JP2003517020A

JP2003517020A - 線維素溶解プロテイナーゼを局所投与する方法

Info

Publication number: JP2003517020A
Application number: JP2001544901A
Authority: JP
Inventors: トウームス，クリストフアー・フランシス
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2003-05-20
Also published as: DE60021111T2; DE60021111D1; MXPA02006024A; HK1050845A1; ES2242655T3; PT1239873E; AU784252B2; SG172474A1; EP1239873B1; EP1239873A2; AU2434601A; HK1050845B; DK1239873T3; US6455269B1; EP1645282A1; CA2394613A1; ATE298585T1; WO2001043765A3; WO2001043765A2

Abstract

(57)【要約】循環血液中のα_２−マクログロブリンの中和効果を回避しつつ、閉塞性線維素含有血餅を溶解するのに安全かつ有効な量で、ヒト患者に線維素溶解メタロプロテイナーゼを局所血管内投与するための方法を提供している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は線維素溶解メタロプロテイナーゼの治療的投与に関し、特にはインビ
ボで局所輸送することによりこのような薬剤を血管血栓に投与して血餅を溶解さ
せる方法に関する。

【０００２】発明の背景血栓および塞栓などの血餅により生じる血管閉塞は、適時に治療されないと四
肢および生命を脅かしうる深刻な医学的疾患である。血管血餅を治療および除去
するための装置および方法が開発されている。実例としては１９８４年５月８日
に付与された米国特許４４４７２３６（Ｑｕｉｎｎ）；１９８７年９月８日に付
与された米国特許４６９２１３９号（Ｓｔｉｌｅｓ）；１９８８年７月５日に付
与された米国特許４７５５１６７号（Ｔｈｉｓｔｌｅ他）；１９９２年１２月１
日に付与された米国特許５１６７６２８号（Ｂｏｙｌｅｓ）；１９９３年６月２
９日に付与された米国特許５２２２９４１号（ＤｏｎＭｉｃｈａｅｌ）；１９
９３年１０月５日に付与された米国特許５２５００３４号（Ａｐｐｌｉｎｇ他）
；１９９４年１２月６日に付与された米国特許５３７０６５３号（Ｃｒａｇｇ）
；１９９５年１月１０日に付与された米国特許５３８０２７３号（Ｄｕｂｒｕｌ
他）；１９９６年３月１２日に付与された米国特許５４９８２３６号（Ｄｕｂｒ
ｕｌ他）；１９９７年５月６日に付与された米国特許５６２６５６４号（Ｚｈａ
ｎ他）；１９９８年１月２０日に付与された５７０９６７６号（Ａｌｔ）；１９
９９年２月２日に付与された米国特許５８６５１７８号（Ｙｏｃｋ）およびＷＯ
９０／０７３５２（１９９０年７月１２日刊行）を参照。このような方法および
装置は血栓溶解薬または線維素溶解薬を血餅に輸送し、これを溶解するための注
入カテーテルを含む。注入カテーテルは典型的には、血餅中の線維素を分解する
ことができ、したがって効率的に血餅を溶解する酵素的に活性な薬剤と組み合わ
せて使用される。このような酵素は典型的には「血栓溶解」薬または「線維素溶
解」薬と称される。

【０００３】フィブロラーゼ（Ｆｉｂｒｏｌａｓｅ）はＳｏｕｔｈｅｒｎｃｏｐｐｅｒｈ
ｅａｄｓｎａｋｅ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘｃｏｎ
ｔｏｒｔｒｉｘ）の毒液から初めて分離された公知の線維素溶解亜鉛メタロプロ
テイナーゼである。Ｇｕａｎ他、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ２８９、Ｎｕｍｂｅｒ
２、ｐ．１９７〜２０７（１９９１）；Ｒａｎｄｏｌｐｈ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１
９９２）、ｐ．５９０〜６００；１９８９年７月１２日に刊行されたヨーロッパ
特許出願０３２３７２２号（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ他）；および１９８６年９月
９日に付与された米国特許４６１０８７９号（Ｍａｒｋｌａｎｄ他）参照。フィ
ブロラーゼは線維素溶解性であることが示されており、このメタロプロテイナー
ゼはフィブリノゲンＡα−鎖に対してタンパク質分解活性を有するが、Ｂβ−鎖
のタンパク質分解切断能は低く、フィブリノゲンのγ−鎖に対しては活性がない
ことが記載されている；Ａｈｍｅｄ他、Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ｖｏｌｕｍｅ
２０、ｐ．１４７〜１５４（１９９０）。線維素は血餅の主な成分であるので
、フィブロラーゼの線維素溶解特性は、インビボでの血栓溶解使用のための血餅
溶解薬としてのその可能性を示している；Ｍａｒｋｌａｎｄ他、Ｃｉｒｃｕｌａ
ｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ９、Ｎｕｍｂｅｒ５、ｐ．２４４８〜２４５６（１９
９４）および前記のＡｈｍｅｄ他参照。

【０００４】ＮｏｖｅｌＡｃｔｉｎｇＴｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ（ＮＡＴ）はフィブロ
ラーゼの修飾形であり、ＮＡＴは、ＳＦＰＱＲのＮ−末端配列を有する２０１ア
ミノ酸を有するが、天然フィブロラーゼのＮ−末端配列はＥＱＲＦＰＱＲで始ま
り、その長さは２０３アミノ酸であることにおいて、フィブロラーゼとは異なる
。このアミノ末端の修飾は、生成物の均一性およびロット間の量的変化を生起し
得る環化グルタミン（ピログルタミン酸）の量的変動を起こしうるアミノ酸残基
において、化学反応が生じないようになされている。したがってＮＡＴはより安
定な分子とみなすことができる。

【０００５】ＮＡＴおよびフィブロラーゼは、これらの構造的な差異にも関わらず酵素（線
維素溶解）活性に関しては類似している。生物学的活性が類似していることは、
ＭａｎｎｉｎｇによりＴｏｘｉｃｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ３３、ｐ．１１８９〜１
２００（１９９５）に記載されているように、フィブロラーゼ分子の活性部位は
アミノ酸１３９〜１５９であり、三次元空間の予測位置がアミノ末端から離れて
いることを示すデータと一致している。フィブロラーゼおよびＮＡＴ分子の活性
部位は、３個のヒスチジン残基により錯体化されている亜鉛原子を含有している
。

【０００６】毒液由来のフィブロラーゼに関する刊行文献は、フィブリノーゲンに対してＬ
ｙｓ^４１３−Ｌｅｕ^４１４部位において、およびインスリンの酸化β−鎖に対し
てＡｌａ^１４−Ｌｅｕ^１５部位においてそのタンパク質分解活性を示すことを明
らかにしている（ＲｅｔｚｉｏｓａｎｄＭａｒｋｌａｎｄ、Ｔｈｒｏｍｂｏ
ｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ７４、ｐ．３５５〜３６７（１９９
４）；Ｐｒｅｔｚｅｒ他、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、
Ｖｏｌｕｍｅ８、ｐ．１１０３〜１１１２（１９９１）；およびＰｒｅｔｚｅ
ｒ他、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅ９、
ｐ．８７０〜８７７（１９９２））。ＮＡＴも、同じ切断部位でこれらの基質に
対するタンパク質分解活性を有することが示されている。

【０００７】フィブロラーゼおよびＮＡＴなどの線維素溶解メタロプロテイナーゼとは対照
的に、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔＰＡ）などの血餅溶解薬は、内因性線維素溶解システムの活性化によ
り血栓溶解を促進するプラスミノーゲンアクチベーターである。特に、プラスミ
ノーゲンアクチベーターは、プラスミノーゲンのプラスミン（セリンプロテアー
ゼ）への変換を触媒する。プラスミンは、アルギニン−リシン結合の所でフィブ
リノゲンおよび線維素を切断することができ、プラスミンの発生を介して、プラ
スミノーゲンアクチベーターは最終的に線維素分解および血餅溶解をもたらす。
現在市販の血栓溶解薬はウロキナーゼ、ストレプトキナーゼまたはｔＰＡなどの
プラスミノーゲンアクチベーターである。

【０００８】フィブロラーゼおよびＮＡＴなどの線維素溶解メタロプロテイナーゼは、血栓
溶解薬のプラスミノーゲンアクチベーター群とは異なり、内因性線維素溶解シス
テム（プラスミンへのプラスミノーゲンの変換）には依存していない。したがっ
て、この群の血餅溶解薬はその独特な作用方法によってプラスミノーゲンアクチ
ベーターとは区別することができ、「直接的な」線維素溶解薬と定義される。

【０００９】 α_２−マクログロブリンは、哺乳類血清に存在する有力なプロテイナーゼ阻害
剤であり、血清蛋白質の最も大きなものの１つである（分子量７２５キロダルト
ンを有する）。プロテイナーゼに対するα_２−マクログロブリンの特異性は幅広
く、セリン、システイン、アスパラギン酸およびメタロプロテイナーゼ群を含む
。α_２−マクログロブリン分子は、同一のサブユニットのテトラマーであり、こ
れは半分子の非共有会合を伴い、対でジスルフィド結合している。したがって還
元条件下では、天然α_２−マクログロブリンはその４個のモノマーサブユニット
に解離しうる。

【００１０】 α_２−マクログロブリンの各サブユニットは、タンパク質分解切断に対して非
常に影響を受けやすい領域を有する（「おとり（ｂａｉｔ）」領域）。このおと
り領域のタンパク質分解はα_２−マクログロブリンに構造変化を引き起こし、こ
の構造変化により、プロテイナーゼがα_２−マクログロブリン分子構造内に捕ら
えられる。このプロセスは文献では「ハエジゴク（ｖｅｎｕｓｆｌｙ−ｔｒａ
ｐ）」相互作用と記載されている。いったんこのプロテイナーゼが捕らえられる
と、このプロテイナーゼは立体的に障害されて、その高分子基質にアクセスでき
ない。

【００１１】加えて、α_２−マクログロブリンと捕らえられた多くのプロテイナーゼとの間
に共有結合が生じうる。前記のように、プロテイナーゼの捕捉はα_２−マクログ
ロブリン分子に構造変化を引き起こす。この構造変化によって、α_２−マクログ
ロブリン分子の内側のチオエステル結合が反応性になり、捕らえられたプロテイ
ナーゼの求核性基（リシンなど）と共有結合を生じうる。こうして全身循環内で
、α_２−マクログロブリンは効率的に様々なプロテイナーゼを中和することがで
きる。

【００１２】さらに、プロテイナーゼの捕捉によって生じるα_２−マクログロブリンでの構
造変化は、細網内皮系により認識される形をもたらす。α_２−マクログロブリン
に捕捉されたプロテイナーゼのクリアランスは、通常、半減期値で分で記載され
、マクロファージ、肝細胞および線維芽細胞で発現される低密度リポタンパク質
（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質を介して生じると考えられている。さらにα_２ −マクログロブリンに関しては、Ａ．Ｊ．Ｂａｒｒｅｔｔにより編集されたＭｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８１）、ｐ．７３７〜７５４を参照。

【００１３】 α_２−マクログロブリンはフィブロラーゼ、ＮＡＴおよび他のプロテイナーゼ
と共に高分子錯体を形成しうる。α_２−マクログロブリンと共に解離性錯体を形
成しうるいくつかのプロテイナーゼとは異なり、フィブロラーゼおよびＮＡＴは
生理的条件下でα_２−マクログロブリンから解離されえない錯体を形成する線維
素溶解メタロプロテイナーゼの２つの例である。精製されたヒトα_２−マクログ
ロブリンおよび例えばＮＡＴを一緒にインキュベートすると、この錯体の形成が
数秒で始まり、数分以内にほぼ完全に終了する。この現象はインビトロでの錯体
形成が迅速であることを示していて、α_２−マクログロブリンならびにＮＡＴま
たは他の線維素溶解メタロプロテイナーゼとのインビボでの錯体形成のかなりの
迅速さを示唆している。

【００１４】 α_２−マクログロブリンは主要な血漿タンパク質の１つであるが、それにも関
わらず、線維素溶解メタロプロテイナーゼと結合し、それを中和しうる循環中の
α_２−マクログロブリンの量は限られている。したがってα_２−マクログロブリ
ン結合能は飽和し得る。α_２−マクログロブリン結合能を超えてしまうと、未結
合の線維素メタロプロテイナーゼの濃度は、付加的な線維素メタロプロテイナー
ゼが試料に添加されるにつれて、比例して上昇する。

【００１５】患者の全身循環中のα_２−マクログロブリンの存在は、全身血液循環中でα_２ −マクログロブリンに捕捉されるフィブロラーゼ、ＮＡＴおよび他の線維素溶解
メタロプロテイナーゼの全身（例えば静脈内）投与に対して攻撃を示す。生来α _２ −マクログロブリンの可飽和レベルをこのような線維素溶解メタロプロテイナ
ーゼの全身投与量が上回らない限り、後者は、効果的に中和され治療目的に無効
となるであろう。

【００１６】ウサギで行われたインビボ研究で、毒液由来のフィブロラーゼの生物学的有効
性が全身静脈内投与により試験された。前記のＡｈｍｅｄ他、Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ。使用されたフィブロラーゼ用量は３．０キログラムのウサギで１ミリリ
ットル当たり約６０マイクログラムの最終血液濃度をもたらすと概算された、１
キログラム当たり３．７ミリグラムである。この量は、おそらくα_２−マクログ
ロブリンによる血液または血漿中に存在する酵素の不活性化を試験する研究をベ
ースに選択された（ｐ．３３６および３３９参照）。

【００１７】別のインビボ研究では、血餅溶解での組換えフィブロラーゼの生物学的効果を
イヌで試験した。前記のＭａｒｋｌａｎｄ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ。１キロ
グラム（動物の体重）当たりこの物質４ミリグラムを５分間かけて、予め生じさ
せた血栓付近で、カテーテル装置により左の頚動脈に注入した（ｐ．２４５０参
照）。ここで再び、おそらくα_２−マクログロブリンの存在により、フィブロラ
ーゼの不活性化が全身血液循環で生じたことが記載されている（ｐ．２４５４、
第２欄、最終パラグラフ参照）。

【００１８】これら２つの研究が示すように、生得α_２−マクログロブリンの可飽和レベル
を超える線維素溶解メタロプロテイナーゼの投与または全身用量によっても（ウ
サギ研究）、血餅の部位に酵素を局所的に輸送して（イヌ研究）全身投与を回避
することによっても、α_２−マクログロブリンの不活性化効果を克服することが
できる。他方で、輸送が全身的であるかまたは局所的であるかに関わらず、α_２ −マクログロブリンの可飽和レベルを超える線維素溶解メタロプロテイナーゼの
用量は、治療される患者に安全かつ許容されるレベルを上回ることもあり得る。
特に、線維素溶解メタロプロテイナーゼは線維素を分解することができるだけで
はなく、他の構造タンパク質を退化させ、したがってα_２−マクログロブリンの
可飽和レベルを上回る高い量でインビボに存在する場合には毒性を有しうる。

【００１９】本発明の目的は、インビボで血餅を溶解するために局所投与される線維素溶解
メタロプロテイナーゼを安全かつ生物学的に有効に使用する方法を提供すること
である。

【００２０】発明の概要簡単に述べると、本発明は、安全で生物学的に有効な量の線維素溶解メタロプ
ロテイナーゼをカテーテル輸送装置などを使用して血餅に局所投与することを含
む、線維素溶解メタロプロテイナーゼによりヒト患者の血餅をインビボで治療す
るための方法である。

【００２１】「安全で生物学的に有効な」量とは、線維素を分解し、血餅（即ち血栓を溶解
を簡単にするために十分な量であるが、治療される患者の循環系中のα_２−マク
ログロブリンの可飽和レベル（即ち、血管壁を損傷しうるレベル）を著しく超え
ないレベルの量である。典型的にはこの量は、インビトロα_２−マクログロブリ
ン含有率および結合能に関して研究されたヒト患者からの血液試料を用いて行わ
れた研究から決定されるように、治療されるヒト患者の体重１キログラム当たり
０．０２５から１．７ミリグラムの範囲である。この研究のインビトロ結果から
、全ての実用目的のためのα_２−マクログロブリンのインビボでの可飽和レベル
を規定することができ、したがって生物学的有効性に必要な線維素溶解メタロプ
ロテイナーゼの最低レベルだけでなく、よく許容される投与のための最大レベル
を考慮した生物学的有効量の線引きが可能である。この研究は下記の実施例でさ
らに詳述する。

【００２２】本発明の方法は、ヒトの生来の動脈または静脈血管あるいは人工動脈または静
脈グラフトに位置する静止線維素血餅の治療で、インビボ治療使用のために適用
することができる。

【００２３】ここで線維素溶解メタロプロテイナーゼの輸送の形に適用されている用語「局
所的に」または「局所」とは、血餅自体（即ち血栓内）へ直接的に、または血餅
近隣に近くに（血流に関し近位または遠位）したがって血餅により吸収される線
維素溶解メタロプロテアーゼの大部分について充分に近くに、動脈内投与または
静脈内投与することである。

【００２４】用語「カテーテル輸送装置」は、ここでは、液体を注入または排出するか通路
を開放したままにする目的のために、管、血管、通路または体腔に挿入するため
の管状の医療装置を意味する慣用的意味合いである。通常、このような装置は典
型的には、１つまたは複数の内部通路（または「ルーメン」）；物質（即ち血餅
溶解薬）をカテーテルボディに導入し、ルーメンを通って流す近傍部分；場合に
よりテーパエンドを有する末端部分；および加えられた圧力に応答して物質をカ
テーテルから出すための、末端部分の末端のところの、またはその付近の複数出
口ポートを備えた延長されたフレキシブルカテーテルを有する。

【００２５】この発明の方法を末梢動脈閉塞（ＰＡＯ）に関して下にさらに詳述する。ＰＡ
Ｏは、アテローム動脈硬化症による末梢血管疾患にその由来を見出されている。
この症状はアテローム動脈硬化症経過として多年にわたり徐々に進行し、下肢疾
患を伴う患者の約１５から２０％が危機的虚血性レベルに達する。薬物療法には
限りがあり、主に脂質低下薬または抗血小板薬などの薬剤、喫煙中止プログラム
および身体運動を使用して、予防またはリスク低減を目指している。Ｊａｃｋｓ
ｏｎａｎｄＣｌａｇｅｔｔ、Ｃｈｅｓｔ、Ｖｏｌｕｍｅ１１４、ｐ．６６
６Ｓ〜６８２Ｓ（１９９８）。

【００２６】末梢血管疾患の臨床症状は肢を脅かす虚血の急性発生または血管疾患のより慢
性的な証拠の存在（即ち、間欠性は行）を含みうる。前記の予防手段の他には、
深刻な生活制限または足を脅かす虚血の徴候まで、慢性ＰＡＯは典型的には治療
されない。冒された血管区域および閉塞の範囲に応じて、利用可能な医学的介入
は経皮経管血管形成術、外科的血管再生および血栓溶解を含む。特に閉塞の早期
段階で血餅溶解薬を動脈内注入すると、外科的介入の必要性を回避できることを
研究は示している。急性ＰＡＯの治療においてプラスミノーゲンアクチベーター
ウロキナーゼを用いる血栓溶解と外科手術とを比較するロチェスター試験で示さ
れたように（Ｏｕｒｉｅｌ他、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶａｓｃｕｌａｒＳｕ
ｒｇｅｒｙ、１９９４、Ｖｏｌｕｍｅ１９、ｐ．１０２１〜１０３０）、研究
の血栓溶解群での患者の約３３％が薬剤介入のみで有効に治療され、したがって
更なる侵襲的処置が回避された。対照的に、手術群での患者の９８％は、血管内
または外科的処置を受けた。

【００２７】閉塞性血餅に関わる他の医学的障害も本発明の方法により同様に有効に治療す
ることができ、これには、これだけに限らないが急性心筋梗塞、虚血性発作、深
部静脈血栓症および肺動脈塞栓症が含まれる。本発明の方法は、留置カテーテル
および血液透析アクセス移植片などの長期にわたり移植される医学的装置に伴い
生じる血餅を溶解するために使用することもできる。

【００２８】図面の簡単な説明図１Ａ〜１Ｃ。図１Ａはバルーンカテーテル誘発損傷および閉塞性血栓形成前
の成体ブタでの頚動脈のベースライン血管造影図である。矢印は、左総頚動脈中
の造影剤の位置および存在を示しており、動脈中の血流が遮られていない（即ち
血管が「開存」しているか、「開存性」を有する）ことを示している。図１Ｂは
本発明の方法によりＮＡＴを投与する前の、同じ動物での第４日で得られた血管
造影図である。矢印は左総頚動脈の位置を示しているが、造影剤は、閉塞性血栓
の存在により動脈中を流れていない。図１Ｃは「ＰＲＯ」カテーテル（この装置
の図解に関しては図３参照）を介してＮＡＴ３０ｍｇを投与した後、２時間後の
血管造影図である。矢印は血管中の造影剤の存在を示しており、左頚動脈に開存
性が回復したことを証明している。最小残留血栓が、動脈のルーメンに見える。

【００２９】図２は血管に血栓溶解薬を局所輸送するために設計されたカテーテル装置の１
タイプを図示している。側面断面図でここでは示されているこの装置は、輸送末
端に「サイドホール」を有し、これを介して、輸液剤（血栓溶解剤）が適用液圧
下に放出される。この図およびこの図に続く図の、全体サイズに対するカテーテ
ル管の直径は、細部をより良く見せるために誇張されている。

【００３０】図３は血管に血栓溶解剤を局所輸送するためのカテーテル装置の別のタイプの
側面断面図である。この装置は「プレッシャレスポンスアウトレット」（ＰＲＯ
）と称される細いスリットを有し、これは、カテーテル内の液圧が臨界点に達す
ると、輸液が漏れてスリットが開くように、一定の間隔でカテーテル壁まで切ら
れている。この装置は、薬剤注入のパルスを輸送しうるピストン駆動の自動パル
ス注入装置（図示せず、ただしさらに下記で例証）と組み合わせて使用すること
ができる。

【００３１】発明の詳細な説明本発明の方法はα_２−マクログロブリンと錯体化しうる線維素溶解メタロプロ
テイナーゼを治療輸送するために適用することができる。天然に生じる場合、こ
のような線維素溶解メタロプロテイナーゼはその天然源から、例えばヘビ毒液か
らのフィブロラーゼから精製することができる。もしくは、その核酸およびアミ
ノ酸配列が公知であるポリペプチド線維素溶解メタロプロテイナーゼは、組換え
発現および精製の慣用の方法を使用して製造することができる。

【００３２】通常、組換え方法は対象の線維素溶解メタロプロテイナーゼをコードするＤＮ
Ａ分子を使用し、これを適正なベクターに挿入して、適切な宿主細胞中で発現さ
せる。このベクターは、使用される特定の宿主細胞中で機能性であるように選択
される。即ちこれは、ＤＮＡの発現が生じうるように機構的に宿主細胞と相容性
である。ベクターは５’フランキング配列（「プロモーター」とも称される）お
よび発現されるＤＮＡに作用可能なように連結された他の発現調節エレメント、
さらに他の公知のエレメント、例えば複製エレメント、転写終止エレメント、ド
ナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペ
プチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、コード核酸
を挿入するためのポリリンカー領域ならびに選択マーカーエレメントも含んでよ
い。ベクターは場合により「タグ」配列、即ちポリＨｉｓまたは他の小さい免疫
原性配列をコードするポリペプチドコード配列の５’または３’末端に位置する
オリゴヌクレオチド配列も含んでよい。このタグは対象のタンパク質と共に発現
され、宿主細胞からこのポリペプチドを精製するためのアフィニティータグとし
て役立つ。所望の場合には、このタグを後で様々な方法、例えば選択的ペプチダ
ーゼを使用して精製されたポリペプチドから除去することができる。

【００３３】ポリペプチドが宿主細胞から分泌されることが望ましい場合には、合成された
場所から宿主細胞の外へポリペプチドを向わせるためのシグナル配列を使用する
ことができる。典型的には、シグナル配列を核酸配列のコード領域に置くか、コ
ード領域の５’末端に直接置く。多くのシグナル配列が同定されていて、選択さ
れた宿主細胞中で機能性であるものの、いずれもが使用可能である。

【００３４】ベクターが構成され、核酸がベクターの適切な位置に挿入されたら、増幅およ
び／またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを適切な宿主細胞に挿
入することができる。宿主細胞は原核性（Ｅ．ｃｏｌｉなど）または真核性（例
えば酵母菌、昆虫細胞または脊椎細胞など）であってよい。

【００３５】適切な宿主細胞または細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）ま
たは３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞であってよい。適切な哺乳動物宿主細胞の選
択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物製造および精製
の方法は公知技術である。他の適切な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１およびＣ
ＯＳ−７細胞系ならびにＣＶ−１細胞系である。他の代表的な哺乳動物宿主細胞
は霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系を含み、形質転換細胞系も含む。正常２倍
体細胞および初代組織のインビトロ培養由来の細胞株のみならず、一次外植片も
適している。候補細胞には、選択遺伝子が遺伝形質的に欠失しているもので有り
得、または優勢に作用している選択遺伝子を有するものであり得る。さらに他の
適切な哺乳動物細胞系は、これに限らないが、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞
、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来する３Ｔ３系、ＢＨＫあ
るいはＨａＫハムスター細胞系を含む。

【００３６】細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉの様々な株ならびに酵母菌の様々な株も宿主細
胞として使用することができる。

【００３７】選択された宿主細胞へのベクターの挿入（「形質転換」または「形質移入」と
も称される）はリン酸カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェ
クション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法を使用
して行うことができる。選択された方法はある程度、使用される宿主細胞タイプ
との関係で決定される。これらの方法および他の適切な方法は当業者によく知ら
れている。

【００３８】適切な条件下に培養された宿主細胞は対象の線維素溶解メタロプロテイナーゼ
を合成することができる。当業者に良く知られている通常の培地を用いて、宿主
細胞を培養することができる。培地は通常、細胞の成長および生存に必要な全て
の栄養素を含有する。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するために適切な培地は例えば、
Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）であ
る。真核細胞を培養するために適切な培地はＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥ
Ｍであり、これら全てに、特定の細胞系の培養で必要とされる血清および／また
は成長因子を補足することができる。

【００３９】典型的には、形質転換された細胞のみを選択的に成長させるために有効な抗生
物質または他の化合物を、培地へのサプリメントとして添加する。使用すべき化
合物は、細胞をそれで形質転換したプラスミド上に存在する選択マーカーエレメ
ントにより影響される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン抵抗性
である場合、培養培地に添加される化合物はカナマイシンである。

【００４０】宿主細胞中で産生されるタンパク質の量は、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫
沈降法および／またはＤＮＡ結合ゲルシフト法などの活性分析法を含む、当分野
で知られている通常の方法を使用して評価することができる。

【００４１】タンパク質がグラム陰性菌以外の宿主細胞から分泌される場合、大部分は細胞
培養培地中で見出される。これが分泌されていない場合、細胞質中に存在する。
細胞内タンパク質では、宿主細胞を典型的には、先ず機械的に破壊する。タンパ
ク質がペリプラズマ領域に在る場合には、ペリプラズム内容物を緩衝溶液に放出
するために機械的破壊または浸透処理を使用することができ、次いでポリペプチ
ドをこの溶液から単離する。その後、溶液からの精製を、様々な技術を使用して
行うことができる。

【００４２】そのカルボキシルまたはアミノ末端にヘキサヒスチジンまたは他の小さいペプ
チドなどのタグを含むようにタンパク質が合成されている場合、これを必ず、ワ
ンステッププロセスでアフィニティカラムに溶液を通過させることにより精製す
る。このカラムマトリックスはタグまたはポリペプチドに対して直接に高いアフ
ィニティを有する（即ちモノクローナル抗体）。ポリペプチドがタグを有さず、
抗体が利用できない場合には、他の良く知られている精製のための方法を使用す
ることができる；例えばイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグ
ラフィー、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた天然ゲ
ル電気泳動および分取等電点電気泳動（「イソプライム（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ）」
装置／技術、ＨｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。場合によっては、これら
の技術の２種またはそれ以上を純度を高めるために組み合わせることもできる。

【００４３】本発明の実施を詳述するためにここで使用されるＮｏｖｅｌＡｃｔｉｎｇ
Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ（ＮＡＴ）ポリペプチドは通常、ＳＥＱＩＤＮＯ
：１の線維素溶解活性なメタロプロテイナーゼを言う。ＮＡＴポリペプチドは、
ＳＥＱＩＤＮＯ：２のｃＤＮＡ分子によりコードされるが、同じポリペプチ
ドをコードする様々な配列のＤＮＡ分子を、下記でさらに参照される特定の方法
で発現および製造するために使用することもできる。

【００４４】フィブロラーゼは、科学文献および特許文献中に記載されている；前記参照。
典型的には、本発明の実施で使用されるフィブロラーゼの形は、ＳＥＱＩＣ
ＮＯ：４のｃＤＮＡ分子または同じアミノ酸配列をコードするその変異体により
コードされるＳＥＱＩＤＮＯ：３の形である。

【００４５】好ましくは、ＮＡＴの組換え発現のために酵母発現系を使用する。使用に最も
有利で好ましいものとして、Ｐｉｃｈｉａ株、例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
ｒｉｓを特に挙げることができる。このような系の詳細な記載は米国特許４８５
５２３１号（Ｓｔｒｏｍａｎ他）、米国特許４８１２４０５号（Ｌａｉｒ他）、
米国特許４８１８７００号（Ｃｒｅｇｇ他）、米国特許４８８５２４２号（Ｃｒ
ｅｇｇ）および米国特許４８３７１４８号（Ｃｒｅｇｇ）に見ることができ、こ
れらの開示をここに参照により取込む。このような系でのフィブロラーゼの発現
は典型的には、「成熟型」ポリペプチド（ヌクレオチド７８４〜１３９２）に加
えて「プレプロ」配列（ヌクレオチド１〜７８３）をコードするＳＥＱＩＤ
ＮＯ：５のＤＮＡ分子に関する。このような系でのＮＡＴの発現は典型的には、
「成熟型」ポロペプチド（ヌクレオチド７８４〜１３８６）に加えて、「プレプ
ロ」配列（ヌクレオチド１〜７８３）をコードするＳＥＱＩＤＮＯ：６のＤ
ＮＡ分子を含む。

【００４６】本発明で使用される線維素溶解メタロプロテイナーゼをそれがＮＡＴ、フィブ
ロラーゼまたは他の線維素溶解メタロプロテイナーゼであるかに関わらず、薬剤
的に許容される溶液の形で単独で、または付加的な製剤的に許容される成分と共
に投与する。所望の場合にはこのような溶液は、線維素溶解メタロプロテイナー
ゼおよび溶剤（即ち蒸留水または生理食塩水）に加えて、安定剤（タンパク質凝
集あるいは水性媒体中での物理的または化学的分解を防ぐための）、充填剤（バ
ルクを提供するための）、希釈剤、抗菌剤、粘度調節剤、抗酸化剤などの通常の
成分を慣用の量で含有してよい。処方物中に含まれていてよい公知の付形剤には
ポリオール（マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールを含む）；糖（グ
ルコースおよびスクロースを含む）；ならびにアミノ酸（アラニン、グリシンお
よびグルタミン酸を含む）が含まれる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ参照。

【００４７】望ましくは、製剤組成物を投与前に中性（７．０）またはその付近、通常は約
６．５から約８．０ｐＨ（±０．５）であるｐＨに緩衝する（生体親和性緩衝剤
、例えばクエン酸またはクエン酸塩）。

【００４８】フィブロラーゼまたはＮＡＴなどで、線維素溶解メタロプロテイナーゼの金属
イオンが亜鉛である場合、安定剤として水溶性亜鉛塩（例えば、硫酸亜鉛または
酢酸亜鉛）を含むことが好ましい。組成物の長期安定性および貯蔵安定性をさら
に増強するために、溶液を凍結するか、事情に応じて使用前に解かすか、元に戻
す凍結乾燥（フリーズドライ）生成物に変えることも有利である。

【００４９】例として、本発明の方法で使用可能な凍結可能な液体薬用組成物はフィブロラ
ーゼまたはＮＡＴ、水溶性亜鉛塩、クエン酸緩衝液、場合により水溶性カルシウ
ムからなる群から選択される付加的安定剤ならびに場合により充填剤（例えばマ
ンニトール）を含む。Ｔｗｅｅｎ８０（ＢＡＳＦ、Ｇｕｒｎｅｅ、Ｉｌｌｉｎｏ
ｉｓ）などの界面活性剤を、凍解安定性を高めるために添加することもできる。
トリス緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）またはｐＨ
７．０を上回る緩衝能を有する他の緩衝液を、ｐＨをｐＨ７．４またはそれ以上
に安定化させるために添加することもできる。これらの成分の多くは、０．００
１から２．０ミリモル（ｍＭ）の範囲または１０％（ｗ／ｖ）未満の少量で存在
する。所望のｐＨを達成するために十分な量で緩衝剤を添加するが、この量は特
定の処方により変動しうる。

【００５０】更なる例として、本発明の方法で使用することができる凍結乾燥可能か、凍結
乾燥された製剤組成物はフィブロラーゼまたはＮＡＴ、亜鉛安定剤（例えば前記
のような水溶性亜鉛塩）ならびにクエン酸緩衝液を他の付形剤（例えば、マンニ
トール、グリシンなどの充填剤）と共に、またはそれを伴わずに有する。凍結乾
燥された組成物はさらに、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）とし
てスクロースまたはトレハロースなどの二糖を含んでよい。Ｔｗｅｅｎ８０など
の界面活性剤を、線維素溶解メタロプロテイナーゼ（例えば、フィブロラーゼま
たはＮＡＴ）を凍結乾燥ストレスに対して保護するために添加することもできる
。ｐＨ８．０±０．５の範囲にｐＫ_ａを有する適切な緩衝液（たとえば、Ｔｒｉ
ｓ）を使用して、ｐＨを理想的にはこの範囲に維持する。成分の量は前記による
。

【００５１】前記のように、本発明の方法を、０．０２５から１．７ｍｇ／ｋｇの範囲の生
物学的に有効な量の線維素溶解メタロプロテイナーゼを局所投与するために使用
する。好ましくは、この量は約０．１から約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲である。溶
液濃度はしたがって、投与の必要に応じて稀釈して処方する。

【００５２】典型的なケースでは、本発明の方法をカテーテル定方向血栓溶解処置と組み合
わせて実施する。このような処置は、その側壁が薄い、半硬質または軟質生体親
和性材料（例えばポリオレフィン、フルオロポリマーまたは他の不活性ポリマー
）製でよい前滅菌されたカテーテルタイプ薬剤輸送装置の使用を伴う。通常、適
切なカテーテルは装置の長さに亙る少なくとも１つの内部空洞（またはルーメン
）を含む。カテーテルがそれから構成されている材料は、血管壁に損傷をもたら
すこと無く、血管系の内部を通して動かすに十分なほど柔軟であるが、装置の内
部空洞が十分に膨張したまま治療部位までの距離まで延びるに十分に硬い。典型
的には、このようなカテーテル装置はカテーテル直径では２から２０のフレンチ
スケールであり（１／３ミリメートル＝１フレンチ）、長さでは２から６フィー
トまたはそれ以上である。

【００５３】本発明による血栓溶解投薬の血管内輸送のためのカテーテル装置の例を図２お
よび３に示したが、この実際の適用は下記の実施例に詳述する。しかしながら、
ここで参照する特定の装置を含め（これに限らないが）、この方法に適切な慣用
のカテーテル輸送装置のいずれをも使用することができる。

【００５４】線維素溶解メタロプロテイナーゼの有効用量をカテーテルを介して、拍動性注
入、持続注入、ボーラス投与またはこれら３種全ての組み合わせにより治療の局
所部位に輸送することができる。治療溶液中の線維素溶解メタロプロテイナーゼ
の溶液濃度（即ち濃度）は重要なパラメーターの１つである。特には、下限では
有効性のための線維素溶解メタロプロテイナーゼの最低稀釈（ボーラス投与で特
に重要である）と上限では線維素溶解メタロプロテイナーゼの最大溶解性との間
の範囲を選択するべきである。通常、約０．１から約８０ｍｇ／ｍＬの範囲の溶
液濃度を使用する。次いでボーラスの用量（または「パルス」輸送の場合の複数
ボーラスの総用量）を、前記の範囲内の有効量の線維素メタロプロテイナーゼを
輸送するために選択する。

【００５５】特異的な実施形態の説明さらに本発明を次の実施例で詳述するが、これは詳述を目的としたものであっ
て、本発明を記載の実施形態に限定するものではない。これらの実施例中、およ
び本発明の説明を通して、「ｋｇ」は試験患者の体重のキログラムを示し、「ｍ
ｇ」はミリグラムを示し、「ｍＬ」はミリリットルを示し、「ｍｉｎ」は分を示
す。記載の線維素溶解メタロプロテイナーゼ、即ちＮｏｖｅｌＡｃｔｉｎｇ
Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ（ＮＡＴ）は組換え由来であり、前記の方法で製造し
た。

【００５６】実施例１成体ブタ総頸動脈の亜急性血栓症における血栓溶解契約研究所（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏ
ｕｔｈｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で、平均体重が７５ｋｇの
成体ブタにおける頸動脈の亜急性血栓症のモデルで、ＮＡＴを検討した。この検
討は、ヒトの末梢動脈閉塞症に関連する血栓症モデルにおいてＮＡＴの線維素溶
解活性を確定するために行った。

【００５７】この動物モデルにおいて、バルーン損傷、トロンビンおよび鬱血を組み合わせ
て、頸動脈をその全長（大動脈での基点から頸動脈分岐部までのおよそ２０セン
チメートル）に沿って血栓症にした。血栓の大きさは、末梢動脈閉塞症を有する
ヒトにおいて臨床的に見られる血栓の大きさに近い。血栓症に成功した後、動物
を４日間回復させた。広範な繊維素の架橋結合、血栓の再構築、および細胞の浸
透を行わせるために４日間を選択した。特に、このモデルにおける血栓の大きさ
も年齢も、最近発表された、ヒトの末梢動脈閉塞症においてプラスミノーゲン活
性化因子を用いる血栓溶解のＴＯＰＡＳ試験に報告されている虚血性症状の大き
さおよび持続期間の妥当な代表である。例えば、Ｏｕｒｉｅｌ他、ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ３３８
、ｐ．１１０５〜１１１１（１９９８）を参照されたい。

【００５８】簡単には、総頸動脈を蛍光透視法で誘発した直接バルーン損傷によりその全長
に沿って血栓症にすることができる。使用するバルーンは過大寸法でありコンプ
ライアントでない。１２気圧までの圧力でバルーンを膨張させて、血管の内膜層
に破砕損傷を引き起こす。バルーンが膨張している間、血管内皮を剥ぎ取るため
に前後に動かす。

【００５９】空気注入法は、極めて損傷性であって、高度な血栓形成性血管表面を引き起こ
し、総頸動脈の全長の全体に渡って繰り返す。全動脈を完全に損傷した後、大動
脈の近接部位にバルーンを引き上げ、膨張させて血管を通る血液の流れを閉塞す
る。閉塞している間、凝血を刺激するためにバルーンカテーテルの末端部分を通
して、ウシのトロンビンを５０ユニット注射する。３０分間バルーンを膨張させ
たままにしておくと、血管が血栓性閉塞する。３０分後、バルーンをしぼませ、
血管が閉塞したことを確かめるために血管造影を行う。これらの方法により、血
管の閉塞は９０％以上の確率で成し遂げられた。

【００６０】血栓症にした後、バルーンカテーテル、ガイドカテーテルおよびアクセス鞘を
除去し、４日間動物を回復させる。４日目に、動物を再度麻酔し、閉塞を再確認
し、多数の側面穴のある薬物輸送カテーテル（図２および３参照）を蛍光透視法
の手引きに従って進め、側面穴が血栓内に位置するように配置する。１０から３
０ｍｇ（または体重換算でおよそ０．１から０．４ｍｇ／ｋｇ）の範囲に固定し
たＮＡＴ用量を用い、図１Ａ〜１Ｃに示すように、ＮＡＴでの血栓溶解を血管造
影的に観察した。

【００６１】図１Ｂに図示するように、血管造影法で評価される順行性血流を回復させるた
めに、ＮＡＴは効果的である。より定量的にするため、目標血管中の血流は次の
４点法（０から３の範囲）に従って定量的に点数化する。

【００６２】０は、血流なし。

【００６３】１は、対側性（非血栓症）頸動脈の３０％未満と見積られる血流。

【００６４】２は、対側性頸動脈の３０〜８０％と見積られる血流。

【００６５】３は、対側性頸動脈と見分けのつかない血流。

【００６６】図１Ｂに示したイメージは、３の血流等級として点数化した。この等級は３０
ｍｇ用量で固定したＮＡＴ（７５ｋｇブタにおいておよそ０．４ｍｇ／ｋｇ）を
用いて処理した血栓症血管ではしばしばなる。以下の実施例における表１〜３に
、治療法および連続的な血管撮影から得られた平均血流点数を示す。全ての研究
において、呼吸、体温、心拍数および動脈圧を連続的に監視したところ、ＮＡＴ
の投与に対して変化が観察されない程度の生理的範囲内であった。

【００６７】実施例２ＰＲＯカテーテルおよびパルス−スプレー輸送の選択末梢動脈閉塞の臨床管理においては、血栓近傍に位置するかまたは血栓中に組
み込んだカテーテルを通して血栓溶解剤を輸送する。図２および３に示すように
、２つのタイプのカテーテルがある。

【００６８】１種である「サイドホール」カテーテル（図２）は、閉鎖末端６の近傍のカテ
ーテル（４）に開けた小さな円形のサイドホール（２）、および近接末端１２に
添付した接合リング１０中の入口８（線維素溶解性メタロプロテイナーゼ溶液用
）を有する。カテーテル４は、曲げやすく、細長い、生体適合性のポリマーチュ
ーブ物質から構成されており、これは中空で薄壁であって、２から２０Ｆｒｅｎ
ｃｈ、および好ましくは３から５Ｆｒｅｎｃｈの均一な直径を有する。カテーテ
ルは、サイドホール２を含むカテーテル部分との境界を画する末端６近傍の外面
に、２つの放射線不透過性のマーカー１４を含む。実際には、閉塞した動脈また
は静脈中の外科的開口にカテーテルを挿入し、標準の承認済み手段に従って蛍光
透視により観察しながら、末端６が血栓中または近傍に位置するように血管中を
注意深く動かす。蛍光透視イメージで明確に現れるマーカー１４は、サイドホー
ル２から放出される輸液が、血栓に直接接触するように、カテーテルの部分を位
置づけるためのガイドとして役立つことができる。そして、入口８に注射器様リ
ザーバ１６から穏やかな圧力で、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの薬剤溶液
を注射し、末端６にまで運び、血栓中にホール２を通して放出して、繊維素物質
の分解を引き起こす。

【００６９】線維素溶解性メタロプロテイナーゼの注入をこのタイプのカテーテルを用いて
行う場合、ほとんどの線維素溶解薬含有溶液は、近接サイドホール（すなわち、
薬剤入口８に最も近いホール）から漏れる傾向にあり、これは治療部位での薬剤
輸送の均一性には負の効果を有することになる。負の圧力下ではサイドポート２
を通してカテーテル中に血液が逆流する可能性もある。

【００７０】図３に示す中空で薄壁の生体適合性ポリマー物質から構成されてもいる他種の
カテーテルは、閉鎖末端６の近傍に等間隔で曲げやすいカテーテル４にレーザで
切り込まれた極めて薄いスリット２を有する。プレッシャレスポンスアウトレッ
ト（「ＰＲＯ」）と言われるこのスリットは、カテーテル内の液圧が臨界点に達
して、スリットを同時に膨張させ、それによって一時的に開口しない限り輸液が
漏れ出さないように充分堅固である。血栓部位に装置を位置決めする助けとして
、カテーテルは外部の放射線不透過性マーカー８をも含む。

【００７１】理想的には、この種の「ＰＲＯ」注入カテーテルは、カテーテル４の近接末端
１４に付着された接合リング１２中の入口１０に、低容量の薬剤輸液を定常パル
スで輸送することができる、自動化したピストン駆動のパルス式注入装置（図示
せず）と共に使用する。パルス輸送する際、カテーテル内の圧力は一時的に上昇
する。これに応じて、プレッシャレスポンスアウトレット（スリット２）が一時
的に開口し、輸液（例えば、線維素溶解性メタロプロテイナーゼの薬剤溶液）を
放出させる。輸液をパルス状に輸送することおよびＰＲＯタイプのカテーテルの
理論的利点は、スリットを通ってカテーテルの全長に沿って輸液が均一に輸送さ
れることが、「サイドホール」カテーテル（図２）を通って輸送された輸液は最
小抵抗の経路に従い、記載したように非均一的に近接サイドホールから流れ出す
。

【００７２】４日齢頸動脈血栓症のブタモデルを、３０ｍｇの固定ＮＡＴ用量（７５ｋｇの
ブタにおいておよそ０．４ｍｇ／ｋｇ）を用いて上述した２種のカテーテルタイ
プの性能を評価するために使用した。結果を表１に要約する。

【００７３】

【表１】

【００７４】ＣＭ：Ｃｒａｇｇ−ＭｃＮａｍａｒａ（商標）バルブのある注入「サイドホー
ル」タイプのカテーテル（ＭｉｃｒｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、
ＳａｎＣｌｅｍｅｎｔｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＰＳ：自動パルス注入装
置（ＰＵＬＳＥ^＊ＳＰＲＡＹＩＮＪＥＣＴＯＲＭｏｄｅｌＰＳＴ−１、
ＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｑｕｅｅｎｓｂｕｒｙ、ＮｅｗＹｏ
ｒｋ）と共に用いる、プレッシャレスポンスアウトレット（ＰＲＯ）カテーテル
（Ｕｎｉ^＊Ｆｕｓｅカテーテル（商標）、ＡｎｇｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎ
ｃ．、Ｑｕｅｅｎｓｂｕｒｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ）を使用することにより定義さ
れる「パルススプレー」輸送。

【００７５】表１に示すように、パルス−スプレー様式で処置した群における血管造影血流
点数は、３０分間血管造影した最初の血流点数より僅かに高く、これは４時間時
点まで維持することが示された。統計的な差異は得られなかったけれども、血管
造影の結果は一般的に優れていると判断された。したがって、パルス−スプレー
輸送と組み合わせたＰＲＯ−タイプのカテーテルは、本発明に従う線維素溶解性
メタロプロテイナーゼの好ましい輸送モードである。

【００７６】実施例３薬剤輸送時間の評価急性末梢動脈閉塞は、通常ウロキナーゼなどのプラスミノーゲン活性化因子で
処置し、これはしばしば２４時間、時には４８時間という長期間で輸液として輸
送する。閉塞性血栓を効率的に溶解するために長期間にわたってプラスミン生成
の程度を低く維持するために長期にわたる注入を行う。ＮＡＴおよびフィブロラ
ーゼのいずれも線維素溶解性メタロプロテイナーゼであるので、このような期間
の長い注入は必要でない。輸送速度が血管造影血餅溶解に影響するかどうかを判
定するため、３０ｍｇの固定ＮＡＴ用量（７５ｋｇブタ中およそ０．４ｍｇ／ｋ
ｇ）をＰＲＯカテーテルおよびパルススプレー装置を用いて輸送した。０．１ｍ
Ｌのパルス容量を用いて、５ｍｇ／ｍＬＮＡＴ溶液を６分かけて（１分間に１０
パルス）または６０分かけて（１分間に１パルス）輸送した。結果を表２に示す
。

【００７７】

【表２】

【００７８】表２に示すように、６分かけて３０ｍｇのＮＡＴを輸送すると、３０分血管造
影で３動物において平均血流点数が２．７であり、これは４時間まで維持された
。対照的に、６０分かけてパルス注入により３０ｍｇのＮＡＴを輸送しても大し
て目立たなかった。これらのデータを統計的に比較してはいないけれども、より
速いパルス投薬としてＮＡＴを輸送することが好ましいことをこの結果は示して
いる。

【００７９】実施例４パルス容量の最適化パルス−スプレー注入装置は、１パルス当たり０．１から０．５ｍＬのパルス
容量を輸送するようにプログラム可能である。パルス容量がブタモデルにおいて
血管造影結果に何らかの効果があるかどうかを決定するために、パルス容量０．
２ｍＬとパルス容量０．４ｍＬとを比較した。１０ｍｇ（７５ｋｇブタにおいて
０．１５ｍｇ／ｋｇと同等）の固定用量でＮＡＴを輸送した。結果を表３に示す
。

【００８０】

【表３】

【００８１】表３に示すように、３０分において平均血管造影点数は、０．４ｍＬパルス容
量群において僅かに高かった。しかしながら、４時間の時点では、群の平均は０
．２ｍＬパルス容量で僅かに高かった。したがって、これらの調査からはあるパ
ルス容量が別のパルス容量より優れているかについて結論を引き出すことはでき
ない。

【００８２】これらＮＡＴ処置法はほぼすべて、本発明の輸送方法を用いて末梢動脈閉塞を
処置するために効果的であり、これらの結果は少なくとも血栓溶解剤に対する現
行の好まれる処置であるウロキナーゼなどのプラスミノゲン活性化因子での処置
に匹敵することを、前述の記載および表の結果は示している。

【００８３】この結果は、パルス−スプレー輸送を有するＰＲＯカテーテルは、優れた血管
造影結果を提供すると考えられることを示している。これらの調査において動物
の体重（７０〜１００ｋｇ）を考慮すると、３０ｍｇの固定用量は、体重換算で
およそ０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇに相当する。

【００８４】固定ＮＡＴ用量を１０ｍｇに下げると、４時間での群平均血管造影点数が減少
し、若干の動物では開存性が得られなかった。これは、１０ｍｇのＮＡＴ用量は
このモデルでは生理活性に関して限界用量であると思われることを示している。
これらの調査において動物の体重（７０〜１００ｋｇ）を考慮すると、１０ｍｇ
の固定用量は、体重換算でおよそ０．１〜０．１５ｍｇ／ｋｇに相当する。パル
ス容量を０．２ｍＬから０．４ｍＬに変化させても、血管造影開放点数への大き
な影響は見られなかった。

【００８５】実施例５ヒトにおける安全で十分に許容され生物学的に有効な用量範囲の確立末梢血管系疾病（ＰＶＤ）を有する高齢の患者におけるα_２−マクログロブリ
ンの血清中濃度および生化学活性に関して満足すべき文献は見当たらない。α_２ −マクログロブリン濃度は安全性の重要な決定要因であり、生体内で線維素溶解
性メタロプロテイナーゼの許容度に関連すると考えられるので、血清中α_２−マ
クログロブリン濃度および線維素溶解性メタロプロテイナーゼ結合能を評価する
ために（試験薬としてＮＡＴを用いて）ＰＶＤ患者に横断疫学的調査を行った。

【００８６】２６０名の患者を２カ所のセンター（ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎｉｃＦ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、およびＲｏｃｈｅｓｔｅｒ
ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に登録した。
人口学的情報および他の患者の特徴を収集し、α_２−マクログロブリン、（結合
していないＮＡＴを検出するＨＰＬＣアッセイを用いて個々の患者の血清サンプ
ルを力価測定することによる）ＮＡＴ結合能および他の血清化学パラメータを測
定するために血清を得た。主な終点は、α_２−マクログロブリンの血清中濃度と
生体外で中和されるＮＡＴ量（血清ミリリットル当たりのミクログラム）との関
係（ＮＡＴ結合能）を決定することであった。

【００８７】本調査における患者の特徴をＰＡＯにおける血栓溶解に関して発表済みの２つ
の大規模な調査（すなわち、ＳＴＩＬＥおよびＴＯＰＡＳの調査）での特徴と比
較すると、本調査における患者の集合は、ＰＡＯにおける血栓溶解の以前の調査
を代表することが示された。以前の調査の更なる詳細に関しては、それぞれ、Ａ
ｎｎａｌｓｏｆＳｕｒｇｅｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ２２０、ｐ．２５１〜２６
６（１９９４）およびＯｕｒｉｅｌ他、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａ
ｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌｕｍｅ３３８、ｐ．１１０５〜１１１１
（１９９８）を参照のこと。

【００８８】ＮＡＴに関する推定最大用量（ＥＭＤ）をＮＡＴ結合能およびそれぞれの患者
の血漿量の推定値を用いてそれぞれの患者について計算した。その調査により平
均の患者は、ＮＡＴと結合し中和するα_２−マクログロブリンの能力を超えずに
（局所的にまたは全身的に輸送された）１．７ｍｇ／ｋｇの用量を受けることが
出来ると予測される。調査結果を下記表４に要約する。

【００８９】

【表４】

【００９０】この調査における２１６検体それぞれについてＮＡＴの推定最大用量を計算し
た。この調査での結果を上記にヒストグラムとして示す。ここでは、釣鐘状の分
布が目視検査により観察できる。本調査における平均の患者は、ＮＡＴ１．７ｍ
ｇ／ｋｇ（釣鐘状の分布のピーク）を許容できると推察される。動物調査におい
て投与した用量を参照として示すが（右側）、これは調査集合の９９％において
ＮＡＴの推定最大用量を超えると見ることができる。

【００９１】したがって、本発明に関する０．０２５から１．７ｍｇ／ｋｇの規定範囲は、
患者が、（α_２−マクログロブリンに関する血漿量およびＮＡＴ結合能を基準と
して）循環中遊離のＮＡＴが発生せずに安全に受けることができる用量の合理的
な推定値である。

【００９２】結論として、例示した薬理学調査の結果である上記実施例１〜４は、ヒトにお
ける末梢動脈閉塞でしばしば見られる大きさおよび年齢に匹敵する血栓の、血栓
症の動物モデルにおける血餅溶解剤としての線維素溶解性メタロプロテイナーゼ
の生物学的効果を示している。動物モデルで同定された用量は、動物における潜
在的な毒性を考慮または評価せずに得たものである。Ａｈｍｅｄ他およびＭａｒ
ｋｌａｎｄ他により（上記に）記載されているラビットおよび犬における有効用
量（それぞれ３．７および４．０ｍｇ／ｋｇ）を、獣医学で線維素溶解性メタロ
プロテイナーゼに用いることができる。しかしながら、ヒトデータの存在を考慮
すると、用量３．７および４．０ｍｇ／ｋｇでの投与は、調査集合の９９％が過
剰用量である。したがって、発表済みの動物調査は、安全かつ生物学的に有効な
方式で、ヒトの線維素溶解性メタロプロテイナーゼの治療に使用することはでき
ない。他方、実施例５に示したデータは、ヒトでのこのような使用を可能にする
ものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】バルーンカテーテル誘発損傷および閉塞性血栓形成前の成体ブタでの頚動脈の
ベースライン血管造影図である。

【図１Ｂ】本発明の方法によりＮＡＴを投与する前の、同じ動物での第４日で得られた血
管造影図である。

【図１Ｃ】「ＰＲＯ」カテーテル（この装置の図解に関しては図３参照）を介してＮＡＴ３
０ｍｇを投与した後、２時間後の血管造影図である。

【図２】血管に血栓溶解薬を局所輸送するために設計されたカテーテル装置の１タイプ
を示す図である。

【図３】血管に血栓溶解剤を局所輸送するためのカテーテル装置の別のタイプの側面断
面図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C076 AA11 BB40 CC11 4C084 AA02 AA03 BA44 CA62 DC02 MA17 MA65 NA10 NA13 ZA362 ZA542

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】安全で生物学的に有効な量の、製剤学的に許容される溶液中
の線維素溶解メタロプロテイナーゼをカテーテル輸送手段により血餅に局所投与
することを含み、上記安全で生物学的に有効な量は、治療されるヒト患者の体重
１キログラム当たり線維素溶解メタロプロテイナーゼ０．０２５から１．７ミリ
グラムの範囲である、血餅のヒト患者を治療処置するための方法。
【請求項２】線維素溶解メタロプロテイナーゼの量が体重１キログラム当
たり約０．１から約０．５ミリグラムの範囲である請求項１に記載の方法。
【請求項３】線維素溶解メタロプロテイナーゼを血栓内投与により輸送す
る請求項１に記載の方法。
【請求項４】線維素溶解メタロプロテイナーゼを血餅のごく近傍に投与す
る請求項１に記載の方法。
【請求項５】血餅が動脈に位置する請求項１に記載の方法。
【請求項６】末梢動脈閉塞を治療するために使用する請求項５に記載の方
法。
【請求項７】血餅が静脈に位置する請求項１に記載の方法。
【請求項８】カテーテル輸送手段が「サイドホール」カテーテル装置を含
む請求項１に記載の方法。
【請求項９】カテーテル輸送手段が「プレッシャレスポンスアウトレット
」（ＰＲＯ）カテーテル輸送装置を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】線維素溶解メタロプロテイナーゼの溶液をパルス−スプレ
ー注入により投与する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】１パルス当たり線維素溶解メタロプロテイナーゼ溶液約０
．１から約０．５ミリリットルのパルス容量を使用する請求項１０に記載の方法
。
【請求項１２】線維素溶解メタロプロテイナーゼが１ミリリットル当たり
約０．１から約８０ミリグラムの範囲の溶液濃度で存在する請求項１に記載の方
法。
【請求項１３】線維素溶解メタロプロテイナーゼがＮＡＴ（Ｎｏｖｅｌ
ＡｃｔｉｎｇＴｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ）である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】線維素溶解メタロプロテイナーゼがフィブロラーゼである
請求項１に記載の方法。