SE466531B - Farmaceutisk produkt innehaallande urokinas och pro-urokinas - Google Patents

Description

l0 l5 20 25 30 35 466 531 2 av ett medel för potentiering av den trombolytiska effekten av pro-UK.

Med "synergistisk effekt" menas en fibrinpropplyserande aktivitet som är större (antingen vad gäller ökad snabbhet hos lyseringen eller större grad av lysering eller bådadera) än vad som kunde förväntas från den additiva effekten av de två aktiva medlen när dessa administreras oberoende av varandra.

Urokinas kan användas antingen i den lågmolekylära formen (LMW-UK, MW N 33 000 dalton) eller den högmolekylära formen (HMW-UK, MW N 55 000 dalton), av vilka HMW-formen är föredragen. UK kan fås från naturliga källor (t.ex. urin) eller fås genom rekombinanta DNA-tekniker inbegripande klyvning av den initialt bildade enkelkedjiga formen (pro-UK), såsom rapporterats av W.E. Holmes et al, Bio/Technology 2 923 (1985). I-iMW-UK är kommersiellt tillgänglig som Ukidan (reg. varumärke) eller Actosolv (reg. varumärke), LMW-UK som Abbokinase (reg. varumärke).

På liknande sätt kan pro-UK erhållas från urin, såsom ursprungligen beskrivits i Europa-patentet 40238, eller från kulturer av naturliga cellinjer eller cellinjer transformerade med rekombinant DNA-teknik och kan fås i former som varierar vad gäller glykosyleringsgrad eller i andra avseenden.

Den pro-UK som används enligt uppfinningen kommer normalt att vara human pro-UK, som har den aminosyrasekvens som visas för pro-UK i Figur A i Europa-patentansökan 92182, med ignorering av försekvensen från -20 till -l.

Den pro-UK som används enligt uppfinningen kan dock skilja sig från denna struktur genom substitution, utelämnande eller tillfogande vid en eller flera aminosyrarester, så länge som denebibehåller väsentligen samma biologiska aktivitet. Sålunda faller exempelvis en icke-human pro-UK eller en förening som beskrivs i PCT-patentansökan WO 86/04351, som har en annan aminosyra i stället för Lys-l35 och/eller Phe-l57, eller såsom beskrivs i Europa-patent- ansökan 200 451, som har substitioner eller utelämnanden vid Phe-l57 eller LyS-l58, inom ramen för definitionen av "pro-UK" så länge som den bibehåller biologisk aktivitet. Vidare ingår stympade former av pro-UK, exempelvis såsom beskrivs av Rijken et al i Thrombosis Research _12 749-760 och 761-768, i definitionen av "pro-UK" så länge som biologisk aktivitet bibehålls. Sådana molekyler kan ha sin amino-terminal vid Lys-l36, motsvarande enkelkedjig LMW-UK, eller vid andra lämpliga sites, exempelvis Ala-l32, Lys-IM och Glu-l50. Sådana former av pro-UK, som har ytterligare aminosyror, exempelvis en initial metionin, ingår också om de är aktiva.

På liknande sätt kan den UK, som används vid uppfinningen, skilja sig på motsvarande sätt från endera av de två normala humana UK-molekylerna (HMW-UK och LMW-UK) så länge som de bibehåller sin biologiska aktivitet. l0 l5 20 25 30 35 4 6 6 5 3 'l 3 Bland patienter, som får speciell nytta av uppfinningen, ingår post- operativa patienter, patienter som nyligen drabbats av myokardinfarkt med proppbildning, och patienter som lider av djupa ventromboser. Pro-UK och UK, separat eller tillsammans, blandas med någon farmaceutiskt godtagbar bärar- substans, t.ex. koksaltlösning och administreras parenteralt, antingen intra- venöst eller genom injektion till påverkade artärer eller hjärtat. intravenös administrering, som är att föredra, kan ske genom infusion, genom en bolusinjektion eller genom en kombination av dessa.

Patienten ges också företrädesvis heparin, exempelvis en bolusinjektion om 5000 I.U. heparin före administrering av PUK eller UK, eventuellt följt av infusion av 1000 I.U./h av heparin. Heparinet kan också ges i form av en blandning med pro-UK eller UK eller som en blandning av alla tre kompo- nenterna.

Den föredragna mängd UK, som används vid förfarandet enligt uppfin- ningen, är från 100 000 I.U. till 300 000 I.U., mera föredraget från 150 000 I.U. till 250 000 I.U., speciellt 200 000 I.U. Den föredragna mängden använd pro-UK är mindre än 6 500 000 I.U., mera föredraget från 2 000 000 I.U. till 4 000 000 I.U.

Den ovannämnda mängden UK är effektivast när den administreras som en bolusinjektion 15 minuter eller mindre före administreringen av pro-UK. För att förenkla administreringen kan det dock vara föredraget att administrera en blandning av pro-UK och UK i en enda injektion eller infusion, företrädesvis som en enda bolusinjektion. Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen tillhanda- hålles därför en farmaceutisk komposition innefattande en blandning av UK och pro-UK tillsammans med ett farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel eller dito bärare eller en blandning av UK och pro-UK i ren lyofiliserad form.

Komponenterna i den synergistiska blandningen enligt uppfinningen kan också föreligga i form av tvillingförpackning, dvs. som en enda förpackning innehållande separata enhetsdoser av UK och pro-UK tillsammans med instruk- tioner för concomitant administrering.

Kompositionen är företrädesvis i huvudsak ren, dvs. att den inte innehåller någon väsentlig mängd av något annat farmaceutiskt aktivt material än UK och pro-UK. Mera föredraget är att kompositionen är analytiskt ren, dvs. att den inte innehåller något annat protein än UK och pro-UK i någon mängd, som är detekterbar med analysmetoder tillgängliga vid tidpunkten för denna ansökan. När ett spädningsmedel eller en bärare finns närvarande är denna företrädesvis sterilt vatten för injektion eller steril isotonisk koksaltlösning.

Viktförhållandet mellan UK och pro-UK i kompositionen enligt uppfin- 10 15 20 25 30 35 466 551 4 ningen är företrädesvis från 1:40 till l:6,7, mera föredraget 1:20 till 1:10, speciellt 1:15 till 1:10. Kompositionen är företrädesvis beredd i enhetsdos- former, t.ex. ampuller för injektion eller flaskor för infusion, vardera innehållande 100 000 - 300 000 I.U. av UK och 2 000 000 - 4 000 000 LU. av pro- UK, mera föredraget 200 000 I.U. av UK och 2 000 000 - 3 000 000 I.U. av pro- UK.

En sådan enhetsdosform innehåller en kombinerad total dosering av UK och pro-UK från 2 100 000 till 4 300 000 I.U., motsvarande ungefärligen 21- 43 mg protein. Mängderna av varje förening är sålunda mycket lägre än den mängd, som krävs för optimal propplysering vid användning i frånvaro av den andra vid samma terapeutiska kur.

Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen ges patienten en bolus- injektion av UK och en bolusinjektion av pro-UK, följt av en infusion av pro-UK.

Den givna mängden UK som bolus är såsom beskrivits ovan, dvs. företrädesvis 100 000 - 300 000 I.U., mera föredraget 150 000 - 250 000 LU., speciellt 200 000 I.U. Mängden pro-UK given som bolus är företrädesvis 300 000 - 1 000 000 I.U., mera föredraget 400 000 - 600 000 I.U., speciellt 500 000 LU. Dessa mängder kan administreras som tvâ separata bolusinjektioner, givna i godtycklig ordning, eller från en dubbelspruta, eller som en enda bolusinjektion av en blandning av UK och PUK, vilket representerar en ytterligare komposition enligt uppfin- ningen.

Viktförhållandet mellan UK och pro-UK i denna komposition är företrädesvis från 1:10 till 1:1, mera föredraget 1:4 till l:1,6, speciellt 1:2,5.

UK administreras dock företrädesvis innan man ger någon pro-UK.

Det kan också vara önskvärt att administrera heparin tillsammans med bolusen av UK och/eller pro-UK. Den mängd heparin, som skall sättas till de ovan angivna mängderna av UK, pro-UK eller UK/pro-UK-blandning, är företrädesvis från 1000 till 10 000 I.U., mera föredraget cirka 5000 I.U.

Den mängd pro-UK, som ges som en efterföljande infusion, är företrädesvis ungefär 100 000 I.U./minut, som kan ges under ungefär 40 minu- ter, dvs. totalt 4 000 000 I.U. I många fall kan öppning av den tilltäppta artären ske inom 30 minuter eller till och med mindre, och infusionen kan avbrytas efter denna tid om man kan fastställa arteriell öppning genom exempelvis koronar- angiografi.

För användning vid denna aspekt av uppfinningen tillhandahålles en sats omfattande en enhetsdos UK för injektion, en enhetsdos av pro-UK för injektion och en enhetsdos av pro-UK för infusion. Satsen presenteras företrädesvis i en enkelförpackning och med instruktioner för administreringen. Enhetsdosformer- 10 15 20 25 30 35 466 551 5 na för injektion kan vara sterila lösningar av UK eller pro-UK i rent vatten eller i fysiologisk koksaltlösning, eller också kan de vara i lyofiliserad eller i frystorkad fast form, till vilken sterilt vatten eller koksaltlösning sätts före injektionen. Enhetsdosformen av pro-UK för infusion kan vara en lösning i fysiologisk koksaltlösning eller i andra sterila vattenhaltiga medier för infusion, eller också lyofiliserad eller frystorkad fast substans eller ett vätskekoncentrat, från vilket en infusionslösning kan beredas. Lösningen för injektion eller infusion kan innehålla andra komponenter, exempelvis buffertsalter som NazHPO4/Nai-lzPOg och konserveringsmedel, t.ex. mannitol och humant albumin, och dessa komponenter kan också ingå i de lyofiliserade eller frystorkade fasta formerna.

Mängden av UK och pro-UK i enhetsdosformerna för injektion är företrädesvis såsom beskrivits ovan, speciellt 200 000 I.U. av UK och 500 000 I.U. av pro-UK. Mängden pro-UK i enhetsdosformen för infusion är företrädes- vis 3 000 000 - 5 000 000 I.U., mera föredraget 4 000 000 I.U.

Kombinationen av lågdos-UK (200 000 I.U.) och lågdos-pro-UK (3 000 000 I.U.) kan åstadkomma effektiv trombolys i större delen av fallen med myokardinfarkt. För att uppnå samma grad av framgång med enbart UK skulle det vara nödvändigt med doseringar av 2 000 000 till 2 500 000 I.U., och vid denna dosnivå återfinner man biverkningar såsom systemisk fibrinogenolys och förlust av plasminogen. För att uppnå samma resultat med enbart PUK skulle det vara nödvändigt med doseringar klart över 6 500 000 I.U., exempelvis 9 000 000 I.U. Dessa resultat visar en synergistisk samverkan mellan UK och pro-UK vid propplysering.

Mängderna av vardera föreningen uttrycks häri antingen som vikt (mg) eller som internationella enheter (IU), baserat på International Reference Preparation of UK vid test på standardfibrinplatta (Brakman, Fibrinolysis, f.

Standarized Fibrin Plate Method and a Fibrinolytic Assay of Plasminogen, Scheltema år l-lolkema NV, Amsterdam, 1967, sid. l-24). Pro-UK testas efter aktivering av plasmin såsom beskrivs i Gurewich et al., J. Clin. Invest. (1984) 7_3, sid. 1731-1739. UK (både l-IMW- och LMW-formerna) och pro-UK gav liknande specifika aktiviteter (cirka 100 000 IU/mg), så att proteinkoncentra- tionerna kunde jämföras (l IU = 10 ng protein).

Eftersom UK är bekvämt tillgängligt i ampuller innehållande 250 000 I.U., så kan en dosering av 250 000 I.U. av UK ersätta den på 200 000 I.U., där denna anges i föreliggande beskrivning och exempel. Användningen av en dos på 250 000 I.U. undviker svårigheterna med att uppskatta 4/5 av en ampull och ger samma gynnsamma effekter som dosen om 200 000 I.U. 10 15 20 25 30 35 466 551 EXEMPEL 1 En 58-årig kvinna, som led av myokardinfarkt, fick en bolusinjektion av 200 000 LU. urokinas i.v. följt av en bolusinjektion av 1 000 000 I.U. prourokinas och en infusion av prourokinas med en dosering av 5,5 miljoner I.U./h. Partiell perfusion uppnåddes efter 15 minuter och fullständig perfusion efter 30 minuter, dvs. efter det att totalt 3 250 000 I.U. pro-UK hade administrerats. 24 h efter administreringen var perfusionen fortfarande fullständig.

EXEMPEL 2 En manlig patient, som led av myokardinfarkt, fick en blandning av 200 000 I.U. urokinas och 2 500 000 I.U. pro-UK infuserat under loppet av 15 minuter. Efter denna tid hade man uppnått fullständig perfusion.

EXEMPEL 3 - Doseringsformer a) Blandning för injektion 200 000 I.U. UK och 2 000 000 I.U. pro-UK löses i 20 ml steril isotonisk koksaltlösning och förpackas i en ampull för injektion. b) Lyofiliserad blandning En lösning av 200 000 I.U. UK och 3 000 000 I.U. pro-UK lyofiliseras och den fasta återstoden förseglas i en ampull, till vilken koksaltlösning för injektion kan sättas. c) Dubbelspruta Ena behållaren i den förförpackade sprutan innehåller 200 000 I.U. UK i 10 ml steril isotonisk koksaltlösning och den andra innehåller 3 000 000 I.U. pro- UK i 10 ml steril isotonisk koksaltlösning. d) Tvillingförpackning En tvillingförpackning omfattar en ampull innehållande 200 000 I.U. UK i lyofiliserad form och en ampull innehållande 3 000 000 I.U. pro-UK i lyofiliserad form, tillsammans med instruktioner för concomitant administre- ring.

EXEMPEL 4 Doseringsformerna i Exempel 3 bereds även med användning av 500 000 I.U. pro-UK i stället för 2 000 000 eller 3 000 000 I.U. pro-UK.

EXEMPEL 5 Vid öppna, prospektiva kliniska multicenterprövningar användes följande protokoll: Kriteria för att ingå 1) smärta, karaktäristisk för myokardial infarkt med minst 30 minu- ters varaktighet 2) symptomen börjar mindre än 5 h innan den. lytiska terapin l0 15 20 25 30 35 466 551 påbörjas 3) EKG-data karaktäristiska för myokardinfarkt 4) medgivande från patienten.

Kriterier för uteslutning l) kontraindikationer för koronarangiografi 2) kontraindikationer för lytisk terapi a) påbörjad terapi med heparin eller kumarin b) venös eller arteriell perforering inom de senaste 8 dagarna c) cerebrovaskulär incident inom de senast två månaderna d) aktiv blödning e) magsår eller duodenalsår inom det senaste året f) kirurgiskt ingrepp inom de senaste 8 dagarna g) hemorragisk diates 3) ofullständig blockering av koronarartär (påvisat genom koronar- angiografi) 0) partiell eller fullständig reperfusion efter administrering av nitroglycerin 5) hjärtrelaterat koma 6) allvarlig hjärtklaff- eller hjärtsjukdom, hypertropisk kardiomyo- pati 7) allvarlig njur- eller leversjukdom, som skulle kunna påverka pro- urokinasexkretionen 8) användning av orala antikonceptionsmedel.

Procedur Patienter som uppfyller ovanstående kriterier för att medtas ges 5000 I.U. heparin och koronarangiografi utförs. Om en total arteriell blockering observeras ges l00-200 pg nitroglycerin intrakoronalt och man utför upprepad angiografi av det blockerade kärlet. Om ingen öppning observeras efter administrering av nitroglycerin ges patienten 200 000 I.U. HMW-urokinas i en intravenös bolusinjektion, följt av 500 000 I.U. pro-urokinas i.v. i en bolusinjek- tion under 3 minuter. Omedelbart därefter utförs intravenös infusion av 4 000 000 I.U. pro-UK under loppet av 40 minuter. Koronarangiografi utförs med 15 minuters intervaller för att övervaka fortskridandet av propplyseringen, med upprepning 60 minuter efter framgångsrik lysering och även 21+ h och 3 veckor efter behandlingen för att kontrollera eventuell återocklusion. 466 551 Resultat Av 19 patienter som behandlats enligt detta protokoll uppvisade 14 (74%) återöppning eller patens av den ockluderade artären efter 40 minuters infusion. Av dessa uppvisade tvâ återocklusion efter 214 h.

Claims (10)

10 15 20 25 g 466 551 PATENTKRAV

1. Produkt innehållande urokinas (UK) och pro-urokinas (pro-UK) som kombinerat preparat för samtidig, separat eller Sekventiell användning som trombolytiskt medel.

2. Produkt enligt patentkravet 1, kännetecknad av att doseringen av UK är från 100.000 till 300.000 I.U., företrädesvis från 150.000 till 250.000 I.U., och doseringen av pro-UK är mindre än 6.500.000 I.U., företrädesvis från 2.000.000 till 4.000.000 I.U.

3. Produkt enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknad av att UK är anordnat att administreras som en bolusinjektion före en injektion eller infusion av pro-UK.

4. Farmaceutisk komposition innefattande en blandning av UK och pro-UK tillsammans med ett farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel eller dito bärare, eller en blandning av UK och pro-UKi ren lyofiliserad form.

5. Komposition enligt patentkravet 4, kännetecknad av att viktförhållandet mellan UK och pro-UK är från 1:40 till 126,7, företrädesvis från 1:15 till 1:10.

6. Enhetsdosform av en komposition enligt patentkravet 4 eller 5, kännetecknad av att den innehåller 100.000 till 300.000 I.U av UK och 2.000.000 till 4.000.000 I.U. av pro-UK.

7. Komposition enligt patentkravet 4, kännetecknad av att viktförhållandet mellan UK och pro-UK är från 1:4 till 111,6.

8. Enhetsdosform av en komposition enligt patentkravet 7, kännetecknad av att den innehåller 150.000 - 250.000 I.U. av UK och 400.000 - 5 4 6 6 5 .73 'l 19 600.000 I.U. av pro-UK.

9. Enhetsdosform enligt patentkravet 8, kännetecknad av att den dessutom innehåller 1.000 till 10.000 I.U. heparin.

10. Användning av UK för framställning av ett medel fór potentiering av den trombolytiska effekten av pro-UK. x n v