ES2242655T3 - Uso de metaloproteinasas fibrinoliticas para el tratamiento terapeutico de coagulos de sangre. - Google Patents
Uso de metaloproteinasas fibrinoliticas para el tratamiento terapeutico de coagulos de sangre.Info
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Abstract
Uso de una metaloproteinasa fibrinolítica que forma complejo con la á2-macroglobulina en una solución farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de un sujeto humano aquejado de un coágulo de sangre, por administración local al coágulo de sangre por medios de administración por catéter, en donde la metaloproteinasa fibrinolítica es para la administración en una cantidad que varía entre 0, 025 y 1, 7 miligramos de la metaloproteinasa fibrinolítica por kilogramo de peso corporal del sujeto humano que ha de ser tratado .
Description
Uso de metaloproteinasas fibrinolíticas para el
tratamiento terapéutico de coágulos de sangre.
Esta invención se refiere al uso terapéutico de
metaloproteinasas fibrinolíticas, y más específicamente al uso
in vivo de dichos agentes por administración localizada a
trombos vasculares para efectuar la lisis de coágulos.
Las oclusiones vasculares causadas por coágulos
de sangre, tales como trombos y embolismos son graves enfermedades
que pueden amenazar un miembro del cuerpo o la vida si no se tratan
a tiempo. Se han desarrollado dispositivos y métodos para el
tratamiento y la eliminación de coágulos vasculares de sangre. A
modo de ilustración, véanse la patente de EE.UU. nº 4.447.236
(Quinn), expedida el 8 de mayo de 1984; la patente de EE.UU. nº
4.692.139 (Stiles), expedida el 8 de septiembre de septiembre 1987;
la patente de EE.UU. nº 4.755.167 (Thistle et al.), expedida
el 5 de Julio de 1988; la patente de EE.UU. nº 5.167.628 (Boyles),
expedida el 1 de diciembre de 1992; la patente de EE.UU. nº
5.222.941 (Don Michael), expedida el 29 de junio de 1993; la
patente de EE.UU. nº 5.250.034 (Appling et al.), expedida el
5 de octubre de 1993: la patente de EE.UU. nº 5.370.653 (Cragg),
expedida el 6 de diciembre de 1994; la patente de EE.UU. nº
5.380.273 (Dubrul et al.), expedida el 10 de enero de 1995;
la patente de EE.UU. nº 5.498.236 (Dubrul et al.), expedida
el 12 de marzo de 1996; la patente de EE.UU. nº 5.626.564 (Zhan
et al.), expedida el 6 de mayo de 1997; la patente de EE.UU.
nº 5.709.676 (Alt), expedida el 20 de enero de 1998; la patente de
EE.UU. nº 5.865.178 (Yock), expedida el 2 de febrero de 1999, y la
solicitud de patente internacional WO 90/07352 (publicada el 12 de
julio de 1990). Dichos métodos y dispositivos incluyen catéteres de
infusión para administrar agentes trombolíticos o fribrinolíticos
al coágulo de sangre y disolverlo. Los catéteres de infusión se
usan típicamente junto con agentes enzimáticamente activos que
pueden degradar la fibrina del coágulo y por tanto disolver
eficazmente el coágulo. Dichas enzimas se denominan típicamente
agentes "trombolíticos" o "fibrinolíticos".
La fibrolasa es una conocida metaloproteinasa de
zinc fibrinolítica que se aisló primeramente del veneno de la
serpiente de cabeza cuprífera meridional (Agkistrodon contortrix
contortrix). Véase Guan et al., Archives of Biochemistry and
Biophysics, Volume 289, Number 2, pp. 197-207
(1991); Randolph et al., Protein Science, Cambridge Universidad
Press (1992), pp. 590-600; Solicitud de patente
europea nº 0323722 (Valenzuela et al.), publicada el 12 de
julio de 1989; y la patente de EE.UU. 4.610.879 (Markland et
al.), expedida el 9 de septiembre de 1986. La fibrolasa ha
demostrado ser fibrinolítica, y está documentado que esta
metaloproteinasa tiene actividad proteolítica contra la cadena
A\alpha del fibrinógeno, con escisión proteolítica reducida de la
cadena B\beta y sin actividad contra la cadena \gamma (gamma)
del fibrinógeno; Ahmed et al., Haemostasis, Volume 20, pp.
147-154 (1990). Debido a que la fibrina es un
componente principal de los coágulos de sangre, las propiedades
fibrinolíticas de la fibrolasa apuntan a su potencial como agente
de disolución de coágulos para usa trombolítico in vivo;
véase Markland et al., Circulation, Volume 9, Number 5, pp.
2448-2456 (1994), y Ahmed et al., antes
citado.
La fibrolasa con nueva acción trombolítica (NAT)
es una forma modificada de la fibrolasa natural que difiere de la
fibrolasa natural en que la fibrolasa NAT contiene 201 aminoácidos
con una secuencia N-terminal de SFPQR, mientras que
la secuencia N-terminal de la fibrolasa natural
empieza con EQRFPQR y tiene una longitud de 203 aminoácidos. La
modificación amino-terminal se diseñó para impedir
reacciones químicas en residuos de aminoácidos que podían formar una
cantidad variable de glutamina ciclizada (ácido piroglutámico) que
tiene el potencial de crear variaciones de lote a lote en la
calidad y uniformidad del producto. Por tanto, la fibrolasa NAT
puede ser considerada como una molécula más estable.
A pesar de estas diferencias estructurales, la
fibrolasa NAT y la fibrolasa natural son similares con respecto a
actividad enzimática (fibrinolítica). Esta simililtud en actividad
biológica es consistente con datos que indican que el sitio activo
de la molécula de fibrolasa abarca los aminoácidos
139-159, como se describe por Manning en
Toxicon, Volume 33, pp. 1189-1200 (1995), y
su localización predicha en el espacio tridimensional es distante
del amino terminal. El sitio activo de las moléculas de fibrolasa
natural y la fibrolasa NAT contiene un átomo de zinc que está
complejado con tres residuos de histidina.
La bibliografía publicada sobre la fibrolasa
procedente de veneno ha demostrado su actividad proteolítica contra
el fibrinógeno en el sitio Lys^{413}-Leu^{414}
y contra la cadena \beta oxidada de la insulina en el sitio
Ala^{14}-Leu^{15}; Retzios and Markland,
Thrombosis Research, Volume 74, pp. 355-367 (1994);
Pretzer et al., Pharmaceutical Research, Volume 8, pp.
1103-1112 (1991), y Pretzer et al., Pharmaceutical
Research, Volume 9, pp. 870-877 (1992). También
se ha determinado que la fibrolasa NAT tiene actividad proteolítica
sobre estos sustratos en los mismos sitios de
escisión.
escisión.
En contraste con las metaloproteinasas
fibrinolíticas, tales como la fibrolasa natural y la fibrolasa NAT,
los agentes de lisis de coágulo, tales como estreptoquinasa,
uroquinasa y el activador tisular de plasminógeno (tPA) son
activadores de plasminógeno que promueven la trombolisis por
activación del sistema fibrinolítico endógeno. Más específicamente,
los activadores de plasminógeno catalizan la conversión de
plasminógeno en plasmina, que es una
serina-proteasa. La plasmina puede escindir el
fibrinógeno y la fibrina en los enlaces
arginilo-lisilo, y es a través de la generación de
plasmina como los activadores de plasminógeno finalmente efectúan la
degradación de la fibrina y la lisis del coágulo. Los agentes
trombolíticos actuales comercialmente disponibles son activadores
de plasminógeno, tal como uroquinasa, estreptoquinasa o tPA.
A diferencia de la clase activador de
plasminógeno de los fármacos trombolíticos, las metaloproteinasas
fibrinolíticas, tales como la fibrolasa natural y la fibrolasa NAT,
no se basan en el sistema fibrinolítico endógeno (conversión de
plasminógeno en plasmina). Por tanto, esta clase de agentes de
lisis de coágulos pueden distinguirse de los activadores de
plasminógeno por su modo único de acción, y se definen como agentes
fibrinolíticos "directos".
La alfa_{2}-macroglobulina es
un inhibidor de proteinasa prevalente presente en el suero de
mamíferos y es una de las proteínas más grandes de las seroproteínas
(que tiene un peso molecular de 725 kilodaltons). La especificidad
de una \alpha_{2}-macroglobulina para las
proteinasas es amplia, abarcando las clases
serina-proteinasas,
cisteína-proteinasas, ácido
aspártico-proteinasas y metaloproteinasas. La
molécula de \alpha_{2}-macroglobulina es un
tetrámero de subunidades idénticas que están unidas por puentes de
disulfuro en pares con una asociación no covalente de medias
moléculas. Por tanto, en condiciones reductoras, la
\alpha_{2}-macroglobulina natural puede
disociarse en sus cuatro subunidades monó-
meras.
meras.
Cada subunidad de
\alpha_{2}-macroglobulina posee una región que
es muy susceptible a la escisión proteolítica (la región
"cebo"). La proteolisis de la región cebo induce un cambio
conformacional en la \alpha_{2}-macroglobulina,
que atrapa la proteinasa dentro de la estructura molecular de la
\alpha_{2}-macroglobulina. Este proceso se
describe en la bibliografía como interacción "trampa volante
Venus". Una vez que la proteinasa está atrapada, está
estéricamente impedida y por lo tanto no puede acceder a su sustrato
molecular.
Además, puede formarse un enlace covalente entre
la \alpha_{2}-macroglobulina y muchas de las
proteinasas que atrapa. Como se ha mencionado, el atrapamiento de
una proteinasa induce un cambio conformacional en la molécula de
\alpha_{2}-macroglobulina. Se supone que por
este cambio conformacional, llega a ser reactivo un enlace tioéster
en el interior de la molécula de
\alpha_{2}-macroglobulina y puede formar un
enlace covalente con los residuos nucleófilos (tales como. lisina)
de la proteinasa atrapada. Por tanto, dentro de la circulación
general, la \alpha_{2}-macroglobulina puede
neutralizar eficazmente una variedad de proteinasas.
Además, el cambio conformacional en la
\alpha_{2}-macroglobulina producido por el
atropamiento de una proteinasa da como resultado una forma que es
reconocida por el sistema reticuloendotelial. La eliminación de
\alpha_{2}-macroglobulina-proteinasas
atrapadas se describe generalmente con valores de
semi-vida de minutos y se cree que ocurre a través
del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL), que es una
proteína relacionada expresada en macrofágos, hepatocitos y
fibroblastos. Para más detalles sobre la
\alpha_{2}-macroglobulina, véase Methods in
Enzymology, editado A.J. Barrett, Academic Press, Inc.,
Philadelphia, (1981), pp. 737-754.
La alfa_{2}-macroglobulina
puede formar un complejo macromolecular con la fibrolasa natural, la
fibrolasa NAT y otras proteinasas. A diferencia de algunas
proteinasas que pueden formar un complejo disociable con la
\alpha_{2}-macroglobulina, la fibrolasa natural
y la fibrolasa NAT son dos ejemplos de metaloproteinasas
fibrinolíticas que forman un complejo que no puede disociarse de la
\alpha_{2}-macroglobulina en condiciones
fisiológicas. Cuando la
\alpha_{2}-macroglobulina y la fibrolasa NAT
purificadas, por ejemplo, se incuban juntas, la formación del
complejo comienza en segundos y es casi completa en unos cuantos
minutos. Este fenómeno muestra que in vitro la formación de
complejo puede ser rápida y sugiere la potencial rapidez de la
formación del complejo in vivo entre la
\alpha_{2}-macroglobulina y la fibrolasa NAT u
otras metaloproteinasas fibrinolíticas.
Aunque la
\alpha_{2}-macroglobulina es una de las
principales proteínas del plasma, hay sin embargo una cantidad
finita de \alpha_{2}-macroglobulina en la
circulación que pudiera estar disponible para unirse a la
metaloproteinasa fibrinolítica y neutralizarla. La capacidad de
unión de la \alpha_{2}-macroglobulina es por
tanto saturable. Una vez que se ha excedido la capacidad de unión
de la \alpha_{2}-macroglobulina, la
concentración de metaloproteinasa fibrinolítica no unida asciende
proporcionalmente a medida que se añade a la muestra
metaloproteinasa fibrinolítica adicional.
La presencia de
\alpha_{2}-macroglobulina en la circulación
general de un paciente presenta un reto para la administración
sistémica (por ejemplo, intravenosa) de fibrolasa natural,
fibrolasa NAT y otras metaloproteinasas fibrinolíticas que son
unidas (fijadas) por la
\alpha_{2}-macroglobulina en la circulación de
la sangre general. A no ser que la concentración saturable de
\alpha_{2}-macroglobulina sea excedida por la
dosis administrada sistémicamente de dichas metaloproteinasas
fibrinolíticas, estas últimas serán neutralizadas y hechas
ineficaces para fines terapéuticos.
En un estudio in vivo realizado en
conejos, la eficacia biológica de fibrolasa derivada de veneno de
serpiente se examinó siguiendo la administración sistémica
intravenosa. Ahmed et al., Haemostasis, trabajo antes
citado. La dosis de fibrolasa usada fue 3,7 miligramos por
kilogramo, que se estimó proporcionaba una concentración final en
sangre de aproximadamente 60 microgramos por mililitro en un conejo
de 3,0 kilogramos. Esta cantidad se eligió basándose en estudios
que examinaban la inactivación de la enzima en presencia de sangre
o plasma, debido presumiblemente a la
\alpha_{2}-macroglobulina (véase la páginas 336
y 339 del trabajo citado).
En otro estudio in vivo se examinó en
perros el efecto biológico de la fibrolasa recombinante sobre la
lisis de coágulos. Markland et al., Circulation, trabajo
antes citado. Se infundieron cuatro miligramos de este material por
kilogramo (de peso corporal del animal) en cinco minutos en un
sitio próximo a un trombo pre-inducido en la
arteria carótida izquierda mediante un dispositivo de catéter (véase
la página 2450 del trabajo citado). De nuevo aquí, se advirtió que
la inactivación de la fibrolasa ocurre en la circulación de la
sangre general presumiblemente debido a la presencia de
\alpha_{2}-macroglobulina (véase la página 2454,
segunda columna, último párrafo del trabajo citado).
Como muestran estos dos estudios, los efectos
desactivantes de la \alpha_{2}-macroglobulina
pueden superarse bien sea por la administración de dosis sistémicas
de metaloproteinasa fibrinolítica que excedan del nivel saturable de
la \alpha_{2}-macroglobulina innata (el estudio
con conejos) o bien sea por administración de la enzima localmente
en el sitio del coágulo (el estudio con perros) y evitando la
administración sistémica. Por otro lado, la dosis de la
metaloproteinasa fibrinolítica en exceso de la concentración
saturable de \alpha_{2}-macroglobulina, tanto si
se administra sistémicamente como localmente, puede sobrepasar las
concentraciones que son seguras y bien toleradas por el sujeto que
está siendo objeto del tratamiento. Apreciablemente, las
metaloproteinasas fibrinolíticas pueden destruir no solo la
fibrina, sino que también pueden degradar otras proteínas
estructurales y por tanto son parcialmente tóxicas in vivo
cuando están presentes en grandes cantidades que sobrepasan la
concentración saturable de
\alpha_{2}-macroglobulina.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un modo seguro y biológicamente eficaz de usar
metaloproteinasas fibrinolíticas administradas localmente para
lisar in vivo los coágulos de sangre.
Explicada de un modo resumido, está invención se
refiere al tratamiento de un coágulo de sangre in vivo en
sujetos humanos, usando una metaloproteinasa fibrinolítica, que
comprende la administración local de una cantidad segura y
biológicamente eficaz de la metaloproteinasa fibrinolítica al
coágulo de sangre, tal como por uso de medios de administración por
catéter.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona el uso de una metaloproteinasa fibrinolítica que forma
complejo con la \alpha_{2}-macroglobulina en
una solución farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento terapéutico de un sujeto humano
aquejado de un coágulo de sangre por administración local al
coágulo de sangre por medios de administración por catéter, en
donde la metaloproteinasa fibrinolítica es para administración en
una cantidad que varía entre 0,025 y 1,7 miligramos de la
metaloproteinasa fibrinolítica por kilogramo de peso corporal del
sujeto humano que se somete al tratamiento.
Por cantidad "segura y biológicamente
eficaz" se quiere decir una cantidad suficiente para degradar la
fibrina y facilitar la lisis del coágulo (es decir, el trombo), al
mismo tiempo que no se sobrepasan las concentraciones
significativamente superiores a la concentración saturable de
\alpha_{2}-macroglobulina en el sistema
circulatorio del paciente que está siendo tratado (es decir, las
concentraciones que pueden causar daño a las paredes de los vasos
sanguíneos). Típicamente, esta cantidad estará en el intervalo
entre 0,025 y 1,7 miligramos por kilogramo de peso corporal del
sujeto humano que está siendo tratado, según se determina por un
estudio realizado con muestras de sangre de sujetos humanos que han
sido estudiados para contenidos de
\alpha_{2}-macroglobulina in vitro y
capacidad de unión. Por los resultados in vitro de este
estudio, ha sido posible definir la concentración saturable in
vivo de \alpha_{2}-macroglobulina para todos
los fines prácticos, facilitando de este modo el hallazgo de una
cantidad biológicamente eficaz que tiene en cuenta no sólo la
concentración mínima de metaloproteinasa fibrinolítica requerida
para la eficacia biológica, sino también la concentración
máxima para la administración bien tolerada. Este estudio se describe con detalle más adelante en los ejemplos.
máxima para la administración bien tolerada. Este estudio se describe con detalle más adelante en los ejemplos.
El uso de esta invención es aplicable para el
tratamiento in vivo de coágulos de fibrina localizados en
vasos sanguíneos arteriales o venosos, o en injertos sintéticos
arteriales o venosos, en seres humanos.
Los términos "localmente" o
"localizado" como se aplican a la forma de administración de la
metaloproteinasa fibrinolítica en la presente memoria se refieren a
la administración intra-arterial o intravenosa bien
directamente al coágulo de sangre propiamente dicho (es decir,
intratrombo) o en la proximidad inmediata al coágulo (bien sea
proximal o distal con respecto al flujo sanguíneo) y suficientemente
cerca de la mayoría de la metaloproteinasa fibrinolíticapara ser
adsorbidapor el coágulo.
La expresión "medios de administración por
catéter" se emplea en la presente memoria en el sentido
convencional de denominar un dispositivo médico tubular para
inserción en los canales, vasos, conductos o cavidades corporales
con el fin de inyectar o retirar fluidos o para mantener abierto un
conducto. En general, dichos medios comprenderán típicamente un
cuerpo de catéter alargado y flexible que contienen uno o más
conductos interiores (o "lúmenes"); una porción proximal que
permite que el material (es decir, el agente de lisis del coágulo)
sea introducido en el cuerpo del catéter y fluya a través del
lumen; teniendo opcionalmente una porción distal un extremo cónico;
y múltiples orificios de salida en o cerca del extremo de la
porción distal para permitir que el material salga del catéter en
respuesta a la presión aplicada.
El uso de esta invención se ilustra además a
continuación con respecto a la oclusión de la arteria periférica
(abreviadamente PAO por las iniciales de la expresión inglesa
peripheral artery occlusion). La PAO está en el origen de la
enfermedad vascular periférica debida a la aterosclerosis. Los
síntomas se desarrollan lentamente durante muchos años a medida que
progresa la aterosclerosis, alcanzándose un nivel isquémico crítico
en aproximadamente 15 a 20% de los pacientes con enfermedad de las
extremidades inferiores. La terapia médica es limitada y
predominantemente está dirigida a la prevención o reducción del
riesgo empleando medicamentos, tales como agentes depresores de
lípidos o agentes antiplaquetarios, programas de cese de exposición
a humos y ejercicio físico. Jackson and Clagett, Chest, Volume
114, pp. 666S-682S (1998).
Las manifestaciones clínicas de la enfermedad
vascular periférica pueden incluir episodios agudos de isquemia con
riesgo para los miembros inferiores o la presencia de más evidencia
crónica de la enfermedad vascular (es decir, cojeras intermitentes).
Además de las medidas antes mencionadas, la PAO crónica típicamente
no se trata hasta el comienzo de graves limitaciones en el estilo
de vida o de isquemia amenazante para los miembros. Dependiendo del
segmento del vaso afectado y la extensión de la oclusión, las
intervenciones médicas disponibles incluyen angioplastia
transluminal percutánea, revascularización quirúrgica, y
trombolisis. Hay estudios que han demostrado que la infusión
intra-arterial de agentes de lisis del coágulo,
particularmente en las etapas tempranas de la oclusión, pueden
evitar la necesidad de intervención quirúrgica. Como se demostró en
la prueba de Rochester, que comparó la trombolisis por el
activadorde plaminógeno, uroquinasa, con la cirugía en el
tratamiento de la PAO aguda (Ouriel et al., Journal of Vascular
Surgery, 1994, Volume 19, pp. 1021-1030),
aproximadamente 33 por ciento de los pacientes de la parte del
estudio referente a la trombolisis se trataron satisfactoriamente
sólo con intervención médica, evitando un procedimiento más
invasivo. En contraste, 98 por ciento de los pacientes en la parte
quirúrgica del estudio fueron sometidos a un método endovascular o
quirúrgico.
Otros trastornos médicos que implican coágulos
oclusivos de sangre pueden tratarse eficazmente de una manera
similar de acuerdo con la invención, incluyendo, pero sin
limitación: infarto agudo de miocardio, ictus isquémico, trombosis
venosa profunda y embolismo pulmonar. El uso de esta invención
también puede emplearse para disolver coágulos que se producen en
dispositivos médicos permanentemente implantados, tales como
catéteres permanentes e injertos para acceso a tratamientos de
hemodiálisis.
Figuras 1A-1C. La Figura 1A es un
angiograma antes de iniciar el estudio de la arteria carótida de un
cerdo adulto antes de la lesión inducida por un catéter con globo y
la formación de un trombo oclusivo. La flecha indica la posición y
la presencia del medio de contraste en la arteria carótida
primitiva izquierda, que indica que el flujo de sangre en la
arteria está no obstruido (es decir, el vaso sanguíneo está "no
obstruido" o tiene "falto de obstrucción"). La Figura 1B es
un angiograma tomado el día 4 en el mismo animal, antes de la
administración de fibrolasa NAT de acuerdo con el método de esta
invención. La flecha indica la posición de la arteria carótida
primitiva izquierda, sin embargo, el medio de contraste no fluye en
la arteria debido a la presencia de un trombo oclusivo. La Figura
1C es un angiograma 2 horas después de la administración de 30 mg
de fibrolasa NAT a través de un catéter "PRO" (véase la Figura
3 para una ilustración de este dispositivo). La flecha indica la
presencia de medio de contraste en el vaso, demostrando que se ha
restablecido la falta de obstrucción en la arteria carótida
izquierda. El trombo residual mínimo es visible en el lumen de la
arteria.
La Figura 2 ilustra un tipo de dispositivo de
catéter diseñado para la administración localizada de un agente
trombolítico a un vaso sanguíneo. El dispositivo mostrado en esta
figura, en vista de la sección transversal lateral, contiene
"agujeros laterales" en el extremo de administración a través
de los cuales se hace salir el material infundido, también llamado
"infusato" (agente trombolítico) bajo la presión del fluido
aplicada. Los diámetros de los tubos de catéter de esta figura y de
la figura siguiente respecto al tamaño real están exagerados para
mejor mostrar los detalles.
La Figura 3 es una vista en sección transversal
de un tipo alternativo de dispositivo de catéter para la
administración localizada de un agente trombolítico en un vaso
sanguíneo. Este dispositivo contiene delgadas ranuras, denominadas
"salidas en respuesta a la presión" (abreviadamente PRO por la
expresión inglesa pressure response outlets), que han sido
cortadas en la pared del catéter a intervalos regulares, de tal
modo que el material infundido escape cuando la presión del fluido
en el interior de catéter alcance un punto crítico, haciendo que se
abra la ranura. El dispositivo se puede usar junto con un
dispositivo de infusión automático pulsado, accionado por un émbolo
(que no se muestra, pero que se ilustra más adelante) que puede
administrar pulsaciones de infusión de fármaco.
El uso de esta invención es aplicable para la
administración terapéutica de cualquier metaloproteinasa
fibrinolítica que pueda ser complejada con
\alpha_{2}-macroglobulina. Dichas
metaloproteinasas fibrinolíticas, si son de origen natural, pueden
ser purificadas a partir de sus fuentes naturales, por ejemplo, la
fibrolasa procedente de veneno de serpiente. Alternativamente, las
secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos, correspondientes a
agentes constituidos por metaloproteinasas fibrinolíticas
polipetídicas, que son conocidas se pueden producir empleando los
métodos convencionales de expresión genética recombinante y
purificación.
En general, los métodos recombinantes emplean una
molécula de DNA recombinante que codifica la metaloproteinasa
fibrinolítica de interés que se inserta en un vector apropiado para
la expresión en una célula hospedante adecuada. El vector se
selecciona para que sea funcional en la célula hospedante particular
empleada, es decir, sea compatible con la maquinaria de la célula
hospedante, de tal modo que pueda ocurrir la expresión del DNA. Los
vectores también pueden contener una secuencia flanqueante en 5'
(también denominada "promotor") y otros elementos reguladores
de la expresión unidos operativamente al DNA que se ha de expresar,
así como otros elementos conocidos, tales como un origen de
elemento de replicación, un elemento de terminación de la
transcripción, una secuencia completa de intrón que contiene un
sitio donador y aceptor de empalme, una secuencia de péptido señal,
un elemento de sitio de unión al ribosoma, una secuencia de
poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido
nucleico codificante, y un elemento marcador seleccionable. El
vector también puede contener opcionalmente una secuencia de
"cola marcadora", es decir, una secuencia de oligonucleótido
localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia, que codifica el
polipéptido poliHis u otra pequeña secuencia inmunógena. Esta cola
marcadora se expresará junto con la proteína de interés, y puede
servir como cola marcadora por afinidad para la purificación de este
polipéptido a partir de la célula hospedante. Si se desea, la cola
marcadora se puede eliminar subsiguientemente del polipéptido
purificado por diversos medios, por ejemplo, mediante el uso de una
peptidasa selectiva.
En los casos en los que es deseable que el
polipéptido sea segregado desde la célula hospedante, se puede usar
una secuencia de señal para dirigir la salida del polipéptido de la
célula hospedante en la que se sintetiza. Típicamente, la secuencia
de señal está colocada en la región codificadora de la secuencia
del ácido nucleico, o directamente en el extremo 5' de la región
codificadora. Se han identificado muchas secuencias de señal y
puede usarse cualquiera que sea funcional en la célula hospedante
seleccionada.
Después de que se ha construido el vector y se ha
insertado un ácido nucleico en el sitio apropiado del vector, dicho
vector completo puede insertarse en una célula hospedante adecuada
para amplificación y/o expresión del polipéptido. Las células
hospedantes pueden ser procarióticas (tales como E. coli) o
eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de
insecto o una célula de vertebrado).
Las células o líneas de células hospedantes
adecuadas pueden ser células de mamíferos, tales como células de
ovario de hámster chino (abreviadamente CHO por la expresión
inglesa Chinese hamster ovary) o células 3T3. La selección de
células de mamíferos hospedantes adecuadas y los métodos para la
transformación, cultivo, amplificación, escrutinio y producción del
producto y purificación son conocidas en la técnica. Otras líneas
celulares adecuadas de mamíferos son las líneas celulares de monos
COS-1 y COS-7, la línea celular
CV-1. Otras células hospedantes de mamíferos
ilustrativas incluyen líneas celulares de primates y líneas
celulares de roedores, incluyendo líneas celulares transformadas.
También son adecuadas células diploides normales, cepas celulares
derivadas de cultivos in vitro de tejido primario, así como
explantes de tejidos primarios. Las células candidatas pueden ser
genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden
contener un gen de selección que actúa dominantemente. Incluso
otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero sin
limitación: células HeLa, células de ratón L-929,
líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH,
y líneas celulares de hámster BHK o HaK.
También son útiles como células hospedantes
células bacterianas, por ejemplo, diversas cepas de E. coli,
y diversas células de levadura.
La inserción (también denominada
"transformación" o "transfección") del vector en la célula
hospedante seleccionada puede lograrse empleando métodos, tales
como fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección
o el método del DEAE-dextrano. El método
seleccionado será en parte función del tipo de célula hospedante que
se vaya a usar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien
conocidos por los expertos en la técnica.
La célula hospedante, cuando se cultiva en
condiciones apropiadas, puede sintetizar la metaloproteinasa
fibrinolítica de interés. Las células hospedantes pueden cultivarse
usando medios estándares bien conocidos por los expertos en la
técnica. Los medios usualmente contendrán todos los nutrientes
necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células.
Los medios necesarios para cultivar células de E. coli son,
por ejemplo, caldo de Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB). Los medios
adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM,
DMEM, todos los cuales pueden suplementarse con suero y/o factores
de crecimiento según se requiera para la línea particular que se
cultive.
Típicamente, se añade como suplemento para los
medios un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento
selectivo de las células transformadas. La elección del compuesto
que ha de usarse vendrá dictada por el elemento marcador
seleccionable presente en el plásmido con el cual se transformó la
célula. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es
resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de
cultivo será kanamicina.
La cantidad de proteína producida en la célula
hospedante puede evaluarse usando métodos estándares conocidos en la
técnica, incluyendo análisis por transferencia Western,
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida,
electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC,
inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad, tales como ensayos
de desplazamiento en gel de unión al DNA.
Si la proteína se segrega desde células
hospedantes distintas de bacterias gram-negativas,
la mayoría se encontrará probablemente en el medio de cultivo
celular. Si no se segrega estará presente en el citoplasma. Para
proteínas intracelulares, las células hospedantes se rompen primero
típicamente por medios mecánicos. Para proteínas que tienen una
localización periplásmica, puede usarse cualquier rotura mecánica o
tratamiento osmótico para liberar el contenido del periplasma en una
solución tamponada, y el polipéptido se aísla luego de esta
solución.
La purificación a partir de una solución puede
conseguirse luego empleando una variedad de técnicas.
Si la proteína ha sido sintetizada de modo que
contenga una cola marcadora, tal como hexahistidina u otro pequeño
péptido en cualquiera de sus extremos carboxilo o amino, puede
purificarse esencialmente en un proceso de una sola etapa haciendo
pasar la solución a través de una columna de afinidad en donde la
matriz de la columna tiene una alta afinidad para la cola marcadora
o para el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo
monoclonal). Cuando el polipéptido no tiene cola marcadora y no
están disponibles anticuerpos, pueden usarse otros procedimientos
conocidos para la purificación, por ejemplo, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC,
electroforesis en gel natural en combinación con elución de gel, y
enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime",
Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más
de estas técnicas para conseguir la mayor pureza.
El polipéptido (fibrolasa) de nueva acción
trombolítica (NAT) utilizado en la presente memoria para ilustrar la
práctica de esta invención se refiere en general a la
metaloproteinasa fibrinolíticamente activa de la SEQ ID NO: 1. El
polipéptido NAT está codificado por la molécula de cDNA de la SEQ ID
NO: 2, aunque puede usarse cualquier molécula de DNA de una
secuencia variante que codifique el mismo polipéptido para la
expresión y fabricación de acuerdo con métodos específicos a los que
se hará referencia más adelante.
La fibrolasa se ha descrito en la literatura
científica y de patentes; véanse las referencias anteriores.
Típicamente, la forma de fibrolasa que se emplea en la práctica de
esta invención será la de la SEQ ID NO: 3, que está codificada por
la molécula de cDNA de la SEQ ID NO: 4 o sus variantes que
codifican la misma secuencia de aminoácidos.
Preferiblemente, se emplea un sistema de
expresión de levadura para la expresión recombinante de NAT. Se
mencionan especialmente las cepas de Pichia, por ejemplo,
Pichia pastoris, por ser la más ventajosa y preferida para su
uso. Una descripción detallada de dicho sistema puede encontrarse
en la patente de EE.UU. nº 4.855.231 (Stroman et al.), la
patente de EE.UU. nº 4.812.405 (Lair, et al.), la patente de
EE.UU. 4.818.700 (Cregg et al.), la patente de EE.UU. nº
4.885.242 (Cregg), y la patente de EE.UU. nº 4.837.148 (Cregg). La
expresión de fibrolasa en dicho sistema implicará típicamente una
molécula de DNA de la SEQ ID NO: 5, que codifica la secuencia
"prepro" (nucleótidos 1-783) además del
polipéptido "maduro" (nucleótidos 784-1392). La
expresión de fibrolasa NAT en dicho sistema implicará típicamente
una molécula de DNA de la SEQ ID NO: 6, que codifica la secuencia
"prepro" (nucleótidos 1-783) además del
polipéptido "maduro" (nucleótidos
784-1386).
La metaloproteinasa fibrinolítica empleada de
acuerdo con esta invención, tanto si es fibrolasa NAT, como
fibrolasa natural, o alguna otra metaloproteinasa fibrinolítica, ha
de administrarse en forma de una solución farmacéuticamente
aceptable, sola o que contenga ingredientes adicionales
farmacéuticamente aceptables. Si se desea, dichas soluciones pueden
comprender, además de la metaloproteinasa fibrinolítica y un
disolvente (es decir, agua destilada o solución salina fisiológica),
ingredientes habituales, tales como estabilizadores (para impedir
la agregación de proteínas o la degradación física o química en
medios acuosos), agentes de voluminosidad (para proporcionar
volumen), diluyentes, agentes antibacterianos, agentes de ajuste de
la viscosidad, anti-oxidantes, y similares, en
cantidades convencionales. Los excipientes conocidos que pueden
incluirse en la formulación incluyen polioles (incluyendo manitol,
sorbitol y glicerol); azúcares (incluyendo glucosa y sacarosa); y
aminoácidos (incluyendo alanina, glicina y ácido glutámico). Véase,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Deseablemente, la composición farmacéutica estará
tamponada (con un agente tamponante biocompatible, por ejemplo,
ácido cítrico o sal de ácido cítrico) a un pH que es neutro o casi
neutro (7,0) antes de la administración, y usualmente un pH entre
aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,0 (\pm 0,5).
Si el ion metálico de la metaloproteinasa
fibrinolítica es zinc, tal como ocurre con la fibrolasa natural o
la fibrolasa NAT, puede ser preferible incluir una sal de zinc
soluble en agua (por ejemplo, sulfato de zinc o acetato de zinc)
como estabilizador. Para mejorar más la estabilidad a largo plazo y
el periodo de validez de la composición, puede ser ventajoso
congelar la solución o convertirla en un producto liofilizado
(secado por congelación) que se descongela o se reconstituye, según
sea el caso.
A modo de ilustración, una composición medicinal
líquida congelable que puede emplearse en el método de esta
invención comprende fibrolasa natural o fibrolasa NAT, una sal de
zinc soluble en agua, un tampón de ácido cítrico, opcionalmente un
estabilizador adicional seleccionado del grupo que consiste en sales
de calcio solubles en agua, opcionalmente un agente de
voluminosidad (por ejemplo, manitol). También puede añadirse un
tensioactivo, tal como Tween 80 (BASF, Gurnee, Illinois), para
aumentar la estabilidad de la
congelación-descongelación. Puede añadirse tampón
Tris (Sigma, St. Louis, Missouri) u otro tampón con una capacidad
tamponante superior a pH 7,0 para estabilizar el pH en el valor 7,4
o superior. La mayoría de estos ingredientes estarán presentes en
cantidades minoritarias que varían de 0,001 a 2,0 milimolar (mM) o
menos del diez por ciento (peso/volumen). El agente tamponante se
añadirá en una cantidad suficientes para conseguir el pH deseado y
esta cantidad puede variar dependiendo de la formulación
específica.
A modo de ilustración adicional, una composición
farmacéutica liofilizable o liofilizada que puede usarse de acuerdo
con esta invención comprende fibrolasa natural o fibrolasa NAT, un
estabilizador de zinc (por ejemplo, una sal de zinc soluble en
agua, tal como la indicada antes), y un tampón de ácido cítrico, con
o sin otros excipientes (por ejemplo, agente de voluminosidad, tal
como manitol, glicina, o similares). La composición liofilizada
también puede contener un azúcar disacárido, tal como sacarosa o
trehalosa, como agente lioprotector. Puede añadirse un tensioactivo,
tal como Tween 80, para proteger contra las tensiones de la
liofilización sobre la metaloproteinasa fibrinolítica (por ejemplo,
fibrolasa natural o fibrolasa NAT). El pH se mantendrá idealmente en
un valor de pH = 8,0 \pm 0,5, empleando un tampón adecuado con un
pK_{a} en este intervalo (por ejemplo, Tris). Las cantidades de
los ingredientes estarán de acuerdo con lo anterior.
Como se ha mencionado, el uso de esta invención
se emplea para administrar localmente cantidades biológicamente
eficaces de una metaloproteinasa fibrinolítica que están en el
intervalo entre 0,025 y 1,7 mg/kg. Preferiblemente, esta estará en
el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 mg/kg. Las
concentraciones de la solución se formularán en consecuencia,
efectuándose una dilución según se necesite para la
administración.
En el caso típico, el uso de esta invención se
realiza junto con un método de trombolisis dirigido por catéter.
Dicho método implica el uso de un dispositivo
pre-esterilizado de administración de fármaco de
tipo catéter, cuyas paredes laterales pueden estar hechas de un
material biocompatible delgado, semi-rígido o
flexible (por ejemplo, una poliolefina, fluoropolímero, u otro
polímero inerte). En general, los catéteres adecuados contienen al
menos una cavidad interior (o lumen) en el sentido longitudinal del
dispositivo. El material a partir del cual se construye el catéter
es suficientemente flexible para ser movido a través del interior
de la vasculatura sin causar daño a las paredes de los vasos
sanguíneos, pero suficientemente rígido para extenderse a una
distancia hasta el sitio del tratamiento, mientras que la cavidad
interior del dispositivo permanece fuertemente distendida.
Típicamente, dichos dispositivos de catéter variarán desde 2 a 20 e
la escala francesa para diámetros de catéter (1/3 de milímetro igual
a una unidad francesa) y con una longitud de 60,8 cm a 183 cm.
Los dispositivos de catéter ilustrativos para la
administración intravascular de medicación trombolítica de acuerdo
con esta invención se ilustran en las Figuras 2 y 3, cuyas
aplicaciones prácticas se describen con detalle en los Ejemplos
siguientes. Sin embargo, puede utilizarse cualquier dispositivo
convencional de administración por catéter que sea adecuado para
este método, incluyendo, pero sin limitación, los dispositivos
específicos descritos en la presente memoria.
Una dosis eficaz de metaloproteinasa
fibrinolítica puede administrarse a través del catéter al sitio
local del tratamiento por infusión pulsada, infusión continua,
administración de bolo, o una combinación de las tres anteriores. La
fuerza de la solución (es decir, la concentración) de la
metaloproteinasa fibrinolítica en la solución de tratamiento es un
parámetro importante. Más específicamente, debe seleccionarse un
intervalo entre la dilución mínima de la metaloproteinasa
fibrinolítica para eficacia en el extremo inferior (lo que es
especialmente importante para la administración de bolo) y la
solubilidad máxima de la metaloproteinasa fibrinolítica en el
extremo superior. En general, se emplean concentraciones de
solución en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente
80 mg/mL. El volumen del bolo (o volumen total de múltiples bolos en
el caso de una administración "pulsada") se selecciona luego
en consecuencia para administrar una cantidad de metaloproteinasa
fibrinolítica que esté dentro de los intervalos prescritos
anteriormente.
La invención se ilustra además en los ejemplos
siguientes, los cuales han de considerarse solamente ilustrativos y
que no limitan la invención a las realizaciones descritas. En estos
ejemplos, y en toda la descripción de esta invención, "kg"
indica kilogramos de peso corporal por sujeto sometido a ensayo,
"mg" indica miligramos, "mL" indica mililitros, y
"min" indica minutos. La metaloproteinasa fibrinolítica
empleada en los ejemplos, a saber, la fibrolasa de nueva acción
trombolítica (NAT), era una obtenida por tecnología de DNA
recombinante y preparada por los métodos antes citados.
La fibrolasa NAT fue estudiada en un modelo de
trombosis subaguda de la arteria carótida de cerdos adultos, que
tenían un peso de 75 kg, en un laboratorio contratado (Charles
River Laboratories, Southbridge, Massachusetts). El objeto de este
estudio fue establecer la actividad fibrinolítica de la fibrolasa
NAT en un modelo de trombosis que es pertinente a la oclusión
arterial periférica en seres humanos.
En este modelo animal, se formaron trombos en la
arteria carótida a lo largo de su longitud completa (aproximadamente
20 centímetros desde su origen en la aorta hasta la bifurcación de
la carótida) mediante una combinación de daño por globo, trombina y
estasis. El tamaño del trombo se aproxima al tamaño del trombo
encontrado clínicamente en seres humanos oclusión arterial
periférica. Después de una trombosis experimental adecuada, se dejó
que el animal se recuperara durante un periodo de cuatro días. El
periodo de cuatro días se seleccionó para permitir la reticulación
extensiva de la fibrina, la remodelación del trombo, y la
infiltración de células. Notablemente, tanto el tamaño como la
antigüedad del trombo de este modelo son representaciones razonables
del tamaño y duración de los síntomas isquémicos descritos en la
prueba TOPAS de trombolisis recientemente publicadas con activadores
de plasminógeno en oclusiones arteriales periféricas en seres
humanos. Para referencia, véase Ouriel et al., New England
Journal of Medicine, Volume 338, pp. 1105-1111
(1998).
Dicho resumidamente, en la arteria carótida
primitiva se pueden producir trombos en toda su longitud por lesión
dirigida fluoroscópicamente con globo. Los globos que se usan son
de tamaño superior al de la arteria y no flexibles. Los globos se
inflan a presiones de hasta doce atmósferas, lo cual causa daño a la
capa íntima del vaso. Mientras se infla el globo, se mueve hacia
adelante y hacia atrás para separar el endotelio vascular.
El método de producción de coágulos con globo es
muy dañino y crea una superficie del vaso altamente trombógena y se
repite a lo largo de la longitud completa de la arteria carótida
primitiva. Después de dañar intensamente la arteria, el globo se
retira hasta una posición próximal cerca de la aorta y se infla para
obturar el flujo de sangre a través del vaso. Mientras que la
arteria se encuentra ocluida, se inyectan cincuenta unidades de
trombina de bovino a través del orificio distal del catéter con
globo para estimular la coagulación. El globo permanece inflado
durante un periodo de treinta minutos, lo cual da como resultado la
oclusión trombolítica del vaso. Después de treinta minutos, se
desinfla el globo y se realiza un angiograma para confirmar que el
vaso ha quedado ocluido. Con estos métodos se consiguió la oclusión
del vaso en el noventa por ciento de los casos.
Una vez que se ha conseguido el trombo, se
retiran el catéter con globo, el catéter de guía y la vaina de
acceso y se deja que el animal se recupere durante un periodo de
cuatro días. En el cuarto día, los animales son
re-anestesiados, se reconfirma la oclusión, y se
hace avanzar bajo guiado fluoroscópico un catéter de administración
de fármaco con múltiples agujeros laterales (véanse las Figuras 2 y
3), de tal modo que los agujeros laterales se coloquen dentro del
trombo. La trombolisis con fibrolasa NAT se observó
angiográficamente empleando dosis de fibrolasa NAT que variaban
desde 10 a 30 mg (o aproximadamente 0,1 a 0,4 mg/kg respecto a una
base ajustada al peso), como se muestra en las Figuras
1A-1C.
Como ilustra la imagen de la Figura 1B, la
fibrolasa NAT es eficaz en restablecer el flujo anterógrado, que se
determina por angiografía. Para ser más cuantitativo, el flujo en
el vaso objeto del estudio se puntúa cuantitativamente en una escala
de 4 puntos (variando desde 0 a 3) en donde:
0 = sin flujo
1 = flujo estimado menor que 30% del de la
carótida contralateral (sin trombo).
2 = flujo estimado de 30-80% del
de la carótida contralateral.
3 = flujo que es indistinguible del de la
carótida contralateral.
La imagen mostrada en la Figura 1B fue puntuada
con una calidad de flujo igual a 3, un resultado frecuente en vasos
con trombos tratados con una dosis fija de 30 mg de fibrolasa NAT
(aproximadamente 0,4 mg/kg en un cerdo de 75 kg). Las Tablas
1-3 de los ejemplos siguientes ilustran el régimen
de tratamiento y las puntuaciones medias del flujo obtenidas de
series de angiogramas. En la totalidad de estos estudios, se
monitorizaron continuamente la respiración, la temperatura corporal,
la frecuencia cardiaca y la presión sanguínea arterial y
permanecieron dentro de los intervalos fisiológicos sin cambios
observados por la administración de fibrolasa NAT.
En el tratamiento clínico de la oclusión arterial
periférica, los agentes trombolíticos se administran a través de
catéteres que se colocan cerca del trombo o se empotran en dicho
trombo. Como se muestra en las Figuras 2 y 3, hay dos tipos de
catéteres.
Una variedad, el catéter de "agujeros
laterales" (Fig. 2), tiene minúsculos agujeros redondos (2)
recortados en el catéter (4) cerca del extremo distal próximo (6),
un orificio de entrada (8) (para la solución de metaloproteinasa
fibrinolítica) en el anillo de acoplamiento (10) fijado en el
extremo proximal (12). El catéter 4 está construido de un material
tubular alargado de polímero flexible, biocompatible que es hueco y
de paredes delgadas y tiene un diámetro uniforme de 2 a 20 unidades
francesas, y preferiblemente 3 a 5 unidades francesas. El catéter
contiene dos marcadores radiopacos (14) en la superficie exterior
cerca del extremo distal (6) que delimitan la porción del catéter
que contiene los agujeros laterales (2). En la práctica, el catéter
está insertado en una abertura quirúrgica en la arteria o vena
ocluida y, mientras que es observado por fluoroscopía de acuerdo
con los métodos estándares aprobados, se mueve cuidadosamente a
través del vaso sanguíneo, de tal modo que el extremo distal (6) se
coloque en o cerca del trombo. Los marcadores (14), que se muestran
claramente en una imagen fluoroscópica, pueden servir como guía
para colocar esa porción del catéter, de tal modo que el material
infundido (infusato) que sale por los agujeros laterales (2) se
pondrá en contacto directamente con el trombo. Se inyecta luego
bajo presión moderada una solución farmacéutica de la
metaloproteinasa fibrinolítica desde un depósito tipo jeringa (16)
en el orificio de entrada (8) y se impulsa hasta el extremo distal
(6), para salir a través de los agujeros (2) y entrar en el trombo,
y causar la degradación del material fibrinoso.
Cuando las infusiones de una metaloproteinasa
fibrinolítica se realizan usando este tipo de catéter, la mayor
parte de la solución que contiene el agente fibrinolítico tiende a
escaparse a través de lo agujeros laterales proximales (es decir,
los que están mas cerca del orificio de entrada (8)), lo cual tiene
un impacto negativo en la uniformidad de la administración del
fármaco en el sitio de tratamiento. También existe la posibilidad
de un retroflujo de la sangre al catéter a través de los orificios
laterales (2) bajo presión negativa.
Otra variedad de catéter, también constituido por
un material polímero biocompatible, hueco y de pared delgada,
mostrada en la Figura 3, tiene ranuras extremadamente delgadas (2)
que están cortadas con láser en el catéter flexible (4) a
intervalos regulares cerca del extremo distal próximo (6). Las
ranuras, que se denominan salidas en respuesta a la presión
("PRO"), son suficientemente estancas de modo que no escapará
el material infundido (infusato) a no ser que la presión del fluido
dentro del catéter alcance un punto crítico y haga que las ranuras
se distiendan simultáneamente y por tanto se abran temporalmente.
El catéter también puede contener marcadores radiopacos exteriores
(8) para ayudar a la colocación del dispositivo en el sitio del
trombo.
Idealmente, dichos catéteres de infusión
"PRO" se usan junto con un dispositivo de infusión pulsada,
accionado por émbolo (no mostrado) que puede administrar pulsaciones
reguladas de bajos volúmenes de infusión de fármaco en el orificio
de entrada (10) del anillo de acoplamiento (12) fijado en el extremo
proximal (14) del catéter (4). Cuando se administra una pulsación,
la presión dentro del catéter sube momentáneamente. Como respuesta,
las salidas en respuesta a la presión (ranuras (2)) se abren
momentáneamente y permiten que se escape el infusato, por ejemplo,
una solución farmacéutica de metaloproteinasa fibrinolítica. La
ventaja teórica de la administración pulsada de infusato y un
catéter de tipo PRO es que el infusato se administra uniformemente
a través de las ranuras a lo largo de la longitud completa del
catéter, mientras que el infusato administrado a través del catéter
con "agujeros laterales" (Figura 2) sigue una trayectoria de
menos resistencia y fluye fuera de los agujeros laterales
proximales de un modo no uniforme como ya se ha mencionado.
Se utilizó un modelo de cerdo con trombosis en la
carótida de cuatro días de antigüedad para determinar las
prestaciones de los dos tipos de catéteres, empleando dosis fijas
de 30 mg de fibrolasa NAT (aproximadamente 0,4 mg/kg en un cerdo de
75 kg). Los resultados se recogen en la Tabla 1.
| Puntuación del flujo angiográfico | ||||||||
| Fármaco | Dosis | Categ. | Tiempo de | 0 | 30 min | 1 hora | 2 horas | 4 horas |
| administración | ||||||||
| Fibrolasa | 30 mg | CM | 60 min | 0,0 | 1,2 | 1,6 | 1,8 | 2,0 |
| NAT n=5 | (infusión) | \pm0,0 | \pm0,4 | \pm0,5 | \pm0,4 | \pm0,7 | ||
| Fibrilasa | 30 mg | PS | 60 min (pulsaciones | 0,0 | 1,5 | 1,5 | 2,3 | 2,5 |
| NAT n=4 | de 0,1 mL) | \pm0,0 | \pm0,6 | \pm0,6 | \pm0,5 | \pm0,6 | ||
| \begin{minipage}[t]{153mm} CM: Catéter Cragg-McNamara^{TM} con "agujeros laterales" para infusión dosificada por válvulas (Micro Therapeutics, Inc., San Clemente, California). PS: administración por "pulverización pulsada" como se define por el uso de catéter con salidas en respuesta a la presión (PRO) (Uni*Fuse Catheter^{TM}, AngioDynamics, Inc., Queensbury, New York) usada junto con un dispositivo de infusión pulsada automatizada (PULSE*SPRAY INJECTOR Modelo PSI-1, AngioDynamics, Inc., Queensbury, New York).\end{minipage} | ||||||||
Como se muestra en la Tabla 1, las puntuaciones
de flujo angiográfico en el grupo tratado con la modalidad de
pulverización pulsada mostraron puntuaciones de flujo iniciales
ligeramente mayores en el angiograma de treinta minutos que parecían
persistir hasta cuatro horas. Aunque no se obtuvieron diferencias
estadísticas, los resultados angiográficos se consideraron
generalmente superiores. En consecuencia, un catéter de tipo PRO
junto con administración por pulverización pulsada es el modo
preferido de administración para una metaloproteinasa de acuerdo con
esta invención.
La oclusión arterial periférica aguda se trata
típicamente con activadores de plasminógeno, tal como uroquinasa,
administrada como una infusión que frecuentemente tiene una
duración de veinticuatro horas duración, y en ocasiones llega a
durar tanto como cuarenta y ocho horas. La infusión durante un
tiempo tan prolongado se supone que mantiene un bajo nivel de
generación de plasmina durante un periodo prolongado de tiempo para
disolver eficazmente el trombo oclusivo. Puesto que tanto la
fibrolasa NAT como la fibrolasa natural son metaloproteinasas
fibrinolíticas, puede ser no necesarias dichas infusiones
prolongadas. Para determinar si la velocidad de administración
afecta a la lisis angiográfica del coágulo, se administró una dosis
fija de 30 mg de fibrolasa NAT (aproximadamente 0,4 mg/kg en un
cerdo de 75 kg) usando catéteres PRO y un dispositivo de
pulverización pulsada. Usando volúmenes de pulsaciones de 0,1 mL, se
administró durante seis minutos una solución de 5 mg/mL de
fibrolasa NAT (diez pulsaciones por minuto) o durante sesenta
minutos (una pulsación por minuto). Los resultados se muestran en
la Tabla 2.
| Puntuación del flujo angiográfico | ||||||||
| Fármaco | Dosis | Categ. | Tiempo de | 0 | 30 min | 1 hora | 2 horas | 4 horas |
| administración | ||||||||
| Fibrolasa | 30 mg | PS | 6 min | 0,0 | 2,7 | 2,7 | 2,7 | 2,7 |
| NAT n=5 | (0,1 mL) | \pm0,0 | \pm0,6 | \pm0,6 | \pm0,6 | \pm0,6 | ||
| Fibrilasa | 30 mg | PS | 60 min | 0,0 | 1,0 | 1,0 | 1,3 | 1,3 |
| NAT n=4 | (0,1 mL) | \pm0,0 | \pm0,0 | \pm1,0 | \pm0,5 | \pm1,7 |
Como se muestra en la Tabla 2, la administración
de 30 mg de fibrolasa NAT durante seis minutos dio como resultado
una puntuación media de flujo de 2,7 en los tres animales en el
angiograma realizado a los treinta minutos, que persistía hasta
cuatro horas. En contraste, la administración de 30 mg de fibrolasa
NAT por infusión pulsada durante sesenta minutos fue mucho menos
satisfactoria. Aunque estos datos no se han comparado
estadísticamente, los resultados parecen estar a favor de la
administración de fibrolasa NAT en forma de un régimen pulsado
más
rápido.
rápido.
El dispositivo de infusión con pulverización
pulsada es programable para administrar volúmenes pulsados de 0,1 a
0,5 mL por pulsación. Para determinar si el volumen de pulsación
tenía efectos sobre la respuesta angiográfica en el modelo del
cerdo, se compararon volúmenes de pulsación de 0,2 mL con volúmenes
de pulsación de 0,4 mL. La fibrolasa NAT se administró a una dosis
fija de 10 mg (equivalente a 0,15 mg/kg en un cerdo de 75 kg). Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
| Puntuación del flujo angiográfico | ||||||||
| Fármaco | Dosis | Categ. | Tiempo de administración | 0 | 30 min | 1 hora | 2 horas | 4 horas |
| (volumen de la pulsación) | ||||||||
| Fibrolasa | 10 mg | PS | 5 min | 0,0 | 1,0 | 1,1 | 1,6 | 1,4 |
| NAT n=5 | 2,5 mg/mL | (0,2 mL cada 15 s) | \pm0,0 | \pm0,6 | \pm0,7 | \pm1,0 | \pm1,1 | |
| Fibrilasa | 10 mg | PS | 60 minutos | 0,0 | 1,2 | 1,0 | 0,8 | 1,0 |
| NAT n=4 | 2,5 mg/mL | (0,1 mL cada 30 s) | \pm0,0 | \pm0,4 | \pm0,6 | \pm0,8 | \pm0,6 |
Como se muestra en la Tabla 3, a los treinta
minutos la puntuación angiográfica media fue ligeramente superior en
el grupo de volúmenes de pulsación de 0,4 mL. Sin embargo, a las
cuatro horas, el valor medio del grupo era ligeramente superior en
el volumen de pulsación de 0,2 mL. Por tanto, de estos estudios no
se pueden sacar conclusiones con respecto a si un volumen de
pulsación es superior al otro.
Los resultados de los estudios y Tablas
precedentes sugieren que virtualmente la totalidad de estos
regímenes de tratamiento con fibrolasa NAT son eficaces en el
tratamiento de las oclusiones arteriales periféricas, con el método
de administración de esta invención, y que estos resultados son al
menos comparables al tratamiento con activadores de plasminógeno,
tal como uroquinasa, que es actualmente el tratamiento de elección
con agentes trombolíticos.
Los resultados demuestran que el catéter PRO para
administración por pulverización pulsada parece proporcionar
superiores resultados angiográficos. Teniendo en cuenta el peso
medio de los animales en estos estudios (70-100 kg),
la dosis fijada de 30 mg es aproximadamente equivalente a
0,3-0,4 mg/kg respecto a una base ajustada al
peso.
Disminuir la dosis fijada de fibrolasa NAT a 10
mg dio como resultado una reducción de las puntuaciones
angiográficas medias después de cuatro horas y en algunos animales
no se observó falta de obstrucción. Esto indica que una dosis de 10
mg de fibrolasa NAT parece ser una dosis umbral para la actividad
biológica en este modelo. Teniendo en cuenta el peso corporal de
los animales de estos estudios (70-100 kg), la
dosis fijada de 10 mg es aproximadamente equivalente a
0,1-0,15 mg/kg respecto a una base ajustada al
peso. Variar el volumen de pulsación desde 0,2 mL a 0,4 mL no
pareció que influyera profundamente sobre las puntuaciones de falta
de obstrucción angiográfica.
No existe una bibliografía satisfactoria sobre la
concentración en suero o la actividad bioquímica de
\alpha_{2}-macroglobulina en pacientes ancianos
afectados por la enfermedad vascular periférica (abreviadamente PVD
por la expresión inglesa peripheral vascular disease).
Puesto que las concentraciones de
\alpha_{2}-macroglobulina son una clave
determinante de la seguridad y probablemente están relacionadas con
la tolerabildad de las metaloproteinasas fibrinolíticas in
vivo, se realizó un estudio epidemiológico transversal en
pacientes con PVD para evaluar la concentración de
\alpha_{2}-macroglobulina en suero y la
capacidad de unión a la metaloproteinasa fibrinolítica (usando
fibrolasa NAT como agente de ensayo).
Se inscribieron doscientos dieciséis pacientes en
dos centros (Cleveland Clinic Foundación, Cleveland, OH, y Rochester
General Hospital, Rochester, NY). Se recogieron la información
demográfica y otras características y se obtuvo suero para medir la
\alpha_{2}-macroglobulina, la capacidad de unión
a la fibrolasa NAT (por valoración de muestras de suero de
pacientes individuales por análisis mediante HPLC que detecta la
fibrolasa NAT no unida) y otros parámetros de la química del suero.
El principal punto final fue la determinación de la relación entre
la concentración \alpha_{2}-macroglobulina en
suero y la cantidad de fibrolasa NAT (en microgramos por mililitro
de suero) que podía ser neutralizada in vitro (capacidad de
unión a la fibrolasa NAT).
Una comparación de las características de los
pacientes de este estudio con las de dos estudios mayores
publicados de trombolisis en oclusión arterial periférica (PAO) (es
decir, los estudios de STILE y TOPAS) indicó que la población de
pacientes de este estudio era representativa de los estudios
previos de trombolisis en PAO. Para más detalles sobre los estudios
previos, véanse Annals of Surgery, Volume 220, pp.
251-266 (1994) y Ouriel et al., New England
Journal of Medicine, Volume 338, pp. 1105-1111
(1998), respectivamente.
Se calculó para cada paciente la dosis máxima
estimada (abreviadamente EMD por la expresión inglesa estimated
maximun dose) para fibrolasa NAT empleando la capacidad de
unión de fibrolasa NAT y una estimación del volumen de plasma de
cada uno de los pacientes. Los resultados del estudio predijeron que
el paciente medio podría recibir una dosis de 1,7 mg/kg
(administrada local o sístémicamente) sin sobrepasar la capacidad
de la \alpha_{2}-macroglobulina para unirse a
la fibrolasa NAT y neutralizarla. Los resultados de este estudio se
recogen en la Tabla 4, siguiente.
Para cada uno de los 216 sujetos de este estudio
se calculó la dosis máxima estimada de fibrolasa NAT. Los resultados
del estudio se representan, antes del comienzo de este párrafo, en
forma de un histograma, en donde puede observarse a simple vista
un distribución en forma de campana. Se predice que el paciente
medio de este estudio podrá tolerar 1,7 mg/kg de fibrolasa NAT (el
pico de la distribución en forma de campana). Se muestran como
referencia las dosis administradas en estudios con animales (lado
derecho del histograma) y puede apreciarse que son superiores a la
dosis máxima de fibrolasa NAT para el 99% de población objeto del
estudio.
Por tanto, el intervalo prescrito de 0,025 a 1,7
mg/kg para la invención representa una estimación racional de la
dosis que los pacientes pueden recibir con seguridad (en base al
volumen de plasma y la capacidad de unión de la fibrolasa NAT a la
\alpha_{2}-macroglobulina) sin que en la
circulación aparezca fibrolasa NAT libre.
En conclusión, los resultados de los estudios
farmacológicos ilustrados, Ejemplos 1-4,
anteriores, indican la eficacia biológica de una metaloproteinasa
fibrinolítica, como agente de lisis de un coágulo en un modelo
animal de trombosis, en donde el trombo es comparable en tamaño y
antigüedad a los que se encuentran frecuentemente en la oclusión
arterial periférica en seres humanos. Las dosis identificadas en los
modelos animales se obtuvieron sin tener en cuenta ni determinar
las potenciales toxicidades en el animal. Las dosis eficaces en
conejos, y perros (3,7 y 4,0 mg/kg, respectivamente) según son
descritas por Ahmed et al. and Markland et al. (antes
citados) podrían facilitar un uso veterinario para las
metaloproteinasas fibrinolíticas. Sin embargo, cuando se consideran
en presencia de datos de seres humanos, la administración de dosis
de 3,7 y 4,0 mg/kg se tendría una sobredosificación en el 99 por
ciento de la población objeto del estudio. Por lo tanto, los
estudios publicados referentes a animales no permiten el uso
terapéutico de metaloproteinasas fibrinolíticas en seres humanos de
un modo que sea seguro y biológicamente eficaz. Los datos
presentados en el Ejemplo 5, por otro lado, permiten el uso en
seres humanos.
<110> Amgen Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA LA ADMINISTRACIÓN
LOCALIZADA DE METALOPROTEINASAS FIBRINOLÍTICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-627
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> N/A
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 17 diciembre 1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Fibrolasa NAT (análoga de la fibrolasa natural de
Agkistrodon Contortrix)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: codifica fibrolasa NAT (análoga de fibrolasa
natural)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fibrolasa natural de Agkistrodon
Contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 609
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica fibrolasa natural de
Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Profibrolasa natural de
Agkistrodon contortrix
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proNAT (análoga de profibrolasa de Agkistrodon
Contortrix)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Uso de una metaloproteinasa fibrinolítica que
forma complejo con la \alpha_{2}-macroglobulina
en una solución farmacéuticamente aceptable, para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento terapéutico de un sujeto
humano aquejado de un coágulo de sangre, por administración local
al coágulo de sangre por medios de administración por catéter, en
donde la metaloproteinasa fibrinolítica es para la administración
en una cantidad que varía entre 0,025 y 1,7 miligramos de la
metaloproteinasa fibrinolítica por kilogramo de peso corporal del
sujeto humano que ha de ser tratado.
2. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde la cantidad de la metaloproteinasa fibrinolítica está en el
intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,5 miligramos
por kilogramo de peso corporal.
3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
en donde la metaloproteinasa fibrinolítica es para administración
vía intratrombo.
4. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la metaloproteinasa fibrinolítica
es para administración en la proximidad inmediata del coágulo de
sangre.
5. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el coágulo de sangre está
localizado en una arteria.
6. Un uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
donde el medicamento es para el tratamiento de la oclusión arterial
periférica.
7. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el coágulo de sangre está situado
en una vena.
8. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el sujeto humano tiene una
enfermedad vascular periférica.
9. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la enfermedad vascular periférica
es debida a aterosclerosis.
10. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento es para el
tratamiento de infarto de miocardio agudo, ictus isquémico,
trombosis venosa profunda o embolismo pulmonar.
11. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el medicamento es para disolver un
coágulo que se produce con un dispositivo médico permanentemente
implantado.
12. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el medio de administración
por catéter comprende un dispositivo de catéter con "agujeros
laterales".
13. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en donde el medio de administración por
catéter comprende un dispositivo de administración por catéter con
"salidas en respuesta a la presión" (PRO).
14. Un uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde la solución de metaloproteinasa fibrinolítica es para
administración por infusión de pulverización pulsada.
15. Un uso de acuerdo con la reivindicación 13,
en donde la solución de metaloproteinasa fibrinolítica es para
administración en un volumen de pulsación de aproximadamente 0,1 a
aproximadamente 0,5 mililitros de solución de metaloproteinasa
fibrinolítica por pulsación.
16. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en donde la metaloproteinasa fibrinolítica
está presente en una concentración en el intervalo de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 80 miligramos por
mililitro.
17. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la metaloproteinasa
fibrinolítica es fibrolasa de nueva acción trombolítica (NAT).
18. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en donde la metaloproteinasa fibrinolítica
es fibrolasa natural.
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| EP1645282A1 (en) | 2006-04-12 |
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