ES2210298T3 - Composicion trombolitica. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION HACE REFERENCIA A UNA TERAPIA DE COMBINACION TROBOLITICA MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE UN AGENTE CAPAZ DE ACTIVAR PLASMINOGENO NATURAL, Y ANALOGO DE PLASMINOGENO NO NATURAL QUE ES DIVISIBLE POR LA TROMBINA NATURAL PARA GENERAR ACTIVIDAD DE PLASMINA.
Description
Composición trombolítica.
Esta invención se refiere a productos y
procedimientos para mejorar los tratamientos trombolíticos de
pacientes con riesgo de desarrollar uno o varios trombos. En
particular, la invención se refiere a un tratamiento trombolítico
combinado mediante la administración de un agente capaz de activar
el plasminógeno nativo, y un análogo no nativo del plasminógeno que
se puede fragmentar por la acción de la trombina nativa para generar
actividad de plasmina.
Se conocen agentes capaces de activar el
plasminógeno nativo y se están usando en el tratamiento
trombolítico, están en estudio clínico o se han propuesto para tal
propósito. Ejemplos de tales compuestos incluyen el activador de
plasminógeno de tipo tisular (tPA), la uroquinasa, la
estreptoquinasa y el activador de plasminógeno salival de Desmodus
(DSPA). El tratamiento intravenoso con tPA y estreptoquinasa ha
tenido éxito en la reducción de la mortalidad causada por el infarto
agudo de miocardio.
A pesar de este éxito, está ampliamente
reconocido que la trombolisis tiene limitaciones importantes debidas
a las deficiencias de los agentes disponibles (revisión por Marder y
Sherry. New England Journal of Medicine 1989, 318:
1513-1520). Por ejemplo, para el tPA éstas son su
rápida eliminación del organismo y su ausencia relativa de
especificidad para el trombo a dosis clínicamente útiles. El rápido
aclaramiento del tPA significa que se debe administrar una gran
cantidad de la proteína mediante infusión venosa, lo que retrasa el
comienzo del tratamiento hasta que el paciente ingresa en el
hospital. Otro problema asociado con el rápido aclaramiento del tPA
es que cuando se interrumpe la administración de tPA normalmente se
produce la reoclusión del vaso sanguíneo reperfundido. Por último,
la relativa ausencia de especificidad para el trombo de las dosis
terapéuticas de tPA produce un riesgo de hemorragia. El riesgo de
hemorragia es un problema común a todos los trombolíticos actuales
porque no son específicos del trombo a dosis clínicamente útiles y
activan el plasminógeno para producir plasmina en la circulación
general.
La uroquinasa tiene un aclaramiento plasmático
rápido similar y también requiere que se administre mediante
infusión continua.
Se han realizado muchos intentos para aumentar la
semivida del tPA y superar su rápido aclaramiento, pero parece ser
que las variantes del tPA en desarrollo clínico sólo se eliminan
3-5 veces más despacio que el tPA (Thromb.
Haemostas. 66: 569-574, 1991; Thromb.
Haemostas. 70: 307-312, 1993); la semivida en
plasma del tPA es de aproximadamente cinco minutos en el ser humano
(Bounameaux y col. In: "Contemporary issues in Haemostasis and
Thrombosis" vol 1 pág. 5-91, 1985. Collen y col.
eds, Churchill Livingstone). Estas variantes del tPA bien se pueden
administrar en bolo y/o reducir la dosis pero no es probable que
permanezcan en la circulación sanguínea el tiempo suficiente como
para ser eficaces en la prevención de la reoclusión. Tampoco es
probable que reduzcan el riesgo de hemorragia de forma significativa
y, puede aumentar a causa de la persistencia en la circulación.
Otro enfoque para mejorar la eficacia clínica de
los activadores de plasminógeno es a través de tratamiento
complementario con agentes anticoagulantes y antiagregantes
plaquetarios. Ha habido un éxito limitado en la mejora de la
eficacia terapéutica de tPA con el uso complementario de heparina y
ácido acetilsalicílico. Sin embargo, tal régimen terapéutico todavía
tiene limitaciones de una tasa de fracaso de un 15%-20% para
recanalizar la arteria relacionada con el infarto y por una tasa de
reoclusión de 5%-10%. Como resultado, la tasa de reinfarto a los 30
días es de 4%-6%, el shock cardiogénico y la insuficiencia
congestiva cardíaca se produce es el 5%-7% y el 15%-17% de los
pacientes, respectivamente, y la mortalidad se encuentra en el
intervalo de 5%-8% (Am. J. Cardiol. 75: 7-13 1995).
Se piensa que el fracaso inicial de la trombolisis y la reoclusión a
pesar del uso de heparina y ácido acetilsalicílico son el resultado
de la actividad persistente de la trombina. Por tanto, agentes más
potentes y selectivos se encuentran en investigación. Hirudina es un
potente inhibidor de la trombina que, en modelos animales, se ha
mostrado que es superior a la heparina en la reducción del depósito
de plaquetas y la formación de trombos (Circulation 79:
657-665, 1989) y se ha mostrado que en modelos de
trombosis coronaria acelera la trombolisis y reduce la reoclusión
(Circulation 83: 1048-1056 y Circulation Research
70: 829-834, 1992). La patente de EE.UU. 4944943
describe el uso de agentes trombolíticos tales como tPA y agentes
antitrombóticos, siendo hirudina el único ejemplo sugerido, como
tratamiento complementario. La patente de EE.UU. 5126134 describe el
uso de un activador de plasminógeno, como tPA e hirudina, como
tratamiento complementario. Sin embargo, tres ensayos clínicos en
los que se investigaba hirudina como tratamiento complementario al
tPA se interrumpieron en 1994 a causa de una elevada incidencia de
hemorragia (Circulation 90: 1624-30,
1631-37 y 1638-42, 1994). Además, en
estos ensayos se investigaba una dosis de heparina más elevada que
la norma previa y se encontró que también estaba asociada con un
aumento de la incidencia de hemorragia. Por tanto, parece ser que la
intensificación del tratamiento antitrombótico complementario usando
agentes que inhiben la actividad de la trombina resulta en un
aumento inaceptable de las hemorragias.
Las publicaciones de patente WO 91/09118 y WO
94/10318 (ambas de British Bio-technology Ltd)
describen un nuevo enfoque al tratamiento de trastornos trombóticos
basándose en el uso de mutantes de plasminógeno que son activados
para generar actividad de plasmina o similar a plasmina mediante la
escisión con una enzima que está implicada en la cascada natural de
la coagulación, particularmente trombina. Una ventaja de tales
agentes reside en su especificidad para el trombo. Dado que la
activación se produce con la exposición a la trombina, que está
particularmente concentrada en el lugar donde está el trombo, la
actividad trombolítica de la plasmina se genera donde es requerida,
reduciendo por tanto el riesgo de activación sistémica y de
hemorragia. Debe esperarse que tales compuestos tendrán también un
efecto antitrombótico, porque la tendencia a la formación de trombos
se contrarrestará con la actividad trombolítica de la plasmina
generada por la escisión por la trombina del agente en ese lugar. El
Gluplasminógeno natural tiene una semivida plasmática de 2,2 días
(Thromb. Haemostas. 43: 77-89 1980), por lo
que la persistencia prolongada en la circulación confiere al
plasminógeno activable por trombina otra ventaja que complementa a
la selectividad por el trombo de su acción.
La potencia de los mutantes de plasminógeno
activables por trombina de los documentos WO 91/09118 y WO 94/10318
puede aumentarse con la mutación posterior descrita en el documento
WO 94/03614 (British Bio-technology Ltd) que se
diseña para introducir resistencia a antiplasmina, la serín proteasa
inhibidora de plasmina conocida.
Esta invención se basa en el hallazgo de los
presentes inventores que los análogos de plasminógeno activables por
trombina de la clase mencionada anteriormente son capaces de
aumentar la actividad trombolítica de los agentes activadores de
plasminógeno tales como tPA, sin aumentar de forma significativa la
producción sistémica de plasmina y, por tanto, el riesgo de
hemorragia. Este hallazgo hace que se disponga de un nuevo
tratamiento trombolítico más eficaz permitiendo la administración en
bolo del activador de plasminógeno y por tanto, el inicio más
temprano del tratamiento; reduciendo la dosis eficaz de activador
de plasminógeno requerida, disminuyendo así el riesgo de hemorragia;
y reduciendo la incidencia de reoclusión de los vasos abiertos al
volver a formar los trombos.
Según la presente invención se proporciona un
producto que contienen un activador de plasminógeno de la clase que
escinde directamente el plasminógeno para generar actividad
trombolítica de tipo plasmina o que forma un complejo con el
plasminógeno provocando cambios conformacionales que permitan al
complejo escindir las moléculas de plasminógeno para liberar
plasmina, y un análogo de plasminógeno de la clase que se puede
activar por la trombina para poseer actividad de plasmina y que
contiene la secuencia con el punto de escisión
P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',
donde P3 es un residuo de aminoácido básico, P4 es un residuo y de
aminoácido hidrófobo y cada uno de P1' y P2' es de forma
independiente un residuo de aminoácido no ácido, siendo dicho sitio
escindible por la trombina entre la Arg y el P1', para su uso
simultáneo, por separado o secuencial en el tratamiento
trombolítico.
La invención también incluye el uso de un análogo
de plasminógeno de la clase que se puede activar con trombina para
dar actividad de plasmina y que contiene la secuencia con el sitio
de escisión
P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',
donde P3 es un residuo de aminoácido básico, P4 es un residuo de
aminoácido hidrófobo y cada uno de P1' y P2' es de forma
independiente un residuo de aminoácido no ácido, siendo dicho sitio
escindible por la trombina entre la Arg y el P1', en la preparación
de un agente para reducir el riesgo de hemorragia en un paciente
sometido a tratamiento trombolítico con un activador de plasminógeno
que escinde directamente el plasminógeno para generar actividad
trombolítica de tipo plasmina o que forma un complejo con
plasminógeno provocando cambios conformacionales que permiten al
complejo escindir las moléculas de plasminógeno para liberar
plasmina.
Tal tratamiento antitrombótico complementario
puede usarse para tratar enfermedades vasculares agudas tales como,
infarto de miocardio, ictus, angina inestable, embolia pulmonar,
trombosis venosa profunda, oclusión arterial periférica,
circulación extracorpórea, derivaciones arteriovenosas y otras
trombosis venosas para acelerar la eliminación de trombos
patológicos.
Con el término "activador de plasminógeno"
se quiere decir un compuesto que activa plasminógeno para generar
actividad trombolítica de tipo plasmina. Ejemplos de activadores de
plasminógeno que directamente escinden el plasminógeno para generar
plasmina incluyen tPA, DSPA, uroquinasa y mutantes de estas
proteínas con cambios de secuencia que no destruyen su capacidad
para escindir el plasminógeno y para liberar plasmina.
La estreptoquinasa es un ejemplo de un activador
de plasminógeno que forma un complejo con plasminógeno provocando
cambios conformacionales que permiten al complejo escindir las
moléculas de plasminógeno para liberar plasmina.
Análogos de plasminógeno activables por trombina
se describen en las publicaciones de patente de British
Bio-technology citadas anteriormente. Las mutaciones
que proporcionan la molécula escindible por la trombina para generar
actividad plasmina están preferiblemente en o cerca de la posición
en la molécula correspondiente al punto de escisión natural del
plasminógeno de tipo salvaje. A este respecto, el plasminógeno se
numeró como resultado de los estudios de secuenciación de proteínas
de Sottrup-Jensen y col. (en: Atlas of Protein
Sequence and Structure (Dayhoff, M.O., ed.) 5 suppl. 3, pág. 95
(1978)), que indicaron que el plasminógeno era una proteína de 790
aminoácidos y que el punto de escisión era el enlace peptídico
Arg(560)-Val(561). Sin embargo, un
adecuado ADNc de plasminógeno útil como producto intermedio por
Forsgren y col. (FEBS Letters 213: 254-260 (1987)),
que codifica una proteína de 791 residuos con uno adicional está en
la posición 65. En esta memoria descriptiva, la numeración de los
aminoácidos en el plasminógeno corresponde a la del ADNc de
Forsgren.
El activador de plasminógeno preferido en la
actualidad para usar en la presente invención es el tPA, aunque los
"tPA de segunda generación" como el conocido como BM 06.022
(Martin. U. Y col., Thromb. Haemostas. 66:
569-574, 1991) o el conocido como
T103N.KHRR296-299AAAA (Paoni N.F. y col., Thromb.
Haemostas. 70: 307-312. 1993) pueden preferirse como
y cuando los aprueben para el tratamiento de seres humanos las
autoridades reguladoras.
Los análogos de plasminógeno activables por
trombina preferidos en la actualidad para usar en la presente
invención incluyen aquéllos descritos en el documento WO 94/10318,
que tienen una secuencia con el punto de escisión
P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',
donde P3 es un residuo de aminoácido básico, P4 es un residuo de
aminoácido hidrófobo y cada uno de P1' y P2' es de forma
independiente un residuo de aminoácido no ácido, siendo dicho sitio
escindible por trombina entre la Arg y el P1'. Un análogo de
plasminógeno activable por trombina particularmente preferido para
usar en la invención es BB-10153, como se describe
en el ejemplo 2 del documento WO 94/10318, que es un análogo de
plasminógeno en el que, respecto del plasminógeno de tipo salvaje,
los residuos aminoacídicos Pro(559), Gly (560) se sustituyen
con
Thr-Tyr-Lys-Ile-Lys-Pro,
y Val (562) se sustituye con lie para producir un bucle de escisión
escindible por trombina; y otras dos sustituciones de aminoácidos,
Glu 606 a Lys y Glu623 a Lys, sirven para impedir la unión de
antiplasmina \alpha2.
En los productos de la invención, el activador de
plasminógeno y el análogo de plasminógeno activable por trombina,
por razones de requerimientos reguladores y/o control de calidad del
producto, preferiblemente se envasan en formas de dosis unitaria,
particularmente para la inyección en bolo intravenoso separada. La
tecnología estándar para la formulación de proteínas inyectables
permite la preparación de formulaciones de dosis unitarias
adecuadas. Generalmente, la concentración de la dosis unitaria de
tPA estará en el intervalo de 0,05-1,5 mg/kg de peso
corporal, preferiblemente 0,1-0,5 mg/kg de peso
corporal y la concentración de la dosis unitaria del análogo de
plasminógeno activable por trombina generalmente estará en el
intervalo de 0,1-5 mg/kg de peso corporal,
preferiblemente 0,5-3 mg/kg de peso corporal, más
preferiblemente 2 mg/kg de peso corporal.
Generalmente, la dosis máxima del análogo de
plasminógeno activable por trombina BB-10153 no será
superior a 5 mg/kg.
Como alternativa, los productos de la invención
pueden contener dosis unitarias únicas de una mezcla de activador de
plasminógeno y de análogo de plasminógeno activable por trombina,
siempre que la tecnología de formulación usada para su preparación
asegure la estabilidad y conservación satisfactorias de los dos
componentes.
Para el tratamiento de pacientes humanos, como
terapéutica individual, en un principio el tPA se administró a una
dosis de 100 mg mediante infusión intravenosa durante 3 horas. En la
actualidad esto se ha sustituido por un régimen acelerado que
comprende una dosis en bolo intravenoso de 15 mg seguida por una
infusión intravenosa de 0,75 mg/kg de peso corporal durante un
periodo de 30 minutos (máximo 50 mg) y después una infusión de 0,5
mg/kg durante 60 minutos (máximo 35 mg) (J. Am. Coll. Cardiol.
14: 1566-1569, 1989 y N. Eng. J. Med. 329:
673-682, 1993). El tPA no es eficaz como dosis única
en bolo intravenoso, aunque recientemente se ha comunicado que es
eficaz como dos inyecciones en bolo intravenoso de 50 mg (J. Am.
Coll. Cardiol. 23: 6-10, 1994). La variante del tPA
de acción prolongada Reteplase (BM 06.022) se ha administrado en
forma de un bolo doble intravenoso de 10 millones de unidades (MU)
seguido 30 minutos después por 5 MU (Am. J. Cardiol. 72:
518-524, 1993).
La estreptoquinasa se administra como una dosis
unitaria de 1,5 millones mediante infusión intravenosa durante 1
hora.
Las dosis eficaces del activador de plasminógeno
y de los análogos de plasminógeno activables por trombina para
administración puede determinarlas el médico, basándose en el
conocimiento de las dosis actuales y la potencial reducción de la
dosis posible de tPA.
Los inventores han descubierto, en estudios con
animales, que generalmente es posible una reducción del triple o más
de la dosis de tPA con la administración complementaria del análogo
de plasminógeno activable por trombina BB-10153,
ambos agentes administrados en forma de bolo intravenoso. Sería de
esperar una reducción similar usando otros activadores de
plasminógeno. Por tanto, la administración complementaria de un
análogo de plasminógeno activable por trombina puede permitir que
los agentes activadores de plasminógeno se administren como bolo
único.
La dosis máxima de tPA en cualquier régimen
actual es de 100 mg. Mediante la administración simultánea de un
análogo de plasminógeno activable por trombina, la dosis de total
eficaz de tPA puede reducirse a 80 mg y, preferiblemente, a 70 mg,
60 mg, 50 mg, 40 mg, 35 mg, 30 mg, 20 mg o 10 mg.
Mediante la administración simultánea de un
análogo de plasminógeno activable por trombina la dosis total eficaz
de Reteplase tPA puede reducirse a 12 MU y, preferiblemente, a 10
MU, 8 MU, 7 MU, 6 MU, 5 MU, 4 MU, 3 MU, 2 MU o 1,5 MU. Una reducción
similar de la dosis total puede conseguirse para los otros "tPA de
segunda generación", incluyendo el conocido como
T103N.KHRR296-299AAAA.
Mediante la administración simultánea de un
análogo de plasminógeno activable por trombina, la dosis total
eficaz de estreptoquinasa puede reducirse a 1,2 MU y,
preferiblemente, a 1 MU, 0,8 MU, 0,7 MU, 0,6 MU, 0,5 MU, 0,4 MU, 0,3
MU, 0,2 MU o 0,15 MU.
Cuando el activador de plasminógeno y el análogo
de plasminógeno activable por trombina se administran por separado,
cada uno mediante inyección en bolo intravenoso, el orden de
administración no es crucial. Puede ser preferible administrar el
activador de plasminógeno primero, seguido por el análogo de
plasminógeno activable por trombina.
Cuando el análogo de plasminógeno activable por
trombina y los agentes tPA se administran por separado, se contempla
que el primer agente se administre 1-30 minutos,
preferiblemente alrededor de 10 minutos, más preferiblemente
alrededor de 5 minutos, después de la administración del primer
agente.
La administración del activador de plasminógeno y
del análogo de plasminógeno activable por trombina también puede
realizarse mediante infusión intravenosa, bien a partir de fuentes
separadas de los dos componentes o (de nuevo siempre que la
tecnología de formulación usada para su preparación asegure la
estabilidad y conservación de la potencia de los dos componentes)
bien a partir de una única fuente de los componentes mezclados.
La administración simultánea puede verse afectada
usando un dispositivo capaz de administrar dos sustancias de forma
simultánea. Por otro lado, también se contempla que la
administración simultánea incluya la administración del análogo de
plasminógeno activable por trombina o del tPA primero, y el otro
componente puede administrarse inmediatamente después. En este
contexto "inmediatamente" significa cualquier periodo de tiempo
hasta un minuto tras la administración del primer componente.
Alternativamente, la administración del
activador de plasminógeno o del análogo de plasminógeno activable
por trombina puede ser mediante infusión intravenosa y el otro
mediante inyección en bolo intravenoso.
Una forma de realización de la presente invención
se ilustra en el siguiente ejemplo no limitante.
El diseño, construcción, expresión y purificación
del análogo de plasminógeno activable por trombina BB10153 se
describe en el documento WO 94/10318.
BB10153 es un análogo de plasminógeno en el que
los residuos de aminoácidos Pro(559), Gly(560) se
sustituyen por
Thr-Thr-Lys-Ile-Lys-Pro,
y Val(562) se sustituye por lie para producir un bucle de
escisión escindible por trombina; otras dos sustituciones de
aminoácidos, Glu606 a Lys y Glu623 a Lys, sirven para impedir la
unión de antiplasmina-\alpha2.
Las actividades trombolíticas del tPA y del
plasminógeno activable por trombina BB-10153 se
midieron en un modelo de conejo con trombosis arterial, en el que se
induce la formación de un trombo en la arteria femoral mediante la
inserción de una bobina de cable de cobre (el cobre es un potente
estímulo de la formación de trombina). El flujo sanguíneo se
controló en la zona distal de la bobina mediante una sonda de flujo
de ultrasonidos y un aparato de medición.
Conejos macho New Zealand White de
2,5-3,0 kg se anestesiaron mediante inyección
intravenosa (vena del oído) con una dosis de carga de 35 mg/kg de
una solución de fenobarbital de 17,5 mg/ml. Una vez que la cánula
intravenosa estaba en su lugar, se infundió el fenobarbital a lo
largo del experimento a 18 mg/kg/h (velocidad de infusión 2ml/h). Se
introdujo una cánula en la tráquea del conejo anestesiado para
permitir que el animal respirara artificialmente. El CO_{2} al
final de la espiración se estableció a 6% y el aire inspirado estaba
enriquecido con oxígeno. Se introdujeron cánulas en ambas venas
yugulares, una para la infusión anestésica y la otra para las dosis
en bolo de los compuestos de prueba. Se introdujo una cánula en la
arteria carótida izquierda para registrar la presión arterial y la
frecuencia cardíaca.
La arteria femoral de ambas extremidades se
limpió de tejido adyacente asegurando que no estaba unida ninguna
rama lateral. Se realizó una laparotomía y se abrió el peritoneo por
encima de la posición donde la aorta se bifurca en las arterias
ilíacas. En la arteria femoral izquierda se colocó una sonda de
flujo (2SB Transonic) en posición distal a la arteria circunfleja
lateral y a la arteria epigástrica superficial (aproximadamente
2-3 cm distal a la epigástrica). Después se
administraron aproximadamente 5 ml de bicarbonato para corregir la
acidosis. Se tomó una muestra de sangre para comprobar el pH
(7,35-7,45) y los gases arteriales pO_{2}
(100-120 mm de Hg) y pCO_{2}
(35-45 mm de Hg). Para inducir un trombo se usó una
bobina de cobre hecha con 10 vueltas de cable de 0,5 mm de diámetro
alrededor de una aguja de 0,812 mm (21 gauge). La bobina se colocó
en la arteria femoral izquierda, justo en posición distal a la
arteria circunfleja lateral y en posición proximal a la sonda de
flujo mediante canulación de la arteria femoral derecha. Las ramas
entre la bobina y la sonda se ataron. Se usó una cánula para hacer
avanzar la bobina hacia arriba al interior de la arteria ilíaca
derecha y a continuación en la aorta donde la sangre la lleva hacia
abajo a la arteria ilíaca izquierda a la arteria femoral. Por
último, la bobina se coloca usando fórceps. El flujo sanguíneo se
monitorizó justo en posición distal a la bobina en la arteria
femoral mediante una sonda de flujo de ultrasonidos y un aparato de
medición. El flujo sanguíneo a través de la arteria femoral
izquierda se interrumpió en 5 minutos de la colocación de la bobina
en el vaso y el tratamiento comenzó 30 minutos después del cese del
flujo. Para el tratamiento combinado, primero se administró
BB-10153 como una inyección en bolo intravenoso,
seguido 5 minutos después por tPA, también administrado en forma de
bolo. Se tomaron muestras de sangre de 1,0 ml de una arteria
carótida para su análisis antes y 0,5, 1, 2, 3 y 4 horas después de
la administración del fármaco. Las muestras se anticoagularon con
3,8% p/v de citrato trisódico (1 parte en 10). Las muestras se
centrifugaron a 14.000 rev/min durante 10 minutos y después el
plasma se usó para las determinaciones de proteína hemostática
(véase Procedimientos).
El tPA (Actilyse, suministrado por Boehringer
Ingelheim) a 3 mg/kg produjo una reperfusión prolongada en 4/6
animales y periodos cortos de reperfusión en los restantes 2. El tPA
a 1 mg/kg indujo periodos significativos de reperfusión en 2/8
animales, pero no hubo reperfusión en los otros 6. El tPA a 0,3
mg/kg no indujo ninguna reperfusión significativa.
El BB-10153 no indujo reperfusión
de la arteria femoral ocluida cuando se administró a dosis de hasta
4 mg/kg.
La potencia trombolítica del tPA se incrementó de
forma significativa mediante la administración simultánea de
BB-10153. La combinación de 1mg/kg de tPA y 2 mg/kg
de BB-10153 indujo una reperfusión prolongada en 4/6
animales, una reperfusión significativa aunque más corta en 1 animal
y varios periodos cortos de flujo en 1. Este patrón fue similar al
producido por 3 mg/kg de tPA. La combinación de 0,3 mg/kg de tPA y 2
mg/kg de BB-10153 indujo periodos sustanciales de
flujo en 3/4 animales.
El aumento de la potencia trombolítica del tPA
mediante la administración simultánea de BB-10153 no
se acompañó de un aumento significativo de la generación sistémica
de plasmina. El tPA a 3 mg/kg produjo una marcada generación
sistémica de plasmina como puso de manifiesto la reducción del nivel
de antiplasmina-\alpha2 plasmática
(\alpha2-PI) a menos del 20% del control y la
reducción del nivel plasmático de fibrinógeno a aproximadamente el
25% del control. El tPA a 1 mg/kg redujo los niveles de
\alpha2-PI y de fibrinógeno a alrededor del 60% y
del 75% del control, respectivamente. El BB-10153 a
2 mg/kg no tuvo ningún efecto sobre los niveles plasmáticos de
\alpha2-PI y de fibrinógeno. La combinación de 1
mg/kg de tPA y 2 mg/kg de BB-10153 sólo produjo un
incremento menor de la actividad sistémica de plasmina en
comparación con el producido por 1 mg/kg de tPA solo.
El tPA a 0,3 mg/kg tuvo poco efecto sobre los
niveles de \alpha2-PI y de fibrinógeno y esto no
varió con la combinación trombolítica de 0,3 mg/kg de tPA y 2 mg/kg
de BB-10153.
Todas las determinaciones se realizaron en un
coagulómetro ACL300R de Instrumentation Laboratories; el
coagulómetro estaba provisto de un PC con el software necesario
(software de Investigación). Todos los reactivos y equipos para las
pruebas de coagulación fueron suministrados por Instrumentation
Laboratories.
Antiplasmina \alpha2 El ensayo se llevó
a cabo usando el equipo estándar suministrado para el coagulómetro y
los datos establecidos por defecto para la prueba de
antiplasmina.
Fibrinógeno Se usó una modificación del
procedimiento de Clauss (Clauss. A, Acta Haematol. 17:
237-1957). Se creó una curva de calibración usando
plasma de calibración (el recíproco de la concentración de
fibrinógeno frente a al tiempo de coagulación). El plasma para las
curvas de calibración se obtuvo de Instrumentation Laboratories
(IL). Las concentraciones fueron 2,95, 1,475, 0,98, 0,7375, 0,59 y
0,295 g/l (diluciones de la inicial son inicial, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5
y 1:10). El fibrinógeno en las muestras de sangre de prueba se
determinó a partir de la curva de calibración usando los resultados
del ensayo del tiempo de trombina (véase más adelante). Los análisis
de los datos se llevaron a cabo en un PC usando el software de
Investigación suministrado por IL para el coagulómetro ACL 300R.
Tiempo de trombina Se usó un equipo
estándar con la modificación de que la trombina se preparó con 100
mmol de CaCl_{2} hasta una concentración de 3 NIHU/ml. El ensayo
se llevó a cabo usando el modo investigación (es decir ciclo de
coagulación 1), los volúmenes de la muestra y reactivo 75 \mul,
tiempo de activación 180 segundos, intervalo entre ciclos 1 segundo,
tiempo de adquisición 300 segundos, velocidad 1200 rpm. El análisis
se realizó usando el Path mett.def (S/rx10. S4.S4. umbral
(3,50)).
Claims (6)
1. Un producto que contiene
un activador de plasminógeno de la clase que
escinde directamente el plasminógeno para generar actividad
trombolítica de tipo plasmina o que forma un complejo con
plasminógeno provocando cambios conformacionales que permiten que el
complejo escinda las moléculas de plasminógeno para liberar plasmina
y
un análogo de plasmina de la clase que se puede
activar con trombina para dar actividad de plasmina y que contiene
la secuencia con el sitio de escisión
P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',
donde P3 es un residuo aminoácido básico, P4 es un residuo
aminoácido hidrófobo y P1' y P2' son de forma independiente un
residuo aminoácido no ácido, siendo ese sitio escindible por
trombina entre la Arg y la P1',
para su uso simultáneo, por separado o secuencial
como tratamiento trombolítico.
2. El uso de un análogo de plasminógeno de la
clase que se puede activar con trombina para dar actividad de
plasmina y que contiene la secuencia con el sitio de escisión
P4-P3-Pro-Arg-P1'-P2',
donde P3 es un residuo aminoácido básico, P4 es un residuo
aminoácido hidrófobo y P1' y P2' son de forma independiente un
residuo de aminoácido no ácido, siendo ese sitio escindible por
trombina entre la Arg y el P1' , en la preparación de un agente para
reducir el riesgo de hemorragia en un paciente sometido a
tratamiento trombolítico con un activador de plasminógeno que
escinde directamente el plasminógeno para generar actividad
trombolítica de tipo plasmina o que forma un complejo con
plasminógeno provocando cambios conformacionales que permiten al
complejo escindir moléculas de plasminógeno para liberar
plasmina.
3. Un producto según la reivindicación 1, en el
que el activador de plasminógeno es tPA.
4. Un producto según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el análogo de plasminógeno es
BB-10153.
5. El uso según la reivindicación 2, en el que el
activador de plasminógeno es tPA.
6. El uso según la reivindicación 2 o la
reivindicación 5, en el que el análogo de plasminógeno es
BB-10153.
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