CN1517126B - 具有血栓溶解、抗炎和细胞保护性能的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了具有血栓溶解、抗炎和细胞保护特性的药物组合物。该组合物含有活性蛋白酶，该酶附加于凝胶或者凝胶和水溶性聚合物的混合物上，所述的附加是借助照射，优选是用γ-射线或者用加速电子流实现的。本组合物含有蛋白酶，它在高达70℃，优选在30-40℃是稳定的，例如，作为蛋白酶的有枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或者链激酶。凝胶优选聚乙二醇凝胶、葡聚糖或者多聚糖凝胶，并且水溶性聚合物是聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖或者多聚糖。也公开了制备上述组合物的方法及其应用。优点：本发明组合物具有广泛的应用领域并且可用于心脏病学、肾病学、外科学、风湿病学、如产科学和胃肠病学。

Description

具有血栓溶解、抗炎和细胞保护性能的药物组合物
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及药理学和以酶制剂为基础的药剂，它可能用于综合治疗局部缺血性心脏病、局部缺血性脑中风、类风湿病以及其他伴有局部缺血、血栓形成和非特异性炎症等疾病。
本发明包含血栓形成蛋白的酶水解领域，主要是血纤维蛋白领域，该蛋白是所有血栓的结构形成蛋白，并且与肽的位置和大小无关。本发明比较具体地涉及含有蛋白水解酶的化合物，酶固定(附加)于亲水的水溶的聚合物上并具有溶解纤维蛋白的特性。本发明还涉及治疗急性心肌梗塞、局部缺血脑中风时，使用上述化合物进行溶解纤维蛋白治疗的方法以及涉及治疗各种病原(包括由于微血栓形成)的器官和组织局部缺血损伤而进行的血液流变特征的矫正(改善)的治疗方法。
背景技术
已知已经有应用于治疗局部缺血性心脏病和局部缺血性脑中风疾病的各种药剂。通常，这些疾病的晚期，其基本发病机制因素是形成血管内血栓。在现代医学实践中，治疗急性心肌梗塞和局部缺血脑中风，普遍应用血栓溶解药剂作为病原治疗的手段。已知的药剂有，诸如，链激酶、链球菌激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化剂(组织纤维蛋白溶酶原激活物)和纤维蛋白溶酶(对急性心肌梗塞病人早期治疗措施的推荐方法，美国心脏病学院和美国心脏学协会通报，“汇编”，V.N.加纽克夫主编，新西伯利亚市，1998年，第100页俄文译本)。这些药剂都是直接或者借助活化血液的抗凝系统，使之作用于纤维蛋白，使其遭到破坏，从而达到使血管内的血栓得到溶解的目的。这种治疗法尽管能够获得很高的治疗效果，可是具有明显的副作用，那就是容易造成无法控制的和危险的出血事故，这是因为服用上述那些药剂，会使凝血系统衰竭(Saunders W.B.Indications for Fibrinolytic Therary Trialists CollaborativeGroup.//Lancet Ltd.，1994，vol.343，pp.311-322)。另外，对于链激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂，难于确定适当的治疗剂量，因为在人体内具有对链球菌的单独的抗血清活性，其会导致使这些药剂失活。
已知，有的药剂具有降低炎症反应的能力。其中最为普遍应用的是非类固醇抗炎药，诸如，阿斯匹林、抗炎痛(吲哚美辛)、双氢芬钠及其他(纳索诺夫E.L.，赤维特克娃V.S.，和托福N.L.，环氧化酶-2的选择性抑制剂：人类疾病治疗的新前景，“药剂档案”，1998，No.5，第8-14页，俄文本)。上述已知的药剂具有很大缺点，那就是会损伤胃，从而引发非类固醇胃病、出血和肠胃道系统粘膜溃疡。
已知的具有细胞保护特性的药剂，诸如，普列都塔(preductal)(心脏保护作用)和H2受体阻滞剂[胃则平(gastrozepine)、雷尼替丁]。长期使用上述已知的药剂时，会显现出抗药性，造成这些药只有很弱的细胞保护作用(Brottier L，Barat j.L.Combie C et al.Therapeutic value of acardioprotective agent in patients with severe ischaemic cardiomyopathy//Eur.Heart J，1990，vol.11，pp 207-212)。
目前在科学和医学文献中还没有记载治疗局部缺血、发炎和血栓形成的主要发病环节的具有多目协同作用的药物组合物，该药物还应具有细胞保护特性。
曾经报导过关于使酶包括蛋白酶，固定在一系列聚合物载体上的各种方法。例如，R.I.隆尔塔尼克等在“治疗化脓性疾病过程中被固定的蛋白酶”(新西伯利亚市，(1981)，第3-8页，俄文本)工作中阐述了用共价地结合于纤维素固体小颗粒的蛋白水解酶治疗化脓性疾病、脓肿和蜂窝织炎的方法。O.A.别列金等在“眼科学”杂志，1987，No.3，第145-148页和贡恰尔等在“兽医学”杂志，1989，No.4，第52-55页阐述了具有附着蛋白酶的液体聚合物的应用。在大多数情况下，曾经使用了双功能的化学试剂作为连接剂，后者的一个化学基团与酶蛋白的氨基酸残基结合，同时另一个反应基团与聚合物载体连接。曾经研究了一系列化学操作方法，以便使各种酶共价地结合到固体载体上。然而，结合到固体小颗粒或纤维上的蛋白酶，不但不能治疗导致血管内的血栓形成的损伤和疾病，还会造成组织和器官的微循环通道内的血液流变学的负面变化。
综上所述，急需能够有效地水解蛋白的化合物，这些蛋白主要是会造成在不同直径的血管中形成血栓，而后者又是发展像诸如，急性心肌梗塞和脑中风的病因。用于综合治疗局部缺血性心脏病、高血压、类风湿疾病的这些含有无毒性的血栓溶解体的化合物和血液流变学的修正功能的物质在目前还没有合成成功。同样，也需要一种简单、价廉和方便的方法，而且能够同时将蛋白酶附加到聚合物载体络合物上，并且提供最终产品的灭菌消毒。理想的方法是可以生产出各种粘度和聚集状态、能够用于各种目的和各种施药方法的化合物。
发明内容
本研究可以满足上述要求并且比其他药剂和药物组合物制备方法优越，对局部缺血性心脏疾病的各种发病环节具有综合协同治疗作用。此外，由于细胞保护、血栓溶解和抗局部缺血效应本发明要求的药物组合物以及其制备方法在治疗非特异性炎症时能够达到很高的治疗效果。
本发明涉及提供药物组合物，其用于选择性水解血栓形成蛋白，该药剂由活性蛋白酶组成，它附加于亲水的、水溶性的聚合物上。本组合物主要由固定于亲水聚合物上的枯草溶菌素组成。
本发明致力于开发这样的药物组合物的制备方法，即使蛋白酶附加于水溶性聚合物上，从而形成混合物，同时用照射，具体是用加速电子流，或者γ-射线以及其他种类的离子化照射，包括使用激光源，对混合物进行灭菌消毒。
本发明致力于开发新的药物组合物，用于水解血栓形成蛋白，该药剂由附加于亲水性的聚合物的活性蛋白酶组成。这样的组合物有利于去除血栓，包括血纤维蛋白和其它形成物。本发明还致力于开发新的化合物，以修正组织和器官内由于形成血栓和局部缺血造成的病理学变化，也致力于改善非特异性炎症反应，并可以作为治疗和预防由于使用非类固醇的抗炎症药剂造成的胃病的辅助手段。本发明的固定在水溶性的、亲水性聚合物上的蛋白酶能够选择性地使血栓蛋白、主要是血纤维蛋白降解。与此同时，活细胞和功能性活性蛋白会完整保留下来并不被损坏。为了血栓物质蛋白的有效水解，优选使用善于辨别和能够水解各种肽键的蛋白酶的多功能混合物。天然的蛋白酶包括，例如，枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶、番木瓜蛋白酶以及其他具有纤维蛋白溶解的和蛋白水解活性的动物和细菌来源的酶。
虽然蛋白酶可以由任意来源得到，包括动物和植物蛋白酶，但是特别优先选择细菌蛋白酶。因为细菌蛋白酶与其他类型的蛋白酶相比，比较便宜，而且一般是可以数量不受限制地获得。本发明优先选择的细菌蛋白酶可以由Bac·Subtilis(枯草杆菌)繁殖，已知的如枯草溶菌素。优先选用中性和/或碱性的枯草溶菌素混合物，因为该混合物可以选择性地降解各种肽键并在PH值为6-10的范围内保留其活性。
本发明的蛋白酶附加于水溶性聚合物组合，后者的作用是作为蛋白水解酶的载体。比较优先选用的水溶性聚合物是聚氧化乙烯物(PEO)synonym：聚乙二醇(PEG)，其分子量为1500KDa(PEO-1500)和葡聚糖，其分子质量为30-40KDa。聚氧化乙烯和葡聚糖具有或多或少的分子量，也可用于代替PEO-1500或者与PEO-1500和具有30-40KDa分子量的葡聚糖共同使用。也可以使用其他合适的水溶性聚合物以及它们可以使用的组合包括，例如，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮等。
本发明的组合物可以呈任何非固态或者固态形式，或者呈团粒组合形式。本组合物根据该化合物计划用于何领域，优先选用与水溶性聚合物的各种组合的冻干粉(物质)。
为了达到总的治疗特性，可以向本组合物中添加抗体、治疗性消毒剂、糖类皮质激素、组织再生刺激素以及其他治疗剂。为获得好效果，在没有查明上述这些添加剂对本发明组合物的特殊的和治疗活性的影响之前，上述这些添加剂不应该大量与蛋白酶混合使用。
本发明也推荐将蛋白酶附加于水溶性聚合物并同时用照射对所形成的混合物进行灭菌消毒来制备组合物的方法。优先选择的照射种类为加速电子或者γ-射线。
制药工艺简述如下：蛋白酶混合物溶液(优先选用枯草溶菌素及水溶性聚合物，优先选用聚氧化乙烯和葡聚糖)被来自电子加速器的电子进行作用，其剂量能够促进附加于聚合物载体并且同时对所得到的化合物进行灭菌消毒。另一方面，钴-60发射的γ-射线可用于代替电子束并能提供组份的附加和灭菌消毒。该领域的专家能够选择足够的剂量，其既要考虑提供混合物无菌同时还要考虑对酶的蛋白水解活性不产生明显的影响。
最后，本发明也致力于清除血管中的血栓的方法，即施用或者使用有效数量的本发明组合物去除血栓。本发明的组合物可用作治疗剂，在各个方面，诸如医学、口腔学、兽医学和个人护理方面均能取得良好的功效。
据此，本发明的组合物特别适用于治疗局部缺血性心脏病及其并发症、还有局部缺血脑中风、类风湿病以及其他疾病。它们的发病机制中具有发炎反应、组织局部缺血、破坏血液流变学和由于形成血栓破坏了血管的微循环。本发明的药物组合物也适用于粘性生物液体，诸如，分泌粘液(例如，支气管分泌物)的酶促破坏，所以本组合物可以有效治疗肺病，可用于治疗和预防支气管梗阻。本发明的药物组合物也适用于坏死组织的蛋白和肽的酶促破坏，这种坏死组织总是存在于外伤性的和传染发炎病例中，所以本组合物对治疗各种病因学和局部化脓性、发炎性病症均有效。
这些组合物可以用医学上，用已知的任何方法施加到病灶患处。这些方法包括，例如，非肠道的施用，腔内用和外用，气溶胶喷雾，使用导液管注射，支气管镜检验或者其他合适的施用。施药方法至少部分地与损伤部位的状况和需要去除的血栓形成组织的类型和数量或者与坏死组织有关系。
本药剂(组合物)优选的施药方法是非肠道给药的方法。
附图说明
图1表示在体外血栓溶解模型上研究的本发明组合物的血栓溶解性。
标准治疗剂量即50生理单位/ml(50PhU/ml)的本发明组合物确实胜过了纤维蛋白溶酶(P＜0.02)；胰蛋白酶(P＜0.01)；和在生理作用溶液中的自发血栓溶解(P＜0.01)。
图2表示随着血栓“年龄”的增长到7天，本发明组合物仍然保持血栓溶解特性。纤维蛋白溶酶不作用于7天的血栓。在生理作用的溶液中头两个小时，纤维蛋白溶酶对血栓的作用与自发的背景溶解准确地无差异。在临近第4个小时终结时，本发明组合物完全溶解了血栓，而与此同时，纤维蛋白溶酶只溶解了“陈旧”血栓质量的20％。
图3表示本发明组合物的抗炎特性，这是在发炎介体感应模型上，即在线鼠CBA内霉素休克时肿瘤的坏死因子(αTNF)模型上进行的研究。使用L929细胞[以活性单位(Au)表示]测定了αTNF的活性。
图中：1-完整的动物的αTNF；
2-对动物给予内霉素后αTNF的活性
3-动物在给予内霉素前1小时，给予本发明组合物的αTNF的活性。可以看出，本发明组合物降低了αTNF的活性50倍。
图4表示本发明组合物的细胞保护特性，这是在对大鼠肾上腺素心肌炎模型上研究的。给出了大鼠心肌坏死和营养不良变化的容积量的组织学和形态测量学的研究数据。采用测面积的方法，测定被损害的体积并用体积密度％表示，它等于被损害的体积/比上组织的总体积，再乘以100％。
图中符号标示：
K坏死-对照组的动物，对它们引入肾上腺素后，往腹部引入1ml NaCe等渗溶液，2次/天；
TRB坏死-试验组的动物，往腹部引入肾上腺素后情况，引入1ml本发明组合物，2次/天。
图4的头两个柱形图表示动物处理到第三天临近终结时，本发明组合物的正面效果(降低心脏肌肉坏死数量大约1.5倍)。
后两个的两个柱形图，表示动物被处理到第7天临近终结时，本发明组合物的正面效果(心肌内减少营养不良(萎缩)变化，大约降低2.5倍)。
下面举例演示本发明组合物的成分，制备方法和药理学特征。当然，本发明并不受它们局限。
具体实施方式
实施例1
采用下列方法制备本发明的药物组合物
制备反应混合物的方法是在葡聚糖(分子量为40-70kDa、优选40kDa)溶液中，在0.025M的磷酸钠缓冲溶液中(其pH值为7.5-8.2)溶解原枯草菌素(protosubtilin)，优选原枯草菌素G3Kh和聚氧化乙烯(PEO)(其分子质量为400-20000Da，优选1500Da)。将所得到的混合物用去除惰性和无用的蛋白办法进行纯化，具体办法是用盐沉淀，接下来进行过滤。用γ-射线或者加速电子束(能量为2.0MeV)，剂量为0.5-1.5Mrad，对所得到的溶液进行照射。照射之后对溶液进行灭菌消毒性过滤并按10ml为一份分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml。然后用冻干法将溶液干燥到残余水分不大于2％。
结果得到含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上、由枯草芽孢杆菌(Bac.Subtilis)组成的蛋白酶络合物的组合物。所制得的组合物在一个小瓶内的蛋白水解活性为500-1000.0蛋白水解单位/克(PU/g)。本组合物呈多孔状、均质的略带黄色的物质。
为了治疗目的，使用本发明组合物溶液(暂命名为“血栓瓦吉姆”(Trombovazim))，可将其当场制成。为此，溶解小瓶内的内含物于10ml氯化钠的灭菌的等渗溶液内或者溶解于10ml注射用水中。
实施例2
本发明组合物可以用另外的方法制取，即分别制备含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上的蛋白酶络合物的活性组份(第1组份)和溶剂——聚氧化乙烯溶液(第2组份)。通过改变活性组份/溶剂的比例关系的办法，组合物的双组分成分可以改变本发明药物组合物的活性，从而能够选择各种单独的治疗方案。
采用下列办法制取上述双组份组合物：
第1组份(活性物质)
用下列方法制备反应混合物：在葡聚糖(分子量为40-70kDa、优选40kDa)的0.025M的磷酸钠缓冲溶液中(其pH值为7.5-8.2)溶解原枯草菌素(优选原枯草菌素G3Kh)和聚氧化乙烯(PEO)(其分子量为400-20000Da(优选1500Da)。将所得到的混合物用去除惰性和无用的蛋白的办法进行纯化。具体办法是用盐沉淀，接下来进行过滤。用γ-射线或者加速电子束(能量为2,0MeV)，剂量为1.0Mrad对所得到的溶液进行照射。照射之后对溶液进行灭菌消毒性过滤并按10ml为一份，分装到小瓶(带长颈的小瓶)中，每个小瓶的容量为15ml。然后用冻干法干燥到残余水分不大于2％。
结果得到组合物的第1组份，它含有固定在聚氧化乙烯和葡聚糖上、由Bac.Subtilis组成的蛋白酶络合物。所制取的组合物在一个小瓶内的水解蛋白活性为500-1000.0PU/g。第1组份呈多孔状、均质的略带黄色的物质。
第2组份(溶剂)
在0.025M的磷酸钠缓冲溶液中(其pH值为7.5-8.2)制备聚氧化乙烯溶液(优选聚氧化乙烯，其分子量为1500Da)。用γ-射线或者加速电子束(能量为2.0MeV)，剂量为1.0Mrad，对所得到的溶液进行照射。照射之后，对溶液进行消毒灭菌性过滤并按10ml为1份，分装到小瓶(带长颈的小瓶)中，每个小瓶的容量为15ml。
结果，得到本发明组合物的第1组份用的无菌的溶剂。该溶剂呈略带黄色的液体。
为了临床治疗的目的，使用本发明组合物溶液(暂命名为“血栓瓦吉姆”)，将其当场制成，为此，将小瓶内的含有第1组份的内含物(它含有固定的蛋白酶)溶解于10ml组分(2)(溶剂)中。
当在溶剂(第2组份)内当场溶解第1组份以及并接着冻干时，得到本发明药物组合物。
实施例3
将15g聚氧化乙烯PEO-1500溶解于300ml 10％的葡聚糖的0.025M的磷酸缓冲(pH为7.5)溶液中，葡聚糖的分子量为40kDa，添加6.3g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃，将混合物搅动30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性和无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠(Sodium phosphatedisubstituted)，使之完全溶解并且最终浓度达到0.45％并添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉降物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度条件下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀惰性无用的蛋白。接下来经过滤纸(白带)过滤反应混合物。滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.0Mard。照射后，对溶液进行灭菌消毒性过滤。将溶液按10ml为一份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml，再经冻干到残余水分不大于2％。
结果，得到下列成分的组合物，用重量％表示：
1、原枯草菌素G3Kh            2.1
2、葡聚糖(分子量40kDa)       10.0
3、聚氧化乙烯1500            5.0
4、0.025M的磷酸钠缓冲液      82.9
组合物的蛋白水解活性         850PU/g。
实施例4
将15g聚氧化乙烯(PEO-1500)溶解于300ml 5％葡聚糖的pH为8.2的0.025M磷酸钠缓冲液溶液中，葡聚糖的分子量为40KDa，添加6.0g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃温度条件下，将混合物搅拌30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠，使之完全溶解并达到最终浓度为0.45％并添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉淀物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度条件下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀无用惰性的蛋白。接下来，通过滤纸(白带)过滤反应混合物，滤液的体积为300ml，将所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.0Mrad。照射后，对溶液进行灭菌消毒过滤，将溶液按10ml为1份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml再经冻干到残余水分不大于2％。
结果，得到下列成分的组合物，重量％：
1、原枯草菌素G3Kh            2.0
2、葡聚糖(分子量40kDa)       5.0
3、聚氧化乙烯1500            5.0
4、0.025M的磷酸钠缓冲液      88.0
组合物的蛋白水解活性         800PU/g。
实施例5
将0.5g聚氧化乙烯(PEO-1500)溶解于300ml 10％葡聚糖在pH8.2的0.025M磷酸钠缓冲液的溶液中，葡聚糖的分子量为40kDa，添加5.7g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的温度条件下，将混合物搅拌30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性和无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠，使之完全溶解并且最终浓度达到0.45％并添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉降物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度条件下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀惰性无用的蛋白。接下来通过滤纸(白带)过滤反应混合物。滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.0Mrad。照射后对溶液进行灭菌消毒性过滤，将溶液按10ml为1份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml，再经冻干到残余水分不大于2％。
结果，得到下列成分的组合物，重量％：
1、原枯草菌素G3Kh            1.9
2、葡聚糖(分子量40kDa)       10.0
3、聚氧化乙烯PEO-1500        0.5
4、0.025M的磷酸钠缓冲液      87.6
组合物的蛋白水解活性         750PU/g。
实施例6
将15g聚氧化乙烯PEO-1500溶解于300ml 5％的葡聚糖在pH为8.2的0.025M磷酸钠缓冲液溶液中，葡聚糖分子质量为40kDa，添加7.5g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的温度条件下，将混合物搅拌30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性和无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠，使之完全溶解并且最终浓度达到0.45％并添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉降物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度条件下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀惰性无用的蛋白。接下来通过滤纸(白带)过滤反应混合物。滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.2Mrad。照射后，对溶液进行灭菌消毒过滤。将溶液按10ml为一份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml，再经冻干到残余水份不大于2％。
结果，得到下列成分的组合物，重量％：
1、原枯草菌素                2.5
2、葡聚糖(分子量40kDa)       5.0
3、聚氧化乙烯PEO-1500        5.0
4、0.025M磷酸钠缓冲液        87.5
组合物蛋白水解活性           500PU/g。
实施例7
将15g聚氧化乙烯PEO-4000溶解于300ml 5％的葡聚糖在pH为8.2的0.025M磷酸钠缓冲液溶液中，葡聚糖分子质量为70kDa，添加7.5g原枯草菌素G10Kh，在18-20℃的温度条件下，将混合物搅拌30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性和无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠，使之完全溶解并且最终浓度达到0.45％和添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉降物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀惰性无用的蛋白。接下来，通过滤纸(白带)过滤反应混合物。滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为0.8Mrad。照射后，对溶液进行灭菌消毒过滤。将溶液按10ml为一份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml，再经冻干到残余水份不大于2％。
结果，得到下列成分的组合物，重量％：
1、原枯草菌素G10Kh        2.5
2、葡聚糖(分子量70kDa)    5.0
3、聚氧化乙烯PEO-4000     5.0
4、0.025M磷酸钠缓冲液    87.5
组合物蛋白水解活性       1000PU/g。
实施例8
制备由活性组份和溶剂组成的本发明组合物(双组份的成分)
第1组份：
将0.5g聚氧化乙烯PEO-1500溶解于300ml 10％的葡聚糖在pH为8.2的0.025M磷酸钠缓冲液溶液中，葡聚糖分子质量为40kDa，添加5.7g原枯草菌素G3Kh，在18-20℃的温度下，将混合物搅拌30分钟。然后用盐沉淀法进行沉淀惰性和无用的蛋白。为此，往混合物中按顺序添加1.3g双取代的磷酸钠，使之完全溶解并且最终浓度达到0.45％和添加1.9g氯化钙到最终浓度为0.63％。氯化钙在反应混合物中溶解后，沉降下来不溶的磷酸钙沉降物，后者吸附惰性无用的蛋白。在4-8℃的温度下，将混合物保持12小时，使之完全沉淀惰性无用的蛋白。接下来，通过滤纸(白带)过滤反应混合物。滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.0Mrad。照射后，对溶液进行灭菌消毒过滤。将溶液按10ml为一份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml，再冻干到残余水份不大于2％。
结果得到下列成分的组合物第1组份，重量％：
1、原枯草菌素G3Kh                 1.9
2、葡聚糖(分子量40kDa)            10.0
3、聚氧化乙烯PEO-1500             0.5
4、0.025M磷酸钠缓冲液             87.6
组合物第1组份的蛋白水解活性为     750PU/g。
第2组份(溶剂)：
将15.0g聚氧化乙烯PEO-1500溶解于300ml 0.025M的磷酸钠缓冲液。然后将溶液经滤纸(“白带”)进行过滤。过滤液体积为300ml。对所得到的溶液进行γ-射线照射，剂量为1.0Mrad。照射后，对溶液进行灭菌消毒过滤，将溶液按10ml为1份，分装到小瓶中，每个小瓶的容量为15ml。结果，得到下列成分的组合物的第2组份，以重量％表示：
1、聚氧化乙烯PEO-1500      5.0
2、0.025M的磷酸钠缓冲液    95.0
当在溶剂(第2组份)中溶解第1组份和冻干后，得到本发明的药物组合物。
实施例9
对本发明组合物(“血栓瓦吉姆”)的药理学特性研究
对本发明组合物(暂命名为“血栓瓦吉姆”)的药理学特性的研究，是在实验室的体外和体内条件下进行的。
在体外血栓溶解模型上(图1)研究组合物的血栓溶解特性。从所提供的图上得知，“血栓瓦吉姆”具有极明显的血栓溶解作用，而且确实胜过了标准治疗浓度——50PhU/ml-的纤维蛋白溶酶(p＜0.02)、胰蛋白酶(P＜0.01)和生理溶液中的血栓的自发的溶解(P＜0.01)。应当指出，随着血栓“年令”的增加到7天，“血栓瓦吉姆”的血栓溶液解特性仍能够保持住(图2)，此时，纤维蛋白溶酶对7天的血栓实际已不发生作用。头两个小时期间，纤维蛋白溶酶对血栓的作用与生理溶液中的自发的背景的溶解准确地一致。临近第4小时终结时，“血栓瓦吉姆”完全溶解了血栓，而在这个时间，纤维蛋白溶酶只溶解“陈旧”血栓质量的20％。
众所周知，纤维蛋白溶酶是最活性的溶纤剂(2)，这样的制剂有，诸如，链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂和组织纤维蛋白溶酶原，这些是非直接的纤维蛋白溶体并且它们的血栓溶解作用是通过活化纤维蛋白溶解系统和产生内生的纤维蛋白溶酶的间接方式发生影响的，后者导致已经形成的血栓发生溶解(1)。
在对大鼠应用氯化铁引起的颈动脉血栓模型上，研究了“血栓瓦吉姆”体内的血栓溶解的活性。
表2提供Wistar线鼠经过应用氯化铁后(0-15分钟)，预防性给予“血栓瓦吉姆”(每只动物80PU)对同侧颈动脉血流(ml/分)影响的结果。
表2
  组别   0分   15分   30分   45分   60分   75分   90分
  对照组n＝9   3.8±0.3   2.3±0.4   0.9±0.5   0.4±0.2   0.5±0.4   0.2±0.1   0.2±0.1
  试验组n＝10   2.9±0.3   2.5±0.1   2.1±0.3   1.9±0.4   1.9±0.5   1.9±0.4   1.7±0.4
从所提供的结果看出，在氯化亚铁起作用后的头1,5小时，预防性地引入“血栓瓦吉姆”可以有效地限制颈动脉中的血栓形成过程。
表3提供了给Wistar线鼠应用氯化铁(0-15分钟)后，治疗性地给予“血栓瓦吉姆”(每只动物80PU)对同侧颈动脉血流(ml/分)的影响结果。
表3
  组别   0分   15分   30分   45分   60分   75分   90分
  对照组n＝8   3.3±0.4   2.6±0.6   2.8±0.9   2.1±0.7   2.3±0.7   1.2±0.4   0.9±0.4
  试验组n＝9   3.8±0.3   3.3±0.5   2.7±0.5   1.7±0.4   1.6±0.3   1.6±0.4   1.8±0.4
从所提供的结果看出，往大鼠颈动脉作用氯化亚铁后的头1,5小时，治疗性给予“血栓瓦吉姆”，可以有效地抑制颈动脉处的血栓形成的进程。此外，组织学的(形态测量学的)研究表明，当治疗性给予“血栓瓦吉姆”24小时后，颈动脉完全闭塞和存在血栓的动物比例降低3倍。这证明本药剂具有明显的血栓溶解活性。
在诱导基本发炎介体之一的模型即发生内霉素休克(图3)的CBA线鼠的肿瘤坏死因子(αTNF)上，研究了本发明组合物的抗炎特性。采用生物方法和利用线细胞L929，测定了肿瘤坏死因子(αTNF)的活性并用作用单位(UA)表示。在图3上提供了完整动物(1)的肿瘤坏死因子(αTNF)的活性和给予内霉素(2)后的活性。在给予内霉素(3)之前的1小时，给予“血栓瓦吉姆”可以降低肿瘤坏死因子(αTNF)活性50倍。这证明了“血栓瓦吉姆”的抗炎特性。
在大鼠的抗炎痛胃病模型上(表1)和肾上腺素心肌炎模型上(图4)研究了“血栓瓦吉姆”的细胞保护特性。
表1
Figure G021542902D00141
从上述表中看出，对照的和试验的各组的大鼠，按它们的胃的总面积(SH)具有可比性，即指标没有可信的差异。各组内的出血(溢血)面积(SB)具有可信差异：预先引入“血栓瓦吉姆”(试验组)的SB组比对照组减少3倍(P＜0.01)。在比较相对损伤面积(S％)时，也观察到上述同样的可靠的比例关系。综上所述，在胃粘膜受到抗炎痛损伤时，“血栓瓦吉姆”具有明显的细胞保护作用。
图4提供患有肾上腺素心肌炎的大鼠坏死和心肌内营养不良的变化容积量的组织学和形态测量学的研究数据。采用测量面积法测定了受损体积，并用体积密度％来表示，它等于受损体积比上组织的总体积的比例再乘上100％。在对照组(K)给予肾上腺素后，往腹部引入NaCL等渗溶液1.0ml，2次/天，在试验组内(TRB)给予“血栓瓦吉姆”1.0ml，2次/天。从所提供的结果得出，肾上腺素心肌炎发作发展后，与对照组(K坏死)相比，用“血栓瓦吉姆”治疗在第3天终结时，可靠地降低心肌坏死的数量1.5倍(TBR坏死)。临近第7天终结时，试验组(TBR营养不良)心肌营养不良变化比对照组(K营养不良)可信地减少2,5倍。
表1和图4所提供的结果证明，“血栓瓦吉姆”具有明显的心脏保护和细胞保护作用。在由非类固醇的抗炎药剂引起的，具体是抗炎痛引起的特定的胃病时，准确地显示出“血栓瓦吉姆”的保护效果，并且对于急性肾上腺素心肌炎，其中对发病机制起关键作用的是急性局部缺血、坏死并发展为心肌萎缩症(营养障碍)，也具有治疗效果。
此外，还在肝局部缺血/再灌注模型上研究了解毒、抗局部缺血和细胞保护效果。为此，在Wistar线鼠试验组和对照组(每组各10支大鼠)的动物解剖后20分钟压迫了肝三岔脉，即完全闭锁了区域淋巴和血液循环。然后恢复血流并研究动物肝脏的组织学结构(基本的数量依据标准是指在区域性的淋巴结内白细胞的蓄积，作为由于局部缺血/再灌注的产物：过氧化物和自由基造成对肝脏组织的细胞毒素损伤的反应特征)。研究结果在图5上表示。
正如上面提供的结果，“血栓瓦吉姆”在肝脏局部缺血/再灌注模型上显示出具有肝脏保护作用，进一步肯定了本组合物具有的细胞保护、解毒和抗炎的特性。
虽然本发明的描述作为优选使用，具有推荐的性质，但是应当理解的是可以做各种修改而不会偏离本发明的实质精神。综上所述，本发明仅受限于下列权利要求书。

Claims (14)

1.具有溶栓、抗炎、解毒和细胞保护特性的组合物，所述组合物包含固定在水溶性聚合物混合物上的治疗有效量的活性蛋白酶，所述的活性蛋白酶选自枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶或番木瓜蛋白酶，所述的水溶性聚合物混合物为聚氧化乙烯和葡聚糖的混合物。
2.按照权利要求1的组合物，其特征在于蛋白酶在水溶性聚合物混合物上的固定是借助离子化的照射，使其作用于含有活性蛋白酶和水溶性聚合物混合物的水溶液而实现的。
3.按照权利要求2的组合物，其特征在于离子化照射采用加速电子流、γ-射线和紫外线照射。
4.按照权利要求1的组合物，其特征在于它包含含有冻干的固定在聚氧化乙烯和葡聚糖的混合物上的活性蛋白酶和溶剂的双组分的药剂形式。
5.按照权利要求4的组合物，其特征在于使用经离子化照射活化的聚氧化乙烯溶液作为溶剂。
6.按照权利要求1的组合物，其特征在于所述的组合物是用于非肠道或口服给药的组合物。
7.按照权利要求1的组合物，其特征在于所述的组合物是用于腔内和局部给药的组合物。
8.权利要求1的组合物的制备方法，其包括将蛋白酶附加到凝胶或者将蛋白酶附加到凝胶和水溶性聚合物的混合物上，以便形成非固态混合物并对混合物进行照射灭菌消毒。
9.按照权利要求8的方法，其中的照射为加速电子流或者γ-照射。
10.按照权利要求8的方法，其中的所述蛋白酶为枯草溶菌素。
11.固定在水溶性聚合物的混合物上的活性蛋白酶在制备用于治疗伴随有局部缺血、血栓形成、中毒和/或炎症的疾病的药物的用途，所述的活性蛋白酶选自枯草溶菌素、胰蛋白酶、糜蛋白酶或番木瓜蛋白酶，所述的水溶性聚合物的混合物为聚氧化乙烯和葡聚糖的混合物。
12.按照权利要求11的用途，所述的活性蛋白酶是以局部应用形式应用的。
13.权利要求12的用途，其中的局部应用形式选自气溶胶、注射、套针、支气管镜检验或栓剂。
14.按照权利要求11的用途，其中所述的蛋白酶为枯草溶菌素。
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