

Ferrolat 300 224.30+3.71 307^00+10,15 8^77+8,28 x p< 0 05 k p<0 01

Signifikant med hensyn til kontrol (beregnet med Student's •t')

TABEL III

N@INGSPQEBRUG__ RFTTaMnr.TH^ SAMLET GENNET* Variation BEHANDLING SNITSF0R- \ mg/kg/di BRUG_;_ kcQtrol 32,33

Ferrolat 50 30,42 - 5.91

Ferrolat 100 30*98 - 4.18

Ferrolat 30 0 28 *54__· -11.72

tabet. IV

HffiMATOLOGISKE DATA ---- BEHANDLING__Eig/kg/diaet__ kontrol. Fermi et 30 ferrolati00 ira^iat^1 Hæmoglobin 12,11*0,47 11,77+0.37 112.39+0,30 12,93+0.25 Hæmatocrit; % 66,88+2,06 61,44+1.96 66.90^2,77 64,16+1.80

Leucocyte. 103/ ; 16.95+2.25 16.55+1*65 23.46+2,16 19.93+2.58

Erythrocyte ‘ 5.76+0.51 6.12+0.58 5.91+0.6S 6.22^).31 lO^mm^

DK 159824 B

25

TABEL V HÆMATOKEMISKE DATA

BEHANDLING rng/kg/dist — --— . - - — - - - f

Kontrol Ferro lat *0 Eerrolst "IOCFerrolat 500

Glucose mg/100 ml 55.33+5-75 52.81+4,38 63-61+5,53 60.74+4-37 .Azotemia /inn , 32-73+1,33 34,59+2. ZS ' 28--68+2-34 32.33+2.S2 mg/100 ml — — — — C-OT 110/51+7,10 130-81+8^59 109.09+5,21 113-36+7.29 mE/ml G?T 19,.58+1,52 26-86+3.43 30-14+6.02 23.15+2,57 mE/ml

Alkalir.sk x phosphatase 2S5,65+13,32 229-53+17-03 257-53+22,35 213,80+12,72 mE/ml protein ialt 6.19jj0.12 6,02jK3-17 6.37+0.12 6.21+0-16 g/100 ml

Signifikant x p<0.05 xx p<0«01 xxx p<0,001

DK 159824B

26

TABEL VI ORINUNEERSØGELSE

BEH&NDLING mg/kg/ d. jast

Kontrol Ferrolat 30 Ferrolat lOCpeiirpiat 30Q pH 8»15jPcl7 8e55^0*14 8#40Κ)*18 8*SO<>,12 XX χ proteiner 21#-*3 #78 24.-+3,05 63#- +12# 47 S3#33^11#66 mg/dl

• glucose NUL NUL NUL NUL

— _;______

keton legemer ^UL NUL NUL

bilirubin NUL NUL NUL NUL

1 ' _

o lod . NUL NUL NUL NUL

cigrififcånt' x p< o#os xx p<0#01 xxx p <0*001

TABEL VII

27

DK 159824 B

ABSOLUT FRISK VEGT AF KOTERNES ORGANER

_RKRAwm.TNG_mg/kg/diæt_ __ Kontrol Ferrolat qO Ferrolat ΊΟ(Ferrolat *00 LEGEMSVÆGT * g 310.60+7.53 300,33+3,64 296.8+6.16 278.44+8.89 ' 5?fri| 1,15+0,05 i;i0+p»05 1,14+0,04 1,09+0,07

EungSSC g 1.55+O.OS 1,20+0.20 1.68+0*05- 1,57+0.12

Lever g 9‘. 14+0.35 ' 5.89+0.3S 8-78+0-28 8,35+0.44

Milt- g Γ. 38+0,13 1.36+0.08 1,65+0,12 1,37+0,09 i ___________ ______ • $yre g 2.2Z+O.Q2 Z. 21+0.09 2,22+0.08 2,09+0,10

Surrenalgk±rtler 50.30+4. SS 5$, 33+7,69 51.80+6.07 37>44+5»56 fjerne g 1,77+0.03 . 1.70+0,03 1.67+0.05 1,68+0.06

Ir ^^ g 3.30+0,05. 3,12+0,10 3.03^0.16 3*25+0.07 " — I. Ill I . . αΜΗΜΜΜηΜΜ· g 1» 77:+0.09 1.77+0.05 1.75+0.07 1-53+0.09

Signifikant x p<0.05 xx p <0.01 XXX p ¢0.001

TABEL VIII

28

DK 1 59824 B

RELATIV FRISK WGI AF ROTTERNES ORGANER

_BEHANDLING_mg/kg/diæt_ _Kontrol Ferrolat 30 Ferroj-at i 00 Ferrolat 300 x LEGEMSVÆGT 310,60+7.53 300.35+3«64 296,.80+6 r16 278.44+8,89

Hierte % 0.37+0.01 0.-37+0*08 0.39+0.09 0.39+0^02 m ·%

Lunger i 0,50+0.02 0.56+0.06 · 0*57+0.02 0*57+0*06

Lever $ 2.94+0,04 2.9,6+0.10 2;96+0*06 2.99+O.OS

mit % 0.445>.03 0,45+0.03 0*565*04 0,49+0,03

Nyre % 0.735).01 O.745D.O2 0.755),03 0.755).02

Surranal kirtler % O.OI65D.OOI O.OI953.OO3 0.0175).002 O.OI453.OO2

Hjerneå 0,5753.02 0,5753.01 0.5753.02 0,60+0.01 , " i " -% 1,06+0.02 L'045.03 1,0453.05 l.lS+0,04

Mave % O.S653.O2 0.59+0*02 Ο.5955.Ο2 0*54+0.02 __1 _L_I_

Signifikant X p<0.05 p<0«01 w ρζΟ.ΟΟΙ

DK 159824 B

29

TABEL IX

'· HffiMATISKE KONCENTRATIONER: SAMMENLIGNING FERRØLAT - FERROSULFAT

Se rom jemp^ BEHANDLING timer efter behandl ing, _ 30' 1 2 4 6

Kontrol HOS ml/kg 99»22 59,91 98.,25 80« 17 74,- 2 +24,92 ♦ 6,35 +13,28 +6,37 + 10,10 (S) " (S) “ (5) “ (S) ~ CS) • Ferrolat 22»37 mg/kg 22727¾ 26¾ 2θ5?1ό 14§?18 +16,40 +18,91 +22,51 +27,74 +16-73 (5 mlAg = 1 mg FeAg) “ (5) . (5) " (S) ” (S) ~ (Sj

XXX XXX XXX XXX

FeSO 7H 0: 4198 mg/kg 336,27 272,14 273-56 129»50 80,52 4 2 +27,79 +24.09 +19.32 +6,21 +S.65 (5 ml Ag = 1 mg FeAg) “ (5) " (S) ” (5) (S) CS)

Significant med hensyn til kontrol: x p<0,GS xx p<0.01 xxx p <0,001

Signifijcant af de to jern præparater: 30'sp <0.01; 4h: P <0.057 6h: p<0-01

TABEL X

HÆMATISKE KONCENTRATIONER: SAMMENLIGNING FERROLAT - FERRITIN

BEHANDLING Se run jem j1g/100 timer efter behandling .

1 2 4 ' o

Ferritin (F-4S03 Signa 168.79 χ70.66 148.08 89-22 fortynding 1,081 v/v, +1S.3S +14.70 +18.69 +12.75 (5 mlAg = 1 mg FeAg) ~

Ferrolat 21 Λ6 mg/kg ^07 269Λ1 223 72 106.24 (5 mlAg = 1 mg FeAg) +15.59 +29-94 +18 SI +11-30 ·

XXX

kontrol, destilleret vand 80+40 5 ml/kg +6+39 **_ i _____ P<0f0S Signifikant beregnet med Student "t" med xx P < 0,01 hensyn til ferritin.

XXX piO.OOl

DK 159824 B

30

TABEL XI

BLODKONCENTRATION: SAMMENLIGNING MELLEM SUCCINYL FERROPROTEINER OPNÅET UD FRA FORSKELLIGE PROTEINTYPER.

serun jern ir. }ig/100 si BEHANDLING gennemsnitsværdi SE

K ontrol S3, 99+7 * 56

Succ. soya 260. 63+29. 52***

Succ. ovaluunin 255* 82+5^6. 06*

Succ. serum protein 277* 65+4-9. 35**

Eerrolat 305* 81+23. 20***

Signifikant med hensyn til kontrollen * pCO.Oy ** p<0.01 *** p<0.001

Claims (1)

1. DK 159824 B Patentkrav. Analogi fremgangsmåde til fremstilling af succinylferroprotein, 5 kendetegnet ved, at et succinyleret protein bringes til at reagere med jernsalte i et vandigt medium ved en pH-værdi mellem 7,5 og 8, og at det opnåede produkt isoleres ved udfældning ved en pH-værdi af størrelsesordenen 2-4, idet sidstnævnte pH-værdi frembringes spontant eller ved hjælp 10 af syrning, eller at pH efter reaktionen justeres til ca. 7, og opløsningen dialyseres mod vand og derefter frysetørres eller sprøjtetørres. 15 (J 20 25 30 35