FI93798B - Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta - Google Patents

Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta Download PDF

Info

Publication number
FI93798B
FI93798B FI882605A FI882605A FI93798B FI 93798 B FI93798 B FI 93798B FI 882605 A FI882605 A FI 882605A FI 882605 A FI882605 A FI 882605A FI 93798 B FI93798 B FI 93798B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
solution
activity
mol
plasminogen activator
lysine
Prior art date
Application number
FI882605A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI882605A (fi
FI882605A0 (fi
FI93798C (fi
Inventor
Hans-Arnold Stoehr
Eric Paul Paques
Original Assignee
Behringwerke Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke Ag filed Critical Behringwerke Ag
Publication of FI882605A0 publication Critical patent/FI882605A0/fi
Publication of FI882605A publication Critical patent/FI882605A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI93798B publication Critical patent/FI93798B/fi
Publication of FI93798C publication Critical patent/FI93798C/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/49—Urokinase; Tissue plasminogen activator
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0023—Heat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Description

93798
Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta 5
Keksintö koskee menetelmää, jonka avulla valmistetaan ja mahdollisesti pastöroidaan proteiiniliuos, jossa on kudos-plasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta, jonka spesifinen tilavuusaktiivisuus on yli 5*106 U/ml.
10 Elimistössä on kaksi tasapainossa olevaa systeemiä suojaamassa sitä sekä verenhukalta että verisuonitukoksilta: hyytyrnissysteemi ja fibrinolyyttinen systeemi. Näiden välinen yhteistoiminta tekee mahdolliseksi sen, että verenvuodon tyrehdyttämiseksi syntyy ensiksi liukenemattomia 15 fibriinipolymeerejä, jotka haavan parantuessa taas fibri-nolyysin hajottavassa vaiheessa hajoavat.
Trombiini ja plastiini ovat molempien systeemien avainentsyymejä. Fysiologisissa olosuhteissa vallitsee trombiinin tromboplastisen aktiivisuuden ja plasmiinin , 20 trombolyyttisen aktiivisuuden kontrolloima dynaaminen tasapaino hyytymis- ja fibrinolyysisysteemin välillä. Tasapainon ylläpitämisessä auttavat kulloinkin mukana olevat inhibiittorit. Jomman kumman systeemin ylivoimalla voi olla kohtalokkaita seurauksia, nimittäin sekä verenpur-25 kaumia ja verisuonitukoksia että verisuonivaurioita.
Trombolyyttisesti vaikuttava plasmiini on suhteellisen epäspesifinen, trypsiinin kaltainen seriiniproteaa-si. Sitä syntetisoidaan epäaktiivisen esimuodon, plasmi-nogeenin muodossa. Plasminogeeni kiertää epäaktiivisena 30 esimuotona veressä ja aktivoituu vasta tiettyjen ärsykkeiden vaikutuksesta. Plasminogeenin muuttumista plasmii-.. . niksi katalysoivat plasminogeeniaktivaattorit.
Plasminogeenin aktivointi voi tapahtua neljän erilaisen plasminogeeniaktivaattorisysteemin välityksellä: 35 1. tekijästä XII riippuvan systeemin, 2 93798 2. streptokokeista eristetyn plasminogeeniakti-vaattorin, streptokinaasin, 3. kudos-plasminogeeniaktivaattorin (t-PA) ja
4. urinaarisen plasminogeeniaktivaattorin (u-PA
5 tai urokinaasi) avulla.
Tekijästä XII riippuvan systeemin avulla aktivoinnilla on vain vähäinen fysiologinen merkitys. Bakteeriperäisellä plasminogeeniaktivaattorilla streptokinaasilla on tosin yhä edelleen suuri terapeuttinen merkitys, mutta 10 sillä on kuten myös urinaarisella plasminogeeniaktivaat torilla urokinaasilla haittana se, että se vaikuttaa käytön tai vapautumisen jälkeen koko verisuonisysteemissä, eli se ei saa aikaan aktivoitumista pelkästään kohteessa. Kudos-plasminogeeniaktivaattori on taas monissa kudoksis-15 sa ja kudosnesteissä mukana oleva proteiini, joka vasta sitouduttuaan fibriiniin kehittää täyden fibrinolyyttisen aktiivisuutensa. Plasminogeeniaktivointi t-PA:n avulla on siis spesifisesti vain kohteessa tapahtuva reaktio, jonka yhteydessä ei ole vaarana muiden plasmaproteiinien saman-20 aikainen epäspesifinen proteolyysi.
Fibrinolyyttisen systeemin vajaatoiminta, joka voi olla mitä alkuperää tahansa, voi johtaa tukosten muodostumisesta johtuen suonentukkeutumisiin. Sellaisten tukosten seuraukset ovat esimerkiksi sydäninfarktit, keuhkoveritul-( , 25 pat tai myös halvauskohtaukset. Monien fibrinolyyttisen systeemin vajaatoiminnasta riippuvien sairauksien ennaltaehkäisyssä ja hoidossa plasminogeeniaktivaattoreiden käytöllä on ratkaiseva merkitys. Ihanteellisessa tapauksessa käytetyn plasminogeeniaktivaattorin tulisi tehdä mahdolli-30 seksi sivuvaikutukseton fibriinispesifinen hajoitushoito.
Tämän vaatimuksen voi täyttää vain t-PA, koska t-PA-akti-vointi riippuu sitoutumisesta fibriiniin, kuten jo on mainittu. t-PA:a voidaan valmistaa riittävässä määrin eläin-soluista. t-PA:n kuten myös urokinaasin puoliintumisaika 35 ihmiskehossa on vain 3-8 min. Siitä on seurauksena, että 3 93798 t-PA:n tasainen ja keskeytymätön saanti täytyy tehdä mahdolliseksi esim. suonensisäisen infuusion avulla. Samanaikaisesti saadun nestemäärän tilavuus täytyy pitää mahdollisimman pienenä, jotta potilaita, joilla on sydämen tai 5 munuaisten vajaatoimintaa, ei ylimääräisesti rasitettaisi. Sen vuoksi t-PA-pitoisten, fysiologisesti siedettävien parenteraalisten liuosten muotoilemiseksi vaaditaan mahdollisimman suurta spesifistä tilavuusaktiivisuutta.
EP-hakemusjulkaisussa 156 169 kuvatuissa olosuh-10 teissä voidaan lisäämällä lysiiniä ja ornitiiniä saavuttaa t-PA-konsentraatioita 3 000 - 50 000 yksikköä/ml. Vaadittavaan terapeuttiseen annostukseen tarvittaisiin siis hyvin suuri nesteen syöttö. Lysiinin tai ornitiinin lisääminen EP-patenttihakemuksessa 156 169 kuvatulla tavalla ei 15 voi johtaa terapeuttisesti käyttökelpoisiin t-PA-pitoisiin liuoksiin.
DE-hakemusjulkaisussa 36 17 753 kuvataan t-PA-liuoksia, joissa saavutetaan t-PA-pitoisuuksia arvoon 5 000 000 yksikköä/ml asti alentamalla pH-arvoa välille « , .*20 2-5. Näin liuoksessa saavutetaan tosin terapeuttisesti puolustettavissa oleva t-PA-konsentraatio, mutta liuoksen infuusio ei ole mahdollista, koska pH-arvo on fysiologisesti täysin sopimaton. Sellaisten liuosten anto aiheuttaa infuusiokohdan läheisyydessä ihoärsytystä ja verisuo-25 nivaurioita.
Tämän keksinnön tarkoituksena oli sen vuoksi saada käyttöön menetelmä, joka tekee mahdolliseksi valmistaa suuren konsentraation t-PA-aktiivisuuden omaavaa proteiinia sisältäviä parenteraalisesti annettavia, fyaiologises-30 ti siedettäviä liuoksia.
Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti niin, että liuokseen lisätään vähintään kaksi ainetta ja/tai L-aminohappojen ryhmästä. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että muodostetaan liuos, joka sisäl-35 tää kudos-plasminogeeniaktivaattoria yksi- tai kaksiket- 4 93798 juisessa muodossa tai luonnossa esiintyvänä, synteettisesti tai geeniteknologisesti valmistettuna johdannaisena, ja liuokseen lisätään 0,001 - 1 mol/1 argiininiä ja 0,001 - 1 mol/1 lysiiniä.
5 Yllättävästi n havaittu, että arginiinin ja lysii- nin lisäys liuokseen vaikuttaa stabiilisuutta parantavasti t-PA-aktiivisuuden omaaviin proteiineihin. Samalla voidaan havaita proteiinin lisääntynyt liukoisuus. Molemmat ilmiöt ovat selväpiirteisyydessään täysin odottamattomia. Sekä 10 stabiilisuuden paraneminen että liukoisuuden lisääntyminen perustuvat ilmeisesti yksittäisten ilmiöiden yhteisvaikutukseen .
Valmistettaessa liuosta, jolla on plasminogeeniak-tivaattoriaktiivisuuden omaavan proteiinin suuri spesifi-15 nen tilavuusaktiivisuus, on osoittautunut sopivaksi arginiinin ja lysiinin yhdistelmä, joka sisältää näitä aineita 0,001 - 1 mol/1, edullisesti 0,01 - 0,5 mol/1. Niinpä voitiin esim. osoittaa, että t-PA-aktiivisuus soluviljelmän . . , supernatantissa oli laskenut lämpötilassa +4 eC suoritetun --- 20 5 päivän inkuboinnin jälkeen 31 %:in lähtöarvosta, kun taas lisättäessä rinnakkaisnäytteeseen 0,1 mol/1 arginii-nia ja 0,1 mol/1 lysiiniä aktiivisuus laski saman inku-bointiajan kuluttua vain 5 %.
Edellä esitettyjen aineiden stabiilisuutta edistä-., 25 vä ja liukoisuutta parantava vaikutus voitiin havaita sekä kudos-plasminogeeniaktivaattorilla yksi- ja kaksiket-juisessa muodossaan että luonnossa esiintyvillä, synteettisesti tai geeniteknologisesti valmistetuilla johdannaisilla tai myös t-PA:n ja sen luonnossa esiintyvien syn-30 teettisesti tai geeniteknologisesti valmistettujen johdannaisten ja/tai pro-urokinaasin tai urokinaasin yhdistelmillä.
t-PA:n tai saman aktiivisuuden omaavan proteiinin eristäminen voidaan suorittaa käyttäen tavallisia mene-35 telmiä. Mahdollisesti t-PA-aktivisuutta omaava proteiini 5 93798 saatetaan liuotettuun muotoon ennen kaikkea dialysoimalla kaotrooppisen aineen, esim. KSCN:n, puskuroitua liuosta vastaan, konsentroidaan tässä tilassa haluttuun t-PA-kon-sentraatioon ja sen jälkeen dialysoidaan vähintään argi-5 niiniä ja lysiiniä sisältävää puskuroitua liuosta vastaan. Tällöin plasminogeeniaktivaattoriaktiivisuutta omaavan proteiinin liuos dialysoidaan edullisesti ensin noin 1,6 mol/1 KSCN:a sisältävää 0,05-M Tris-HC1-liuosta vastaan, jonka pH on 7, ja sen jälkeen 0,1 mol/1 sekä arginiinia 10 että lysiiniä sisältävää 0,05-M Tris-HCl-liuosta vastaan, jonka pH on 7.
Stabiilisuutta parantavia vaikutuksia voidaan kuitenkin saada aikaan myös lisäämällä edellä mainitut aineet suoraan soluviljelmän supernatanttiin. Keksinnön mu-15 kaisesti käsiteltyjen soluviljelmien supernatanteista eristetään t-PA-aktiivisuuden omaavat proteiinit, jolloin niiden ominaisaktiivisuuden havaitaan kohonneen kolminkertaiseksi vertailuseerumiin nähden.
. . Arginiinin ja lysiinin stabilisuutta ja liukoisuut- ••20 ta parantavat vaikutukset ovat laajalla alueella pH-arvo-sta riippumattomia. Vastaavan proteiinipitoisen liuoksen pH voi olla välillä 5 - 10 ja edullisesti välillä 6-8.
Tavallisesti parenteraaliseen käyttöön tarkoitetut liuokset steriilisuodatetaan, koska monet biologisesti 25 aktiiviset molekyylit tuhoutuisivat pastöroitaessa. Ste- riilisuodatettujen tuotteiden yhteydessä ei kuitenkaan koskaan ole täysin varmaa, että virukset olisi saatu täysin poistetuksi, kuten rokkojen vastaisten rokotusten SV 40-kontaminaatio ja AIDS-viruksen siirtyminen tekijä VII-30 I-preparaattien välityksellä osoittavat. Tässä kuvatun menetelmän oleellinen etu on se, että t-PA-aktiivisuuden ’· omaavat proteiinit stabiloituvat lisättäessä edellä mai nittuja aineita niin hyvin, että niiden aktiivisuus on tallella suuressa määrin vielä pastöroinnin jälkeen. Kun 35 matalassa lämpötilassa suoritetun pastöroinnin jälkeen 6 93798 0,5 % lähtöarvosta, lisättäessä 1 mol/1 sekä arginiinia että lysiiniä, voitiin säilyttää noin 85 % alkuperäisestä aktiivisuudesta.
Arginiinin ja lysiinin stabiilisuutta parantava 5 vaikutus on suuressa määrin pastörointitavasta riippumaton. Niinpä pastörointi pH-alueella 5-10 voidaan suorittaa inkuboimalla 1-60 tuntia lämpötiloissa 40 - 90 °C.
On kuitenkin tarkoituksenmukaista suorittaa pastörointi lähes fysiologisella pH-alueella, eli pH-arvoilla 10 6-8, inkuboimalla lämpötiloissa 50 - 70 °C 6 - 16 tunnin aj an.
Edullinen suoritusmuoto on matalalämpötilapastöroin-ti pH-arvon ollessa noin 7, eli t-PA-aktiivisuuden omaavaa proteiinia inkuboidaan 10 tunnin ajan lämpötilassa 60 °C.
15 Proteiinipitoiseen liuokseen voidaan mahdollisesti sekoittaa muita lisäaineita, esim. mono- tai disakkaride-ja, sokerialkoholeja, mahdollisesti myös muita mukaan tulevia aineita kuten esimerkiksi albumiineja, gelatiineja, ; - verisoluja, natriumkloridia, kalsiumkloridia, hepariinia, • ' 20 EDTA:a, glysiiniä tai pinta-aktiivisia aineita. Fysiologisesti siedettävien määrien lisääminen näitä aineita tehdään esim. stabiloimisen, systeemin puskuroinnin, proteaa-sien estämisen, pintajännityksen pienentämisen ja osmoosin vähentämisen vuoksi.
25 Sakkaroosin tai sorbiitin lisäämisellä on pastö roinnin yhteydessä vielä stabiilisuutta parantava vaikutus. Siten pastöroinnin jälkeen glysiinillä puskuroidussa t-PA-liuoksessa, joka sisältää 0,5 mol/1 sekä arginiiniä että lysiiniä, aktiivisten molekyylien osuus on kohonnut 30 arvosta noin 81 % arvoon 96 %. Edullista on tällöin lisätä 0,2 - 2 kg sakkaroosia tai sorbiittia litraan liuosta.
* Tämän keksinnön mukaisesti käsitellyn t-PA:n tai saman vaikutuksen omaavien proteiinien aktiivisuus on jäljellä myös kylmäkuivauksen ja sitä seuraavan, välittö-35 mästi ennen käyttöä suoritettavan steriloituun veteen liuotuksen jälkeen.
Il 7 93798
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan valmistaa t-PA-aktiivisuuden omaavaa proteiiniliuosta, jonka spesifinen tilavuusaktiivisuus on yli 5 · 106 yksikköä/ml. Tämä konsentraatio tekee mahdolliseksi ongelmattoman käytön 5 myös pitkäaikaisen keskeytymättömän infuusion yhteydessä. Potilailla, joilla on suuria vaikeuksia erityksessä, t-PA-konsentraatio voidaan nostaa arvoon 30 · 106, ilman että esiintyy liukoisuus- tai stabiilisuusongelmia.
Valitusta t-PA-konsentraatiosta riippumatta on 10 osoittautunut, että keksinnön mukaisesti valmistettujen liuosten aktiivisuus säilyy oleellisesti pastöroinnin jälkeen. t-PA-aktiivisuuden omaavan proteiinin vesiliuoksen ensimmäisellä, pastöroimalla steriloidulla plasminogeeni-aktivaattoripreparaatilla on terapeuttisesti mielekäs spe-15 sifinen tilavuusaktiivisuus.
Keksinnön mukainen liuos soveltuu käytettäväksi yhtä hyvin ihmis- ja eläinlääketieteessä. Koska liuokseen lisätään vain fysiologisesti siedettäviä aineita, keksinnön mukaisesti valmistetun liuoksen käytön yhteydessä ei *.20 esiinny tulehduksia eikä ihoärsytystä tai verisuonivauri oita.
Keksinnön mukaisen liuoksen edullinen käyttöalue on verisuonitukosten ja veritulppien hoito ja ehkäisy, eli valmistetta voidaan käyttää fibrinolyyttisenä aineena.
25 Esimerkit selventävät keksintöä.
Esimerkki 1 t-PA:ta tuottavia CHO-soluja (Chinese Hamster Ovary) kasvatettiin 20 l:ssa "Dulbecco's modified Eagles Medium "-kasva tusliuosta, joka sisälsi 5 % naudanseerumia. 30 Soluviljelmän supernatantit otettiin talteen joka 24. tunti ja korvattiin tuoreella aineella.
? Steriilisti talteenotettuja soluviljelmäsuperna- tantteja säilytettiin 5 päivää lämpötilassa +4 °C argi-niinin (0,1 mol/1) ja lysiinin (0,1 mol/1) läsnäollessa 35 tai ilman niitä.
93798 ____ -· n...
8 t-PA-aktiivisuus määritettiin päivittäin käyttäen Ranbyn (Progress in Fibrinolysis 5, 233-235, 1981) menetelmää .
5 Inkuboinnin Aktiivisuus/% kesto lämpö- Soluviljelmä- Soluviljelmä- tilassa +4°C supernatantti supernatantti (päivää) ilman Arg ja Lys 0,1 mol/lArg + _0.1 mol/1 Lys 10 - 100 100 1 65 98 2 52 97 3 40 96 4 35 96 15 5 31 95
Tulokset osoittavat yksiselitteisesti, että aktiivisen t-PA:n osuus käsittelemättömässä soluviljelmässä laskee melkein 70 % eli että sen jälkeen eristetyn pro-20 teiinin spesifinen aktiivisuus on tuskin 30 % kokoamishet-ken spesifisestä aktiivisuudesta. Keksinnön mukaisesti käsitellyssä soluviljelmäsupernatantissa aktiivisuuden lasku on kuitenkin vain 5 %, niin että lisäämällä arginii-nia ja lysiiniä soluviljelmäsupernatantin väliaikainen 25 varastointi on mahdollista, ilman että aktiivisuus oleellisesti vähenee.
Esimerkki 2 t-PA-pitoinen liuos dialysoitiin 1,6 mol/1 KSCN-liuosta vastaan 0,05 mol/1 Tris-HCl-liuoksessa pH-arvon 30 ollessa 7,0, sen jälkeen dialysoitiin 0,1-mol/l arginiinia ja 0,1-mol/l lysiiniä vastaan 0,05 mol/1 Tris-HCl-liuok-* sessa pH-arvon ollessa 7,0 ja konsentroitiin arvoihin 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 10, 20, 40, 60 ja 80 mg t-PA/ml. Havaittiin, että t-PA voitiin säilyttää liuoksessa konsentraa-35 tioon 60 mg/ml saakka. Tween 80®:iiä (0,1 %) ilman lisäaineita liukoisuusraja oli 0,5 mg t-PA/ml.
9 93798
Esimerkki 3 t-PA-pitoista liuosta dialysoitiin 1,6 mol/1 KSCN-liuosta vastaan 0,05 mol/1 Tris-liuoksessa pH-arvon ollessa 7,0 ja sen jälkeen puskuria vastaan, joka sisälsi 0,05 5 mol/1 glysiiniä pH-arvon ollessa 7,0 sekä nousevat konsen-traatiot arginiinia ja lysiiniä. Jos taulukossa on ilmoitettu, t-PA-pitoiseen liuokseen sekoitettiin sakkaroosia 0,5 tai 1 g/ml. Liuosten pH säädettiin arvoon 7. Liuoksia kuumennettiin 10 tuntia lämpötilassa 60 eC. t-PA-aktii-10 visuus määritettiin ennen pastörointia ja sen jälkeen.
Konsentraatio Aktiivisuus pastöroinnin jälkeen (%) arginiini+lysiini Sakkaroosikonsentraatio (g/ml) (mol/1)_0_0_*_5_1 15 - - 0,5 - 68 0,001 0,001 56,0 0,05 0,05 56,9 0,1 0,1 71,3 88,0 88,0 .. 0,2 0,2 76,1 ·· 20 0,5 0,5 80,7 91,0 96,3 1,0 1,0 85,6
Taulukosta havaitaan, että sekä sakkaroosi että arginiinin ja lysiinin lisäys vaikuttavat plasminogeeniak-25 tivaattoria stabiloivasti. Kun näytteessä, johon ei oltu lisätty sakkaroosia eikä arginiiniä tai lysiiniä, pastörointi tuhoaa aktiivisuuden lähes täysin, säilyy 68 % läh-töaktiivisuudesta lisättäessä 1 g sakkaroosia millilitraa kohti. Tätä arvoa voidaan selvästi parantaa lisäämällä ar-30 giniiniä ja lysiiniä, niin että käytettäessä yhdistelmää, jossa on sakkaroosia 1 g/ml ja arginiiniä 0,5 mol/1 ja lysiiniä 0,5 mol/1, aktiivisuus on 96 % lähtöarvosta, joten aktiivisuuden väheneminen pastöroitaessa jää merkityksettömän pieneksi.

Claims (12)

93798 10
1. Menetelmä, jonka avulla valmistetaan ja mahdollisesti pastöroidaan proteiiniliuos, jossa on kudos-plas- 5 minogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta, jonka spesifi nen tilavuusaktiivisuus on yli 5·106 U/ml, tunnet-t u siitä, että muodostetaan liuos, joka sisältää kudos-plasminogeeniaktivaattoria yksi- tai kaksiketjuisessa muodossa tai luonnossa esiintyvänä, synteettisesti tai gee- 10 niteknologisesti valmistettuna johdannaisena, ja liuokseen lisätään 0,001 - 1 mol/1 arginiiniä ja 0,001 - 1 mol/1 ly-siiniä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA:ta sisältävä liuos si- 15 sältää myös pro-urokinaasia tai urokinaasia.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA:ta sisältävä liuos dia-lysoidaan ensin puskuroitua KSCN-liuosta vastaan, sen jälkeen puskuroitua liuosta vastaan, joka sisältää arginii- 20 niä ja lysiiniä, edullisesti käyttäen ensin 1,6 mol/1 KSCN:a noin 0,05 mol/1 Tris-HCl-liuoksessa pH-arvon ollessa 7, sen jälkeen 0,1-mol/l arginiiniä ja 0,1 mol/1 lysiiniä pH-arvon ollessa 7.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, .25 tunnettu siitä, että liuos on soluviljelmän super- natantti.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuoksen pH säädetään arvoon 5-10, edullisesti arvoon 6-8.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että proteiinipitoinen liuos pastöroidaan.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pastörointi suoritetaan pH- 35 arvossa 5-10 käyttäen 1-60 tuntia kestävää inkuboin-tia lämpötilassa 40 - 90 °C. Il 11 93798
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pastörointi suoritetaan pH-arvossa 6-8 käyttäen 6-15 tuntia kestävää inkubointia lämpötilassa 50 - 70 °C.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pastörointi suoritetaan pH-arvossa 6,5 - 7,5 käyttäen 10 tuntia kestävää inkubointia lämpötilassa 60 °C.
10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen me-10 netelmä, tunnettu siitä, että liuokseen lisätään vielä tavallisia, farmaseuttisesti hyväksyttäviä, stabiloivia ja/tai puskuroivia aineita.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään sakkaroosia ja/tai 15 sorbitolia, edullisesti 0,2-2 kg/1.
12. Jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinipitoinen liuos kylmäkuivataan. ' » < ψ » I » * 12 93798
FI882605A 1987-06-05 1988-06-02 Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta FI93798C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873718889 DE3718889A1 (de) 1987-06-05 1987-06-05 Verfahren zur herstellung einer loesung hoher spezifischer volumenaktivitaet von einem protein mit gewebe-plasminogenaktivator (t-pa)-aktivitaet, loesung, enthaltend protein mit t-pa-aktivitaet und verwendung der loesung in der human- und veterinaermedizin
DE3718889 1987-06-05

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI882605A0 FI882605A0 (fi) 1988-06-02
FI882605A FI882605A (fi) 1988-12-06
FI93798B true FI93798B (fi) 1995-02-28
FI93798C FI93798C (fi) 1995-06-12

Family

ID=6329147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI882605A FI93798C (fi) 1987-06-05 1988-06-02 Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5068106A (fi)
EP (1) EP0297294B1 (fi)
JP (1) JP2690944B2 (fi)
KR (1) KR970005837B1 (fi)
AT (1) ATE73671T1 (fi)
AU (1) AU617322B2 (fi)
CA (1) CA1338698C (fi)
DE (2) DE3718889A1 (fi)
DK (1) DK167738B1 (fi)
ES (1) ES2037136T3 (fi)
FI (1) FI93798C (fi)
GR (1) GR3004869T3 (fi)
PT (1) PT87658B (fi)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3728852C2 (de) * 1987-08-28 2003-06-18 Wilhelm Hoerrmann Arzneimittel zur Tumortherapie
US4980165A (en) * 1989-01-27 1990-12-25 Genetics Institute, Inc. Pharmaceutical formulations of plasminogen activator proteins
JP2520975B2 (ja) * 1989-09-21 1996-07-31 三井東圧化学株式会社 組織プラスミノ―ゲンアクチベ―タ―若しくはその誘導体を含有する血栓溶解剤
US6207151B1 (en) * 1989-09-21 2001-03-27 Mitsui Chemicals Inc. Aqueous solution of t-PA
DE3939346A1 (de) * 1989-11-29 1991-06-06 Behringwerke Ag Arzneimitel zur subkutanen oder intramuskulaeren applikation enthaltend polypeptide
DE3942143A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh T-pa pro stabilisierung
DE3942141A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh K2p pro-stabilisierung
DE3942144A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierung von k1k2p pro
US5366730A (en) * 1989-12-20 1994-11-22 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilized compositions having human tissue type plasminogen activator enzymatic activity
DE3942142A1 (de) * 1989-12-20 1991-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierung von glykosyliertem t-pa
DE4405426A1 (de) * 1994-02-21 1995-08-24 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutisches Präparat enthaltend Plasminogenaktivator (t-PA) oder dessen Derivate
US7544500B2 (en) 1999-11-13 2009-06-09 Talecris Biotherapeutics, Inc. Process for the production of a reversibly inactive acidified plasmin composition
US6355243B1 (en) * 1999-11-13 2002-03-12 Bayer Corporation Method of thrombolysis by local delivery of active plasmin
DE10022092A1 (de) * 2000-05-08 2001-11-15 Aventis Behring Gmbh Stabilisiertes Protein-Präparat und Verfahren zu seiner Herstellung
GB2386469B (en) * 2001-11-14 2006-05-17 Varian Semiconductor Equipment Scan methods and apparatus for ion implantation
US20110014676A1 (en) * 2007-06-29 2011-01-20 Battelle Memorial Institute Protein stabilization
JP2011522538A (ja) * 2008-06-04 2011-08-04 タレクリス・バイオセラピユーテイクス・インコーポレーテツド プラスミン製造のための組成物、方法およびキット
PT2403865E (pt) 2009-03-03 2015-11-18 Grifols Therapeutics Inc Métodos de preparação de plasminogénio
EP3512545B1 (en) 2016-09-16 2022-10-26 Leukocare AG A novel method for stabilization of a biopharmaceutical drug product during processing

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4258030A (en) * 1979-03-07 1981-03-24 Zeria-Shinyaku Kogyo Kabushiki Kaisha Urokinase preparation for oral administration
US4440679A (en) * 1980-03-05 1984-04-03 Cutter Laboratories, Inc. Pasteurized therapeutically active protein compositions
JPS60181028A (ja) * 1984-02-29 1985-09-14 Asahi Chem Ind Co Ltd 組織プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の溶解補助法
DE3584902D1 (de) * 1984-02-29 1992-01-30 Asahi Chemical Ind Waessrige loesung eines darin in erhoehter konzentration aufgeloesten gewebe-plasminogen-aktivators und herstellungsverfahren.
EP0218112B1 (en) * 1985-09-10 1992-12-09 Eisai Co., Ltd. Composition containing tissue plasminogen activator
JPH0669960B2 (ja) * 1985-11-22 1994-09-07 エーザイ株式会社 水溶性を増加したｔＰＡ含有医薬組成物
US4646292A (en) * 1985-10-01 1987-02-24 Aetna Telecommunications Laboratories Link controller
JPH0672105B2 (ja) * 1985-10-02 1994-09-14 持田製薬株式会社 血栓溶解剤及びその製法

Also Published As

Publication number Publication date
US5068106A (en) 1991-11-26
DK304288A (da) 1988-12-06
JPS63317083A (ja) 1988-12-26
PT87658B (pt) 1993-03-31
DK304288D0 (da) 1988-06-03
FI882605A (fi) 1988-12-06
EP0297294B1 (de) 1992-03-18
PT87658A (pt) 1988-07-01
FI882605A0 (fi) 1988-06-02
DE3869230D1 (de) 1992-04-23
ES2037136T3 (es) 1993-06-16
AU1732288A (en) 1988-12-08
AU617322B2 (en) 1991-11-28
GR3004869T3 (fi) 1993-04-28
EP0297294A1 (de) 1989-01-04
DE3718889A1 (de) 1988-12-22
KR890000103A (ko) 1989-03-11
FI93798C (fi) 1995-06-12
KR970005837B1 (ko) 1997-04-21
DK167738B1 (da) 1993-12-13
JP2690944B2 (ja) 1997-12-17
CA1338698C (en) 1996-11-12
ATE73671T1 (de) 1992-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI93798B (fi) Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa suuren spesifisen tilavuusaktiivisuuden omaavaa liuosta proteiinista, jolla on kudosplasminogeeniaktivaattori(t-PA)-aktiivisuutta
Tanaka et al. Timing of the administration of tranexamic acid for maximum reduction in blood loss in arthroplasty of the knee
KR101082769B1 (ko) 저장 안정성의 액상 피브리노겐 제형
US4552760A (en) Method for stabilizing tissue plasminogen activator and a stable aqueous solution or powder containing the same
FI85334B (fi) Foerfarande foer framstaellning av en vattenbaserad, vaevnadsplasminogenaktivator (t-pa) innehaollande, koncentrerad parenterad loesning.
EP0620738A1 (en) Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment with plasmin
FI85335B (fi) Foerfarande foer framstaellning av lyofiliserad, farmaceutisk vaevnadsplasminogenaktivator(t-pa)-komposition.
WO1993007893A1 (en) Fibrinolysis and fibrinogenolysis treatment with plasmin
JPH0378375B2 (fi)
AU785103B2 (en) Stabilized liquid preparation of the protease which activates blood coagulation factor VII, or of its proenzyme
EP0218112B1 (en) Composition containing tissue plasminogen activator
WO1989005347A1 (en) Method to solubilize tissue plasminogen activator
CA1283047C (en) Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same
Collen et al. Synergistic effect on thrombolysis of sequential infusion of tissue-type plasminogen activator (t-PA) single-chain urokinase-type plasminogen activator (scu-PA) and urokinase in the rabbit jugular vein thrombosis model
US20050143283A1 (en) Activated protein c formulations
JPH01240186A (ja) フィブリン特異性２本鎖プラスミノーゲンアクチベーター
JPS6338327B2 (fi)
US5827818A (en) Agent for subcutaneous administration of protein C
Hathiwala et al. Alteplase (TPA) for clotted dialysis catheters
GB2197195A (en) Urokinase compositions for treating thrombosis
NO874143L (no) Fremgangsmaate for fremstilling av trombolytiske midler.
JPH049334A (ja) 線溶活性増強剤
WO1990001334A1 (en) Formulations for plasminogen activator using aspartate
EP1432437A2 (en) Human tissue urokinase type plasminogen activator formulation
AU2002323643A1 (en) Human tissue urokinase type plasminogen activator formulation

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed

Owner name: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT