DK164640B - Farmaceutisk praeparat med thrombolytisk aktivitet og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 164640 B

Den foreliggende opfindelse angår et thrombolytisk aktivt farmaceutisk præparat, som indeholder en synergis-tisk blanding af kendte thrombolytiske midler og en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne præparater.

5 Det er kendt, at visse enzymer, de såkaldte plas- minogen-aktivatorer, er i stand til at udøve thrombolytisk aktivitet in vivo som følge af intravenøs indgift til mennesker eller dyr. Deres aktivitet baseres på aktivering af plasminogen, en .iblodbestanddel, som for sin del initie-10 rer en kæde af reaktioner, resulterende i opløsning (lysis) af fibrinholdige blodpropper, når sådanne propper er til stede i blodkarret. Den totale aktiveringsmekanisme er temmelig kompleks og er meget forskellig, afhængig af den type plasminogen-aktivator som anvendes.

15 Der skelnes mellem to typer plasminogen-aktivatorer, nemlig plasminogen-aktivatorer af vævstype (t-PA) og plasminogen-aktivatorer af urokinasetype (u-PA). Med hensyn til den sidste skelnes der yderligere mellem en tokædet form (betegnet urokinase) og en enkædet form (betegnet 20 scu-PA). Aktivitetsmekanismerne for disse tre plasminogen-aktivatorer er forskellige.

En plasminogen-aktivator af vævstype (t-PA) er i stand til at forårsage aktivering af plasminogen, men næsten udelukkende ved tilstedeværelse af fibrin. Dette be-25 tyder at aktiveringen hovedsagelig sker i nærheden af en blodprop, som opløses derved, mens så godt som ingen aktivering af plasminogen sker i det cirkulerende blod. En sådan plasminogen-aktivator reagerer ikke med antisera mod plasminogen-aktivatorer af urokinasetype.

30 Den tokædede form af u-PA (betegnet urokinase) for årsager en effektiv aktivering af plasminogen i blod, både ved tilstedeværelse og fravær af fibrin. Dette betyder, at blodpropper kan opløses, men også at der sker en aktivering af det fibrinolytiske system i det cirkulerende 35 blod, hvilket fører til fibrinogen-nedbrydning og en tendens til blødning.

Den enkædede form af u-PA (betegnet scu-PA) vil kun 2

DK 164640 B

aktivere plasminogen effektivt ved tilstedeværelsen af fibrinholdige blodpropper. På samme måde som med t-PA vil der ikke ske aktivering af det fibrinolytiske system i det cirkulerende blod til trods for den kendsgerning, at 5 aktiveringsmekanismerne er forskellige, og at scu-PA immunologisk ikke er beslægtet med t-PA.

Af disse tre plasminogen-aktivatorer har urokinase allerede længe været anvendt i medicinsk praksis, og de angivne bivirkninger har vist sig at være en hæmsko der-10 ved. De to andre plasminogen-aktivatorer er stadig i det kliniske forsøgsstade, selv om forsøgsarbejdet er relativt fremskredent i tilfældet t-PA.

Ved forskning har det nu vist sig, at t-PA og scu-PA og også t-PA og urokinase har synergistisk effekt in 15 vivo, dvs. en højere thrombolytisk aktivitet end aktiviteten af de enkelte midler, når de tilføres samtidig til mennesker eller dyr. Dette indebærer, at der kan opnås en ækvivalent eller større thrombolytisk aktivitet med mindre doser end tidligere anvendt, hvilket således medfører, 20 at man sparer kostbare midler. Det indebærer yderligere, at bivirkningerne, som hovedsagelig sker i forbindelse med urokinase (aktivering af det fibrinolytiske system i blod og nedbrydning af fibrinogen), i det store og hele kan undgås.

25 Opfindelsen er baseret på disse opdagelser. I en udførelsesform tilvejebringer den et thrombolytisk aktivt farmaceutisk præparat indeholdende en synergistisk blanding af plasminogen-aktivator (t-PA) af vævstype og plas-minogen-aktivator af urokinasetype (u-PA) som aktive be-30 standdel. En sådan blanding kan enten være en blanding af t-PA og scu-PA eller en blanding af t-PA og urokinase.

I en anden udformning tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af et thrombolytisk aktivt farmaceutisk præparat, hvor man blander plasminogen-35 aktivator af vævstype (t-PA) og plasminogen-aktivator af urokinasetype (u-PA) med en eller flere farmaceutisk acceptable excipienter. Det fremkomne præparat kan have 3

DK 164640 B

enhver egnet form, men er fortrinsvis i form af et intravenøst infusionsfluid eller en blanding af sådanne infusionsfluider.

Den plasminogen-aktivator af vævstype, der anven-5 des kan være en hvilken som helst slags t-PA, der er opnået ud fra passende kilde. I de eksperimenter der skal beskrives, udvandtes den anvendte t-PA fra- det konditionerede medium af en melanomcellelinie, men rekombinant t-PA afledt fra transformerede bakterier eller celler vil 10 også være egnet.

Den anvendte urokinase opnås normalt ud fra urin og vil være kommercielt tilgængelig.

Den scu-PA der anvendes, kan i princippet opnås ud fra flere kilder, såsom vævskultur, urin, plasma og lig-15 nende, men fortrinsvis udvindes den fra kulturmediet af konditionerede cellekulturer eller transformerede bakterier .

Der findes flere metoder til isolering og rensning af plasminogen-aktivatorer fra deres-medier. Sådanne 20 metoder indebærer sædvanligvis kromatografi i mange trin.

De to typer plasminogen-aktivator (t-PA og u-PA). kan blandes på enhver passende måde. Selv om det er muligt at tilvejebringe blandingen som et tokomponent system, foretrækkes det at frembringe et enkomponent system, i 25 hvilket begge plasminogen-aktivatorer blandes med hinanden i en almindelig excipient. Excipienten kan være et medium, der er traditionelt eller egnet til formålet.

Vægtforholdet mellem t-PA og u-PA i præparatet i-følge opfindelsen kan variere bredt, fx sædvanligvis mel-30 lem 1:10 og 10:1. Der anvendes fortrinsvis et vægtforhold mellem 1:2 og 2:1.

Farmaceutiske præparater indeholdende en blanding af plasminogen-aktivatorer kan have enhver form, der er egnet til indgift til mennesker eller dyr. Det foretræk-35 kes imidlertid, at sådanne præparater har form af en intravenøs- infusionsvæske eller en blanding af infusionsvæsker, da denne form giver bedst mulighed for gode re- 4

DK 164640 B

sultater. Sådanne infusionsfluider eller andre præparatformer kan fx indeholde ca. 0,2 mg/ml plasminogen-aktiva-tor, selv om koncentrationer fra 0,05 mg/ml til 10 mg/ml sædvanligvis er mulige. Ydermere kan præparater med en 5 højere koncentration af plasminogen-aktivator, op til 100%, gøres tilgængelige, forudsat at de fortyndes til førnævnte område før anvendelse.

De doser af t-PA og u-PA, der skal anvendes, når det farmaceutiske præparat gives til en thrombose-patient 10 kan være væsentlige lavere end krævet for hvert middel alene, på grund af den synergistiske effekt af de to midler. Almindeligvis vil sådanne doser være 5-30% og fortrinsvis 10-20%, af den effektive dosis af t-PA og u-PA, der anvendes alene. Opfindelsen belyses ved følgende 15 ikke-begrænsende forsøg.

Forsøg I

Dette forsøg viser effekten af flere plasminogen-2q aktivatorer og blandinger deraf på en eksperimentel thrombose •der er fremkaldt i kaniner.

I bedøvede hvide kaniner (New Zealand type) der vejede 2,4+3,0 kg dissekeredes den ydre halsblodåre i en længde af 4 cm. Et segment af åren isoleredes ved 25 hjælp af karklemmer, og dets volumen bestemtes. Der indførtes 0,1 ml thrombinopløsning (100 NIH-enheder/ml) i det tømte segment efterfulgt af frisk blod blandet med 10-20 μΐ humant fibrinogen mærket med radioaktivt jod.

Mængden af blod svarede til det forudbestemte rumfang 3Q af karsegmentet. En blodprop der dannedes i karret, fik lov at ældes i 30 minutter inden karklemmerne fjernedes.

Derpå bestemtes mængden af radioaktivitet i karsegmentet.

Derefter tilførtes flere thrombolytiske midler, nemlig t-PA, urokinase, scu-PA og blandinger deraf til 25 kaninerne ved infusion via en marginal ørevene. Til dette formål fortyndedes passende mængder af midlerne med en fysiologisk saltopløsning til et slutrumfang på 20 ml.

5

DK 164640 B

Infusionerne fortsattes over en periode på 4 timer. 30 Minutter derefter sammensyedes karsegmentet indeholdende thromben ved begge ender og fjernedes, hvorpå den tilbageværende radioaktivitet bestemtes. Graden af-thrombolyse 5 beregnedes som den procentvise forskel mellem den oprindelige radioaktivitet og den tilbageværende radioaktivitet i blodkarsegmentet.

Der blev foretaget en isotopbalance ved at addere radioaktiviteten i det fjernede karsegment og radioaktivi-10 teten i det cirkulerende blod ved slutningen af forsøget og udtrykke den fremkomne værdi i procent af den oprindelige radioaktivitet i karsegmentet. Radioaktiviteten i skjoldbruskkirtlen og i lungerne var ubetydelig.

Under infusionen af de thrombolytiske midler, og 15 også før og efter den periode, blev der taget flere blodprøver til måling af radioaktivitet, fibrinogenindhold, d2-antiplasminindhold og indhold af t-PA og scu-PA.

For yderligere detaljer af den eksperimentelle model henvises der til D. Collen et al., J.Clin.Invest.

20 7JL' ( 1983), 368-376. Den i disse forsøg anvendte t-PA opnåedes ud fra det konditionerede cellekulturmedium af en melanomcellelinie, som beskrevet af D.C. Rijken et al., J.Biol.Chem., 256 (1981), 7035-7041 og D. Collen et al., Thromb.Haemost. j[8 ( 1982), 294-296. Urokinasen var fra en 25 kommerciel kilde, og scu-PA opnåedes ud fra det konditionerede medium af en lungeadenokarcinomcellelinie som beskrevet af D.C. Stump et al., Thromb.Haemost. 5j4 ( 1985), 122.

Resultaterne af dette forsøg fremgår af tabel 1, 30 i hvilken de rapporterede værdier fremkommer som gennemsnittene af tre prøver. I kontrolgrupperne der kun modtog opløsningsmidler, var den gennemsnitlige grad af thrombo-lyse 9+1%.

Af tabellen fremgår det at thrombolyse påvirkedes 35 af systemisk infusion af t-PA, urokinase eller scu-PA, og at graden deraf var dosisafhængig. Desuden fremgår det at indgift af urokinase i thrombolytiske doser er forbundet 6

DK 164640 B

med omfattende fibrinogennedbrydning.

Samtidig indgift af t-PA og scu-PA bevirkede en sammenlignelig grad af thrombolyse ved meget lavere doser. Samtidig indgift af t-PA og urokinase havde, også en syn-5 ergistisk effekt på thrombolyse, men der observeredes ingen synergi mellem urokinase og scu-PA. Ingen af de blandede infusioner fremkaldte systemisk f ibr-inogen-ned-brydning.

Dette viser at der eksisterer en tydelig synergis-7 0 tisk effekt mellem t-PA og scu-PA og også mellem t-PA og urokinase med hensyn til thrombolyse in vivo. Blandinger af disse midler i doser af kun 10-20% af de thromboly-tiske doser af hvert middel for sig fremkalder allerede en ækvivalent eller større thrombolytisk effekt. Synergi 15 observeredes ved vægtforhold af t-PA til u-PA mellem 1:10 og 10:1 og var mest markant ved vægtforhold mellem 1:2 og 2:1.

20 25 30 35

Tabel 1 7

DK 164640 B

Dosis, mq/kg_ t-PA scu-PA Urokinase Thrombo- Isotop Fibrino- lyse, % genvin- genniveau, 5 _ ___ding,% ~ %_ 000 9+1 99+3 92+11 0,05 0 0 14+1 97+2 113+5 0,125 0 0 24+1 89+1 105+1 10 0,25 0 0 32+1 89+2 93+1 0,50 0 0 57+6 83+1 101+3 0 0,20 0 13+1 94+1 92+12 0 0,50 0 21+1 94+3 97+3 15 0 1,0 0 31+1 90+1 92+2 0 0 0,2 12+1 99+2 101+5 0 0 0,5 15+2 94+2 95+5 0 0 1,0 23+1 95+1 91+7 20 0 0 2,0 44+1 98+5 37+26 0,025 0,05 0 15+1 97+1 101+2 0,05 0,10 0 23+1 96+4 99+3 0,1 0,2 0 51+10 88+4 106+1 25 0,025 0 0,1 17+2 94+3 96+5 0,05 0 0,2 27+2 90+2 " 100+4 0,10 0 0,4 39+7 93+1 102+1 30 0 0,05 0,1 11+2 95+1 88+14 0 0,1 0,2 . 17+2 93+1 99+8 0 0,2 0,4 25+2 92+1 102+2 0,012 0,10 0 18+2 98+2 100+1 35 0,050 0,025 0 28+2 98+1 92+3 0,10 0,025 0 27+2 90+2 81+4 0,012 0,20 0 24+1 94+1 99+6 0,025 0 0,20 29+3 96+1 98+1 40 0,038 0 0,30 49+7 93+1 96+9 0,050 0 0,10 25+7 94+3 106+5 45

Forsøg II

3

DK 164640 B

Dette forsøg viser den thrombolytis-ke effekt af synergistiske blandinger af plasminogen-aktivatorer i humane patienter med akut hjerteinfarkt og kranspulsåre-5 tillukning-(okklusion).

Ved alle patienter udførtes selektivt højre og venstre koronar arteriografi fra den højre brachiale arterie. Dernæst tilførtes en blanding af t-PA og u-PA (scu-PA eller urokinase) fortyndet med fysiologisk salt-10 vand til et slutrumfang på 100 ml ved intravenøs infusion i løbet af 60 minutter. Arteriografi af den tillukkede kranspulsåre blev gentaget med 15 minutters mellemrum, eller når der viste sig tegn på reperfusion. Der blev opsamlet blodprøver på citrat og fibrinogen blev be-15 stemt umiddelbart deri. Resultaterne er samlet i tabel 2 hvor overskrifterne af kolonnerne 3 og 4 har følgende betydning: tid (1), tidsinterval mellem begyndende symptomer og start på·infusionen, 20 tid (2), tidsinterval fra start af infusion til reperfusion.

Reperfusion defineres som en fuldstændig opfyldning af det koronare kar fjernt fra den oprindelige tillukning inden for et tidsrum af 3 kardiale perioder.

25 I et første forsøg tilførtes en blanding af 10 mg t-PA og 300.000 IE urokinase til fire patienter med akut koronar okklusion (tabel 2A). For tre af de fire patienter opnåedes reperfusion efter henholdsvis 46, 50 og 53 minutter. Den fjerde patient reagerede ikke overfor den-30 ne infusion og var også resistent mod intrakoronar streptokinase. Ingen af patienterne havde komplikationer i forbindelse med infusionen. Den samlede indgift af t-PA og urokinase fremkaldte ikke en systemisk lytisk tilstand hos nogen af patienterne, hvilket fremgik af de uforandrede 35 niveauer af fibrinogen.

9

DK 164640 B

Ved et andet forsøg tilførtes en blanding af 10 mg t-PA og 10 mg scu-PA intravenøst i løbet af en time til syv patienter med akut koronar tillukning (tabel B).

Der blev opnået en stabil koronar reperfusion for fem pa-5 tienter og en forbigående reperfusion for én patient (nr. 4), mens den sidste patient (nr. 5) ikke reagerede overfor infusionen. Ligesåvel fremkaldte den samlede infusion ikke fibrinogen nedbrydning her.

Det kan konkluderes ud fra tabel 2, at en samlet 10 indgift af t-PA og u-PA til humane patienter vil fremkalde en effektiv grad af thrombolyse ved doser, der er væsentlig mindre end de, der normalt anvendes for hver af midlerne alene.

15 20 25 30 35

Tabel 2 10

DK 164640 B

Patient køn/alder Tid (1) Tid' (2) Fibrogen- timer minut_ niveauet,% 5 A. 10 mg t-PA og 300.000 IE urokinase 1 M/64 4,5 Ingen 100 2 M/63 4,0 50 100 3 F/62 3,7 46 100 10 4 M/69 4,6 53 100

B. 10 mg t-PA og 10 mg scu-PA

1 M/66 1,8* 23 88 2 M/60 5,6 30 94 15 3 M/65 5,7 60 100 4 M/69 2.4 24 108 5 M/58 6,0 Ingen 115 6 M/70 3,0 60 92 20 7 M/51 5,5 45 93 25 30 35

Claims (10)

1. Farmaceutisk præparat med thrombolytisk aktivitet, kendetegnet ved at det indeholder en synergis-tisk blanding af plasminogen-aktivator af vævstype (t-PA) 5 og plasminogen-aktivator af urokinasetype (u-PA) som aktiv bestanddel sammen med en eller flere farmaceutisk acceptable excipienter dertil.

2. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved at den synergistiske blanding er en blanding 10 af en plasminogen-aktivator af vævstype (t-PA) med en en-kædet plasminogen-aktivator, af urokinasetype (scu-PA).

3. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved at den synergistiske blanding er en blanding af plasminogen-aktivator af vævstype (t-PA) med en 15 tokædet plasminogen-aktivator af urokinasetype (urokinase) .

4. Farmaceutisk præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegn e^t ved at det indeholder t-PA og u-PA i et vægtforhold mellem 1:10 og 20 10:1, fortrinsvis i et vægtforhold mellem 1:2 og 2:1.

5. Farmaceutisk præparat ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved at præparatet har form af en intravenøs infusionsvæske eller en blanding af infusionsvæsker.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et thromboly- tisk aktivt farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at man blander en plasminogen-aktivator af vævstype (t-PA) med en plasminogen-aktivator af urokinasetype (u-PA) i en eller flere farmaceutisk acceptable excipien-30 ter.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at man blander plasminogen-aktivatoren af vævstype (t-PA) med en enkædet aktivator af urokinasetype (scu-PA).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet 35 ved at man blander plasminogen-aktivatoren af vævstype (t-PA) med en tokædet plasminogen-aktivator af urokinasetype (urokinase). DK 164640 B

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved at man blander t-PA og u-PA i et vægtforhold mellem 1:10 og 1011, fortrinsvis i et vægtforhold mellem 1:2 og 2:1.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kra vene 6-9, kendetegnet ved at man giver præparatet form af en intravenøs infusionsvæske-eller en blanding af intravenøse infusionsvæsker. 10 15 20 25 30 35