JP4334189B2 - Age生成阻害剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化最終産物(Advanced Glycation End product:以下AGEともいう)の生成を阻害する作用を有する物質を有効成分として含有するAGE生成阻害剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
血中の蛋白質が非酵素的に糖化されることはよく知られている。蛋白質の糖化の段階には、臨床的に糖尿病のコントロールの指標に用いられている糖化ヘモグロビンのような産物を生成する前記段階と、糖化最終産物(AGE)を生成する後期段階とがあることが知られている。
【0003】
このAGEの生成過程の詳細は不明であるが、AGEは前記段階で蛋白質中に存在するアミノ基とグルコースなどの還元糖のアルデヒド基とが非酵素的に反応(Glycation)し、アルジミンというSciff塩基を経由してアマドリ転移生成物が形成された後、そのアマドリ転移生成物から長時間の複雑な開裂や縮合などの後期段階を経て形成されると考えられている。
【0004】
このAGEは、黄褐色を呈し蛍光を発する物質であって、近くに存在する蛋白と結合して架橋を形成する性質を有している。AGEは変性した蛋白であり、正常な機能を失している場合が多く、種々の組織において障害を生じるものと推定されている。
【0005】
糖尿病の場合には、血糖の上昇に比例してこのAGEの非酵素的な反応が増加するが、これが糖尿病の合併症を惹起する原因のひとつになるとされている(Metabolism, Vol. 28, page 431 (1979)及びNew England Jounal of Medicine, Vol. 314, page 403 (1986))。この過程は老化の一因とも考えられている。また、例えば老人性白内障、アテローム性動脈硬化症の病変、老化に伴う細血管の基底膜における肥厚及び腎臓の機能低下を惹起する腎糸球体基底膜の肥厚にもAGEが関与していることが確認されている(Science, Vol. 232, page 1629 (1986))。
【0006】
AGEの生成阻害剤としては、例えばアミノグアニジンが知られており(最新医学,Vol. 42(2), page 78 (1994))、上記疾患予防、治療に期待される。しかし、アミノグアニジンはAGE生成の阻害に効果がある反面、種々の副作用を引き起こすという問題がある。
【0007】
すなわち、前記アミノグアニジンは、アマドリ転移生成物からAGEへの移行を抑制するとの報告(Science, Vol. 232, page 1629 (1986))がある一方で、ストレプトゾシン(streptozocin)誘発糖尿病ラットに8ヶ月投与することにより、腎腫瘍発生頻度が上昇した(Diabetes 43 (Suppl 1), page 204 (1994))などの症例が副作用の例として報告されている。
【0008】
即ち、現在迄の処、生体内でAGEの生成を有効に阻害し、且つ安全性に優れた薬剤は見いだされていないのが実情である。そのため、副作用の可能性の少ない新たな薬剤が求められていた。
【0009】
一方、トマトについては、AGEの生成を阻害する作用を有することは全く知られていなかった。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記観点からなされたものであり、安全かつ調製が容易で、AGE生成を阻害する作用(以下、AGE生成阻害作用ともいう)を有する新規なAGE生成阻害剤を提供することを課題とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、トマトの漿液にAGE生成阻害作用があることを見出し、本発明の完成に至った。
【0012】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
(1)トマト搾汁液の漿液の分画物を有効成分として含有する、AGE生成阻害剤であって、
前記分画物が、トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約20,000の限外濾過膜を用いて濾過し、その結果得られる膜透過液である、AGE生成阻害剤。
(2)前記分画物が、前記膜透過液に最終エタノール濃度が50%〜95%となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させ、その結果得られる上清である、(1)に記載のAGE生成阻害剤。
(3)前記(1)又は(2)に記載のAGE生成阻害剤を含有するAGE生成阻害のための医薬用組成物。
【0013】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
<1>本発明のAGE生成阻害剤
本発明のAGE生成阻害剤は、トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する。
【0014】
トマト搾汁液を遠心分離することにより得られた漿液又はその分画物には、以下の実施例から明らかなようにAGE生成阻害作用がある。そこでトマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として、効果を示すに有効な量含有する剤は、AGE生成阻害剤として好適に使用することができる。
【0015】
また、上記トマト搾汁液の漿液の分画物である、漿液を排除限界分子量約20,000の限外濾過膜を用いて濾過することにより得られた膜透過液、又は、さらにこの膜透過液に最終エタノール濃度が50%〜95%となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させることにより得られた上清にはAGE生成阻害作用を有する物質がより高濃度に含有されている。
【0016】
そこで、これらの膜透過液又は上清からなるAGE生成を阻害する作用を有する画分を含有させると、より好ましいAGE生成阻害剤を得ることができる。
【0017】
本発明でいうAGEとは、糖と蛋白質の結合反応、転移反応、脱水反応などを繰り返して生成した架橋重合した化合物であり、溶解度が低下し、プロテアーゼの作用を受けにくくなった化合物をいい、具体的にはペントシジン、ピラリン、クロスリン、CML(カルボキシメチルリジン)などを例示することができる。また、老齢のレンズ蛋白質や硬膜のコラーゲンなどで観察することができる(Science, Vol. 221, page 491 (1981), Biochem. Biophys. Acta, Vol. 750, page 97 (1983) )。
【0018】
そして、本発明においてAGEの生成を阻害するとは、糖と蛋白質の結合反応、転移反応、脱水反応などのいずれか、もしくはそのいくつかを阻害することをいう。例えば、後記実施例にもあるように、アルブミンとフルクトースを用いて蛍光強度を測定したとき、蛍光強度の上昇が抑えられる場合、本発明でいうAGE生成阻害作用があるといえる。
【0019】
上記トマト搾汁液を得る方法としては、トマト果実からトマト搾汁液が得られれば特に制限はない。例えば、洗浄及び選別した生トマトをクラッシャー等を用いて破砕し、チューブヒーター等で加熱して殺菌および酵素失活を行った後、エクストラクター等を用いて搾汁する、あるいは、パルパー・フィニッシャー等を用いて搾汁する等の通常用いられている方法が挙げられる。
【0020】
また、トマト搾汁液から上記の漿液、膜透過液、又は上清の各画分を抽出する例を以下に示すが、本発明はこの抽出例に限定されるものではない。
【0021】
トマト搾汁液を遠心分離し、漿液と沈殿物に分ける。これにより得られた漿液をAGE生成阻害剤に含有させることができる。尚、ここで、遠心条件は、6,000rpmで、遠心時間は5分であると好ましい。
【0022】
次に、上記トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約20,000の限外濾過膜、例えば、限外濾過膜(UF膜、ACP−1050、旭化成工業(株)社製)等を用いて圧力0.1Mpa程度をかけ、時間あたり500Lの流量で3時間の循環を行い、膜内部に残留する濃縮液と膜透過液に分ける。これにより得られた分子量20,000以下の化合物を取り出した膜透過液をAGE生成阻害剤に含有させることができる。
【0023】
次に、上記膜透過液に最終エタノール濃度が50%〜95%となるようにエタノールを加え遠心分離により上清と沈殿に分ける。これにより得られた上清をAGE生成阻害剤に含有させることができる。
【0024】
このようにして得られた漿液、膜透過液、又は上清の各画分のAGE生成阻害作用の確認方法としては、後記実施例に示す評価方法を用いることができる。
【0025】
本発明のAGE生成阻害剤と、医薬用又は食品用として通常用いられている他の任意成分とを組み合わせれば、AGEの生成を阻害することができる医薬用組成物や機能性食品を提供することができる。
<2>本発明のAGE生成阻害剤を含有する医薬用組成物。
【0026】
本発明の医薬用組成物は、本発明のAGE生成阻害剤が配合されている以外は、通常の医薬用組成物を適用することができる。本発明のAGE生成阻害剤は、通常の医薬用組成物で用いられている方法にしたがって配合することができる。本発明の医薬用組成物は、AGE生成阻害作用が期待できるものであれば特に限定されるものではない。
【0027】
また、本発明の医薬用組成物の剤型も特に限定されず、一般に製剤上許容される1または2種類以上の担体、賦形剤、統合剤、防腐剤、安定剤、香味剤等と共に混合して、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、水薬、ドリンク剤等の内服剤型とすることが好ましい。このような製剤化は、通常、医薬の製造に用いられる方法に従って製剤化することができる。
【0028】
上記医薬用組成物の投与量としては、疾患の種類、症状、患者の年齢、体重等により異なるが、成人1日当たり、上記した漿液を例えば溶液の状態での重量で5〜100g、又は上記した膜透過液を例えば溶液の状態での重量で5〜100g含むAGE生成阻害剤を含有する医薬用組成物を、1回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。又は、上記した上清で規定するとすれば、上記医薬用組成物の投与量としては、成人1日当たり、上記した上清を例えば凍結乾燥物での重量で10〜200mg含むAGE生成阻害剤を含有する医薬用組成物を、1回ないし数回に分けて投与するのが好ましい。
<3>本発明のAGE生成阻害剤を含有する機能性食品
本発明の機能性食品は、本発明のAGE生成阻害剤が配合されている以外は、通常の食品用組成物を適用することができる。本発明のAGE生成阻害剤は、通常の食品用組成物で用いられている方法にしたがって配合することができる。
【0029】
本発明の機能性食品としては、AGE生成阻害作用が期待できるものであれば特に限定されるものではないが、種々の食品に、食品として通常用いられている任意成分とともに、食品原料に上記した漿液、膜透過液、又は上清の各画分を所要量配合することができる。この漿液、膜透過液、又は上清画分を配合する際に特に留意することはなく、通常の製造方法により加工製造することにより、健康食品等を含む各種機能性食品を製造することができる。
【0030】
配合量は、食品の種類により異なるが、食品の味を損なわず、且つ十分なAGE生成阻害する効果を得るためには、食品用組成物全量に対して、上記した漿液を例えば溶液の状態での重量で0.5〜50重量%、より好ましくは2〜20重量%、又は上記した膜透過液を例えば溶液の状態での重量で0.5〜50重量%、より好ましくは2〜20重量%割合で配合させるのが好ましい。又は、上記した上清で規定するとすれば、食品用組成物全量に対して、上記した上清を例えば凍結乾燥物での重量で0.001〜1重量%、より好ましくは0.01〜0.1重量%の割合で配合させるのが好ましい。
【0031】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【0032】
【実施例1】
<試料抽出方法>
試料の抽出方法は、以下のように行った。尚、以下の抽出方法の概略を図1に示す。
【0033】
トマト搾汁液(10kg)を遠心分離(6,000rpm×5分)にて漿液(9.05kg)と沈殿物(0.95kg)に分けた。漿液は、限外濾過膜(UF膜、ACP−1050、旭化成工業(株)社製)に圧力0.1Mpaをかけ、時間あたり500Lの流量で3時間の循環を行い、膜内部に残留する濃縮液(以下、SAともいう)(1.81kg)と膜透過液(以下、SBともいう)(7.24kg)に分離した。
【0034】
SBのうちの一部(100g)は、200mlのエタノール(99.5v/v%、和光純薬工業(株))を加え、5℃で24時間攪拌後、遠心分離(3,000rpm×10分)にて上清と沈殿に分け、上清を凍結乾燥にて乾燥させた。上清の乾燥物に再度80%エタノール100mlを加え、5℃で24時間攪拌後、遠心分離(3,000rpm×10分)により上清と沈殿に分け、それぞれを凍結乾燥し、上清画分(以下、SB−Esともいう)(0.766g)と沈殿画分(以下、SB−Epともいう)(0.039g)を得た。
【0035】
【実施例2】
<AGE生成阻害活性評価>
AGE生成阻害活性評価は、次に示すin vitroの評価系において測定した。
<評価1>
AGEはその生成割合と比例して、特定波長の蛍光強度が上昇することが知られているため、蛋白質としてウシ血清由来のアルブミン(BSA)、糖としてフルクトースを用い、AGE生成阻害に対する作用を蛍光強度を指標として測定した。
【0036】
すなわち、BSA25mgとフルクトース18.0gをPBS−saline緩衝液(137mM 塩化ナトリウム、8.10mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、2.68mM 塩化カリウム、1.47mM リン酸水素二カリウム、pH7.4)5mlに溶解させた後、上記のようにして得られたトマト搾汁液の漿液、又は膜内部に残留する濃縮液(SA)、又は膜透過液(SB)を、それぞれ10μl添加し(コントロール群には、同量の蒸留水)、さらに防腐剤としてアジ化ナトリウム1mgを加え、37℃にてインキュベートして経時的に溶液の蛍光強度(Ex370nm、Em440nm)を測定した。
【0037】
結果を表1に示す。尚、表1において、AGE生成阻害率(%)は以下のようにして求めた。また、表1において、*は、そのデータがコントロール群と比較して危険率5%以下で有意であることを示す。
【0038】
【数1】
【0039】
【表1】
その結果、コントロールと比較して、SAを添加した場合は、AGE生成阻害効果は全く認められなかった。
【0040】
一方で、トマト漿液とSBはAGEの生成を有意に抑制することが明らかとなった。
<評価2>
試験は評価1の蛍光強度を指標とする方法に準じて行った。サンプルはSB−Es、SB−Epをそれぞれ0.1%の濃度となるように水に溶解させ、それぞれ200μl使用した。
【0041】
その結果を表2に示す。尚、表2中、AGE生成阻害率(%)の計算方法及び*印は表1のそれと同様である。
【0042】
【表2】
その結果、SB−EsはAGEの生成を有意に抑制することが明らかとなった。
【0043】
以上、上記評価実験から明らかなように、トマト搾汁液の漿液及びその分画物には、AGE生成阻害作用が認められた。よって、トマト搾汁液の漿液又はその分画物を有効成分として含有する剤は、AGE生成阻害剤として好適に使用することができる。
【0044】
【発明の効果】
本発明により、安全かつ調製が容易で、新規なAGE生成阻害剤を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の分画方法を説明する概略図。
Claims (3)
- トマト搾汁液の漿液の分画物を有効成分として含有する、AGE生成阻害剤であって、
前記分画物が、トマト搾汁液の漿液を排除限界分子量約20,000の限外濾過膜を用いて濾過し、その結果得られる膜透過液である、AGE生成阻害剤。 - 前記分画物が、前記膜透過液に最終エタノール濃度が50%〜95%となるようにエタノールを添加して、エタノール沈殿させ、その結果得られる上清である、請求項1に記載のAGE生成阻害剤。
- 前記請求項1又は2に記載のAGE生成阻害剤を含有するAGE生成阻害のための医薬用組成物。
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