JPH02231075A - デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ - Google Patents
デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼInfo
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- JPH02231075A JPH02231075A JP1050002A JP5000289A JPH02231075A JP H02231075 A JPH02231075 A JP H02231075A JP 1050002 A JP1050002 A JP 1050002A JP 5000289 A JP5000289 A JP 5000289A JP H02231075 A JPH02231075 A JP H02231075A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生体内の酸素分子から発生したスーパーオキ
シド（０；）による組織障害の治療に有用なデキストラ
ン硫酸で修飾されたスーノくーオキシドジスムターゼ（
以下、ＳＯＤと略す）に関するものである． 〔従来技術の説明〕 スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、下弐に示
す不均化反応によってスーパーオキシド（ＯＩ）を消失
させる作用を持つ酵素である。
シド（０；）による組織障害の治療に有用なデキストラ
ン硫酸で修飾されたスーノくーオキシドジスムターゼ（
以下、ＳＯＤと略す）に関するものである． 〔従来技術の説明〕 スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、下弐に示
す不均化反応によってスーパーオキシド（ＯＩ）を消失
させる作用を持つ酵素である。
ＳＯＤ
＋
２０■＋２Ｈ Ｏ，＋Ｈ．Ｏ■従って、
ＳＯＤは、生体内で酸素分子から発生した０７による組
織障害、例えば、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放
射線照射による障害、紫外線による障害、未熟児酸素網
膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌剤の副作用
、虚血部分への血流再開に伴う障害などに対する有効な
治療薬として注目されている． このようにＳＯＤが医薬として有望であるにもかかわら
ず、ＳＯＤの血流内半減期が非常に短い（約５分）ため
に、その薬理活性が充分に発揮されない場合が多い． ＳＯＤの血流内半減期が非常に短い原因としては、その
分子量（３２，０００）が腎糸球体の濾過限界値（分子
量で約５０．０００）よりも小さいために血中から速や
かに消失し、尿中に排泄されることが考えられている。
ＳＯＤは、生体内で酸素分子から発生した０７による組
織障害、例えば、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放
射線照射による障害、紫外線による障害、未熟児酸素網
膜症、白内障、アドリアマイシンなどの制癌剤の副作用
、虚血部分への血流再開に伴う障害などに対する有効な
治療薬として注目されている． このようにＳＯＤが医薬として有望であるにもかかわら
ず、ＳＯＤの血流内半減期が非常に短い（約５分）ため
に、その薬理活性が充分に発揮されない場合が多い． ＳＯＤの血流内半減期が非常に短い原因としては、その
分子量（３２，０００）が腎糸球体の濾過限界値（分子
量で約５０．０００）よりも小さいために血中から速や
かに消失し、尿中に排泄されることが考えられている。
従って、ＳＯＤの薬理活性を充分に発揮させるために、
ポリエチレングリコール（Ｐｙａｔｏｋ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ
ａｌ．ＨＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｔ Ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ
ｇｙ，一１９．１１３ （１９８０））、ラットアル
プミン（Ｗｏｎｇ，Ｋ，ｅｔ ａｌ．；Ａｇｅｎｔ
ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎｓ，土度，２３１ （１９８
０））、フイコール（ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ，Ｍ．ｅｔ
ａｌ．；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
，Ｕ，Ｓ．Ａ，７工，１１５９ （１９８０））、ポリ
アルキレングリコール（特開昭６１−２４９３８８）や
イヌリン（特開昭５８−３２８２６）などを用いてＳＯ
Ｄを巨大分子化させ、ＳＯＤの血中半減期を増加させる
試みがなされている． ところで、巨大分子化したＳＯＤを通常の静脈投与剤と
して使用する場合には、その血中半減期が長くなるのみ
ならず、その酵素活性保持率が高く、かつ医薬としての
安全性が高いことが望ましい． しかしながら、これらの巨大分子化ＳＯＤには、酵素活
性保持率、血中半減期の長さ、抗原性およ？医薬として
の安全性に対して十分には満足できないという問題があ
る． 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、生体内の酸素分子から発生した０■に
よる組織障害の治療に有用なＳＯＤと医薬として安全性
が確認されているデキストラン硫酸とを結合させること
によって得られた修飾ｓｏＤ（以下、ｒ修飾ＳＯＤＪと
略す）を提供するものである． 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、本発明のｒ修飾ＳＯＤＪは、ＳＯＤ修飾に伴
うＳＯＤ活性の低下は殆ど認められず、また、ｒ修飾Ｓ
ＯＤＪの血中半減期も顕著に長くなることを見出し、本
発明を完成するに至った． 即ち、本発明は、デキストラン硫酸で修飾されたＳＯＤ
に関するものである。
ポリエチレングリコール（Ｐｙａｔｏｋ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ
ａｌ．ＨＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
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ｇｙ，一１９．１１３ （１９８０））、ラットアル
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ａｌ．；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
，Ｕ，Ｓ．Ａ，７工，１１５９ （１９８０））、ポリ
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イヌリン（特開昭５８−３２８２６）などを用いてＳＯ
Ｄを巨大分子化させ、ＳＯＤの血中半減期を増加させる
試みがなされている． ところで、巨大分子化したＳＯＤを通常の静脈投与剤と
して使用する場合には、その血中半減期が長くなるのみ
ならず、その酵素活性保持率が高く、かつ医薬としての
安全性が高いことが望ましい． しかしながら、これらの巨大分子化ＳＯＤには、酵素活
性保持率、血中半減期の長さ、抗原性およ？医薬として
の安全性に対して十分には満足できないという問題があ
る． 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明の目的は、生体内の酸素分子から発生した０■に
よる組織障害の治療に有用なＳＯＤと医薬として安全性
が確認されているデキストラン硫酸とを結合させること
によって得られた修飾ｓｏＤ（以下、ｒ修飾ＳＯＤＪと
略す）を提供するものである． 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
した結果、本発明のｒ修飾ＳＯＤＪは、ＳＯＤ修飾に伴
うＳＯＤ活性の低下は殆ど認められず、また、ｒ修飾Ｓ
ＯＤＪの血中半減期も顕著に長くなることを見出し、本
発明を完成するに至った． 即ち、本発明は、デキストラン硫酸で修飾されたＳＯＤ
に関するものである。
以下、本発明について詳し《説明する。
本発明の『修飾ＳＯＤＪは、ＳＯＤと多糖類であるデキ
ストラン硫酸とを化学的に結合させて得られたものであ
り、約９０％の酵素活性保持率と約１４時間の血中半減
期を示すものである．本発明のｒ修飾ＳＯＤＪの作製に
用いるＳＯＤとしては、ウシ、ヒトなどの動物、ホウレ
ン草などの植物、及びセラチアなどの微生物に由来する
ものを挙げることができるが、ヒトに対する抗原性を考
慮した医薬のｒ修飾ＳＯＤＪとしては、ヒトＳＯＤを用
いることが好ましい． そのようなヒトＳＯＤとしては、ヒト赤血球、胎盤など
のＳＯＤを用いることもできるが、近年、遺伝子工学技
術を応用して生産されたヒ｝ＳＯＤ（例えば、特開昭６
１−１１１６９０など）を用いると、大量に安定した試
料を得られるのでさらに好ましい． 本発明のｒ修飾ＳＯＤＪの製造に用いるデキストラン硫
酸としては、平均分子量がｓ，ｏｏｏＯものが好ましい
。
ストラン硫酸とを化学的に結合させて得られたものであ
り、約９０％の酵素活性保持率と約１４時間の血中半減
期を示すものである．本発明のｒ修飾ＳＯＤＪの作製に
用いるＳＯＤとしては、ウシ、ヒトなどの動物、ホウレ
ン草などの植物、及びセラチアなどの微生物に由来する
ものを挙げることができるが、ヒトに対する抗原性を考
慮した医薬のｒ修飾ＳＯＤＪとしては、ヒトＳＯＤを用
いることが好ましい． そのようなヒトＳＯＤとしては、ヒト赤血球、胎盤など
のＳＯＤを用いることもできるが、近年、遺伝子工学技
術を応用して生産されたヒ｝ＳＯＤ（例えば、特開昭６
１−１１１６９０など）を用いると、大量に安定した試
料を得られるのでさらに好ましい． 本発明のｒ修飾ＳＯＤＪの製造に用いるデキストラン硫
酸としては、平均分子量がｓ，ｏｏｏＯものが好ましい
。
本発明のｒ修飾ＳＯＤＪの製造におけるＳＯＤとデキス
トラン硫酸との結合割合は、１分子のＳ０Ｄ当たり１〜
２０分子がよく、好ましくは１〜５分子がよい． 本発明の『修飾ＳＯＤＪは、ＳＯＤの官能基（例えば、
アミノ基またはカルボキシル基）とデキストランの官能
基（例えば、カルボキシル基、アミノ基または水酸基）
とを利用して、好ましくはｐ Ｈ ６． ０〜１０、さ
らに好ましくはｐ Ｈ ７． ０〜８．５で０．１〜１
０％の濃度としたＳＯＤと活性化デキストランを結合さ
せたものであり、例えば、■デキストラン硫酸の水酸基
に塩化シアヌルを反応させた後、これをそのトリアジン
環を介してＳＯＤのアミノ基に結合させることによって
ＳＯＤとデキストラン硫酸とを結合させる方法■デキス
トラン硫酸のカルポキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸
とジシクロへキシルカルボジイミドとを用いてエステル
を導入し、これをＳＯＤのアミノ基に結合させることに
よってＳＯＤとデキストラン硫酸とを結合させる方法 ■デキストラン硫酸の水酸基に無水コハク酸を用いてカ
ルポキシル基を導入し、さらにそのカルボキシル基をＮ
−ヒドロキシコハク酸とジシクロへキシルカルポジイミ
ドとを用いてエステルを導入し、これをＳＯＤのアミノ
基に結合させることによってＳＯＤとデキストラン硫酸
とを結合させる方法 などの方法で作製することができる． このようにして、デキストラン硫酸とＳＯＤとを結合す
ることによって得られるｒ修飾ＳＯＤＪは、８７％の酵
素活性保持率を有するものである。
トラン硫酸との結合割合は、１分子のＳ０Ｄ当たり１〜
２０分子がよく、好ましくは１〜５分子がよい． 本発明の『修飾ＳＯＤＪは、ＳＯＤの官能基（例えば、
アミノ基またはカルボキシル基）とデキストランの官能
基（例えば、カルボキシル基、アミノ基または水酸基）
とを利用して、好ましくはｐ Ｈ ６． ０〜１０、さ
らに好ましくはｐ Ｈ ７． ０〜８．５で０．１〜１
０％の濃度としたＳＯＤと活性化デキストランを結合さ
せたものであり、例えば、■デキストラン硫酸の水酸基
に塩化シアヌルを反応させた後、これをそのトリアジン
環を介してＳＯＤのアミノ基に結合させることによって
ＳＯＤとデキストラン硫酸とを結合させる方法■デキス
トラン硫酸のカルポキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸
とジシクロへキシルカルボジイミドとを用いてエステル
を導入し、これをＳＯＤのアミノ基に結合させることに
よってＳＯＤとデキストラン硫酸とを結合させる方法 ■デキストラン硫酸の水酸基に無水コハク酸を用いてカ
ルポキシル基を導入し、さらにそのカルボキシル基をＮ
−ヒドロキシコハク酸とジシクロへキシルカルポジイミ
ドとを用いてエステルを導入し、これをＳＯＤのアミノ
基に結合させることによってＳＯＤとデキストラン硫酸
とを結合させる方法 などの方法で作製することができる． このようにして、デキストラン硫酸とＳＯＤとを結合す
ることによって得られるｒ修飾ＳＯＤＪは、８７％の酵
素活性保持率を有するものである。
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する．なお
、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであ
って、本発明の範囲を限定するものではない． 本発明の実施例に示したｒ修飾ＳＯＤＪの活性保持率は
、大柳の示した方法（Ｏｙａｎａｇｕｉ，Ｙ＋ ；Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１４
２．２９０−２９６ （１９８４））に準じてデキスト
ランの修飾前後におけるＳＯＤの比活性を求め、その変
化から求めた。
、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであ
って、本発明の範囲を限定するものではない． 本発明の実施例に示したｒ修飾ＳＯＤＪの活性保持率は
、大柳の示した方法（Ｏｙａｎａｇｕｉ，Ｙ＋ ；Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１４
２．２９０−２９６ （１９８４））に準じてデキスト
ランの修飾前後におけるＳＯＤの比活性を求め、その変
化から求めた。
また、デキストラン硫酸がＳＯＤ １分子当たり何分子
結合するかは、分析用の高速ゲル濾過力ラムである３
０ ０ ０ ＰＷおよび５０００ＰＷ（いづれも、東ソ
ー社製）を用いて『修飾ＳＯＤＪの分子量を測定し、そ
の分子量とＳＯＤの分子量とを比較することによって決
定した． 実施例１ １ ０ ０ｍｇのデキストラン硫酸（平均分子量はｓ，
ｏｏｏ．シグマ社製．）を２ｍｌのＮ， Ｎ−ジメチル
ホルムアミドに溶解し、これに１ ０ｍｇのＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミドと２０ｍｇのジシクロへキシルカル
ボイミドを加え、室温で穏やかに１５時間攪拌した．生
じた沈澱物を濾過して除去し、得られた濾液に５０ｍｊ
！のエチルエーテルを加え、生じた沈澱を濾過分取し、
乾燥して７０ｍｇの活性化デキストラン硫酸を得た．こ
のようにして得られた５０ｍｇの活性化デキストランを
ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ溶液〔特開昭６１−１１１６９
０号に示されたヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ生産菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０ （ｐＵＢＥ２）で生産し、精製し
て得られた５ｍｇを２ｍ２の０． １ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解。
結合するかは、分析用の高速ゲル濾過力ラムである３
０ ０ ０ ＰＷおよび５０００ＰＷ（いづれも、東ソ
ー社製）を用いて『修飾ＳＯＤＪの分子量を測定し、そ
の分子量とＳＯＤの分子量とを比較することによって決
定した． 実施例１ １ ０ ０ｍｇのデキストラン硫酸（平均分子量はｓ，
ｏｏｏ．シグマ社製．）を２ｍｌのＮ， Ｎ−ジメチル
ホルムアミドに溶解し、これに１ ０ｍｇのＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミドと２０ｍｇのジシクロへキシルカル
ボイミドを加え、室温で穏やかに１５時間攪拌した．生
じた沈澱物を濾過して除去し、得られた濾液に５０ｍｊ
！のエチルエーテルを加え、生じた沈澱を濾過分取し、
乾燥して７０ｍｇの活性化デキストラン硫酸を得た．こ
のようにして得られた５０ｍｇの活性化デキストランを
ヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ溶液〔特開昭６１−１１１６９
０号に示されたヒトＣｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ生産菌Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｗ３１１０ （ｐＵＢＥ２）で生産し、精製し
て得られた５ｍｇを２ｍ２の０． １ Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）に溶解。
〕に溶解し、室温で穏やかに３時間攪拌した．その後、
水に対して透析し、さらに凍結乾燥することによて４３
ｍｇのｒ修飾ＳＯＤＪを得た．デキストラン硫酸はＳＯ
Ｄ１分子当たり約３分子結合しており、その酵素活性保
持率は８７％であった。
水に対して透析し、さらに凍結乾燥することによて４３
ｍｇのｒ修飾ＳＯＤＪを得た．デキストラン硫酸はＳＯ
Ｄ１分子当たり約３分子結合しており、その酵素活性保
持率は８７％であった。
実施例２
ウイスタ一系ラット（♂、体重は２５０±３０ｇ）の２
匹に、生理食塩水に溶解した実施例１のｒ修飾ＳＯＤＪ
溶液を、１匹当たりＳＯＤの蛋白質量として０． ６
ｍ ｇづつ総頚静脈へ注入した。
匹に、生理食塩水に溶解した実施例１のｒ修飾ＳＯＤＪ
溶液を、１匹当たりＳＯＤの蛋白質量として０． ６
ｍ ｇづつ総頚静脈へ注入した。
注入から、２分、５分、１５分、３０分、６０分、９０
分、１２０分、１５０分、１８０分経過時に０． ４
ｍ ｌづつ採血し、その血漿中のＳＯＤ量を前記の大柳
のＳＯＤ活性測定法で測定した．ｒ修飾ＳＯＤＪの血流
内半減期を求めるために、これらの血漿中のＳＯＤの相
対活性を時間に対してプロットした結果、その半減朋は
、約１４時間であった。
分、１２０分、１５０分、１８０分経過時に０． ４
ｍ ｌづつ採血し、その血漿中のＳＯＤ量を前記の大柳
のＳＯＤ活性測定法で測定した．ｒ修飾ＳＯＤＪの血流
内半減期を求めるために、これらの血漿中のＳＯＤの相
対活性を時間に対してプロットした結果、その半減朋は
、約１４時間であった。
比較例１
未修飾のＳＯＤの血流内半減期を求めるために、実施例
２の場合と同様にして、ウィスタ一系ラット（♂、体重
は２５０±３０ｇ）を用いて血漿中のＳＯＤの相対活性
及び相対濃度を時間に対してプロットした結果、その半
減期は、相対活性及び相対濃度のいずれの．場合におい
ても約５分であった． 〔発明の効果〕 本発明の酵素活性保持率が高く、かっ血流内半減期が改
善されたｒ修飾ＳＯＤＪは、静脈投与剤としてのＳＯＤ
の薬理効果を高めるものである．特許出願人 宇部興
産株式会社
２の場合と同様にして、ウィスタ一系ラット（♂、体重
は２５０±３０ｇ）を用いて血漿中のＳＯＤの相対活性
及び相対濃度を時間に対してプロットした結果、その半
減期は、相対活性及び相対濃度のいずれの．場合におい
ても約５分であった． 〔発明の効果〕 本発明の酵素活性保持率が高く、かっ血流内半減期が改
善されたｒ修飾ＳＯＤＪは、静脈投与剤としてのＳＯＤ
の薬理効果を高めるものである．特許出願人 宇部興
産株式会社
Claims (1)
- デキストラン硫酸で修飾されたスーパーオキシドジスム
ターゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1050002A JPH02231075A (ja) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1050002A JPH02231075A (ja) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231075A true JPH02231075A (ja) | 1990-09-13 |
Family
ID=12846794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1050002A Pending JPH02231075A (ja) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | デキストラン硫酸修飾スーパーオキシドジスムターゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02231075A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5238837A (en) * | 1991-02-05 | 1993-08-24 | Kuraray Co., Ltd. | Superoxide dismutase derivatives |
| US5834273A (en) * | 1991-03-28 | 1998-11-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Heat-stable and water soluble modified enzymes |
| US6689741B2 (en) * | 1998-07-21 | 2004-02-10 | Denis Barritault | Biocompatible polymers, process for their preparation and compositions containing them |
-
1989
- 1989-03-03 JP JP1050002A patent/JPH02231075A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5238837A (en) * | 1991-02-05 | 1993-08-24 | Kuraray Co., Ltd. | Superoxide dismutase derivatives |
| US5834273A (en) * | 1991-03-28 | 1998-11-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Heat-stable and water soluble modified enzymes |
| US6689741B2 (en) * | 1998-07-21 | 2004-02-10 | Denis Barritault | Biocompatible polymers, process for their preparation and compositions containing them |
| US7998922B2 (en) | 1998-07-21 | 2011-08-16 | Denis Barritault | Process for treating fibroses with biocompatible polymer |
| US8476220B2 (en) | 1998-07-21 | 2013-07-02 | Denis Barritault | Biocompatible polymers, process for their preparation and compositions containing them |
| US8883715B2 (en) | 1998-07-21 | 2014-11-11 | Denis Barritault | Biocompatible polymers, process for their preparation and compositions containing them |
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