KR970005837B1 - 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 활성을 갖는 고농도 단백질 용액의 제조방법, t-PA 활성을 갖는 단백질 용액, 및 이러한 용액을 포함하는 섬유소 용해성 조성물 - Google Patents

조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 활성을 갖는 고농도 단백질 용액의 제조방법, t-PA 활성을 갖는 단백질 용액, 및 이러한 용액을 포함하는 섬유소 용해성 조성물 Download PDF

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Description

조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)활성을 갖는 고농도 단백질 용액의 제조방법, t-PA 활성을 갖는 단백질 용액, 및 이러한 용액을 포함하는 섬유소 용해성 조성물
본 발명은 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)활성을 갖는 고농도 단백질 용액의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조되는 단백질 용액, 및 이러한 용액을 포함하는 섬유소 용해성 조성물에 관한 것이다.
신체는 혈액손실 및 현전증으로부터 신체를 보호하기 위하여 평형으로 존재하는 2개의 시스템, 즉 응고시스템 및 섬유소 용해 시스템을 갖는다. 둘간의 상호 작용은, 먼저 불용성 섬유소 중합체가 생성되어 출혈을 멈추게한 다음 상처부위가 회복되는 동안 섬유소 용해의 분해과정에 의해서 분해되는 것을 보장한다.
트롬빈과 플라스민은 두 시스템에서 중요한 효소(Key enzymes)이다. 생리학적 조건하에서, 응고 시스템과 섬유소 용해 시스템간의 동적 평형은 트롬빈의 혈전형성 활성 및 플라스민의 혈전용해 활성의 조절하에있다. 관련된 억제제는 평형에 기여한다. 두 시스템중 하나가 우세한 경우 치명적인 결과, 즉 출혈 및 혈전증 뿐만아니라 혈관손상을 가져올 수 있다.
현전용해 활성을 갖는 플라스민은 상당히 비-특이적인, 트립신-유사 세린 프로테아제이다. 이것은 불활성 전구체의 형태인 플라스미노겐으로 합성된다. 플라스미노겐은 불활성 전구체로서 혈액중에서 순환하며 특정자극에 대한 반응으로만 활성화된다. 플라스미노겐이 플라스민으로 전환되는 것은 플라스미노겐 활성 화제에 의해서 촉매된다.
플라스미노겐은 4개의 상이한 플라스미노겐 활성화제 시스템에 의해 활성화될 수 있다:
1. 인자XII-의존성 시스템,
2. 스트렙토코커스(Streptococcus)로부터 분리된 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제(streptokinase),
3. 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 및
4. 뇨의 플라스미노겐 활성화제[u-PA또는 유로키나제(urokinas)].
인자XII-의존성 시스템을 통한 활성화는 단지 미소한 생리학적 중요성을 갖는다. 세균의 플라스미노겐활성화제인 스트렙트키나제가 상당한 치료학적 중요성을 지니기는 하지만, 뇨의 플라스미노겐 활성화제 유로키나제와 동일한 방법으로, 투여 또는 방출후에 전체 혈관 시스템에서 활성이기 때문에 표적 부위에서뿐만 아니라 다른곳에서도 플라스미노겐이 활성화되므로 유리하지 못하다. 최종적으로, 조직 플라스미노겐활성화제는 많은 조직 및 조직액중에 존재하는 단백질이며, 섬유소에 결합한 후에만 이의 완전한 섬유소용해활성을 나타낸다. 따라서, t-PA에 의한 플라스미노겐 활성화는 표적 부위에서만 특이적으로 일어나는 반응이며 다른 혈장 단백질의 동시적인 비-특이적 단백질 분해(proteolysis)의 위험과는 관계가 없다.
상기 원인과 관계없이 섬유소 용해 시스템의 저기능은 혈전 형성에 기인한 혈과 폐색을 일으킬 수 있다. 상기와 같은 혈전의 결과의 예로는 심근 경색, 페색전증 또는 발작이 있다. 플라스미노겐 활성화제의 투여는, 섬유소 용해 시스템의 저기능으로부터 유도되는 여러가지 질병의 예방 및 치료에 있어서 중요한 역할을 한다. 투여된 플라스미노겐 활성화제가 부작용이 없는 섬유소-특이적 용해 치료를 허용할 수 있어야만이 이상적이다. 이러한 요구는 이미 언급한 바와 같이 t-PA 활성이 섬유소에 대한 결합에 의존하기 때문에 t-PA에 의해서만 만족될 수 있다.
t-PA를 동물 세포로부터 치료에 충분한 양으로 생성할 수 있다. 그러나, t-PA는 유로키나제와 같이 인체네에서 단지 3내지 8분의 반감기를 갖는다. 이 결과로서, t-PA를 예를 들면 혈관내 주입형태로 일정하고도 지속적으로 운반해야 한다. 동시에, 운반되는 유액의 용량도 가능한 소량 유지되어 심장 또는 신장 부전으로 환자에게 추가로 스트레스를 주지말아야 한다. 따라서, 가능한 최고로 높은 농도가 t-PA를 함유하는 생리학적으로 허용되는 비경구 용액의 제형화에 필요하다.
3,000 내지 50,000U/㎖의 t-PA 농도는 EP-A 제156,169호에 기술된 조건하에서 리신 또는 오르니틴을가함으로써 도달될 수 있다. 이로써, 요구되는 치료투여량으로 매우 대량의 액체를 운반하게 된다. EP-A제156,169호에 기술된 바와 같이 리신 또는 오르니틴을 가하면 이상적으로 치료에 사용될 수 있는 t-PA를 함유하는 용액이 될 수 없다.
독일연방공화국 공개특허공보 제3,617,753호에는 pH를 2내지 5로 낮춤으로써 5,000,000U/㎖ 이하의 t-PA농도가 되는 t-PA용액이 기술되어 있다. 이것은 용액에 있어서 치료적으로 이상적인 t-PA농도를 성취시키지만, 이것은 또한 심하게 비-생리학적인 pH를 갖는 용액을 주입해야 한다. 이러한 용약의 투여로 인해 주입부위의 근처에서 피부자극 및 혈관손상을 피할 수 없게 된다.
따라서, 본 발명의 목적은 t-PA활성을 갖는 단백질의 비경구적으로 투여할 수 있는, 고도로 농축되고 생리학적으로 허용되는 용액의 제조를 가능케하는 방법을 제공하는 것이다.
이 목적은 D-및/또는 L-아미노산, 이의 염, 유도체 또는 동족체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2개 이상의 물질을 상기 용액에 가함으로써 본 발명에 따라서 성취된다.
놀랍게도, D-및/또는 L-아미노산, 이의 염, 유도체 또는 동족체 그룹중에서 선택되는 2개 이상의 물질을 가하면 t-PA활성을 갖는 단백질에 대해 안정성 증진효과가 나타났다. 동시에, 이들 물질을 몇개 혼합함으로써 단백질의 증가된 용해도가 관찰될 수 있다. 두 효과의 정도는 완전히 예측하지 못한 것이다. 안정성에 있어서의 증가 및 용해도의 상승은 모두 개별적 작용의 상승작용으로부터 분명하게 유도된다.
예를 들어 리신, 오르니틴, 아르기닌, 디아미노피멜산, 아그마틴, 크레아틴, 구아니디노아세트산, 아세틸오르니틴, 시트룰린, 아르기니노석신산, 트라넥삼산 및 ε-아미노-카프로산과 같은 본 발명에 따르는 물질은 주입용 용액의 체형용으로 현저하게 적합하다. 이들 모두에 대해 공통적인 특징은 아미노 및/또는 구아니디노그룹의 형태로 염기성 그룹이 존재하는 것이다.
바람직하게는 0.001 내지 1mol/ℓ,특히 바람직하게는 0.01내지 0.5mol/ℓ의 아르기닌과 리신의 배합이 플라스미노겐 활성화제 활성을 갖는 단백질의 고농도용액의 제조에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 예를 들면, 4℃에서 5일 동안 배양한 후 세포 배양 상등액중의 t-PA활성은 초기값의 31%로 떨어지는 반면, 아르기닌 0.1mol/ℓ 및 리신 0.1mol/ℓ을 가하고 동일시간 동안 배양한 후에 동일한 샘플중의 활성은 단지 5%만 감소되는 것으로 나타났다.
본 발명에 따르는 물질의 안정성 증진효과 및 용해도 증가 효과는 단일쇄 또는 이쇄형태의 조직 플라스미노겐 활성화제 및 천연적으로 존재하거나 합성 또는 유전자조작에 의해 제조되는 유도체 모두에 대해서, 또는 t-PA 및 천연적으로 존재하거나 합성 또는 유전자 조작에 의해 제조되는 이의 유도체중의 하나, 및/또는 프로-유로키나제 또는 유로키나제와의 배합물에 대해 관찰되었다.
t-PA 또는 동일한 활성을 갖는 단백질의 분리는 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 경우에 따라, t-PA활성을 갖는 단백질을 먼저 카오트로픽제(chaotropic agent)(예:KSCN)의 완충 용액에 대해 투석시켜 용해시키고 이 상태에서 원하는 t-PA농도를 농축시킨 다음, 본 발명에 따르는 물질 2개 이상, 바람직하게는 아르기닌 및 리신을 함유하는 완충용액에 대해 투석시킨다. 예를 들면, 약 0.05mol/ℓ 트리스-HCI(pH 7)중의 약 1.6mol/ℓ KSCN에 대해 먼저 투석시킨 다음, 0.05mol/ℓ 트리스-HCI(pH 7)중의 각각 0.1mol/ℓ의 아르기닌 및 리신에 대해 투석시킨 플라스미노겐 활성화제 활성을 갖는 단백질의 용액을 필요로 한다.
그러나, 마찬가지로 본 발명에 따른 물질을 세포 배양 상등액에 직접 가함으로써 안정성-증진효과를 성취할 수 있다. 본 발명에 따라서 처리된 세포 배양 상등액은 t-PA활성을 가지며 이의 특이 활성이 대조 용액의 3배인 단백질을 분리시킬 수 있다.
본 발명에 따르는 물질의 안정성- 및 용해도-증진 효과는 광범위한 범위의 pH에 대해 독립적이다. 상응하는 단백질-함유 용액의 pH는 5 내지 10일 수 있으며 6 내지 8이 바람직하다.
수많은 생물학적 활성 분자가 저온 살균(pasteurization)에 의해 분해되기 때문에 비경구 투여용 용액은여과에 의해 살균하는 것이 통상적이다. 그러나, 바이러스의 존재는, 두창백신의 SV 40 오염 또는 인자 Ⅷ제제에 의한 AIDS바이러스의 전반(transmission)에 의해 증면된 바와 같이, 여과에 의해 살균된 제품에서 결코 완전히 제거될 수 없다. 본 명세서에 기술하는 방법의 중요한 잇점은 t-PA활성을 갖는 단백질이 본발명에 따른 물질의 첨가에 의해 충분하게 안정화되며 이의 활성은 저온 살균후에도 실질적으로 보존된다는 것이다. t-PA-함유 완충용액은 예를들면, 저온-살균후에 초기 활성의 0.5%만 보존되는 반면에 아르기닌 및 리신을 각각 1mol/ℓ씩 가함으로써 초기 활성의 약 85%가 보존될 수 있다.
본 발명에 따른 물질의 안정화 효과는 저온살균의 유형과는 실질적으로 독립적이다. 따사서, 저온살균은pH 5 내지 10에서 1 내지 60시간 동안 40℃ 내지 90℃의 온도에서 배양함으로써 수행될 수 있다.
그러나, 저온살균은 실질적으로 생리학적 pH, 즉 pH6 내지 pH8에서, 6 내지 16시간 동안 50℃ 내지 70℃의 온도에서 배양함으로써 편리하게 수행된다.
가장 바람직한 양태는 대략 pH7에서 저온 살균하는 것으로, 즉 t-PA활성을 갖는 단백질을 60℃에서 10시간 동안 배양하는 것이다.
단백질-함유 용약은 경우에 따라, 추가의 첨가제, 예를들면 단당류 또는 이당류, 당 알콜, 및 경우에 따라, 예를들면, 알부민, 젤라틴, 해마셀(Haemaccell), 염화나트륨, 염화칼슘, 헤파린, EDTA, 글리신 또는 세제와 같은 다른 추가의 성분과 혼합될 수 있다. 이들 추가의 성분은 예를 들면, 안정화, 시스템의 완충, 프로테아제의 억제,표면 장력의 감소 및 삼투압의 조절을 위하여 생리학적으로 허용되는 양으로 가한다.
슈크로스 또는 솔비톨을 가하면 저온 살균 동안에 추가의 안정성-증진 효과를 갖는다. 따라서, 아르기닌 및 리신을 각각 0.5mol/ℓ씩 함유하는 글리신-완충 t-PA용액에 있어서 저온살균 후에 잔류하는 활성분자의 양은 약81%에서 96%로 증가될 수 있다. 이와 관련하여, 슈크로스 또는 솔비톨을 리터당 0.2 내지 2kg가하는 것이 바람직하다.
t-PA, 또는 본 발명에 따라서 처리되는, 동일한 작용을 갖는 단백질의 활성은 돌결 건조시킨 다음 사용하기 직전에 멸균수에 용해시켜도 보존된다.
t-PA활성을 가지며 이의 농도가 5×106U/㎖보다 높은 단백질 용액을 본 발명에 따른 방법에 의해서 제조할 수 있다. 이 농도는 연장된 기간에 걸쳐서 연속 주입하는 경우에도 투여에 문제가 없음을 보장한다. 배설에 지극히 어려움을 갖는 환자에 있어서 용해도 또는 안정성의 문제를 발생시키지 않고 t-PA 농도를 3×106U/㎖로 상승시킬 수 있다.
선택된 t-PA농도와 관계없이, 본 발명에 따라서 제조된 용액의 활성은 저온 살균 후에도 필수적으로 보조되는 것으로 나타났다. 본 발명에 따르는t-PA활성을 갖는 단백질 수용액은 저온에 의해 살균되는 첫번째 플라스미노겐 활성화제 제제이며 치료적으로 가치가 있는 특이 활성 농도를 갖는다.
본 발명에 따르는 용액은 인체 및 수의약제 용도에 모두 적합하다. 생리학적으로 허용되는 물질만을 가하기 때문에, 본 발명에 따르는 용액을 투여하였을 때 염증, 피부자극 또는 혈관 손상을 일으키지 않는다.
본 발명에 따르는 용액의 바람직한 용도는 혈전증 및 색전증의 치료 및 예방이다. 즉, 본 발명에 따르는 제제는 섬유소 용해제로서 사용될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 설명한다.
[실시예 1]
t-PA-생성 CHO세포(중국산 햄스터 난소: Chinese hamster ovary)를 5% 소혈청을 함유하는 둘배코(Dulbecco)의 변형 이글(Eagle)배지 20ℓ중에서 배양한다. 세포 배양 상등액을 매24시간 마다 수거하고 신선한 배지로 대체시킨다.
멸균 조건하에서 수거한 세포 배양 상등액을 0.1mol/ℓ의 아르기닌 및 0.1mol/ℓ의 리신의 존재 또는 부재하에서 5일동안 +4℃에서 보관한다.
t-PA활성을 랜디(참조 : Randy,Progress in Fibrinolysis 5, 233-235, 1981)의 방법으로 매일 측정한다.
Figure kpo00001
상기 결과는 처리되지 않은 세포 배양 상등액중의 활성 t-PA함량이 거의 70%감소, 즉 후속적으로 분리된 단백질의 특이 활성이 단지 수거시의 특이 활성의 약30%임을 나타낸다.
그러나, 본 발명에 따라서 처리된 세포 배양 상등액의 활성의 감소는 단지 5%이므로, 아르기닌 및 리신의 첨가는 세포 배양 상등액을 활성의 상당한 손실없이 일시적으로 보존할 수 있도록 한다.
[실시예 2]
t-PA-함유 용액을 pH7.0인 0.05mol/ℓ트리스-HCI중의 KSCN 1.6mol/ℓ에 대해 투석시킨 다음, pH7.0인 0.5mol/ℓ의 트리스HCI중의 0.1mol/ℓ의 아르기닌 및 0.1mol/ℓ의 리신을 함유하는 완충용액에 대해 투석시키고 1㎖당 t-PA 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 10, 20, 40, 60 및 80mg이 되도록 농축시킨다. 용액중의 t-PA를 60mg/㎖의 농도까지 유지시킬 수 있음이 관찰되었다. 다른 첨가제 없이 Tween 80 (0.1%)과의 용해도 한계는 0.5mg t-PA/㎖이다.
[실시예 3]
t-PA-함유 용약을 pH7.0인 0.05mol/ℓ트리스중의 KSCN 1.6mol/ℓ에 대해 투석시킨 다음, 아르기닌 및 리신의 농도를 증가시키면서, 0.05mol/ℓ의 글리신을 함유하는 pH7.0인 완충액에 대해 투석시킨다. 0.5 또는 1g/㎖의 슈크로스를 지시된 t-PA-함유 용액에 가한다. 용액의 pH를 7로 조절한다. 용액을 60℃에서 10시간 동안 가열한다. t-PA활성을 저온살균전후로 측정한다.
Figure kpo00002
상기 표는 슈크로스 및 아르기닌과 리신의 첨가가 모두 플라스미노겐 활성화제에 안정화 효과를 제공함을 나타낸다. 슈크로스, 아르기닌 및 리신을 전혀 가하지 않은 샘플에서의 활성은 저온 살균에 의해 거의 완전히 파괴되지만, 단지 1g/㎖의 슈크로즈를 가한후에는 초기 활성의 68%가 보존되었다. 이런 양태는 아르기닌과 리신의 첨가에 의해 상당히 증진될 수 있어서, 1g/㎖의 슈크로스 및 각각 0.5mol/ℓ의 아르기닌과리신의 배합물의 첨가에 의해 초기 활성의 96%가 보존되므로, 이는 저온살균에 기인하는 활성의 손실이무시할 정도로 적어짐을 의미한다.

Claims (13)

  1. 단일쇄 또는 이쇄 형태의 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)함유 용액, 또는 천연적으로 존재하거나 합성 또는 유전자 조작에 의해 제조된 상기 t-PA의 유동체를 함유하는 용액을 제조하는 단계; 및 이러한 용액에 아르기닌 0.001 내지 1mol/ℓ과 리신 0.001 내지 1mol/ℓ를 첨가하는 단계를 포함하는, 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)활성을 갖는 단백질 용액의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, t-PA함유 용액이 프로-유로키나제 또는 유로키나제를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 첨가 단계가 t-PA함유 용액을 아르기닌과 리신을 함유하는 완충용액에 대해 투석시킴을 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, t-PA함유 용액이 세포 배양 상등액인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 첨가 단계후에, 용액을 pH5 내지 10에서 1 내지 60시간동안 40℃ 내지 90℃에서 배양함으로써 저온살균(pasteurization)시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 저온살균을 pH6 내지 8에서 6내지 16시간동안 50℃ 내지 70℃에서 배양함으로써 수행하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 리신과 아르기닌을 첨가한 후 저온살균시키기전에, 슈크로즈 및 솔비톨로 이루어진 그룹중에서 선택된 저온살균 안정화 물질의 유효량을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 안정화 물질이 슈크로스, 솔비톨 또는 이들의 배합물 0.2 내지 2kg/ℓ를 포함하는 방법.
  9. 제1항에서 청구된 방법에 의해 제조되며 특이 활성 농도가 5×106U/㎖보다 높은, t-PA활성을 갖는 단백질 용액.
  10. 활성 성분으로서 제9항에서 청구된 단백질 용액을 포함하는 섬유소 용해성 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 아르기닌 및 리신을 각각 0.01 내지 0.5mol/ℓ로 가하는 방법.
  12. 제3항에 있어서, 완충용액이 0.1mol/ℓ의 아르기닌 및 0.1mol/ℓ의 리신을 함유하고 pH가 7인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 비경구 투여용 조성물.
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