NL8503097A - Geneesmiddel met thrombolytische werking. - Google Patents

Description

t ' ,,J,.

>' * ' t

Br/ws/40

Geneesmiddel met thrombolytische werking

De uitvinding betreft een geneesmiddel met thrombolytische werking, dat een synergische combinatie van bekende thrombolytische agentia bevat.

Het is bekend dat bepaalde enzymatische 5 stoffen, die plasminogeenactivatoren worden genoemd, na intraveneuze toediening aan mens of dier een thrombolytische werking in vivo kunnen uitoefenen. De werking berust op een activering van in het bloed aanwezig plasminogeen, waardoor een keten van reacties op 10 gang wordt gebracht, die ten slotte leidt tot oplossen (lysis) van een fibrinehoudend bloedstolsel dat zich in de bloedbaan bevindt. Het totale werkingsmechanisme is gecompliceerd en kan onderlinge verschillen vertonen, afhankelijk van de soort plasminogeenactivator die 15 gebruikt wordt. Er dient namelijk onderscheid te worden gemaakt tussen twee typen plasminogeenactivator, te weten een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) en een plasminogeenactivator van het urokinase-type (u-PA), terwijl laatstgenoemd type aan de hand van de 20 molecuulvorm nog te onderscheiden is in een 2-ketenvorm (hierna aangeduid als urokinase) en een 1-ketenvorm (hierna aangeduid als scu-PA). Het werkingsmechanisme van deze drie plasminogeenactivatoren is verschillend.

25 Een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) kan wel een activering van plasminogeen veroorzaken, maar nagenoeg alleen bij aanwezigheid van fibrine. Dit betekent dat de activering hoofdzakelijk plaatsvindt in de nabijheid van bloedstolsels, die 30 daardoor worden opgelost, terwijl practisch geen activering van het plasminogeen in het stromende bloed plaatsvindt. Een dergelijke plasminogeenactivator 8503037 • V » f -2- reageert niet met antisera tegen plasminogeenactivatoren van het urokinase-type.

De 2-ketenvorm van u-PA (aangeduid als urokinase) levert een doeltreffende activering van 5 plasminogeen in het bloed, zowel bij aanwezigheid van fibrine als zonder fibrine. Dit betekent dat bloedstolsels kunnen worden opgelost, maar dat ook een activering van het gehele fibrinolytische systeem in het bloed optreedt, hetgeen tot fibrinogeen-afbraak en tot 10 een zekere bloedingsneiging kan leiden.

De 1-ketenvorm van u-PA (aangeduid als scu-PA), activeert plasminogeen doeltreffend, maar alleen bij aanwezigheid van fibrinehoudende bloedstolsels. Evenals bij de t-PA'vindt derhalve geen activering van 15 het fibrinolytische systeem in het stromende bloed plaats, al is het werkingsmechanisme anders en al is scu-PA immunologisch niet met t-PA verwant.

Van de drie soorten plasminogeenactivatoren wordt urokinase reeds lang in de geneeskundige praktijk 20 toegepast, waarbij de genoemde nevenwerking als bezwaar wordt gevoeld. De beide andere soorten plasminogeenactivator -verkeren nog in het stadium van klinische proefnemingen, die in het geval van t-PA ver gevorderd zijn.

25 Bij voortgezet onderzoek is nu gevonden, dat t-PA en scu-PA, alsook t-PA en urokinase, bij gezamenlijke toediening aan mens of dier een synergisch effect in vivo vertonen, dat wil zeggen een thrombolytische werking die groter is dan de werking van 30 de agentia afzonderlijk. Dit betekent dat met kleinere doses dan voorheen eenzelfde of grotere thrombolytische werking kan worden verkregen, hetgeen een besparing aan kostbare agentia oplevert. Tevens betekent het dat de vooral bij urokinase optredende nevenwerking (activering 35 van het fibrinolytische systeem in het bloed en afbraak van fibrinogeen) geheel of in verregaande mate kan worden vermeden.

De uitvinding verschaft daarom in de eerste 8503097 -3- plaats een geneesmiddel met thrombolytische werking, dat gekenmerkt is doordat het een combinatie van een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) met een plasminogeenactivator van het urokinase-type (u-PA) 5 bevat. Dit komt derhalve neer op een combinatie van t-PA met scu-PA, of een combinatie van t-PA met urokinase.

Verder verschaft zij een werkwijze voor het bereiden van een dergelijk geneesmiddel, welke gekenmerkt 10 is doordat men t-PA en u-PA in een geschikt excipiens of geschikte excipientia combineert. Bij voorkeur heeft het resultaat van deze werkwijze de vorm van een intraveneuze infusievloeistof of een combinatie van infusievloeistoffen.

15 Het in het geneesmiddel volgens de uitvinding te gebruiken t-PA kan elke gebruikelijke soort t-PA zijn en kan uit elke geschikte bron zijn gewonnen. Bij de navolgende proeven is t-PA gebruikt dat uit een geconditioneerd medium van een melanoomcellijn werd 20 gewonnen, maar ook recombinant-t-PA, afkomstig uit getransformeerde bacteriën zal bruikbaar zijn.

Het te gebruiken urokinase, dat meestal uit urine wordt gewonnen, is normaal in de handel verkrijgbaar.

25 Het te gebruiken scu-PA kan in principe uit diverse bronnen, zoals weefselkulturen, urine, plasma en dergelijke afkomstig zijn, maar wordt bij voorkeur gewonnen uit het cultuurmedium van geconditioneerde celculturen of uit getransformeerde bacteriën.

30 Voor de isolatie en zuivering van de plasminogeenactivatoren uit hun media staan diverse methoden ter beschikking, die meestal neerkomen op chromatografie in trappen.

De beide typen plasminogeenactivator (t-PA 35 en u-PA) kunnen op elke geschikte wijze met elkaar worden gecombineerd. Hoewel het mogelijk is, de combinatie als een 2-componentensysteem ter beschikking te stellen, zal men bij voorkeur toch een 1-componentensysteem bereiden, waarbij de beide plasminogeenactivatoren met elkaar in 8503037 • ' » -4- een gezamenlijk excipiens worden gecombineerd. Het excipiens kan elk voor dit doel gebruikelijk medium zijn.

De verhouding tussen t-PA en u-PA in het middel volgens de uitvinding kan sterk variëren, bij 5 voorbeeld in het algemeen tussen 1:10 en 10:1. Bij voorkeur wordt een gewichtsverhouding tussen 1:2 en 2:1 toegepast.

Het verkregen geneesmiddel heeft bijvoorkeur de vorm van een intraveneuze infusievloeistof of een 10 combinatie van intraveneuze infusievloeistoffen, aangezien deze vorm de beste kans op doeltreffende resultaten biedt.

De toe te passen dosis van t-PA en u-PA bij het toedienen van het geneesmiddel aan een 15 thrombosepatient, kan dankzij de synergische werking van beide agentia aanzienlijk lager zijn dan bij gebruik van de agentia afzonderlijk. Bij voorkeur bedraagt zij 10 - 20 % van de effectieve dosis bij afzonderlijk gebruik van t-PA en u-PA.

20 De uitvinding wordt nader verduidelijkt door de volgende proeven, die de invloed van t-PA, urokinase en scu-PA, alsmede combinaties daarvan op een kunstmatig bij dieren opgewekte thrombus aangeeft.

Proeven 25 Bij verdoofde witte konijnen (Nieuw

Zeeland-type) met een lichaamsgewicht van 2,4 + 0,3 kg, werd de vena jugularis externa over een afstand van 4 cm blootgelegd. Met behulp van vastklemmen werd een segment afgebakend, waarvan het volume werd gemeten.

30 Vervolgens werd in het lege bloedvatsegment 0,1 ml thrombine (100 NIH-eenheden per ml) ingebracht, gevolgd door vers bloed met 10-20 ul menselijk fibrinogeen dat met radioactief jodium gemerkt was. De hoeveelheid bloed kwam overeen met het gemeten volume van het bloedvatsegment.

35 In het bloedvat vormde zich een bloedstolsel, dat 30 minuten mocht verouderen voordat de klemmen werden weggenomen. Door metingen werd de hoeveelheid radioactiviteit in het stolsel bepaald.

$593097 -5-

Via een ader in het oor werden vervolgens diverse thrombolytische agentia ingebracht en wel t-PA., urokinase, scu-PA en combinaties daarvan. De infusie duurde steeds 4 uren. 30 minuten daarna werd het 5 thrombushoudende bloedvatsegment na sluiting van de einden verwijderd en werd de overgebleven hoeveelheid radioactiviteit gemeten. De mate van thrombolyse werd berekend als het procentuele verschil tussen de oorspronkelijke en de overgebleven radioactiviteit in het 10 bloedvatsegment.

Een isotopenbalans werd gemaakt door de radioactiviteit in het verwijderde bloedvatsegment en in het stromende bloed aan het eind van het experiment op te tellen. De verkregen waarde werd uitgedrukt in 15 procenten van de oorspronkelijke radioactiviteit in het bloedstolsel. De radioactiviteit in de schildklier en longen bleek verwaarloosbaar te zijn.

Tijdens het inbrengen van de thrombolytische agentia, als ook daarvoor en daarna werden voortdurend 20 bloedmonsters genomen, die werden onderzocht op radioactiviteit en op het gehalte aan fibrinogeen en antiplasmine, alsmede het gehalte aan t-PA en scu-PA.

Voor nadere details over de opzet van de proeven wordt verwezen naar D. Collen et al., J. Clin.

25 Invest., 73, (1983) 368 - 376. Het bij de proeven gebruikte t-PA was door zuivering verkregen uit het geconditioneerde cultuurmedium van een melanoom-cellijn, zoals beschreven door D. Rijken et al., J.Biol.Chem.

256, (1981), 7035-7041, en D. Collen et al., Thromb.

30 Haemost. 48, (1982), 294-296. Het urokinase was uit de handel afkomstig en het scu-PA was verkregen uit het geconditioneerde medium van een long-adenocarcinoom-cellijn, zoals beschreven door D.C. Stump et al., Thromb.Haemost., 54^ (1985) 122.

35 De resultaten van de proeven zijn weergegeven in de navolgende tabel, waarbij de gegeven waarden het gemiddelde van drie experimenten aangeven. In de controlegroepen, die uitsluitend een oplosmiddel kregen o ς 0 " *ί ?· 7 Q ~J *j J j -6- toegediend, was de gemiddelde mate van thrombolyse 9+1.

Oit de tabel blijkt, dat de systemische infusie van t-PA, urokinase of scu-PA tot thrombolyse leidde, waarbij de mate van thrombolyse afhankelijk van 5 de dosis was. Tevens blijkt dat het toedienen van urokinase in een thrombolytische dosis met een aanzienlijke fibrinogeen-afbraak gepaard ging.

Gelijktijdige toediening van t-PA en scu-PA leverde een overeenkomstige mate van thrombolyse bij veel 10 lagere dosés. Gelijktijdige toediening van t-PA en urokinase had ook een synergisch effect op de thrombolyse, maar tussen urokinase en scu-PA werd geen synergie waargenomen. Geen van de gecombineerde infusies leidde tot systemische fibrinogeen-afbraak.

15 Hieruit blijkt, dat er een duidelijjk synergisch effect, wat betreft de thrombolyse in vivo tussen t-PA en scu-PA en ook tussen t-PA en urokinase optreedt. Combinaties van deze agentia in doses, die slechts 10% tot 20% van de thrombolytische dosis van elk 20 agens afzonderlijke bedragen, leveren reeds een gelijk of groter thrombolytisch effect.

8503097 ( -7-

TABEL

Dosis (mq/kq)_ t-PA scu-PA Urokinase Thrombolyse Isotoopbalans Pibrinogeen- (%) (%) gehalte _ (%) 0 0 0 9 + 1 99 + 3 92 + 11 0,05 0 0 14+1 97+2 113+5 0.125 0 0 24+2 89+1 105 + 5 0.25 0 0 32+1 89+2 93 + 1 0.50 0 0 57+6 83+1 101 + 3 0 0.20 0 13+1 94+1 92 + 12 0 0.50 0 21+1 94+3 97 + 3 0 1.0 0 31+1 90+1 92+2 0 0 0.2 12+1 99+2 101 + 5 0 0 0.5 15 + 2 94 + 2 95 + 5 0 0 1.0 23+1 95+1 91+7 0 0 2.0 44+3 98+5 37+26 0.025 0.05 0 15+1 97+1 101 + 2 0.05 0.10 0 23+1 96+4 99+3 0.1 0.2 0 51+10 88+4 106 + 1 0.025 0 0.1 17+2 94+3 96 + 5 0.05 0 0.2 27+2 90+2 100 + 4 0.10 0 0.4 39+7 93+1 102+1 0 0.1 0.2 17+2 93+1 99+8 0 0.2 0.4 25+2 92+1 102+2 95 Q 3 Ö 9 7

Claims (10)

1. Geneesmiddel met thrombolytische werking, gekenmerkt doordat het als werkzaam bestanddeel een combinatie bevat van een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) met een plasminogeenactivator van het 5 urokinasetype (u-PA).

2. Geneesmiddel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het geneesmiddel een combinatie bevat van een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) met de 1-ketenvorm van een plasminogeenactivator van het 10 urokinasetype (scu-PA).

3. Geneesmiddel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het geneesmiddel een combinatie bevat van een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) met de 2-ketenvorm van een plasminogeenactivator van het 15 urokinasetype (urokinase).

4. Geneesmiddel volgens conclusie 1-3, met het het kenmerk, dat de gewichtsverhouding van t-PA tot u-PA in het geneesmiddel tussen 1:10 en 10:1 ligt.

5. Geneesmiddel volgens conclusie 4, met het 20 kenmerk, dat de gewichtsverhouding van t-PA tot u-PA in het geneesmiddel tussen 1:2 en 2:1 ligt.

6. Geneesmiddel volgens conclusie 1-5, met het kenmerk, dat het geneesmiddel de vorm heeft van een infusievloeistof of een combinatie van 25 infusievloeistoffen.

7. Werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel met thrombolytische werking, met het kenmerk, dat men een plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) combineert met een 30 plasminogeenactivator van het urokinasetype (u-PA) in een geschikt excipiens of geschikte excipientia.

8. Werkwijze ter behandeling van thrombo-embolie, met het kenmerk, dat men voor patiënten lijdend aan thrombo-embolie behandelt met een combinatie 35 van t-PA en u-PA.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het 8503097 -9- . f kenmerk, dat de gewichtsverhouding van het toegediende t-PA en het toegediende u-PA tussen 1:10 en 10:1 ligt.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, met 5 het kenmerk, dat het t-PA en u-PA worden gebruikt in doses die circa 10-20% van de effectieve thrombolytische doses bij afzonderlijk gebruik van t-PA en u-PA bedragen. 8503097