MXPA02006024A - Metodo para la administracion localizada de metaloproteinasas fibrinoliticas. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un metodo para la administracion intravascular localizada de una metaloproteinasa fibrinolitica a un sujeto humano, en cantidades que son seguras y efectivas para lisar un coagulo sanguineo oclusor que contiene fibrina, mientras que tambien evita los efectos neutralizadores de la (alfa2-macroglobulina en la sangre en circulacion.

Description

MÉTODO PARA LA ADMINISTRACIÓN LOCALIZADA DE METALOPROTEINASAS FIBRINOLÍTICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN 5 Esta invención se refiere a la administración terapéutica de metaloproteinasas fibrinolíticas, y más específicamente un método para administrar tales agentes in vivo vía la administración localizada hacia los trombos 10 vasculares, con el fin de efectuar la lisis del coágulo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las oclusiones vasculares provocadas por los 15 coágulos sanguíneos tales como trombos y embolismos son enfermedades médicas serias que pueden llegar a amenazar las extremidades o la vida si no se tratan de tiempo. Han sido desarrollados dispositivos y métodos para el tratamiento y retiro de los coágulos sanguíneos 20 vasculares. A manera de ilustración, ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,447,236 (Quinn) , expedida el 8 de Mayo de 1984; Patente de los Estados Unidos No. 4,692,139 (Stiles) , expedida el 8 de Septiembre de 1987; la Patente de los Estados Unidos No. 4,755,167 (Thistle y 25 colaboradores) , expedida el 5 de Julio de 1988; la Patente de los Estados Unidos No. 5,167,629 (Boyles) , expedida el REF 139986 átfe &C „á. Á.ÍM .MM¿Í i-ftJNhff* 1 de Diciembre de 1992; la Patente de los Estados Unidos No. 5,222,941 (Don Michael), expedida 29 de Junio de 1993; la Patente de los Estados Unidos No. 5,250,034 (Appling y colaboradores), expedida el 5 de Octubre de 1993; la Patente de los Estados Unidos No. 5,370,653 (Cragg) , expedida el 6 de Dicíembre de 1994; la Patente de los Estados Unidos No. ,380,273 (Dubrul y colaboradores), expedida el 10 de Enero de 1995; la Patente de los Estados Unidos No. 5,498,236 (Dubrul y colaboradores), expedida el 12 de Marzo de 1996; la Patente de los Estados Unidos No. 5,626,564 (Zhan y colaboradores), expedida el 6 de Mayo de 1997; la Patente de I los Estados Unidos No. 5,709,676 (Alt), expedida el 20 de Enero de 1998; la Patente de los Estados Unidos No. 51865,178 (Yock) , expedida el 2 de Febrero de 1999, y el documento WO 90/07352 (publicada el 12 de Julio de 1990) . Tales métodos y dispositivos incluyen catéteres de infusión para la distribución de agentes tro bolíticos] o fibrinolíticos al coágulo sanguíneo y para la disolverlo. Los catéteres de infusión son típicamente utilizados en conjunto con los agentes enzimáticamente activos que son capaces de degradar la fibrina en el coágulo Iy de este modo disolver de manera efectiva el coágulo. Tales enzimas son típicamente denominadas con agentes "trombolíticos" o "fibrinolíticos" . íú jk á áká i ___ La fibrolasa es una metaloproteinasa de zinc, fibrinolítica, que fue primeramente aislada del veneno de la serpiente cabeza cobriza del sur (Agkistrodon contortrix contortrix) . Ver Guan y colaboradores., Archives of Biochemistry and Biophysics, Volumen 289, Número 2, páginas 197-207 (1991); andolph y colaboradores, Protein Science, Cambridge University Press (1992), páginas 590-600; Solicitud de Patente Europea No. 0 323 722 (Valenzuela y colaboradores) , publicada el 12 de julio de 1989; y la Patente de los Estados Unidos No. 4,610,879 (Markland y colaboradores), expedida el 9 de Septiembre de 1986. Las fibrolasas han mostrado que son fibrinolíticas, y esta metaloproteinasa ha sido documentada como poseedora de actividad proteolítica contra la cadena Aa del fibrinógeno, con escisión proteolítica reducida de la cadena Bß y sin actividad contra la cadena ? del fibrinógeno; Ahmed y colaboradores, Haemostasis, Volumen 20, páginas 147-154 (1990) . Debido a que la fibrina es un componente principal de los coágulos sanguíneos, las propiedades fibrinolíticas de la fibrolasa señalan hacia su potencial como un agente disolvedor de coágulos para el uso trombolítico in vivo; ver Markland y colaboradores, Circulation, Volumen 9, Número 5, páginas 2448-2456 (1994) , y Ahmed y colaboradores, anterior. Trombolítica de acción novedosa (NAT) es una forma modificada de la fibrolasa que difiere de la fibrolasa ya que NAT contiene 201 aminoácidos con una secuencia N-terminal de SFPQR, mientras que la secuencia N-terminal de la fibrolasa nativa comienza con EQRFPQR y es de 203 aminoácidos de longitud. La modificación amino- terminal fue diseñada para prevenir las reacciones químicas en los residuos de aminoácidos que eran capaces de formar una cantidad variable de glutaminas ciclizadas (ácido piroglutámico) que tienen el potencial para crear variaciones de lote a lote en calidad y uniformidad del producto. De este modo, NAT puede ser considerada como una molécula más estable. A pesar de estas diferencias estructurales, NAT y la fibrolasa son similares con respecto a la actividad enzimática (fibrinolítica) . Esta similitud en la actividad biológica es consistente con los datos que indican que el sitio activo de la molécula de fibrolasa abarca los aminoácidos 139-159, como se describe por Manning en Toxicon, Volumen 33, páginas 1189-1200 (1995), y su localización predicha en el espacio tridimensional está distante del extremo amino. El sitio activo de la fibrolasa y las moléculas NAT contiene un átomo de zinc que es formado en complejo por tres residuos de histidina. La literatura publicada sobre la fibrolasa derivada de veneno ha demostrado su actividad proteolítica contra el fibrinógeno en el sitio Lys413-Leu414 y contra la cadena ß oxidada de la insulina en el sitio Ala14-Leu15; Rertzios y Markland, Thrombosis Research, Volumen 74, páginas 355-367 (1994) ; Pretzer y colaboradores, Pharmaceutical Research, Volumen 8, páginas 1103-1112 (1991) , y Pretzer y colaboradores, Pharmaceutical Research, Volumen 9, páginas 870-877 (1992) . Se ha determinado que NAT tiene también actividad proteolítica sobre estos sustratos en los mismos sitios de escisión. En contraste a las metaloproteinasas fibrinolíticas tales como la fibrolasa y NAT, los agentes de lisis de los coágulos tales como la estreptocinasa, urocinasa y el activador de plasminógeno tipo tisular (tPA) son activadores de plasminógeno que promueven la trombólisis mediante activación del sistema fibrinolítico endógeno. Más específicamente, los activadores de plasminógeno catalizan la conversión del plasminógeno en plasmina, una proteasa de serina. La plasmina es capaz de escindir el fibrinógeno y la fibrina en los enlaces arginilo-lisilo, y es a través de la generación de la plasmina que los activadores de plasminógeno al final efectúan la degradación de la fibrina y la lisis del coágulo. Los agentes trombolóticos actuales, comercialmente disponibles, son activadores de plasminógeno, tales como urocinasa, estreptocinasa o tPA. De manera contraria a la clase de activadores de plasminógeno de los fármacos trombolíticos, las metaloproteinasas fibrinolíticas, tales como la fibrolasa ' t » ßßffi** -.¿í ?tét?ÜÍ ' -J~tl y NAT, no confían en el sistema fibrinolítico endógeno (conversión de plasminógeno a plasmina) . Por lo tanto, esta clase de agentes de lisis de coágulo pueden ser distinguidos de los activadores de plasminógeno por su modo único de acción y son definidos como agentes fibrinolíticos "directos" . La alfa2-macroglobulina es un inhibidor de proteinasa prevalente presente en el suero de mamífero, y es una de las proteínas séricas más grandes (que tiene un peso molecular de 725 kilodaltones) . La especificidad de la a2-macroglobulina para las proteinasas es amplia, abarcando las clases de serina, cisteína, aspártico y metaloproteinasa. La molécula de a2-macroglobulina es un tetrámero de subunidades idénticas que están unidas por puentes disulfuro en pares con una asociación no covalente de las medias moléculas. De este modo, bajo condiciones reductoras, la a2-macroglobulina nativa puede ser disociada en sus cuatro subunidades monoméricas. Cada subunidad de la a2-macroglobulina posee una región que es muy susceptible a la escisión proteolítica (la región de "cebo"). Las proteólisis de la región de cebo induce a un cambio conformacional en la a2- macroglobulina que atrapa la proteinasa dentro de la estructura molecular de la a2-macroglobulina . Este proceso descrito en la literatura como una interacción de "atrapamoscas". Una vez que la proteinasa es atrapada, ésta es estéricamente impedida y por lo tanto no puede acceder a su sustrato macromolecular. Además, un enlace covalente puede formarse entre una a2-macroglobulina y muchas de las proteinasas que ésta atrapa. Como se mencionó, el atrapamiento de una proteinasa induce un cambio conformacional en la molécula de a2-macroglobulina. Se presume que después de este cambio conformacional, un enlace tioéster sobre el interior de la molécula de a2-macroglobulina se vuelve reactivo y puede formar un enlace covalente con los residuos nucleofílicos (tales como la lisina) de la proteinasa atrapada. De este modo, dentro de la circulación general, la a2-macroglobulina puede neutralizar efectivamente una variedad de proteinasas. Además, el cambio conformacional en la a2-macroglobulina originado por el atrapamiento de la proteinasa, da como resultado una forma que es conocida por el sistema reticuloendotelial . El despejo de las proteinasas atrapadas con a2-macroglobulina es en general descrito con valores de vida media en minutos y se cree que ocurre a través de la proteína relacionada al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) expresada sobre macrófagos, hepatocitos y fibroblastos. Para más detalle sobre la a2-macroglobulina, ver Methods in Enzymology, editado por A.J. Barrett, Academic Press, Inc. Filadelfia, (1981), páginas 737-754.

La a2-macroglobulina es capaz de formar un complejo macromolecular con la fibrolasa, NAT y otras proteinasas. De manera contraria a algunas proteinasas que pueden formar un complejo disociable con la a2-macroglobulina, la fibrolasa y NAT son dos ejemplos de metaloproteinasa fibrinolíticas que forman un complejo que no puede ser asociado de la a2-macroglobulina bajo condiciones fisiológicas. Cuando la a2-macroglobulina humana purificada y NAT, por ejemplo, son incubadas conjuntamente, la formación del complejo comienza en segundos y es casi completa dentro de unos pocos minutos. Este fenómeno muestra que la formación del complejo in vi tro puede ser rápida y es sugestiva de la rapidez potencial de la formación del complejo entre la a2-macroglobulina y NAT u otras metaloproteinasas fibrinolíticas in vivo . Aunque la a2-macroglobulina es una de las proteínas plasmáticas mayores, existe no obstante una cantidad finita de a2-macroglobulina en la circulación, que podría ser disponible para el azar y neutralizar una metaloproteinasa fibrinolítica. La capacidad de enlace de la a2-macroglobulina es por lo tanto saturable. Una vez que la capacidad de enlace de la a2-macroglobulina ha sido excedida, la concentración de la metaloproteinasa fibrinolítica no enlazada se eleva proporcionalmente .Z*-¡i¿-..tei i-« m,f ^á .-^ ^^^^?ú. conforme es agregada metaloproteinasa fibrinolítica adicional a la muestra. La presencia de la a2-macroglobulina en la circulación general de un paciente presenta un reto para la administración sistémica (por ejemplo, intravenosa) de la fibrolasa y NAT y otras metaloproteinasas fibrinolíticas que son enlazadas por la a2-macroglobulina en la circulación sanguínea general . A no ser que el nivel saturable de a2-macroglobulina innata sea excedido, por la dosis sistémicamente administrada de tales metaloproteinasas fibrinolíticas, las últimas efectivamente serán neutralizadas y hechas no efectivas para fines terapéuticos. En un estudio in vivo, conducido en conejos, la efectividad biológica de la fibrolasa derivada de veneno, fue examinada después de la administración intravenosa sistémica. Ahmed y colaboradores, Haemostasis, anteriormente descrita. La dosis de la fibrolasa utilizada fue de 3.7 miligramos por kilogramo, que se estimó produce una concentración final en sangre de aproximadamente 60 microgramos por mililitro en un conejo de 3.0 kilogramos. Esta cantidad fue elegida con base en los estudios que examinan la inactivación de la enzima en presencia de sangre o de plasma, presumiblemente debido a la a2-macroglobulina (ver páginas 336 y 339) .

En otro estudio in vi tro, se examinó el efecto biológico de la fibrolasa recombinante sobre la lisis del coágulo en caninos. Markland y colaboradores, Circulation, anteriormente descrito. Cuatro miligramos de este material por kilogramo (de peso corporal del animal) se infundieron en cinco minutos, proximales a un trombo pre-inducido en la arteria carótida izquierda por medio de un dispositivo de catéter (ver página 2450) . Nuevamente aquí, se notó que la inactivación de la fibrolasa ocurre en la circulación sanguínea general, presumiblemente debido a la presencia de la a2-macroglobulina (ver página 2454, segunda columna, último párrafo). Como lo muestran estos dos estudios, los efectos de desactivación del a2-macroglobulina pueden ser superados ya sea con la administración o por la dosificación sistémica de la metaloproteinasa fibrinolítica que exceden el nivel saturable de la a2-macroglobulina innata (el estudio en conejo) o mediante la distribución de la enzima localmente al sitio del coágulo (el estudio en perro) y evitando la administración sistémica. Por otra parte, las dosis de metaloproteinasa fibrinolítica mayores del nivel saturable de la a2-macroglobulina, ya sea administrada sistémica o localmente, pueden exceder los niveles que son seguros y bien tolerados por el sujeto que es tratado. Notablemente, las metaloproteinasas fibrinolíticas son capaces de destruir no solamente la fibrina, sino que •"^ytv ^ U^^f^ éstas pueden también degradar otras proteínas estructurales y son por lo tanto potencialmente tóxicas in vivo cuando están presentes en cantidades grandes que exceden el nivel saturable de a2-macroglobulina. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una manera segura y biológicamente efectiva de utilizar metaloproteinasas fibrinolíticas localmente administradas, para usar los coágulos sanguíneos in vivo .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Dicho brevemente, esta invención es un método para el tratamiento de un coágulo sanguíneo in vivo, en sujetos humanos, por una metaloproteinasa fibrinolítica, que comprende administrar localmente una cantidad segura, biológicamente efectiva de la metaloproteinasa fibrinolítica al coágulo sanguíneo, tal como mediante el uso de medios de distribución por catéter. Por cantidad "segura, biológicamente efectiva" se entiende una cantidad suficiente para degradar la fibrina y facilitar la lisis del coágulo (por ejemplo, el trombo) , mientras que no se exceden los niveles significativamente por arriba del nivel saturable y el a2-macroglobulina en el sistema circulatorio del paciente que es tratado (por ejemplo, niveles que pueden provocar daño a las paredes de los vasos sanguíneos) . Típicamente, esta ,AA.«,aa.¿ cantidad estará en el intervalo de entre 0.025 y 1.7 miligramos por kilogramo de peso corporal para el sujeto humano que se trata, como es determinado a partir de un estudio conducido por las muestras sanguíneas provenientes de sujetos humanos que han sido estudiados para el contenido de a2-macroglobulina in vi tro y la capacidad de enlace. A partir de los resultados in vi tro de este estudio, ha sido posible definir el nivel saturable in vivo de la a2-macroglobulina para todos los fines prácticos, haciendo de este modo posible la delineación de una cantidad biológicamente efectiva que toma en cuenta no solamente el nivel mínimo de metaloproteinasa fibrinolítica requerida para la efectividad biológica, sino también el nivel máximo para la administración bien tolerada. Este estudio es descrito con detalle más adelante en los ejemplos. El método de esta invención es aplicable para el uso terapéutico in vivo en el tratamiento de los coágulos de fibrina estacionaria localizados en cualquiera de los vasos sanguíneos arteriales o venosos, sanguíneos, o en los injertos sintéticos arteriales o venosos, en humanos. Los términos "localmente" o "localizado" como se aplican a la forma de distribución o administración de la metaloproteinasa fibrinolítica, se refieren en la presente a la administración intra-arterial o intravenosa ya sea directamente al coágulo sanguíneo mismo (por ejemplo, Á? ?. Aj.i,fliiimtaL M¿ -i sái&tAé intratrombos) o en estrecha proximidad al coágulo (ya sea proximal o distante con relación al flujo sanguíneo) lo suficientemente cerca para que la mayor parte de la metaloproteinasa fibrinolítica sea absorbida por el coágulo. El término medio de distribución por catéter" es empleado en la presente en el sentido convencional de referirse a un dispositivo médico tubular para la inserción en canales, vasos, vía de paso o cavidades corporales para fines de inyectar o retirar fluidos o para mantener una vía de paso abierta. En general, tales medios comprenderán típicamente un cuerpo de catéter flexible alargado que contiene una o más vías de paso interiores (o ''lúmenes"); una porción proximal que permite que el material (por ejemplo, el agente de lisis del coágulo) sea introducido en el cuerpo del catéter y fluya a través del lumen; una porción distal que tiene opcionalmente un extremo ahusado; y compuertas de salida múltiples en o cerca del extremo de la porción distal para permitir que el material salga del catéter en respuesta a la presión aplicada. El método de esta invención es ilustrado adicionalmente más adelante con respecto a la oclusión de arterias periféricas (PAO) . PAO encuentra sus orígenes en la enfermedad vascular periférica debida a la ateroesclerosis. Los síntomas se desarrollan lentamente J?i? ^ en muchos años conforme progresa la ateroesclerosis, con un nivel isquémico crítico que es alcanzado en aproximadamente 15 a 20% de los pacientes con enfermedad en las extremidades inferiores. La terapia médica está limitada y predominantemente dirigida a la prevención o a al reducción del riesgo utilizando medicamentos tales como agentes que disminuyen los lípidos o antiplaquetarios, programas para dejar de fumar y ejercicio físico. Jackson y Clagett, Chest, Volumen 114, páginas 666S-682S (1998) . Las manifestaciones clínicas de la enfermedad vascular periférica pueden incluir apariciones agudas de isquemia que amenaza las extremidades, o la presencia de evidencia más crónica de la enfermedad vascular (por ejemplo, claudicaciones intermitentes) . Fuera de las medidas preventivas anteriormente mencionadas, PAO crónica es típicamente no tratada hasta el inicio de la limitación severa del estilo de vida o la isquemia que amenaza las extremidades . Dependiendo del segmento del vaso afectado y del grado de oclusión, las intervenciones médicas disponibles incluyen la angioplastia transluminal percutánea, revascularización quirúrgica, y trombólisis. Los estudios han mostrado que la infusión intra-arterial de los agentes de lisis de los coágulos, particularmente en las etapas tempranas, pueden evitar la necesidad para la intervención quirúrgica. Como se demostró en la prueba de Rochester, que comparó la trombólisis con la urocinasa íi ?i£JáJ_ ^!?.? J?l___t_t activadora de plasminógeno a la cirugía en el tratamiento de PAO aguda (Ouriel y colaboradores, Journal of Vascular Surgery, 1994, Volumen 19, páginas 1021-1030), aproximadamente 33 por ciento de los pacientes en la rama de trombólisis del estudio fueron exitosamente tratados con intervención médica únicamente, con lo cual se evita un procedimiento más invasor. En contraste, 98 por ciento de los pacientes en la rama de operación fueron sometidos a un procedimiento endovascular o quirúrgico. Otros desórdenes médicos involucran coágulos sanguíneos oclusores pueden ser efectivamente tratados de una manera similar mediante el presente método, incluyendo, pero no limitados a, infarto agudo del miocardio, apoplejía isquémica, trombosis venosa profunda y embolismo pulmonar. El método de esta invención puede también ser empleado para disolver los coágulos que aparecen con los dispositivos médicos crónicamente implantados tales como catéteres residentes e injertos de acceso de hemodiálisis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURAS la-lC. La figura la es un angiograma de línea base de la arteria carótida de un cerdo adulto antes del daño inducido por catéter de globo y la formación de un trombo oclusor. La flecha indica la posición y la presencia de los medios de contraste en la arteria carótida común izquierda, indicando que el flujo sanguíneo en la arteria está no obstruido (por ejemplo, el vaso sanguíneo está "patente" o tiene "patencia"). La figura IB es un angiograma tomado en el día 4 en el mismo animal, antes de la administración de NAT de acuerdo con el método de esta invención. La flecha indica la posición de la arteria carótida común izquierda, no obstante, los medios de contraste no fluyen en la arteria debido a la presencia de un trombo oclusor. La figura ÍC es un angiograma a las 2 horas después de la administración de 30 mg de enlace a través de un catéter "PRO" (ver figura 3 para una ilustración de este dispositivo) . La flecha indica la presencia de los medios de contraste en el vaso, demostrando que la patencia ha sido restaurada en la arteria carótida izquierda. El trombo residual mínimo es visible en el lumen de la arteria. La FIGURA 2 ilustra un tipo de dispositivo de catéter diseñado para la administración localizada de un agente trombolítico en un vaso sanguíneo. El dispositivo, mostrado aquí en vista transversal, lateral, contiene "orificios laterales" en el extremo de administración a través del cual el infundido (agente trombolítico) es emitido bajo presión de flujo aplicada. Los diámetros de los tubos de catéter en ésta figura y en la siguiente Í ? i ÉJ^. fcJÉM»l..lAA«5«k, ,...„,»«- A.j.lAafcg figura con relación al tamaño completo, están exagerados para mostrar mejor los detalles. La FIGURA 3 es una vista transversal lateral de un tipo alternativo del dispositivo de catéter para distribución localizada de un agente trombolítico en un vaso sanguíneo. Este dispositivo contiene ranuras delgadas, denominadas como "salidas de respuesta a la presión" (PRO) , que han sido cortadas en la pared del catéter a intervalos regulares tales que el infundido escapa cuando la presión del fluido dentro del catéter alcanza un punto crítico, provocando que la ranura se abra. El dispositivo puede ser utilizado en conjunto con un dispositivo de infusión pulsada, accionado por pistón automático (no mostrado, pero ejemplificado posteriormente en la presente) que es capaz de distribuir pulsos de infusión del fármaco.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El método de esta invención es aplicable para la distribución terapéutica de cualquier metaloproteinasa fibrinolítica que sea capaz de ser formada en complejo con la a2-macroglobulina. Tales metaloproteinasas fibrinolíticas, si son de origen natural, pueden ser purificadas a partir de sus fuentes naturales, por ejemplo, la fibrolasa proveniente del veneno de serpiente.

Ir4 Alternativamente, los agentes de metaloproteinasa fibrinolítica polipeptídicos, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los cuales son conocidas, pueden ser producidas mediante la utilización de métodos convencionales de expresión y purificación recombinante. En general, los métodos recombinantes emplean una molécula de ADN que codifica para la metaloproteinasa fibrinolítica de interés, que es insertada en un vector apropiado para la expresión en una célula anfitriona adecuada. El vector es seleccionado para ser funcional en la célula huésped particular empleada, por ejemplo, es compatible con la maquinaria de la célula anfitriona, tal que la expresión del ADN puede ocurrir. Los vectores pueden también obtener una secuencia flanqueante 5' (también denominada como un "promotor") y otros elementos reguladores de la expresión operativamente enlazados al ADN que va a ser expresado, así como otros elementos conocidos, tales como un origen del elemento de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia peptídica de señal, un elemento del sitio de enlace al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para la inserción del ácido nucleico de codificación, y un elemento marcador seleccionable. El vector puede también contener opcionalmente una secuencia de "etiqueta" por ejemplo, una secuencia oligonucleotídica localizada en el extremo 5' ó 3' y la secuencia que codifica para el polipéptido, que codifica polyHis u otra secuencia inmunogénica pequeña. Esta etiqueta o marcador será expresada junto con la proteína de interés, y puede servir como un marcador de afinidad para la purificación de este polipéptido a partir de la célula anfitrión. Si se desea, el marcador puede ser subsecuentemente removido del polipéptido purificado mediante diversos medios, por ejemplo, con el uso de una peptidasa selectiva. En aquellos casos donde es deseable que el polipéptido sea secretado desde la célula anfitriona, puede ser utilizada una secuencia de señal para dirigir el polipéptido fuera de la célula anfitriona donde ésta es sintetizada. Típicamente, la secuencia de señal es colocada en la región de codificación de la secuencia de ácido nucleico o directamente en el extremo 5' de la región de codificación. Han sido identificadas muchas secuencias de señal, y puede ser utilizada cualquiera que sea funcional en la célula anfitriona seleccionada. Después de que el vector ha sido introducido y el ácido nucleico ha sido insertado en el sitio adecuado del vector, el vector completado puede ser insertado en una célula anfitriona adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido. Las células anfitriones pueden ser procarióticas (tales como E. coli) o eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrado) . Las células anfitriones adecuadas o las líneas celulares adecuadas pueden ser células mamíferas, tales como las células de ovario de hámster Chino (CHO) o las células 3T3. La selección de células anfitriones de mamífero, adecuadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación del producto, son conocidos en la materia. Otras líneas celulares de mamífero, adecuadas son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la línea celular CV-1. Las células anfitrionas de mamífero, ejemplares, adicionales incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo las líneas celulares transformadas. Las células diploides normales, cepas celulares derivadas de cultivo in vitro del cultivo primario, así como explantes primarios, son también adecuados. Las células candidatas pueden ser genotípicamente eficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, las células HeLa, células L-929 de ratón, las líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-C o NIH, las líneas celulares de hámster de BHK o HaK. -.kAfawa- "^ t.a^LA^j.^^jat»?>,t.....^.J.J»»Ju«B.M También útiles como células anfitrionas son las células bacterianas, por ejemplo, diversas cepas de E. coli y diversas cepas de células de levadura. La inserción (también denominada como "transformación" o "transfección") del vector en la célula anfitriona seleccionada, puede ser lograda utilizando métodos tales como el método de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o del DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula anfitriona que va a ser utilizada. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos para la persona experta. La célula huésped, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, puede sintetizar la metaloproteinasa fibrinolítica de interés. Las células anfitrionas pueden ser cultivadas utilizando medios estándares bien conocidos para la persona experta en la técnica. Los medios usualmente contendrán todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son por ejemplo, Caldo Luria (LB) y/o Caldo Terrific (TB) . Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden ser suplementados con suero y/o factores de crecimiento como es requerido por la línea celular particular que es cultivada. k-.?_*_+!iti-?lá*.,*k?-.M. ¿áe.ki. t *.&¡k—A>k.

Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el desarrollo selectivo de las células transformadas es agregado únicamente como un suplemento a los medios. El compuesto que va a ser utilizado será dictado por el elemento marcador seleccionable presente sobre el plásmido con el cual la célula huésped fue transformada. Por ejemplo, donde el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto agregado en el medio de cultivo será la kanamicina. La cantidad de proteína producida en la célula anfitriona puede ser evaluada utilizando métodos estándares conocidos en la técnica incluyendo el análisis de manchado de Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como los ensayos de desplazamiento de gel de enlace al ADN. Si la proteína secretada de las células anfitrionas diferentes de las bacterias gram-negativas, la mayoría probablemente serán encontradas en el medio de cultivo celular. Si ésta no es secretada, ésta estará presente en el citoplasma. Para la proteína intracelular, las células anfitrionas son típicamente primeramente desintegradas mecánicamente. Para la proteína que tiene una localización periplásmica, puede ser utilizada ya sea la desintegración mecánica o el tratamiento osmótico para liberar los contenidos periplásmicos hacia la solución amortiguada, y el polipéptido es luego aislado de esta solución. La purificación a partir de la solución puede ser después de esto lograda utilizando una variedad de técnicas . Si la proteína ha sido sintetizada de modo que ésta contiene un marcador tal como hexahistidina u otro péptido pequeño ya sea en el extremo carboxilo o en el extremo amino, ésta puede ser esencialmente purificada en un proceso de un solo paso al hacer pasar la solución a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una alta afinidad por el marcador o por el polipéptido directamente (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) . Donde el polipéptido no tiene marcador y no están disponibles anticuerpos, pueden ser utilizados otros procedimientos bien conocidos para la purificación, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamices moleculares, cromatografía de fase inversa, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución en gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "isoprime", Hoefer Scientific) . En algunos casos, pueden ser combinadas dos o más de estas técnicas para lograr la pureza incrementada .

El polipéptido Trombolítico de Acción Novedosa (NAT) utilizado en la presente para ilustrar la práctica de esta invención, se refiere en general a la metaloproteinasa fibrinolítica activa de la SEQ ID No. 1. El polipéptido NAT es codificado por la molécula de ADNc de la SEQ ID No. 2, aunque cualquier molécula de ADN en la secuencia variante que codifica para el mismo polipéptido puede ser utilizada para la expresión y fabricación de acuerdo con los métodos específicos que son referidos posteriormente. La fibrinolasa ha sido descrita en la literatura científica de patentes; ver referencias anteriores. Típicamente, la forma de la fibrolasa que es empleada en la práctica de esta invención será de la SEQ ID No. 3, la cual es codificada por la molécula de ADNc de la SEQ ID No. 4 por las variantes de las mismas que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Preferentemente, un sistema de expresión en levadura es empleado para la expresión recombinante de NAT. Se hace una mención especial de las cepas de Pichia, por ejemplo, Pichia pastoris, que son las más ventajosas y preferidas para el uso. Una descripción detallada de tal sistema puede ser encontrada en la Patente de los Estados Unidos No. 4,855,231 (Stroman y colaboradores), Patente de los Estados Unidos No. 4,812,405 (Lair y colaboradores), Patente de los Estados Unidos No. 4,818,700 (Cregg y . ,,..^i^&,AP-¿«-«...A^:j^ja^ colaboradores) , Patente de los Estados Unidos No. 4,885,242 (Cregg) , y la Patente de los Estados Unidos No. 4,837,148 (Cregg), la descripción de las cuales se incorpora por referencia en la presente. La expresión de la fibrolasa en tal sistema involucrará típicamente una molécula de ADN de la SEQ ID No. 5, que codifica para la secuencias "prepro" (nucleótidos 1-783) además del polipéptido "maduro" (nucleótidos 784-1392) . La expresión de NAT en tal sistema involucrará típicamente una molécula de ADN de la SEQ ID No. 6, la cual codifica la secuencia "prepro" (nucleótidos 1-783) además del polipéptido "maduro" (nucleótidos 784-1386) . Las metaloproteinasa fibrinolítica empleada de acuerdo con esta invención, ya sea que ésta sea NAT, fibrolasa, o alguna otra metaloproteinasa fibrinolítica es administrada en la forma de una solución farmacéuticamente aceptable, sola o que contiene ingredientes adicionales farmacéuticamente aceptables. Si se desea, tales soluciones pueden comprender, además de la metaloproteinasa fibrinolítica y un solvente (por ejemplo, agua destilada o solución salina fisiológica) , ingredientes estándares tales como estabilizador (para prevenir la agregación de proteínas o la degradación física o química en medios acuosos) , agentes de volumen (para proporcionar volumen) , diluyentes, agentes antibacterianos, agentes ajustadores de la viscosidad, I .¡II iHtf&i llfeJt» ,títi ¡tH tí_é, antioxidantes, y así sucesivamente, en cantidades convencionales. Los excipientes conocidos que pueden ser incluidos en la formulación incluyen polioles (incluyendo manitol, sorbitol y glicerol); azúcares (incluyendo glucosa y sucrosa) ; y aminoácidos (incluyendo alanina, glicina y ácido glutámico). Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. De manera deseable, la composición farmacéutica será amortiguada (con un agente amortiguador biocompatible, por ejemplo, ácido cítrico o sal de ácido cítrico) a un pH que está en o cerca al neutro (7.0) antes de la administración, y usualmente entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.0 de pH (± 0.5). Si el ion metálico de la metaloproteinasa fibrinolítica es el zinc, tal como con la fibrolasa o NAT, puede ser preferible incluir una sal de zinc soluble en agua (por ejemplo, sulfato de zinc o acetato de zinc) como un estabilizador. Para aumentar adicionalmente la estabilidad a largo plazo y la vida en anaquel de la composición, puede también ser ventajoso congelar la solución o convertirla a un producto liofilizado (secado por congelamiento) que es descongelado o reconstituido antes del uso, como pueda ser el caso. A manera de ilustración, una composición medicinal líquida congelable que puede ser empleada en el método de esta invención, comprende la fibrolasa o NAT, una sal de zinc soluble en agua, un amortiguador de ácido cítrico, opcionalmente un estabilizador adicional seleccionado del grupo que consiste de sales de calcio solubles en agua, y opcionalmente un agente de volumen (por ejemplo, manitol) . Un surfactante, tal como Tween 80 (BASF, Gurnee, Illinois) , puede también ser incrementado para agregar la estabilidad al congelamiento- descongelamiento. El amortiguador de Tris (Sigma, St. Louis, Missouri) u otro amortiguador con una capacidad amortiguadora por arriba de pH 7.0 puede ser agregado para estabilizar el pH en o por arriba del pH 7.4. La mayoría de estos ingredientes estarán presentes en cantidades menores en el intervalo de 0.001 a 2.0 milimolar (mM) o menos de 10% (p/v) . El agente amortiguador será agregado en una cantidad suficiente para lograr el pH deseado, y esta cantidad puede variar dependiendo de la formulación específica. A manera de ilustración adicional, una composición farmacéutica o liofilizable o liofilizada que puede ser utilizada en el método de esta invención comprende fibrolasa o NAT, un estabilizador de zinc (por ejemplo, sal de zinc soluble en agua tal como la anterior) , y un amortiguador de ácido cítrico, con o sin otros excipientes (por ejemplo, agente de volumen tal como manitol, glicina, o similares) . La composición liofilizada puede también contener un azúcar disacárido, tal como sucrosa o trehalosa, como un crioprotector. Un surfactante, tal como Tween 80, puede ser agregado para proteger contra las tensiones por liofiolización sobre la metaloproteinasa fibrinolítica (por ejemplo, fibrolasa o NAT) . El pH será mantenido idealmente a pH de 8.0 ± 0.5, utilizando un amortiguador adecuado con un pKa en este intervalo (por ejemplo, Tris) . Las cantidades de los ingredientes estarán de acuerdo con lo anterior. Como se mencionó, el método de esta invención es empleado para administrar localmente cantidades biológicamente efectivas de una metaloproteinasa fibrinolítica, que están en el intervalo de 0.025 y 1.7 mg/kg. Preferentemente, esta cantidad estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mg/kg. Las fuerzas de las soluciones serán formuladas en consecuencia, con la dilución que es efectuada como sea necesario al momento de la administración. En el caso típico, el método de esta invención es llevado a cabo en conjunto con un procedimiento de trombólisis dirigido por catéter. Tales procedimientos involucran el uso de un dispositivo de administración de fármaco tipo catéter, pre-estabilizado, las paredes laterales del cual pueden ser hechas de un material biocompatible delgado, semi-rígido o flexible (por JáÁÍ.AJáhÁ<Httt[***L *.*•**.£ * . ... .^»teiaA.. .jh^bi ^Aj^-^a^j88 ejemplo, una poliolefina, fluoropolímero, u otro polímero inerte) . En general, los catéteres adecuados contienen al menos una cavidad interior (o lumen) que corre longitudinalmente del dispositivo. El material a partir del cual es construido el catéter es lo suficientemente flexible para ser movido a través del interior de la vasculatura sin provocar daño a las paredes de los vasos sanguíneos, lo suficientemente rígido para extenderse sobre una distancia hacia el sitio del tratamiento, mientras que la cavidad interior del dispositivo permanece completamente distendida. Típicamente, tales dispositivos de catéter estarán en el intervalo de 2 a 20 en la escala French para diámetros de catéter (1/3 de milímetro igual a 1 French) y de 61 cm a 183 cm (dos a seis pies) o más de longitud. Los dispositivos de catéter ejemplares para la administración intravascular del medicamento trombolítico de acuerdo con esta invención son ilustrados en las Figuras 2 y 3, las aplicaciones prácticas de los cuales se describen con detalle en los ejemplos siguientes. No obstante, cualquier dispositivo convencional de distribución por catéter, que sea adecuado para este método, puede ser utilizado, incluyendo pero no limitado a los dispositivos específicos referidos en la presente. Una dosis efectiva de la metaloproteinasa fibrinolítica puede ser distribuida a través del catéter hacia el sitio local del tratamiento por impulsión pulsátil, infusión continua, administración de bolo, o una combinación de los tres. La fuerza de la solución (por ejemplo, la concentración) de la metaloproteinasa fibrinolítica en la solución de tratamiento es un parámetro importante. Más específicamente, debe ser seleccionado un intervalo entre la dilución mínima de la metaloproteinasa fibrinolítica, para la efectividad en el extremo inferior (que es especialmente importante para la administración de bolos) y la solubilidad máxima de la metaloproteinasa fibrinolítica en el extremo superior. En general, son empleadas fuerzas de la solución en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 80 mg/ml. El volumen del bolo (o volumen total de los bolos múltiples en el caso de una administración "pulsada") es luego seleccionada en consecuencia para distribuir una cantidad efectiva de metaloproteinasa fibrinolítica dentro de los intervalos anteriormente prescritos.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ESPECÍFICAS La invención es además ilustrada en los siguientes ejemplos, que se entiende son ilustrativos únicamente y no limitan la invención a las modalidades descritas. En estos ejemplos, y a todo lo largo de la descripción de esta invención, "kg" indica kilogramos de peso corporal por sujeto de prueba, "mg" indica miligramos, "ml" indica mililitros, y "min" indica minutos. La metaloproteinasa fibrinolítica ilustrada a saber el Trombolítico de Acción Novedoso (NAT) fue derivada recombinantemente y realizada de acuerdo con los métodos referidos anteriormente.

EJEMPLO 1 Trombólisis en Trombosis Subaguda de la Arteria Carótida Común del Cerdo Adulto NAT ha sido estudiada en un modelo de trombosis subaguda de la arteria carótida en cerdos adultos, con peso corporal promedio de 75 kg, en un laboratorio por contrato (Charles River Laboratories, Southbridge, Massachussets) . El intento de este estudio fue establecer actividad fibrinolítica de NAT en un modelo de trombosis que es relevante para la oclusión de la arteria periférica en humanos. En este modelo animal, la arteria carótida fue sometida a trombosis a lo largo de su longitud (aproximadamente 20 centímetros desde el origen en la arteria aorta hacia la bifurcación carótida) por una combinación de daño por globo, trombina y estasis. El tamaño del trombo se aproxima al tamaño del trombo ...... A..^ tfea*.-jAA encontrado clínicamente en humanos, con oclusión arterial periférica. Después de la trombosis exitosa, al animal se le dejó recuperarse por un periodo de cuatro días. Se seleccionó un periodo de cuatro días para permitir la reticulación extensa de la fibrina, la remodelación del trombo, y la infiltración de células. Notablemente, el tamaño y la edad del trombo en este modelo son representaciones razonables del tamaño y la duración de los síntomas isquémicos reportados en la prueba TOPAS más recientemente publicada de la trombólisis con activadores de plasminógeno en la oclusión arterial periférica en humanos. Por referencia, ver Ouriel y colaboradores, New England Journal of Medicine, Volumen 338, páginas 1105-1111 (1998) . En resumen, la arteria carótida común puede ser sometida a trombosis a lo largo de su longitud completa mediante daño por globo fluoroscópicamente dirigido. Los globos que son utilizados están sobredimensionados y no son flexibles. Los globos son inflados a presiones de hasta doce atmósferas, lo cual provoca un daño por aplastamiento a la pared íntima del vaso. Mientras que el globo es inflado, éste es movido hacia atrás y hacia adelante con el fin de retirar el endotelio vascular. El procedimiento de inflamiento del globo es muy dañino y crea una superficie del vaso altamente tro bogénica, y se repite a todo lo largo de la longitud tÍA?s - «*J$&*fc*¿»-ff *»-' ^t ^ ? completa de la arteria carótida común. Después de dañar completamente la arteria entera, el globo es retirado a una posición proximal cercana a la aorta, e inflado para ocluir el flujo de la sangre a través del vaso. Mientras que está ocluida, se inyectan cincuenta unidades de trombina bovina a través de la compuerta distal del catéter de globo, con el fin de estimular la coagulación. El globo permanece inflado por un periodo de treinta minutos, lo cual da como resultado oclusión trombótica del vaso. Después de treinta minutos, el globo es desinflado y se realiza un angiograma para confirmar que el vaso se ha llegado a ocluir. Con estos procedimientos, la oclusión del vaso fue lograda en más del 90% de los casos. Una vez sometido a trombosis, el catéter de globo, el catéter guía y la coraza de acceso son retirados, y el animal se deja recuperar en un periodo de cuatro días. En el cuarto día, los animales son re-anestesiados, la oclusión es reconfirmada, y un catéter para administración de fármaco, con orificios laterales múltiples (ver figuras 2 y 3) se hace avanzar bajo guía fluoroscópica y se coloca tal que los orificios laterales son localizados dentro del trombo. La trombosis con NAT fue angiográficamente observada utilizando dosis de NAT fijas que están en el intervalo de 10 a 30 mg (o aproximadamente 0.1 a 0.4 mg/kg en una base ajustada en peso), como se muestra en las figuras 1A-1C.

Co o lo ilustra la imagen en la figura IB, NAT es efectivo en restaurar el flujo antigrado como se evalúa por angiografía. Para ser más cuantitativo, el flujo en el vaso objetivo es cualitativamente calificado de acuerdo a una escala de 4 puntos (en el intervalo de 0 a 3) donde: 0 = sin flujo 1 = flujo estimado como menor del 30% de la carótida contralateral (sin trombosis) 2 = flujo estimado en 30-80% de la carótida contralateral 3 = flujo que es indistinghible de la carótida contralateral La imagen mostrada en la figura IB fue calificada como un grado de flujo igual a 3, un resultado frecuente en vasos con trombosis tratados con una dosis fija de 30 mg de NAT (aproximadamente 0.4 mg/kg en un cerdo de 75 kg) . Las tablas 1-3 de los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente el régimen de tratamiento y las calificaciones de flujo medio derivadas de los angiogramas en serie. En todos los estudios, la respiración, la temperatura corporal, el ritmo cardiaco y las presiones sanguíneas arteriales fueron continuamente monitorizadas y permanecieron dentro de los intervalos fisiológicos sin cambios observados después de la administración de NAT.

EJEMPLO 2 Selección de Catéteres PRO y Administración por Rocío en Pulsos En el manejo clínico de la oclusión arterial periférica, los agentes trombolíticos son distribuidas a través de catéteres que son colocados cerca de o incrustados en el trombo. Como se muestra en las figuras 2 y 3, existen dos tipos de catéteres. Una variedad, el catéter de "orificio lateral" (figura 2) tiene orificios laterales redondos diminutos (2) , cortados en el catéter (4) cerca del extremo distal cerrado 6, y una compuerta de entrada 8 (para la solución de metaloproteinasa fibrinolítica) en el anillo de acoplamiento 10 fijado en el extremo proximal 12. El catéter 4 es construido de un material de tubería polimérica biocompatible, alargado, flexible, que es hueco y de pared delgada y tiene un diámetro uniforme de 2 a 20 French, y preferentemente de 3 a 5 French. El catéter contiene dos marcadores 14 radioopacos sobre la superficie exterior cercana al extremo distal 6 que demarcan la porción del catéter que contiene orificios laterales 2. En la práctica, el catéter es insertado en una abertura quirúrgica de la arteria o vena ocluida y, mientras que se observa por medio de la fluoroscopía de acuerdo con los procedimientos estándares aprobados, es movido cuidadosamente a través del vaso sanguíneo tal que el extremo distal 6 es colocado dentro o cerca del trombo. Los marcadores 14, los cuales se muestran claramente en una imagen de fluoroscopio, pueden servir como una guía para colocar esa porción de catéter, tal que el infundido que emerge de los orificios laterales 2 entrará en contacto con el trombo directamente. Una solución farmacéutica de la metaloproteinasa fibrinolítica es luego inyectada, bajo una presión leve desde el depósito 16 en forma de jeringa, hacia la compuerta de entrada 8, y es impulsado hacia el extremo distal 6, emergiendo a través de los orificios 2 dentro del trombo, provocando la degradación del material fibrinoso. Cuando son realizadas infusiones de una metaloproteinasa fibrinolítica utilizando ese tipo de catéter, la mayor parte de la solución que contiene el agente fibrinolítico tiende a escapar a través de los orificios laterales proximales (por ejemplo, aquellos más cercanos a la compuerta 8 de entrada del fármaco) , que tiene un impacto negativo en la uniformidad de la administración del fármaco en el sitio de tratamiento. Existe también una posibilidad de contraflujo de la sangre hacia el catéter a través de las compuertas laterales 2 bajo presión negativa.

Otra variedad de catéter, también compuesto de un material polimérico biocompatible, de pared delgada, hueco, mostrado en la figura 3, tiene ranuras 2 extremadamente delgadas que son cortadas por láser dentro del catéter flexible 4, a intervalos regulares cerca del extremo distal cerrado 6. Las ranuras, las cuales son referidas como salidas de respuesta a la presión ("PRO") son lo suficientemente apretadas de modo que el infundido no escapará a no ser que la presión del fluido dentro del catéter alcance un punto crítico y provoque que las ranuras se distiendan simultáneamente y de este modo se abran temporalmente. El catéter puede también contener marcadores radioopacos exteriores 8 para ayudar en la colocación del dispositivo en el sitio del trombo. Idealmente, tales catéteres de infusión de "PRO" son utilizados en conjunto con un dispositivo de infusión pulsada, accionado por pistón, automatizado (no mostrado) que es capaz de administrar pulsos regulados de bajo volumen de la infusión de fármaco hacia la compuerta de entrada 10 en el anillo de acoplamiento 12 fijado en el extremo proximal 14 del catéter 4. Cuando es distribuido un pulso, la presión dentro del catéter se eleva momentáneamente. En respuesta, las salidas de respuesta a la presión (ranuras 2) se abren momentáneamente y permiten que el infundido (por ejemplo, la solución farmacéutica de la metaloproteinasa fibrinolítica) escape. La ventaja ia^a?tA= -iittffiti íf ir fe?ttir?lMrrtii rt ?-fHHfjtit teórica de la distribución impulsada del infundido y un catéter tipo PRO, es que el infundido es distribuido uniformemente a través de las ranuras a lo largo de la longitud completa del catéter, mientras que el infundido distribuido a través del catéter de "orificio lateral" (figura 2) sigue una trayectoria de menor resistencia y fluye hacia afuera de los orificios laterales proximales de una manera no uniforme, como se mencionó. Un modelo de cerdo de trombosis carótida de cuatro días de edad, se utilizó para evaluar el funcionamiento de los dos tipos de catéter anteriormente mencionados, utilizando dosis fijas de 30 mg de NAT (aproximadamente 0.4 mg/kg en un cerdo de 75 kg) . Los resultados son resumidos en la tabla 1.

Tabla 1 Comparación de las Calificaciones de Flujo Angiográfico Obtenido con NAT Utilizando los Catéteres de Orificio Lateral y de Infusión PRO CM: Catéter tipo "orificio lateral" de infusión con válvula de Cragg-McNamaraRM (Micro Therapeutics, Inc. San Clemente, California), PS : distribución de "rocío en pulsos" como se define por el uso del catéter de salida de respuesta a la presión (PRO) (UNI*Fuse Catheter", AngioDynamics, Inc., Queensbury, New York) utilizado en conjunto con el dispositivo de infusión pulsada, automatizado (PULSE*SPRAY INJECTOR Modelo PSI-1, AngioDynamics, Inc., Queensbury, New York). Como se muestra en la Tabla 1, las calificaciones de flujo angiográfico en el grupo tratado con la modalidad de rocío en pulsos, mostró calificaciones de flujo iniciales ligeramente más altas en el angiograma de treinta minutos, que pareció persistir al punto de tiempo de cuatro horas. Aunque no fueron obtenidas diferencias estadísticas, los resultados angiográficos han sido en general juzgados como superiores. Por lo tanto, un catéter tipo PRO en conjunto con la distribución por rocío en pulsos es el modo preferido de administración para una metaloproteinasa fibrinolítica de acuerdo con esta invención. . ».~k-^.. * «*«"^«*M***' *"""*" EJEMPLO 3 Evaluación del Tiempo de Distribución del Fármaco La oclusión arterial periférica aguda es típicamente tratada con activadores de plasminógeno, tales como urocinasa, distribuida como una infusión que es frecuentemente de 24 horas de duración, y ocasionalmente tan larga como de 48 horas. Se presume que la infusión prolongada mantiene un bajo nivel de generación de plasmina en un periodo prolongado de tiempo con el fin de disolver de manera efectiva el trombo oclusor. Ya que NAT y la fibrolasa son metaloproteinasas fibrinolíticas, tales infusiones prolongadas pueden no ser necesarias. Para evaluar si la proporción o velocidad de administración afecta la lisis del coágulo angiográfico, una dosis fija de 30 mg de NAT (aproximadamente 0.4 mg/kg en un cerdo de 75 kg) se distribuyó utilizando catéteres PRO y el dispositivo de rocío en pulsos. Utilizando volúmenes de pulso de 0.1 ml, se distribuyó una solución NAT de 5 mg/ml en seis minutos (diez pulsos por minuto) o sobre sesenta minutos (un pulso por minuto) . Los resultados se muestran en la Tabla 2.

A^.gg¿aMfea,A¿A^te»tai.^.,..t.9*^aiA ^ TABLA 2 Comparación de los Tiempos de Distribución de Fármaco para NAT Distribuido por Catéter PRO Inyector de Rocío por Pulsos Como se muestra en la Tabla 2, la administración de 30 mg de NAT en seis minutos, dio como resultado una calificación de flujo medio de 2.7 en los tres animales, en el angiograma de treinta minutos, que persistió hasta el punto de tiempo de cuatro horas. En contraste, la distribución en 30 mg de NAT por infusión pulsada en sesenta minutos fue mucho menos impresionante. Aunque estos datos no han sido estadísticamente comparados, los resultados parecen favorecer la distribución de NAT como un régimen de pulso más rápido.

EJEMPLO 4 Optimización del Volumen de Pulso El dispositivo de infusión de rocío por pulsos es programable para la distribución de volúmenes de pulsados de 0.1 a 0.5 ml por pulso. Para determinar si el volumen del pulso tenía algún efecto sobre los resultados angiográficos en el modelo de cerdo, los volúmenes pulsadas de 0.2 ml fueron comparados a los volúmenes pulsados de 0.4 ml . NAT fue distribuido a una dosis fija de 10 mg (equivalente a 0.15 mg/kg en un cerdo de 75 kg) . Los resultados son mostrados en la Tabla 3.

Tabla 3 Comparación de los Resultados Angiográficos Utilizando NAT Distribuido en Volúmenes Pulsados de 0.2 ml ó 0.4 ml Como se muestra en la Tabla 3, a los treinta minutos la calificación angiográfica media fue ligeramente mayor en el grupo de volumen pulsado en 0.4 ml . No obstante, al punto de tiempo de cuatro horas, la media grupal fue ligeramente más alta en el volumen pulsado 0.2 ml . Como tal, no puede ser extraída ninguna conclusión a partir de estos estudios con respecto a un volumen de pulsado que es superior a otro. Los resultados en el texto precedente y en las tablas sugieren que virtualmente todos estos regímenes de tratamiento con NAT son efectivos en el tratamiento de las oclusiones de las arterias periféricas con el método de administración de esta invención, y que estos resultados son al menos comparables al tratamiento con activadores de plasminógeno, tales como urocinasa, que es el tratamiento actual de elección con agentes trombolíticos . Los resultados demuestran que el catéter PRO con la administración de rocío pulsado parece proporcionar resultados angiográficos superiores. Dado el peso corporal de los animales en estos estudios (70-100 kg) , la dosis fija de 30 mg es aproximadamente equivalente a 0.3 - 0.3 mg/kg en una base ajustada en peso.

La disminución de NAT de dosificación fija a 10 mg dio como resultado una reducción de las calificaciones angiográficas medias grupales a las cuatro horas, y en algunos animales, la patencia no fue lograda. Esto indica que una dosis de 10 mg de NAT parece ser una dosis de umbral para la actividad biológica en este modelo. Dado el peso corporal de los animales en esos estudios (70-100 kg) , la dosificación fija de 10 mg es aproximadamente equivalente a 0.1 - 0.15 mg/kg en una base ajustada en peso. Variando el volumen pulsado de 0.2 ml hasta 0.4 ml no pareció impactar profundamente las calificaciones de patencia angiográfica.

EJEMPLO 5 Establecimiento del Intervalo de Dosis Biológicamente Efectiva, Bien Tolerada, Segura, en Humanos No existe literatura satisfactoria sobre la concentración en suero o la actividad bioquímica de la a2-macroglobulina en pacientes ancianos con enfermedad vascular periférica (PVD) . Ya que las concentraciones de a2-macroglobulina son un determinante clave de la seguridad y probablemente está relacionado a la capacidad de tolerancia de las metaloproteinasas fibrinolíticas in vi vo, un estudio epidemiológico seccional transversal fue conducido en pacientes con PVD, para evaluar la concentración sérica de la a2-macroglobulina y la capacidad de enlace de la metaloproteinasa fibrinolítica (utilizando NAT como el agente de prueba) . Doscientos dieciséis pacientes fueron enrolados en dos centros (Cleveland Clinic Foundation, Cleveland. OH, y Rochester General Hospital, Rochester, NY) . La información demográfica y otras características fueron recolectadas, y el suero se obtuvo para medir la a2- macroglobulina, la capacidad de enlace de NAT (mediante titulación de las muestras de suero de pacientes individuales utilizando un ensayo de HPLC que detecta NAT no enlazado) y otros parámetros de la química sérica. El punto final primario fue la determinación de la relación entre la concentración en suero de la a2-macroglobulina y la cantidad de NAT (en microgramos por mililitro de suero) que pudo ser neutralizado in vitro (capacidad de enlace de NAT) . Una comparación de las características del paciente en este estudio con aquellas de los dos estudios publicados más grandes de trombólisis en PAO (por ejemplo, - los estudios STILE y TOPAS) indicaron que la población de pacientes en este estudio fue representativa de estudios previos de la trombólisis en PAO; para detalles adicionales sobre los estudios previos ver Annals of Surgery, Volumen 220, páginas 251-266 (1994) y Ouriel et . al., New Englabnd Journal of Medicine, Volumen 338, páginas 1105-1111 (1998), respectivamente. La dosis máxima estimada (EMD) para NAT fue calculada para cada paciente utilizando la capacidad de enlace de NAT y un estimado del volumen de plasma de cada paciente. Los resultados del estudio predicen que el paciente promedio podría recibir una dosis de 1.7 mg/kg (administrada localmente o sistémicamente) sin exceder la capacidad de la a2-macroglobulina para enlazar y neutralizar NAT. Los resultados del estudio son resumidos en la Tabla 4, siguiente Tabla 4 Histograma de la Dosis Máxima Estimada de NAT en Pacientes con Oclusión Vascular Periférica 0.00.20.* 0.60J 1.01.2 ?? ?? 1.82.0 Z? 2.42.C 2.83.03.2 »? 3.63.84.0 Dosis M xima Es-timada de NAT (mg/kg) t - .--^Í?á Í?Mí.M?.A íí£?¿k3 La dosis máxima estimada de NAT fue calculada para cada uno de los 216 sujetos en el estudio. Los resultados para el estudio son descritos como un histograma, arriba, donde puede ser observada una distribución en forma de campana mediante inspección visual. En este estudio se predice que el paciente promedio es capaz de tolerar 1.7 mg/kg del NAT (el pico de la distribución en forma de campana) . Las dosis administradas en estudios animales se muestran para referencia (lado a mano derecha) y puede observarse que son mayores que la dosis máxima estimada de NAT para 99% de la población en estudio. De este modo, el intervalo prescrito de 0.025 a 1.7 mg/kg para la invención representa un estimado racional de la dosis que los pacientes pueden recibir de manera segura (con base en el volumen plasmático y la capacidad de enlace NAT para la a2-macroglobulina) sin la aparición de NAT libre en la circulación. En conclusión, los resultados de los estudios farmacológicos ejemplificados, Ejemplos 1-4 anteriores, indican la actividad biológica de una metaloproteinasa fibrinolítica como un agente de lisis de coágulos en un modelo animal de trombosis donde el trombo es comparable en tamaño y en edad a aquel frecuentemente encontrado en la oclusión arterial periférica en humanos. Las dosis identificadas en los modelos animales fueron obtenidas sin tomar en consideración las toxicidades potenciales en el animal. Las dosis efectivas en conejos y perros (3.7 y 4.0 mg/kg, respectivamente) como se describe por Ahmed y colaboradores y Markland y colaboradores (arriba) pueden hacer posible un uso veterinario para las metaloproteinasas fibrinolíticas . No obstante, cuando se considera en presencia de datos humanos, la administración de dosis de 3.7 y 4.0 mg/kg podrían haber sobredosificado al 99% de la población en estudio. Por lo tanto, los estudios animales publicados no hacen posible el uso terapéutico de las metaloproteinasas fibrinolíticas en humanos, de una manera que sea segura así como biológicamente efectiva. Los datos presentados en el Ejemplo 5, por otra parte, no hacen posible tal uso en humanos. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

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LISTADO DE SECUENCIAS <110> Amgen Inc. <120> MÉTODO PARA LA ADMINISTRACIÓN LOCALIZADA DE METALOPROTEINASAS FIBRINOLITICAS <130> A-627 <140> N/A <141> 1999-12-17 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: NAT (análogo de fibrolasa de Agkistrodon contortrix) <400> 1 Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val lie Val Ala Asp His Arg 1 5 10 15 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys He Arg Gln Trp Val 20 25 30 His Gln He Val Asn Thr He Asn Glu He Tyr Arg Pro Leu Asn He 35 40 45 Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu He Trp Ser Asn Gln Asp Leu He 50 55 60 Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp 65 70 75 80 Arg Clu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu 85 90 95 Leu Thr Ala He Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val 100 105 110 Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val He Gln Asp His 115 120 125 Ser Ala He Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly 130 135 140 His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala 145 150 155 160 Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu 165 170 175 Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn 180 185 190 Asn Pro Gln Cys He Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 2 <211> 603 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Codifica NAT (análogo de fibrolasa) <400> 2 tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60 tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120 gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180 caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240 cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300 gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360 tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420 cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480 aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540 tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600 ceg 603 <210> 3 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> Fibrolasa nativa de Agkistrodon Contortrix <400> 3 Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val He Val Ala Asp 1 5 10 15 ,-n—»— *3 ¿ müfl? a : His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Aep Lys He Arg Gln 20 25 30 Trp Val His Gln He Val Asn Thr He Asn Glu He Tyr Arg Pro Leu 35 40 45 Asn He Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu He Trp Ser Asn Gln Asp 50 55 60 Leu He Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly 65 70 75 80 Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala 85 90 95 Gln Leu Leu Thr Ala He Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala 100 105 110 Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val He Gln 115 120 125 Asp His Ser Ala He Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu 130 135 140 Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys 145 150 155 160 Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser 165 170 175 Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr 180 185 190 Val Asn Asn Pro Gln Cys He Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 4 <211> 609 <212> ADN <213> Agkistrodon contortrix <220> <223- 0dif ca la fibrolasa nativa de Agkistrodon contortrix <400> 4 caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60 actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120 attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180 tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240 aactggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300 j.jifc..^ J?'?^á?jst ^ k& t. gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360 aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420 atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480 ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc 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660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080 accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaac cg 1392 <210> 6 <211> 1386 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: proNAT (análogo de profibrolasa de Agkistrodon contortris <400> 6 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840 aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900 aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960 aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020 tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080 atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140 cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200 gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260 gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320 tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380 aaaccg 1386

Claims (1)

1. 49 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para el tratamiento terapéutico de un coágulo sanguíneo en un sujeto humano, caracterizado el método porque comprende administrar localmente al coágulo sanguíneo, por medio de distribución con catéter, una cantidad biológicamente efectiva y segura de una metaloproteinasa fibrinolítica en una solución farmacéuticamente aceptable, en donde la cantidad biológicamente efectiva, segura, está en el intervalo entre 0.025 y 1.7 miligramos de la metaloproteinasa fibrinolítica por kilogramo de peso corporal del sujeto humano que es tratado. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de metaloproteinasa fibrinolítica está en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 miligramo por kilogramo de peso corporal. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metaloproteinasa fibrinolítica es distribuida vía la administración intratrombótica. 50 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metaloproteinasa fibrinolítica es administrada en estrecha proximidad al coágulo sanguíneo. 5 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el coágulo sanguíneo está localizado en una arteria. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se utiliza para 10 tratar la oclusión de arterias periféricas. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el coágulo sanguíneo está localizado en una vena. 8. El método de conformidad con la 15 reivindicación 1, caracterizado porque el medio de distribución por catéter comprende un dispositivo de catéter con ""orificio lateral". 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de 20 administración por catéter comprende un dispositivo de administración de catéter de ""salida de respuesta a la presión" (PRO) . 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la solución de 25 metaloproteinasa fibrinolítica es administrada mediante infusión de rocío por pulsos. 51 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es utilizado un volumen pulsado de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mililitros de etaloprotemasa fibrinolítica en solución, por pulso. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metaloproteinasa fibpnolítica está presente en una potencia de solución en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 80 miligramos por mililitro. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metaloproteinasa fibrinolítica es Trombolítica de Acción Novedosa (NAT) . 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metaloproteinasa fibrinolítica es fibrolasa. HMiSi?a