PT87658B

PT87658B - Processo para a preparacao duma solucao com elevada actividade volumica especifica de uma proteina com actividade de activador de plasminogenio dos tecidos

Info

Publication number: PT87658B
Application number: PT87658A
Authority: PT
Inventors: Eric Paul Paques; Hans-Arnold Stohr
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-06-05
Filing date: 1988-06-03
Publication date: 1993-03-31
Also published as: EP0297294A1; PT87658A; JPS63317083A; DK167738B1; US5068106A; JP2690944B2; FI882605A0; KR970005837B1; AU617322B2; KR890000103A; FI882605A; CA1338698C; ES2037136T3; ATE73671T1; EP0297294B1; DK304288A; DE3718889A1; DE3869230D1; GR3004869T3; DK304288D0

Description

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma solução com elevada actividade volúmica especifica duma proteína com actividade de activador do plasmi nogénio, a uma solução preparada de acordo com o processo reivihdicado e à utilização desta solução na medicina humana e ve terinária.

organismo dispõe de dois sistemas que estão em equilíbrio para se proteger tanto contra a perda de sangue como também contra tromboses» o sistema de coagulação e o sistema fibrinolítico. 0 jogo global entre estes dois sistemas garante que, em primeiro lugar, se obtenham polímeros de fibri na insolúveis para estancar o sangue que, durante a cicratização da ferida, são de novo degradados pelo processo lítico da fibrinólise.

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Α trombina e a plasmina são as enzimas chave de ambos os sistemas. Em condições fisiológicas, o equilíbrio dinâmico entre o sistema de coagulação e o sistema de fibrinóli— se está sob o controlo da actividade tromboplástica da trombina e da actividade trombolítica da plasmina. Para o equilíbrio contribuem os respectivos inibidores. Um excesso dum dos dois sistemas pode ter consequências fatais, nomeadamente tanto hemorragias como tromboses assim como estragos dos vasos sanguíneos.

A plasmina tromboliticamente activa é uma serinaprotease semelhante à tripsina relativamente não especifica.

E Sintetizada sob uma forma precursora inactiva, o plasminogénio. 0 plasminogénio circula no sangue como precursor inactivo e só é activado mediante determinados estímulos. A transformação de plasminogénio em plasmina é catalisada por activadores de plasminogénio.

A activação do plasminogénio pode tomar lugar por meio de quatro sistems,s diferentes de activação do plasminogénio :

1. uin sistema que depende do factor XII,

2. um activador do plasminogénio isolado de estreptocoops, a estreptoquinase,

3. activador de plasminogénio dos tecidos (t-PA) e

4. aptivador do plasminogénio urinário (u-PA e uroquinasp).

A activação por intermédio do sistema dependente do factor XII atem apenas muito pouco interesse do ponto de vista fisiológico. 0 activador bacteriano do plasminogénio é na verdade de muito maior importância terapêutica do que o anterior, tem no entanto, bem assim como o activador urinário do plasminogénio uroquinase, o inconveniente de só ser activo depois da administração ou depois da libertação em todo o sistema circulatório, quer dizer, origina a activação do plasmino génio não apenas no local pretendido. 0 activador de plasmino— génio dos tecidos finalmente é uma proteína existente em muitos tecidos e líquidos dos tecidos que só apresenta a sua activida«5 »

de fibrinolítica completa depois da sua ligação à fibrina. A aetivaçã.0 do plasminogénio por intermédio do t-PA é por consequência tuoa reacção que se realiza especificamente no local pretendido que não origina o perigo de provocar uma proteélise não especifica simultânea de outras plasmoproteínas.

Um funcionamento abaixo do normal do sidbema fibrinolítico de qualquer génese pode originar o entupimento dos vasos por formação de trombos. As consequências da formação desses trombos são por exemplo os infartes do coração, embolias pulmonares ou também ataques de palpitações. Na profilaxia e ^erapia de muitas doenças provocadas por insuficiência de funcionamento do sistema fibrinolítico, a administração de activadores de plasminogénio desempenha um papel importante· Idealmente, o activador do plasminogénio administrado deve permitir realizar uma terapia da lise especifica da fibrina e isenta de acções secundárias. Esta exigência só pode ser satisfeita por t-PA, porque a activação por t-PA, como já se mencionou, depende da ligação à fibrina. 0 t-PA pode ser produzido em quantidades terapeuticamente suficientes a partir de células animais· No entanto, o t-PA, exactamente como a uroquinase, nos organismos humanos têm um tempo de semitransformação de apenas 3 a 8 minutos. Por consequência tem de se possibilitar uma administração contínua e prolongada de t-PA, por exempTO, sob a forma de uma infusão intravascular. Simultaneamente, o volume das quantidades de líquido administradas deve ser o mais possível pequeno para que os pacientes com in.< %' suficiência cardíaca ou renal não sejam agravados adicionalmente. Para a formulação de soluções parentéricas contendo t- PA, fisiol ogicamente aceitáveis, deve exigir^se portanto uma actividade volúmica especifica a maior possível.

Nas condições descritas na Patente Europeia

EP-À 156 109, podem conseguir-se concentrações de t-PA de 3000 a 50 000 U/ml por adição de lisina ou de ornitina. Na dosagem terapêutica necessária, verificou-se ser necessária s adminis tração dum volume extremamente grande dc líquido. A adição de lisina ou de ornitina, coao se descreve no Pedido de Patente

Europeia ©I* 156 169, não pode originar soluções contendo t - Pá terapeuticamente utilizáveis com interesse.

No pedido de Patente Alemã publicado para inspecção pública DE-OS 36 17 753, referem-se soluções de t - PA em que se conseguem concentrações de t - PA de até (5 000 000 u/ml por abaixamento do valor de pH para 2 a 5· Desta forma, consegue-se obter-se na realidade uma concentração de t - Px. terapeuticamente defensável na solução, mas simultaneamente põe-se à vènda uma solução con. u... valor de pH fortemente não fisiológica. A administração dessas soluções origina negativamente irritação da pele e danos nos vasos sanguíneos na proximidade do local de infusão.

objectivo da presente invenção é proporcionar um processo que permite a preparação de soluções fisiologicamente aceitáveis, de alta concentração, administráveis por via parentérica, de uma proteína que possui actividade de t - PA.

De acordo corn a presente invenção, esse objectivo é atingido adicionando à solução pelo menos duas substâncias escolhidas do grupo dos D-aminoácidos e/ou L-aminoáci dos, seus sais, derivados ou homólogos.

A requerente descobriu surpreendentemente que a adição de, pelo menos duas substâncias escolhidas do grupo dos D—aminoácidos e/ou L-aminoácidos, seus sais, deriva.dos ou homólogos tem uma influência que provoca a estabilidade das proteínas com actividade de t-PA, Simultaneamente, por combinação de várias destas substâncias, pode observar-se uma elevada solubilidade da proteína. Ambos estes efeitos são completamente inesperados na sua manifestação. Tanto o aumento da estabilidade como também o aumento da solubilidade se baseiam manifestamente numa sinergia das acções individuais.

As substâncias de acordo com a presente invençãc

como por exemplo, lisina, ornitina, arginina, ácido diaminopimélico, agmatina, creatina, ácido guanidinoacético, acetil-ornitina, citrulina, ácido arginino-succinico, ácido tranexâmioo, ácido -aminocapróico são extraordinariamente apropriados para a formulação de soluçães destinadas a infusão. Uma caracteristica comum a todos eles é a presença dum agrupamento básico com a forma de um grupo amino e/ou de um grupo guanidino.

Como especialmente apropriada para a preparação duma soluçSo de elevada actividade volúmica especifica de uma proteína com actividade de activador de plaminogénio verificou-se ser uma combinação de arginina e lisina, de preferência, com 0,001 a 1 mole/litro e, de maneira especialmente preferida com 0,01 a 0,5 mole/litro. Assim por exemplo, foi possível verificar-se que a actividade de t-PA num sobrenadante de cultura de células depois de incubação a +4°C tinha descido para 31 jé do valor inicial, enquanto a adição de 0,1 mole/litro de arginina e de 0,1 mole/litro a uma amostra paralela depois da mesma duração da incubação tinha originado apenas uma perda de actividade igual a 5 $>·

A influência de aumento da estabilidade e a influ ência de aumento da solubilidade das substâncias de acordo com a presente invenção pode ser observada não só para o activador de jalasminogénio do tecido na sua forma de uma cadeia ou de duas cadeias mas também para os seus derivados que aparecem na natureza ou são preparados sinteticamente pu por tecnologia genética ou ainda também para combinaçães de t - PA com um seu derivado existente na natureza, sintético ou preparado por tecnologia genética e/ou pró-uroquinase ou uroquinase.

isolamento do t - PA ou de uma proteína com igual actividade pode realizar-se de acordo com métodos usuais. Eventualmente, solubiliza-se a proteína coa actividade de t- PA em primeiro lugar por diálise contra um agente caotrópico por exemplo, KSCN, concentra-se nesta condirão até à concentra ção de t - PA pretendida e em seguida dialisa-se contra uma

- 5 ®*W :

_ solução tamponizada que contém pelo menos duas substâncias de acordo com a presente invenção, de preferência, arginina e lisina. Por exemplo, neste caso, dialisa-se a solução com uma proteína com actividade de activador de plasminogénio primeiro contra solução de tiocianato de potássio (KSCN) aproximada mente com 1,6 moles/litro em Tris-HOl de pH 7,0 contendo cerca de 0,05 mole/litro e, em seguida, contra respectivamente 0,1 mole/litro de arginina e lisina em Tris-HOl de pH 7 contendo 0,05 mole/litro.

Mas podem conseguir-se igualmente os efeitos de aumento da estabilidade por adição directa das substâncias de acordo com a presente invenção ao sobrenadante de uma cultura de células. Os sobrenadantes de cultura de células tratados de acordo com a presente invenção permitem o isolamento de proteínas com actividade de t - PA cuja actividade especifica á cerca de três vezes maior em comparação com a de soros de controlo.

Os efeitos de aumento da solubilidade e de estabilidade das substâncias de acordo com a presente invenção são independentes do pH ao longo de um largo intervalo. 0 pH da correspondente solução que contém proteína pode estar compreendido entre 5 θ 10 mas de preferência entre 6 e 8.

Normalmente as soluções que se destinam a administração por via parentérica são esterilizadas por filtração porque muitas moléculas biologicamente activas foram destruídas por pasteurização. Nos produtos esterilizados por filtrarão no entanto nunca se pode excluir completamente a presença de vírus como comprova a contaminação com SV 40 da vacina de protecção contra a varíola ou o transporte de vírus da SIDA pelas composições do factor VIII. Uma vantagem essencial do processo referido na presente memória descritiva consiste no facto de as proteínas com actividade de t - PA serem estabili zadas pela adição das substâncias de acordo com a presente in venção de tal modo intensamente que a sua actividade se mantém * pratiwamente inalterada mesmo depois da pasteurização. Enquan• to depois de uma pasteurização a baixa temperatura uma solução

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tamponizada contendo t-PA apresenta apenas ainda só cerca de 0,5 por cento da actividade inicial, por adição de arginina e lisina cada uma na concentração de 1 mole/litro consegue-se manter cerca de 85 por cento da actividade inicial.

efeito estabilizante das substâncias de acordo com a presente invenção é independente praticamente do tipo da pasteurização. Assim, a pasteurização realiza-se por incubação a pH 5 até 10 durante 1 até 60 horas a temperaturas compreendidas entre 40°C e 90°C.

Oonveniente^onte, noentanto, a pasteurização realiza-se a pH quase fisiológico, isto é, compreendido entre pH 6 e pH 8 mediante incubação durante 6 até l6 horas a temperaturas ’ compreendidas entre 5θ°θ e 70°C.

A forma de realização preferida consiste numa pasteurização a baixa temperatura efectuada a pH aproximadamente igual a 7, isto é, a proteína com a actividade de t-PA é incubada a 60°C durante 10 horas.

A solução que contém a proteina pode eventualmente ser misturada com outros aditivos, por exemplo, monossacáridos ou dissacáridos, alcóois de açucares, eventualuente também outros componentes como por exemplo, albumina, células hèmácias, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, heparina, 3DTA, glicina ou detergentes. A adição destes componentes em quantidades fisiologicamente aceitáveis serve por exemplo para a estabilização, a tamponização do sistema, a inibição de proteases, a diminuição da tensão superficial e a regulação da oslolaridade.

A adição de sacarose ou de sorbitol tem um outro efeito de aumento de estabilidade durante a pasteurização» Assim, a proporção de moléculas activas que se íuantém depois de uma pasteurização numa solução de T-PA tamponizada coa glicina que contém 0,5 mole/litro de arginina e 0,5 mole/litro ie lisina aumenta de cerca de 81 por cento para 96 por cento.

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Neste caso prefere-se uma adição de 0,2 a 2 kg de sacarose ou de sorbitol por litro.

A actividade de t-PA ou de proteínas cora igual actividade que podem ser tratadas de acordo com a presente inveja çao mantém-se constante também depois de liofilização seguida por dissolução em água esterilizada imediatamente antes da utilização.

Pelo processo de acordo com a presente invenção pode preparar-se uma solução de proteínas com actividade de t-PA cuja actividade volúmica especifica é maior do que 5 x 10 U/ml. Esta concentração garante uma administração sem problemas também no caso duma infusão contínua durante um longo intervalo de tempo. Eto doentes com estremas dificuldades de eliminação ι· 6 de liquido» pode subir-se a cobcentração de t-PA até 30 x 10 U/mililitro sem aparecerem problemas de solubilidade ou de estabilidade.

Independentemente da concentração de t-PA escolhi da, verificou-se que a actividade das soluções preparadas de acordo com a presente invenção depois da pasteurização se mantém essencialmente inalterada. A solução aquosa contendo proteína com actividade de t-PA de acordo com a presente invenção constitui a primeira composição de activador de plasminogéqio esterilizada por pasteurização com uma actividade volúmica especifica térapeuticamente iraportante.

A solução de acordo com a presente invenção Õ apropriada para utilização em medicina humana e veterinária de igual forma· Como se adicionam exclusivamente apenas substâncias fisiologicamente aceitáveis, noi-caso da administração da solução de acordo com a presente invenção não se detectaro nem inflamações nen irritações da pele nem danos nos vasos sanguíneos .

campo de aplicação preferido das sol”'~t.· de acordo com a rente invenção é a terapia e s. profilaxia de tromboses e embolias, quer dizer, a composição de acordo com a presente invenção pode utilizar-se como fibrinolítico.

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Os seguintes exemplos esclarecem a presente invenção.

EXEMPLO 1

Em 20 litros de meio de Eagle modificado de Dulbecco contendo 5 /- do soro de vitela, cultivaram-se células de CHO (ovário de criceto chinês) que produzem t-PA. Colheram-se Os sobrenantes da. cultura de células depois de respectivamente 24 horas e substituirnn-se por meio fresco.

Os sobrenadantes da cultura de células colhidas em condições estéries foram armazenados durante 5 dias na prerifc·' sença e na ausência de 0,1 mole/litro de arginina e 0,1 mole/ litro de lisina jrc.

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De terminou-se diariamente r, act ivlAc.de de t-PA empregando o método le Derby (Progress in Ei^rinolysis, 5, 233-235,1981).

Actividade em % Duração da incubação Sobrenadante da cul.	Sobrenadante do cultura de células com a adição de 0,1 r.ole/litro de
a 4°C (dias)	tura de células sem arginina e lisina
arginina 0 le/litro de	, 1 mo - lisina
	100	100
1	6 5	98
2	52	97
3	4o	96
4	35	96
5	31	95
	0s resultados mostram inequivocamente que	0 te-

or de t-PÀ activo num sobrenadante de cultura de células ião tratado diminui quase 70 por cento, crer li.cr, a actividc.de especifica da proteína isolada constitui apeiic.s cerca de ÇO / da actividade especifica eia relação ao valor no momento da colheita. No sobrenadante da cultura de células tratado de acordo cont a presente invenção, no entanto, a diminuição da actividade é apenas igual a cerca de 5 P^or cento, de modo que mediante a adição de arginina e de lisina é possível a armazenagem dos sobrenadantes da cultura de células sem perda importante de actividade.

EXEMPLO 2

Dialisou-se mna solução contendo t-PA contra uma solução contendo 1,6 moles de KSCN por litro em Tris-HCl contendo 0,05 mole/litro de pH 7,0: em seguida dializou-se contra 0,1 mole/litro de arginina e 0,1 mole/litro de lisina em 0,05 mole/litro de Tris-HCl de pH 7,0 e concentrou-se até 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 10, 20, U0, 60, e 80 mg de t-AP/mililitro. Observou-se que se podia manter o t-PÁ em solução até uma concentração de 60 mg/mililitro. Com Tveen 80 e sem outras adições a solubilidade máxima era igual a 0,5 mg de t-PA/inililitro.

EXEMPLO 3

Dialisou-se uma solução contendo t-PA contra uma solução de 1,6 moles/litro de KSCN em 0,05 mole/litro de Tris, pH 7,0 e em seguida dialisou-se contra um tampão contendo 0,05 mole/litro de glicina, pH 7,0 assim como concentrações crescentes de arginina e Usina. Expe±imentou-se também adicionar à solução que continha t-PA 0,5 e 1 g/ml de sacarose_o Regulou-se o valor do pH das soluções de maneira a ser igual a 7. Aqueceram-se as soluções a 60°C durante 10 horas. Determinou-se a actividade de t-PA antes e depois da pasteurização.

Concentração de argi- Actividade depois da pasteurização nina + lisina ( ) mole s/l i t r o. Concentração de sacarose (g/ml)

	0	0,5	1
		0,5		68
0,001	0,001	56,0	-	-
0,05	0,05	56,9	-	-
0,1	0,1	71,3	88,0	38,0
0,2	0,2	76,1	-	-
o,5		80,7	91,0	96,3
1,0	1,0	85,6	-	-

A tabela mostra que a adição não só da sacarose mas tambÓm de arginina e de lisina têm um efeito de estabiTiáíação sobre o activador de plasrainogénio. Enquanto numa íno_s tra a qua não se adicionou nen sacarose nen arginina e lisina, a pasteurização destrói quase complet.emente a actividade, depois da adição de um£grama de sacarose por mililitro, mantém-se 68 fo da actividade inicial. Este valor pode ser melhorado consideravelmente por adição de arginina e lisina de tal maneira que, no caso da combinação de 1 g/ml de sacarose com 0,5 mole/litro de arginina e lisina respectivamente, se consegue obter 96 fo da actividade inicial sendo a perda de actividade por pasteurização desprezavelmente pequena.

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Claims

Processo para a preparação e eventualmente pasteurização duma solução com elevada actividade volúxnica espec_í fica de uma proteína com actividade de activador de plasminogénio dos tecidos (t-PA), caracterizado pelo facto de à soluÇ£o se adicionar pelo menos duas substâncias escolhidas do grupo formado por D-aminoácidos e/ou L-aminoácidos, os seus sais, derivados ou homólogos.

- 2» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se adicionar pelo menos duas substâncias escolhidas do grupo formado por lisina, ornitina, arginina, ácido diaminopii.iélico, agmatina, creatina, ácido guanidino-acético, acetil-ornitina, citrulina, ãcido arginino-succínico, ácido tranexâmico e ácido épsilon-aminocapróico, de preferência, arginina e lisina.

- 3* Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se adicionar a arginina e a lisina numa quantidade de preferência compreendida entre 0,001 a 1 mole/litro de cada uraa delas e de maneira especialmente preferida entre 0,01 e 0,5 mole/litro.

Processo de acordo com pelo menos uma das rei:ões 1 a 3, caracterizado pelo facto de a proteína que constitui o activador de plasminogénio dos tecidos estar con12 tido na solução sob a forma de uma cadeia ou de duas cadeias ou de um seu derivado existente naturalmente ou preparado sin tetiaamente ou por tecnologia genética e sézinha ou em combinação de t-PA e um seu derivado existente naturalmente ou pre. parado sintéticamente ou por tecnologia genética e/ou pró-uro quinase ou uroquinase.

- Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se dializar uma solução contendo uma proteína com actividade de activador de plasminogénio em primeiro lugar contra primeiramente uma solução da tiocianato de potássio (KSON) tamponizada e, em seguida, ©ontra uma solução tamponizada contendo arginina e lisina, de preferencia, em primeiro lugar contra uma solução contendo cerca de 1,6 moles do KSON por litro em solução de Tris-HCl de pH 7 contendo cerca de 0,05 mole/litro e em seguida contra uma solução contendo 0,1 mole de arginina por litro e 0,1 mole de lisina por litro de pH 7.

- 6& Processo de acordo com pelo menos uma das reivin dioações 1 a 4 caracterizado pelo facto de a solução ser o sobrenadante duma cultura de células.

- 7& Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se regular a solução a pH 5 a 10, de preferência, a pH 6 a 8.

- 8a - 15 Processo de acordo com pelo menos uma cds reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se pasteurizar a solução que contém proteína.

- ₉a _

Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a pasteurização se realizar a pH 5 ató 10 por incubação a 40°C até ₉0°C durante uma a 60 horas.

- 10» Processo de acordo com a reivindicação ₉, caracterizado pelo facto de a pasteurização se realizar a pH 6 até 8 por incubação a 5θ°^ até 7θ°0 durante 6 até 15 horas.

- 11» Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a pasteurização se realizar a pH 6,5 até 7»5 por incubação a 60°C durante 10 horas.

- 12& _

Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de à solução se adicionarem ainda as substâncias estabilizadoras e/ou t aju ?oni- I zantes usuais, farraaceuticamente aceitáveis.

- 13» Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se adicionar sacarose e/ou sorhitol ’Ι?' numa quantidade, de preferencia, compreendida entre 0,2 e 2 kg/litro.

- l4& Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo facto de se liofilizar a solução que contém a proteína.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Republica Federal Alemã em 5 de Junho de 1987, sob ο ηδ. P 37 18 889.5.