DK167738B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af en oploesning med hoej specifik rumfangsaktivitet af et protein med vaevs-plasminogenaktivator(t-pa)-aktivitet, oploesning der indeholder protein med t-pa-aktivitet, og anvendelsen af oploesningen inden for human- og veterinaermedicinen - Google Patents

Description

i DK 167738 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en opløsning med høj specifik rumfangsaktivitet af et protein med plasminogenaktivator-aktivitet, en ifølge den her omhandlede fremgangsmåde fremstillet opløsning og anven-5 delsen af denne opløsning i human- og veterinærmedicinen.

Organismen råder over to i ligevægt stående systemer for at beskytte sig mod såvel blodtab som også mod throm-boser: størkningssystemet og det fibrinolytiske system.

Sammenspillet mellem de to sikrer, at nærmest blodstandsnin-10 gen fremkommer uopløslige fibrinpolymere, der under sårhelingen igen nedbrydes ved fibrinolysens lytiske forløb.

Thrombin og plasmin er de to systemers nøgleenzymer. Under fysiologiske betingelser står den dynamiske ligevægt mellem størknings- og fibrinolysesystemet under thrombopla-15 stin-aktiviteten af thrombins kontrol, og under kontrol af plasmins thrombolytiske aktivitet. Til ligevægten bidrager de til enhver tid forekommende inhibitorer. En overvægt af et af de to systemer kan have fatale følger, nemlig såvel blødninger og thrombose som også karskader.

20 Den thrombolytisk aktive plasmin er en relativ uspe cifik trypsinlignende serinprotease. Den syntetiseres i form af en inaktiv forløber, plasminogenet.. Plasminogen cirkulerer som inaktiv forløber i blodet, og det bortaktiveres først ved bestemte irritationer. Omdannelsen af 25 plasminogen til plasmin katalyseres ved hjælp af plasminogen-aktivatorer.

Aktiveringen af plasminogen kan ske ved hjælp af fire forskellige plasminogenaktivator-systemer: 1. Et faktor ΧΙΙ-afhængigt system, 30 2. En ud fra streptokokker isoleret plasminogenaktivator, streptokinase, 3. Vævs-plasminogenaktivator (t-PA), og 4. Urinær plasminogenaktivator (u-PA eller urokinase).

Aktiveringen via det faktor Vll-afhængige system 35 gives kun en underordnet fysiologisk betydning. Den bakterielle plasminogenaktivatorstreptokinase er ganske vist 2 UK lb//J« Kl stadigvæk af stor terapeutisk betydning, den har dog ligesom den urinære plasminogenaktivator urokinase den ulempe, at den efter anvendelsen eller frigørelsen er aktiv i det samlede karsystem, dvs. den fører til en aktivering af plas-5 minogenet ikke kun på det ønskede sted. Endelig er vævs-plasminogenaktivatoren ét i mange væv og vævsvæsker forekommende protein, der først efter binding til fibrin udfolder sin fulde fibrinolytiske aktivitet. Plasminogenaktiveringen med t-PA er dermed en specifik kun på det ønskede sted for-10 løbende reaktion, der ikke bringer risikoen for en samtidig uspecifik proteolyse af andre plasmaproteiner med sig.

En underfunktion af det fibrinolytiske system, uanset hvilken oprindelse, kan føre til lukning af kar ved throm-busdannelse. Følgerne af sådanne thromber er f.eks. hjertein-15 fakter, lungeembolier eller slagtilfælde. Ved forebyggelse og behandling af mange sygdomme, der beror på det fibrinolytiske systems mindre betydende funktioner spiller anvendelsen af plasminogenaktivatorer en betydelig rolle. Ved den ideelle måde' bør den anvendte plasminogenaktivator til-20 lade fibrinspecifik lyseterapi uden bivirkninger. Dette krav kan kun opfyldes af t-PA, da t-PA-aktivering som allerede nævnt afhænger af bindingen til fibrin. t-PA kan produceres ud fra animale celler i terapeutisk tilstrækkelige mængder. t-PA har dog nøjagtig ligesom urokinase en 25 halveringstid på kun 3 til 8 minutter i den menneskelige krop. Deraf følger, at det må være muligt med en støt og kontinuerlig t-PA-tilførsel, f.eks. i form af en intrava-skulær infusion. Samtidig skal rumfanget af den tilførte væskemængde holdes så lille som mulig, for ikke yderligere 30 at belaste patienter med hjerte- eller nyrelidelser yderligere. Til formuleringen af t-PA-holdige fysiologisk forenelige parenterale opløsninger kræves der således en højst mulig specifik rumfangsaktivitet.

Ved de i europæisk patentansøgning nr. 156 169 be-35 skrevne betingelser kan der ved tilsætning af lysin eller ornithin opnås t-PA-koncentrationer på 3.000 til 50.000 DK 167738 B1 3 U/ml. Ved den krævede terapeutiske dosering giver det en ekstrem væsketilførsel deraf. Tilsætningen af lysin eller ornithin, som det er beskrevet i den europæiske patentansøgning nr. 156 169, kan ikke føre til terapeutisk formålstjen-5 lige anvendelige t-PA-holdige opløsninger.

I DE-offentliggørelsesskrift nr. 3 617 753 beskrives t-PA-opløsninger, i hvilke der ved en sænkning af pH-værdien til 2 til 5 opnås t-PA-koncentrationer på op til 5.000.000 U/ml. Derved opnås ganske vist en terapeutisk forsvarlig t-10 PA-koncentration i opløsningen, men samtidig tages dog infusionen af en opløsning med skrap ufysiologisk pH-værdi med i købet. Anvendelsen af sådanne opløsninger fører uvægerligt til hudirritationer og skader på kar i nærheden af infusionsstedet.

15 I EP-A-218 112 beskrives i eksempel 10 en vandig opløsning af vævsplasminogenaktivator, der indeholder L-arginin og L-histidin.

I EP-A-156 169 beskrives i eksempel 10 en fremgangsmåde til fremstilling af en vævsplasminogenaktivator-opløs-20 ning under anvendelse af glycin og ornithin i elueringsop-løsningsmidlet.

Det er således den foreliggende opfindelses formål at stille en fremgangsmåde til rådighed, der tillader fremstilling af meget koncentrerede parenteralt indgivelige 25 fysiologisk forenelige opløsninger af et protein med t-PA-aktivitet.

Dette løses ifølge opfindelsen ved, at der til opløsningen mindst sættes to materialer, der er valgt blandt D-og/eller L-aminosyrerne, salte, derivater eller homologe 30 heraf.

Det har overraskende vist sig, at tilsætningen af mindst to materialer, der er valgt blandt D- og/eller L-aminosyrerne, salte, derivater eller homologe heraf har en stabilitetsfremmende indvirkning på proteiner med t-PA-ak-35 tivitet. Samtidig kan der ved kombination af flere af disse materialer iagttages en forhøjet opløselighed af proteinet.

4

LNV 10//,50 D I

Begge virkninger er fuldkommen uventede. Såvel den forøgede stabilitet som stigningen af opløslighed beror åbenbart på en synergistisk effekt mellem de enkelte virkninger.

Materialerne ifølge opfindelsen, f.eks. lysin, or-5 nithin, arginin, diaminopimelinsyre, agmatin, kreatin, guani-dineddikesyre, acetylornithin, citrullin, argininravsyre, transexamsyre, e-aminocapronsyre, egner sig fremragende til formulering af til infusion bestemte opløsninger. Et kendetegn fælles for dem alle er tilstedeværelsen af en basisk 10 gruppering i form af en amino og/eller en guanidinogruppe.

En kombination af arginin og lysin, fortrinsvis 0,001 til 1 mol/1, især 0,01 til 0,5 mol/1 har vist sig at være særlig egnet til fremstilling af en opløsning med høj specifik rumfangsaktivitet af et protein med plasminogenaktivator-15 aktivitet. Således kan det f.eks. vises, at t-PA-aktiviteten i en cellekulturs ovenstående væske efter 5 dages inkubation ved +4°C er sunket til 31% .af udgangsværdien, mens tilsætning af 0,1 mol/1 arginin og 0,1 mol/1 lysin til en parallel prøve efter samme inkubationsvarighed kun fører til en til-20 bagegang i aktiviteten på 5%.

Materialerne ifølge opfindelsens stabilitetsfremmende og opløselighedsforøgende inflydelse kan iagttages såvel for vævs-plasminogenaktivatoren i dens en- eller to-kædede form som for naturligt forekommende, syntetisk eller genteknolo-25 gisk fremstillede derivater, eller også kombinationer af t-PA og en af dens naturligt forekommende syntetisk eller genteknologisk fremstillede derivater og/eller pro-urokinase eller urokinase.

Isoleringen af t-PA eller et protein med samme ak-30 tivitet kan gennemføres ifølge gængse metoder. Eventuelt bringes proteinet med t-PA-aktivitet først ved dialyse mod en pufret opløsning af et kaotropt middel, f.eks. KSCN, i opløsning, hvorefter det i denne tilstand koncentreres til den ønskede t-PA-koncentration, og der dialyseres derefter 35 mod en pufret opløsning, der indeholder, mindst to materialer ifølge opfindelsen, fortrinsvis arginin og lysin.

DK 167738 B1 5

Eksempelvis dialyseres opløsningen med et protein med plas-minogenaktivator-aktivitet derved først mod ca. 1,6 mol/1 KSCN i ca. 0,05 mol/1 tris-HCl pH 7, og derefter mod 0,1 mol/1 arginin og 0,1 mol/1 lysin i 0,05 mol/1 tris-HCl, pH 5 7.

Ligeså kan den stabilitetsfremmende virkning dog opnås ved direkte tilsætning af materialerne til en cellekulturs overstående væske. Den overstående væske fra ifølge opfindelsen behandlede cellekulturer fører til isolering af 10 proteiner med t-PA-aktivitet, hvor den specifikke aktivitet heraf i sammenligning med kontrolsera er forhøjet 3 gange.

Materialernes stabilitets- og opløselighedsfremmende virkninger er pH-uafhængige over et stort område. Den tilsvarende proteinholdige opløsnings pH kan ligge mellem 5 og 15 10, og er fortrinsvis 6 til 8.

Almindeligvis filtersteriliseres til parenteral anvendelse bestemte opløsninger, da mange af de biologiske aktive molekyler ødelægges ved pasteurisering. Ved filtersteriliserede produkter kan tilstedeværelsen af vira dog 20 ikke fuldstændig udelukkes, som SV '40-kontaminationen af koppevaccine eller overførelsen af aids-virus gennem faktor VIII-præparater viser. En væsentlig fordel ved· den her beskrevne fremgangsmåde består deri, at proteinerne med t-PA-aktivitet stabiliseres så meget ved tilsætningen af materi-25 aler ifølge opfindelsen, at aktiviteten heraf også i stor udstrækning opretholdes efter pasteurisering. Medens en pufferet t-PA-holdig opløsning efter lav temperaturpasteurisering f.eks. kun har 0,5% af udgangs-aktiviteten, kan der ved tilsætning af hver 1 mol/1 arginin og lysin opretholdes 30 ca. 85% af udgangs-aktiviteten.

Den stabiliserende virkning af materialerne er i stor udstrækning uafhængig af pasteuriseringstypen. Således kan pasteuriseringen gennemføres ved pH 5 til 10 ved 1 til 60 timers inkubation ved temperaturer på mellem 40°C og 35 90 eC.

Hensigtsmæssigt gennemføres pasteuriseringen dog ved 6 DK Tb7738 ΒΊ ca. fysiologisk pH, dvs. mellem pH 6 og pH 8, ved 6 til 16 timers inkubation ved temperaturer mellem 50°C og 70°C.

Den mest foretrukne udførelsesform er en lavtemperatur pasteurisering ved pH ca. 7, dvs. at proteinet med t-PA-5 aktivitet inkuberes 10 timer ved 608C.

Til den proteinholdige opløsning kan der eventuelt sættes yderligere tilsætningsstoffer, f.eks. mono- eller disaccharider, sukkeralkoholer, eventuelt også andre tilsætningsstoffer, såsom albuminer, gelatine, "Haemaccel", natri-10 umchlprid, calciumchlorid, heparin, EDTA, glycin eller detergenter. Tilsætningen af disse tilsætningsstoffer i fysiologisk acceptable mængder tjener f.eks. til stabilisering, pufring af systemet, inhibering af proteaser, sænkning af overfladespændingen og til regulering af osmolariteten.

15 Tilsætningen af saccharose eller sorbitol har en yderligere stabilitetsfremmende virkning ved pasteuriseringen. Således kan den efter en pasteurisering tilbageværende andel af aktive molekyler i en glycin-pufret t-PA-opløsning, der indeholder hver 0,5 mol/1 arginin og lysin, stige fra 20 ca. 81% til 96%. Foretrukken er derved en tilsætning af 0,2 til 2 kg saccharose eller sorbitol pr. liter.

Aktiviteten af t-PA eller proteiner med- samme virkning, der er behandlet ifølge den foreliggende opfindelse, opnås også efter lyophilisation efterfulgt af opløsning i 25 steriliseret vand umiddelbart før anvendelsen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der fremstilles en proteinopløsning med t-PA-aktivitet, hvor den specifikke rumfangsaktivitet heraf udgør mere end 5 x 106 U/ml. Denne koncentration sikrer en problemløs anvendelse 30 også ved kontinuerlig infusion over et længere tidsrum. Ved patienter ved ekstreme udskillelsesvanskeligheder kan t-PA-koncentrationen forhøjes til 30 x 106 U/ml, uden at der optræder problemer med hensyn til opløseligheden eller stabiliteten.

35 Uafhængigt af den valgte t-PA-koncentration har det vist sig, at aktiviteten af ifølge opfindelsen fremstillede DK 167738 B1 7 opløsninger i det væsentlige bliver opretholdt efter pasteuriseringen. Den vandige protein opløsning med t-PA-aktivitet ifølge opfindelsen er det første ved pasteuriserings steriliserede plasminogenaktivator-præparet med en terapeutisk 5 formålstjenelig specifik rumfangsaktivitet.

Opløsningen ifølge opfindelsen egner sig i lige grad til anvendelse i human- og veterinærmedicinen. Da der udelukkende tilsættes fysiologisk acceptable materialer, optræder der ved anvendelsen af opløsningen ifølge opfindelsen 10 hverken betændelser eller hudirritationer eller skader på kar.

Det foretrukne anvendelsesområde for opløsningen ifølge opfindelsen er til behandling og forebyggelse af thromboser og embolier, dvs., at præparatet ifølge opfindel-15 sen kan anvendes som fibrinolytikum.

Eksemplerne illustrerer opfindelsen.

Eksempel l t-PA-producerende CHO-celler (Chinese Hamster Ovary) 20 dyrkes i 20 1 "Dulbecco's modified Eaglés Medium”, der indeholder 5% kvægserum. Cellekulturens ovenstående væske høstes efter i hvert tilfælde 24 timer, og den erstattes med friskt medium.

Den sterilt høstede ovenstående væske fra cellekul-25 turen opbevares i 5 dage ved tilstedeværelse, henholdsvis fraværelse, af 0,1 mol/1 arginin og 0,1 mol/1 lysin ved 4°C.

t-PA-aktiviteten bestemmes dagligt ved hjælp af Ran-by's metode (Progress in Fibrinolysis 5, 233-235, 1981).

DK 167738 B1 8

Aktivitet i % ovenstående væske

Inkubationens ovenstående væske fra en cellekultur varighed ved fra en cellekultur med 0,1 mol/1 Arg 5 4eC uden Arg, Lvs_+ 0.1 mol/1 Lvs (Dage) 100 100 10 1 65 98 2 52 97 3 40 96 4 35 96 5 31 95 15

Resultaterne viser tydeligt, at andelen af aktivt t-PA i en ubehandlet ovenstående væske fra en cellekultur går tilbage med ca. 70%, dvs. den specifikke aktivitet af det 20 derefter isolerede protein kun udgør knapt 30% af den specifikke aktivitet ved høsttidspunktet. I en ifølge opfindelsen behandlet ovenstående væske fra en cellekultur udgør faldet i aktiviteten kun 5%, således, at ved tilsætning af arginin og lysin bliver en midlertidig opbevaring af den 25 ovenstående væske fra en cellekultur mulig uden at der sker et væsentligt tab af aktivitet.

Eksempel 2

En t-PA-holdig opløsning dialyseres mod 1,6 mol/1 KSCN 30 i 0,05 mol/1 tris-HCl, pH 7,0, og derefter mod 0,1 mol/1 arginin og 0,1 mol/1 lysin i 0,05 mol/1 tris-HCl, pH 7,0, og der koncentreres til 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 10, 20, 40, 60 og 80 mg t-PA/ml. Det blev iagttaget, at t-PA kunne holdes i opløsning op til en koncentration på 60 mg/ml. Med "Tween 35 80" (0,1%) uden yderligere tilsætningsstoffer ligger oplø sel ighedsgrænsen ved 0,5 mg t-PA/ml.

Eksempel 3

En t-PA indeholdende opløsning dialyseres mod 1,6 40 mol/1 KSCN i 0,05 mol/1 tris, pH 7,0, og derefter mod en puffer, der indeholder 0,05 mol/1 glycin, pH 7,0, samt stig- DK 167738 B1 9 ende koncentrationer af arginin og lysin. Som anført sættes 0,5 henholdsvis 1 g/ml saccharose til den t-PA holdige opløsning. Opløsningernes pH-værdier indstilles på 7. Opløsningerne opvarmes i 10 timer ved 60°C. t-PA-aktiviteten 5 bestemmes før og efter pasteuriseringen.

Koncentration Aktivitet efter pasteurisering (%) af arginin + Saccharose-koncentration (g/ml) lysin fmol/1) 0 0.5 1 10 0,5 - 68 0,001 0,001 56,0 0,05 0,05 56,9 0,1 0,1 71,3 88,0 88,0 15 0,2 0,2 76,1 0,5 0,5 80,7 91,0 96,3 1,0 1,0 85,6

Tabellen viser, at såvel saccharose som tilsætningen 20 af arginin og lysin har en stabiliserende virkning på plas-minogenaktivatoren. Mens pasteuriseringen næsten fuldstændigt ødelægger aktiviteten i en prøve, hvortil der hverken er sat saccharose eller arginin eller lysin, bliver udgangsak-tiviten opretholdt med ca. 68% efter tilsætning af 1 g sac-25 charose/ml. Denne værdi kan ved tilsætning af arginin og lysin forbedres betydeligt, således at der ved en kombination af 1 g/ml saccharose og hver 0,5 ml/1 arginin og lysin opretholdes 96% af udgangs-aktiviteten, hvorved aktivitetstabet ved pasteuriseringen bliver så lille, at der kan ses bort 30 fra det.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en opløsning af et protein med vævs-plasminogenaktivator (t-PA) -aktivitet, med en specifik volumenaktivitet større end 5 x 106 U/ml, 5 kendetegnet ved, at der for at opløse tilsættes mindst to materialer, der er valgt blandt de følgende D-og/eller L-aminosyrer indeholdende basiske funktioner i form af en amino- og/eller guanidinogruppe: lysin, ornithin, arginin, diaminopimelinsyre, agmatin, krea- 10 tin, guanidinoeddikesyre, acetylornithin, citrullin, arginin-ravsyre, tranexamsyre og e-aminocapronsyre, eller salte eller derivater deraf.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der tilsættes arginin og lysin, fortrinsvis 15 0,001 til 1 mol/l af hver, især 0,01 til 0,5 mol/1.

3. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1 eller 2, kendetegnet ved, at proteinet er en vævs-plas-minogenaktivator i den én- eller to-kædede form eller en af dens naturligt forekommende eller syntetisk eller gentekno- 20 logisk fremstillede derivater, og at den indeholdes alene eller i en kombination af t-PA og en af dens naturligt forekommende eller syntetisk eller genteknologisk -fremstillede derivater og/eller pro-urokinase eller urokinase i opløsningen.

4. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-3, kendetegnet ved, at en opløsning med et protein med plasminogen-aktivator-aktivitet først dialyseres mod en pufret KSCN-opløsning, og derefter mod en pufret opløsning, der indeholder arginin og lysin, fortrinsvis først mod ca. 30 1,6 mol/1 KSCN i ca. 0,05 mol/1 tris-HCl, pH 7, og derefter mod 0,1 mol/1 arginin, 0,1 mol/1 lysin, pH 7.

5. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-3, kendetegnet ved, at opløsningen er en cellekulturs ovenstående væske.

6. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-5, kendetegnet ved, at opløsningen bliver pasteuri- DK 167738 B1 seret ved pH 5 til 10 ved 1 til 60 timers inkubation ved 40°C til 90°C.

7. Fremgangsmåde ifølge mindst ét af kravene 1-6, kendetegnet ved, at der tilsættes saccharose 5 og/eller sorbitol, fortrinvis 0,2 til 2 kg/1.

8. Opløsning fremstillet ifølge mindst et af kravene 1-7 til anvendelse i human- eller veterinærmedicin.

9. Opløsning ifølge krav 9 til anvendelse som fibri-nolytikum.