JPH01146900A - 鉄含量が高い可溶性ポリペプチド誘導体とその製法及びこれを含有する製薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は鉄を０．１〜４５重量％含有するポリペプチド
誘導体であって、中性又は塩基性ｐＨで高い溶解性を有
し、酸性ｐＨでは不溶性で、しかも哺乳動物への経口投
与に完全に耐えられるところの極めて優れた鉄損体であ
ることが証明されたポリペプチド誘導体に関する。

本発明はまた。上記のポリペプチド誘導体とアルカリ及
び／又はアルカリ土類金属並びに製薬上許容される有機
塩基との塩に関する。

さらに１本発明は前記の誘導体及びその塩の製造法と、
これら誘導体及び／又はその塩を含有し、ヒト又は動物
用の製薬組成物の製造法に関する。

ヒト及び動物のような生体において、鉄はヘモグロビン
及びその他の酵素の如き成分を形成するうえで１重要な
役割を演じている。

鉄欠乏の病理学的兆候は、低色素性で鉄欠乏性の貧血で
あって、この貧血の原因は失血、腫瘍形成、吸収不足な
ど様々である。

鉄欠乏性貧血の経口治療は、無機塩、有機塩又はコンプ
レックス誘導体で行われるが、この治療はしばしば胃腸
障害、下痢及び嘔吐のような副作用を伴う。

本件出願人の出願に係るイタリア国特許第１１５０２１
３号には、動物性又は植物性蛋白質を様々な度合でスク
シニル化したスクシニル化蛋白質と鉄■イオンとの相互
作用で誘導された鉄含量が０．１〜２０重量％である高
分子蛋白誘導体が記載されいるが、溶解性や生化学的特
性に関係する高濃度物については、鉄損体としての生物
学的利用能及び副作用の有無が示されなければならない
、事実、鉄含量が２０重量％を越える上記特許の誘導体
は、如何なるｐＨ値でも（塩基性、中性及び酸性）不溶
である。

さらに、鉄含量が約１０％以上の当該誘導体は、製薬学
的用途に適当な濃度の溶液とした場合、使用が困難な程
高粘度になる。従って、商業的に入手可能な医薬は、鉄
含量が５〜６重量％の前記公知化合物〔以下これをＦａ
ＳＰ（Ｆｅ−５ｕｃｃｉｎｙｌ−ａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ）と言う〕を使用する。

今、驚くべきことに、前記の誘導体をプロテアーゼで適
当に加水分解すると、鉄含量が上に示した範囲よりかな
り高い化合物が得られ、このものは最適な溶解性と生化
学的特性を示すことが見出された。この化合物は塩基性
及び中性媒体に可溶で、酸性ｐＨ値で不溶である。この
うち第１の特性は、鉄を胃十二指腸レベルで最適に吸収
させるうえで、また腸障害及び下痢作用（これはフリー
の鉄に関係し、フリーの鉄は中性及び塩基性ｐＨ条件下
で刺激性の高い不溶性水和酸化物を生成する）を回避す
るうえで、必須である。また、酸性媒体で不溶性である
ことは、胃中での鉄イオンの放出を防止し、結果的に胃
に障害をもたらさない、さらに、高濃度で鉄を含有する
当該新規誘導体の溶液は、効能度でもその粘度は極めて
低い。

そして、採用する加水分解条件下では、加水分解に付さ
れる出発誘導体の絶対鉄含量に、実質的な変化が起らず
、その鉄含量はそのまま最終生成物に持ち越されること
も見出された１例えば、５重量％の鉄を含む誘導体を加
水分解すると、約１０重量％の鉄を含む生成物が回収さ
れ。

反応媒体中にはフリーの鉄も沈澱した鉄も認められず、
存在が認められるのはペプチド残渣だけである。

鉄を含有するポリペプチド誘導体を調製する本発明の第
１の方法は、鉄スクシニル蛋白質の溶液又は懸濁液（Ｆ
ｅ含量に依存しない）を、適当なｐＨ及び温度条件下に
、純粋な又は混合プロテアーゼで処理し、得られた誘導
体を酸性化（酵素又はその自己加水分解生成物が溶解す
る条件）した後、中性ｐＨで再溶解して再沈澱させ（再
沈澱は完全精製を目的とする）１次いで中性ｐＨで水性
溶媒を真空蒸発、凍結乾燥又は噴震乾燥で除去すること
により、最終固体生成物を取得することからなる。

上記と同様な誘導体は、鉄イオンをスクシニル化蛋白質
の部分的な酵素加水分解から得られる生成物と、ペプチ
ドのスクシニル化で得られ、スクシニル化の程度が異な
るスクシニル化ポリペプチドとの両方に作用させること
によっても調製することができる。この場合のペプチド
は動物性又は植物性蛋白質の一次加水分解で、あるいは
合成で導かれ、また、スクシニル化の程度が異なる範囲
は１元の蛋白質又はペプチドに存在するスクシニル化可
能な基の１０〜１００％がスクシニル化されてた範囲で
ある。従って、本発明の目的は。

ａ）イタリア国特許第１，１５０，２１３号に記載され
た鉄スクシニル蛋白質（ＦｅＳＰ）コンプレックスを、
適当なｐＨ及び温度条件下に、酵素で分解する、 ｂ）スクシニル化の程度が異なるスクシニル化蛋白質（
この蛋白質は動物性又は植物性のいずれでも可）の加水
分解で得られるスクシニル化ポリペプチドと鉄イオンを
相互にさせる、又は。

Ｃ）ポリペプチド（このポリペプチドは動物性又は植物
性蛋白質の加水分解又は合成で得られる）を、適当な条
件下に無水こはく酸又はスクシノイルモノクロライドと
反応させて得られるスクシニル化の程度が異なるスクシ
ニル化ポリペプチドと鉄イオンを相互に作用させる、の
いずれかの手段で得られる鉄含量が０．１〜４５重量％
の鉄−ポリペプチドコンプレックスを提供することにあ
る。

上記の誘導体は後記の実施例で実証される通り１次のよ
うに特徴付けられる。すなわち、当該誘導体は中性又は
塩基性水性媒体に極めて可溶であって、酸性媒体には不
溶である。また、この誘導体は哺乳類に経口投与した場
合、既に公知のＦａＳＰに比較して同じ鉄含量でも、よ
り効果的に鉄を放出する。そしてまた、この誘導体は溶
解度が高く、鉄含量も多く、その溶液が低粘度であるた
めに、薬剤調製により好適である。

実施例Ｉ Ａ）　Ｆｅ５Ｐの調製 上記した特許の手法に従って、１ｇのスクシニル化カゼ
インを２０ｍ１の水に溶解させ、２０園１のｐｅｃｌａ
水溶液を添加した（ＦｅＳＰに存在することが望ましい
鉄含量に応じて、Ｅｓｃ１ａ水溶液の添加量は１０〜３
０ｍｇ／ｍｌである）、生成した沈澱をｐＨ７゜２で溶
解させ、３．５より低いｐｉで再沈澱させて未反応の過
剰イオンを除去した。　Ｆｅ５Ｐを水に加え、ＮａＯＨ
を加えてｐＨを７．２にすることでこれを溶解させ、凍
結乾燥した。ナトリウム塩として得られたＦｅ５Ｐ（５
，５重量％の鉄含有）５００＋ａｇを、２０ｍ１の水に
溶かし、溶液のｐＨを７．５〜８．０に調節した。

Ｂ）酵素による分解 上記の溶液をトリプシンに加えて酵素対基質の比を１　
：　１０Ｇとし、酵素の比活性が蛋白質重量当り、　５
，０００　ＢＡＥＥυ／■ｇとした。加水分解は０、Ｉ
　ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを６〜１０．好ましくは
７．５〜８．５の範囲の一定値に保持しながら、０〜５
０℃（好ましくは２５〜３０℃）で行った６反応は約４
時間又はスタート時の酵素活性が約１／１０に減少する
まで続け、溶液を酸性化（ｐＨ２〜３）することで反応
と完了させた。赤褐色沈澱と上澄みが得られた。この上
澄みについて行った鉄分析では、痕跡程度（反応に存在
した全鉄の０．０５％未満）の鉄しか認められなかった
。

Ｃ）スクシニル化された鉄−ポリペプチドの単離 上記の赤褐色沈澱をデカンテーション（又は濾過若しく
は遠心分離）で回収し、ＨＣＩでｐＨ３とした水で洗浄
した。この沈澱を５■ｌの水に懸濁させ、ｐＨ値が確実
に７を越えるまで０．ＩＮのＮａＯＨを加えてこれを溶
解させた。これに塩酸を加えてｐＨを３にする酸性化で
、鉄誘導体を沈澱させ、濾過によりこれを回収した０次
いでこの沈澱を水に加え、ＮａＯＨでｐＨを７〜７．２
にすることで再溶解させ、凍結乾燥した。

こうして得られた生成物は、スクシニル化されたポリペ
プチド誘導体であって、Ａｒｚｎｅｉ■。

Ｆｏｒｓｃｈ、３４．　（Ｉｆ　）　、９，９４８−９
５２．１９８４年に記載されているようにＯ−フェナン
トロリンとの反応で鉄含量を測定すると、前記誘導体は
１０．２重量％の鉄を含んでいた。スクシニル化された
蛋白質に帰属するバンドの無存在を確かめるために、こ
の誘導体を電気泳動分析にかけ、さらにコンプレックス
中の鉄の原子価状態と、スクシニル化の程度を評価する
ために、ＥＳＲ分析にかけた。

ｍ　　この分析は酢酸セルロースの小片で行った。試料
を沈積する直前に、約５Ｍのトリス−トリシン緩衝液（
ｐＨ８，６）で予め処理した。

小片に４０Ｖ／ｃ園の一定電圧を３０分間与え、緩衝液
にトリス−トリシン（ｐ）Ｉ　８．６）を使用して電気
泳動を行った。電気泳動バンドをポンソーレッド（ｐｏ
ｎｃｅａｕ　ｒｅｄ）で染色して発現させた。試料につ
いて得られた実験結果は、ＦａＳＰに存在するスクシニ
ル化蛋白質のために、バンドがないことを示し、また可
動性の電気泳動バンドはＦｅ５Ｐのそれより高かった。

ＥＳＲ誘導体水溶液の９，０８３　Ｇに於けるＥＳＲス
ペクトルは、酸素原子によって結合された３価の鉄を含
む構造によって、　ｇ＝２．００４に中心を持つバンド
の存在を示゛した。

、＝ｔｔ＜　　　ｉ　　こはく酸含量は、スクシニル化
された鉄−ポリペプチド試料をＩＮ　ＨＣＩで処理し、
窒素雰囲気中、１００℃で１２時間６ＮのＨＣＩ（１０
飄ｌ）で加水分解して鉄を奪取することで放出されるこ
はく酸と、こはく酸チオキナーゼ（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｌｇ、第３巻、１６
１６−１６２１頁、Ｕ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　Ｅｄ、、
　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、１９７４年参照）との
酵素反応によって測定した。この反応により、試料中に
こはく酸が存在していることが確認された（含量は７．
５重量％）。

実施例２ 実施例１に記載したように調製されたＦｅ５Ｐ試料（１
０００ｍｇ）を５０ｍ１の水に溶解させ、　ＮａＯＨを
加えることでｐＨを７．８に調節した。この溶液にトリ
プシンとキモトリプシンとをそれぞれ基質に対して１　
：　１００の比又は０．０１：１００及び１０：１００
の比（１：１００の比が好ましい）で添加した（酵素の
比活性は５０００　Ｕ　ＢＡＥｔ！／−ｇ　トリプシ、
ン及び４０００　ＵＡＴＥＥ／■ｇキモトリプシンであ
る）、約２時間で反応を停止し、１５．４重量％の鉄を
含有するスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。この
ものは６．５以上のｐＨで水性媒体に容易に溶解する。

実施例３ ５％の鉄を含有するＦｅ５Ｐ試料（２０００ｍｇ）を２
００ｍ１のＮａＯＨに溶かして（最終溶液のｐＨ＝７）
　、実施例２に記載したと同様に処理した。

反応媒体から経時的にフラクションを抜き出し、これを
酸性化（ＨＣＩの添加でｐｉを約３にする）することで
加水分解を中断させた０次いで実施例１の工程Ｃ）に記
載したように、水性媒体中で再溶解することで、鉄を含
有する沈澱を精製した。

スクシニル化ポリペプチド試料の鉄含量を次表に示す。

第１表 １　　　１５　　　　　６　　　−０．８−３　　　１
２０　　　　　１１　　　−０．１−プロテアーゼの反
応時間を変えることにより、特定量の鉄を含有するＦｅ
５Ｐ試料から、所望量の鉄を含有するポリペプチド誘導
体が得られることが分かる。

実施例４ 回収してリサイクルされる固体マトリックスに支持させ
たトリプシン及びキモトリプシンを使用しても、実施例
１及び実施例２のようにスクシニル化された鉄−ポリペ
プチド誘導体を得ることができる。すなわち、５０００
−ｇの誘導体を水２５０■ｌに溶かしたＦｅ５Ｐ溶液を
ｐＨ８とし、トリプシン及びキモトリプシンが支持され
ている２０−１のセファローゼ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）
ゲルを含有する円筒状反応器にＦｅ５Ｐ溶液をリサイク
ルさせた。

この場合、支持されたトリプシンの比活性は４０００　
Ｕ　ＢＡＥＥ／１００＋ｅｇセフ　７０−ゼであり、キ
モトリプシンの比活性は２０００　Ｕ　ＡＴＥＥ！／１
００■ｇセファローゼであった。溶液はその粘度が最初
の粘度の１／１０に減少するまでリサイクルさせた。　
ｐＨ３に酸性化してスクシニル化された鉄−ポリペプチ
ド誘導体を回収し、これを実施例１のＣ）に記載したよ
うに精製した。得られた誘導体は１９．５％の鉄を含ん
でいた。

実施例５ トリプシン−キモトリプシンに代えてパンクレアチン（
他のプロテアーゼの一種）を酵素対基質の比５　：　１
００で使用し以外は実施例２の手順を繰り返した。

１４重量％の鉄を含有するスクシニル化鉄−ポリペプチ
ド誘導体が得られた。

実施例６ ＦｅＣ１，の添加を繰返し、各添加毎にｐＨを約７に再
調整して鉄含量２０％の誘導体を取得する以外は上と同
様な方法で調製されたＦａＳＰ試料１０００ｍｇを、２
０ｍ１の水に加えて激しく攪拌後、ＮａＯＨを加えて最
終ｐＨを７．８の一定にした。得られたゲル状懸濁物を
実施例２と同様に、トリプシン−キモトリプシン混合物
（酵素対基質の比３　：　１００）で２４時間処理した
。最終的に得られる溶液を塩酸で処理し、沈澱をｐＨ７
で再溶解し、塩酸でｐＨを３．２にして再沈澱させ、再
びｐＨ７で再溶解させることで精製後、凍結乾燥した０
分析の結果。

この誘導体は３６重量％の鉄を含有するスクシニル化ポ
リペプチド誘導体からなるものであった。

実施例７ ５．６％の鉄を含有するスクシニル化アルブミン試料を
、実施例２に記載した方法で処理した。

得られたスクシニル化ポリペプチドコンプレックスを実
施例１のＣ）に記載した方法で回収、精製した。このコ
ンプレックスは１２％の鉄を含有し、ｐＨ＞５で溶解性
を示した。

実施例８ スクシニル化アルブミンと鉄のコンプレックス（鉄１５
％含有）の試料を、実施例４と同様に。

トリプシン−キモトリプシン混合物で処理した。

２５％の鉄を含有し、ｐＨ＞７で水に溶解するスクシニ
ル化鉄−ポリペブチド誘導体が回収された。

実施例９ カゼイン試料を、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、２９゜５７８、１９５８年に記載された方法で
スクシニル化した。この誘導体を３０℃で約６０分間ト
リプシン及びキモトリプシン（酵素対基質比１：０．２
：１００）により加水分解した０反応ｐＨは７〜８とし
、ＮａＯＨを連続添加して常にこのｐＨを維持した０反
応完了後、ｐＨを３．２に調節し、沈澱（出発物質の約
４０％）を回収した。この沈澱についてアミノ酸分析を
行ったところ、塩基性及び中性アミノ酸の減少が認めら
れた。

このポリペプチド誘導体を濃度１ｇ／１０ｍ１でＮａＯ
Ｈに溶解させ（最終ｐＨ＝７）、ｐＨを７．８の一定に
保持しなからＦｅＣｌ３溶液（ポリペプチド誘導体１ｇ
当り１．５ｇ）と反応させた。　ｐＨを３．２に酸性化
することで沈澱を生成させ、この沈澱をｐＨ８で再溶解
して未反応の鉄を除去し、８Ｃ１で再沈澱させることで
、１８．２重量％の鉄を含有し、ｐＨ＞６．５で水に溶
解するポリペプチド誘導体を得た。

実施例１０ ３０００ｍｇの固体カゼイン（食事用酸カゼイン）をＮ
ａＯＨと共に水に溶解させて最終容積を５０菖ｌとした
。この溶液にトリプシンを加え（酵素対基質比１：１０
０）、混合物を３時間混合した。酸性化でｐＨを３．４
にすることで加水分解反応を停止□させ、遠心分離で不
溶性残渣を回収した。この残渣をアルカリ媒体（ＩＮの
ＮａＯＨ添加）に溶かし、最終ｐＨを７．６とした。　
２ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを７．６に維持しながら
、無水こはく酸を少しずつ添加した。

反応は室温で約２時間行った０反応媒体を２ＮのＨＣＩ
で酸性化（ｐＨ＝３．４）　Ｌ／、遠心分離することで
、反応媒体から生成スクシニル化ポリペプチドを回収し
、再溶解（ｐＨ＝８）、再沈澱（ｐＨ＝３．４）及び遠
心分離（毎回上澄みを除去）を繰り返すことで、過剰の
こはく酸を除去した０回収された生成スクシニル化ポリ
ペプチドをＮａＯＨと共に水に溶解した（最終ｐＨは７
．６の一定）、　ｐＨ７，６を維持しながら、この溶液
ｌこＦｅＣ１ａ溶液を、ポリペプチド誘導体１ｇ当り１
．５ｇの割合で添加した。酸性化によって鉄を含有する
沈澱を生成させ、これを上記の実施例と同様にして精製
し、Ｐ）ｌ）６．５で水によく溶けるところの、１７．
５％の鉄をスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。

実施例１１ ５００ｍｇ（１りポＩＪ　ＩＪジ：／　（ＭＶ＝１７０
００　Ｄ）を上記ノ実施例と同様な方法でスクシニル化
した。但し、ポリリジン対無水こはく酸の重量比は１：
２とした。蒸留水を用いた透析でスクシニル化ポリリジ
ンを精製し、凍結乾燥した。スクシニル化で得られたこ
の誘導体（スクシニル化度８０％以上）をＦｅＣｌ３水
溶液（２５ｓ＋ｇ／醜１溶液）と反応させた。

得られた沈澱から過剰の鉄イオンと塩を透析濾過で除去
することにより、　１８重量％の鉄を含有し、水によく
溶ける最終生成物を得た。

実施例１２ スクシニル化大豆蛋白質の鉄コンプレックス（鉄含量７
％）を使用した以外は実施例２の方法を繰り返した。こ
れにより１６％の鉄を含有するポリペプチド誘導体が得
られたが、このものは出発物質である蛋白質誘導体より
も水によく溶解した。

スクシニル化　−ポリペプチドの経口　収スクシニル化
鉄−ポリペプチド試料の経口投与による鉄吸収を、ラッ
トで評価した。すなわち、当該誘導体を水溶液の形で、
体重ｋｇ当り元素状鉄１ｍｇに相当する投与量にてラッ
トに経口投与し、血清鉄レベルを経時的に測定した。第
２表に示す実験結果は、実施例１の方法で調製された誘
導体で処理したラット（Ｂ欄参照）、無処理のラット（
Ａ欄参照）及び出発物質であるところのＦａＳＰ　（加
水分解前の鉄含量５．２％）を投与したラット（Ｃ欄参
照）それぞれについての鉄含量を示している。

第２表 ０．５　　　　　９５　　２７０　　３２０上のデータ
は、スクシニル化鉄−ポリペプチドが対応するＦａＳＰ
より効率良く、鉄を血漿サイクルに与えられることを示
している。さらに、本発明によるスクシニル化鉄−ポリ
ペプチドは。

対応するＦａＳＰに比較して、許容性、溶解性及び粘性
に関して優れたものであることも強調できる。

本発明は含鉄治療（■ａｒｔｉａｌ　ｔｈｅｒａｐｙ）
に用いる試薬として、スクシニル化鉄−ポリペプチドを
使用することについての工業的な利用にも関係する。従
って、本発明の実質的な目的は、活性成分としてスクシ
ニル化鉄−ポリペプチド（又はその塩）を、予め決めら
れた治療に有効な量で、使用可能な通常の賦形剤と共に
含有する製薬組成物を提供することにもある。そして、
こうした組成物の例としては、単位投与量当り２０〜１
６０ｍｇの鉄に相当する量で鉄−ポリペプチド（又はそ
の塩）を含有する錠剤、糖衣錠、カプセル、シロップ、
バイアル（ｖｉａｌｇ）などを挙げることができ、これ
らは１日に１〜２回投与することができる。

特許出願人　イタルファルマコ　ニス、ピー、エイ。

手続補正書 昭和６３年１１月２１日 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　イタルファルマコエス、ピー、エイ。

代表者　フランチェスコ　デ　サンティス４、代理人 東京都千代田区麹町４丁目５番地（〒１０２）６、補正
の内容 明細書第６頁第１行の「胃十二指腸レベル」を「胃十二
指腸−腸レベル（中性−塩基性ｐＨ）Ｊｌと補正する。

以　　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約６．５より低いｐＨで水に不溶で、約６．５より
   高いｐＨで水に可溶な鉄−スクシニル化ポリペプチドコ
   ンプレックス又は当該コンプレックスとアルカリ金属又
   はアルカリ土類金属との塩又は当該コンプレックスと製
   薬上許容される有機塩基との塩。 ２、鉄を０．１〜４５重量％含有する請求項１記載の鉄
   コンプレックス。 ３、鉄を１０〜４５重量％含有する請求項１記載の鉄コ
   ンプレックス。 ４、請求項１〜３記載のコンプレックスを活性成分とし
   て含有するヒト及び獣の含鉄治療用製薬組成物。 ５、単位投与量当り２０〜１６０ｍｇの鉄が結合したス
   クシニル化ポリペプチドコンプレックスを含有する請求
   項４記載の製薬組成物。 ６、スクシニル化蛋白質と鉄とのコンプレックスを１種
   若しくはそれ以上の蛋白質分解酵素で、６〜１０の一定
   ｐＨに保持しながら温度０〜５０℃の条件下に、所望の
   鉄含量のスクシニル化ポリペプチドコンプレックスが得
   られるまで、酵素で分解し、その生成コンプレックスを
   透析濾過及び凍結乾燥によって回収するか、あるいは反
   応混合物を不溶物があればこれを濾別後、ｐＨ２〜３．
   ５に酸性化し、得られた沈澱を中性又は塩基性ｐＨで水
   性媒体に再溶解し、その水溶液から公知の方法により生
   成コンプレックスを回収することからなる鉄−スクシニ
   ル化ポリペプチドコンプレックスの調製法。 ７、酵素による分解を７．５〜８．５のｐＨ及び２０〜
   ３０℃の温度で行う請求項６記載の方法。 ８、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンか
   らなる群から選ばれる酵素を使用して分解を行う請求項
   ６又は７記載の方法。 ９、酵素対基質の重量比を約１：１００として酵素によ
   る分解を行う請求項６〜８記載のいずれかの方法。 １０、ｐＨ７〜８で鉄イオンをスクシニル化ポリペプチ
   ドと反応させ、得られた沈澱を請求項６記載の方法で単
   離する請求項１〜３記載の鉄−スクシニル化ポリペプチ
   ドコンプレックスの調製法。 １１、スクシニル化蛋白質の酵素による分解で得たスク
   シニル化ポリペプチドを使用する請求項１０記載の方法
   。 １２、ポリペプチドのスクシニル化で得たスクシニル化
   ポリペプチドを使用する請求項１０記載の方法。