SE462829B - Trombolytiskt aktiva kompositioner innehaallande en modifierad plasminogenaktivator av vaevnadstyp samt en normal human t-pa, streptokinas eller humant urokinas - Google Patents

Description

462 829 2 10 15 20 25 30 35 bolys kräver doser om 80 till 100 mg. De höga erforderliga do- serna kan vara relaterade till det förhållandet, att t-PA snabbt avlägsnas fràn cirkulationen genom levern, och halveringstiden för nativt t-PA hos människan är endast nagra minuter EGarabedian et al. 1986, Am. J. Cardiol. 58, sid 673-6791. Den 1 korta halveringstiden gör det även nödvändigt att administrera- aktivatorn som en kontinuerlig infusion under loppet av flera “ timmar i stället för som en lämpligare och snabbare bolus- injektion.

Försök har därför gjorts för att framställa plasminogen- aktivatorer med hög fibrinaktivitet och fibrinselektivitet även med utsträckt halveringstid i blodet. Det förväntas att sådana plasminogenaktivatorer kommer att vara effektiva vid lägre doser än som närvarande användes med avseende pà t-PA och att bolus- injektion kan användas i stället för infusion.

Genetiskt modifierade varianter av t-PA med utsträckt hal- veringstid har framställts genom rekombinant-DNA-teknik [publicerade ansökningarna EP 297066 och 242836 och interna- tionella patentansökningen FCT nummer WO 87/047221. Djurtest med sàdana modifierade t-PA-molekyler har visat att långsammare av- lägsnande från cirkulationen är förenad med en effektivare trom- bolys ECollen et al. 1988, Blood 71, 216-219;].

När emellertid varianterna testas in vitro med avseende pà förmàga att lysera humanblodproppar är aktiviteten förenad med en markerad fördröjningsfas [Kalyan et al. 1988, J. Biol. Chem. 263, 3971-3978]. Detta reducerar variantens aktivitet och för- länger lystiden, vilket sålunda motverkar fördelarna med högre halveringstid in vivo.

Definitioner I föreliggande framställning användes den plasminogenakti- vatornomenklatur som föreslagits vid XXVIII-mötet av den Inter- nationella Kommittéen beträffande trombos och hemostas, Bergamo, Italien, 2? juli 1982. Plasminogenaktivatorn av vävnadstyp (t-PA) och plasminogenaktivator av urokinastyp (uPA). Uttrycken "normalt t-PA” eller "t-PA" användes i föreliggande framställ- ning för att beskriva humant t-PA av full storlek med den amino- syrasekvens som kan deduceras fràn den cDNA som beskrives av Pennica et al. 1983, Nature, 301, 214-221. Beredningar av nor- 10 15 20 25 30 35 462 829 I malt uppträdande t-PA har visat sig uppvisa tre olika N-termi- nala aminosyrarester. Den längsta formen (L-formen) har glycin (Gly) som första rest, medan de korta (S-formen) eller uterina (U-formen) formerna har serin (Ser) och valin (Val) som N-termi- nala aminosyrarester. Alla dessa olika former av t-PA har normal t-PA:s karakteristika. Uttrycket “t-PA-varianter" anger olika former av normal t-PA, vilka modifierats för att minska det snabba avlägsnande som är karakteristiskt för normal t-PA.

BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Det har nu visat sig, att tillsatsen av små mängder normal (rekombinant eller icke-rekombinant) t-PA, u-PA eller strepto- kinas till modifierade t-PA-beredningar eliminerar fördröjnings- fasen i den trombolytiska aktiviteten av dessa föreningar, och den resulterande aktiviteten förhöjes till nivån för normal t-PA. Med hänsyn till den väsentligt utsträckta halveringstiden för modifierade t-PA-molekyler in vivo medför den förbättrade aktiviteten av blandningen en väsentlig synergistisk effekt och skapar därigenom en snabbare och effektivare trombolytisk effekt än endera av föreningarna tagna var för sig.

Föreliggande uppfinning baserar sig på observationen, att t-PA-varianter, vilka modifierats för att förhöja halverings- tiden in vivo, uppvisar en fördröjningsfas med avseende pà den trombolytiska aktivitetens insättande. I kontrast härtill upp- visar normal t-PA, streptokinas eller urokinas ej sådan fördröj- ningsfas. Denna fördröjningsfas observeras ej om mutantmateri- alet blandas med en mindre andel normal t-PA, urokinas eller streptokinas. När dessa ämnen är närvarande i mängder, vilka ej medför signifikant trombolys enbart (subtrombolytiska koncentra- tioner) är aktiviteten för t-PA-varianterna ej kopplad till en väsentlig fördröjningsfas. Dessutom har det befunnits, att prop- par som inkuberats med laga koncentrationer normal t-PA och se- dan tätas och ånyo inkuberas med t-PA-varianten snabbt lyseras på samma sätt som när varianten och normal t-PA inkuberas till- sammans.

Detta antyder att en tromb kan "primas" med en injektion av normal t-PA och sedan effektivt lyseras genom en andra injek- tion av en t-PA-variant med utsträckt plasmahalveringstid. Med sådan kombinationsbehandling kan den trombotiska patienten 462 829 10 15 20 25 30 35 "primas" med en säker, subtrombolytisk injektion av t-PA, u-PA eller streptokinas redan före ankomsten till sjukhuset, där yt- terligare infusioner med en effektiv t-PA-mutant kan fullstän- diggöra den trombolytiska behandlingen. Fördelarna med ovan an- given kombinationsterapi är att en kortare tid erfordras från behandlingens igàngsättning till lysen av tromben. Speciellt när det gäller akut myokaridal infarkt är snabb trombolys väsentlig för en myokardial räddning. En annan fördel med kombinationsbe- handlingen, endera om de två ämnena användes i en blandning eller om de användes separat, är att effektiv trombolys kan upp- nàs vid en totaldos, som är väsentligt lägre än den dos av t-PA som för närvarande användes.

Uppfinningen baserar sig pà ovan beskrivna rönt Enligt en sida av uppfinningen åstadkommas en trombolytiskt aktiv farmako- logisk komposition innefattande en synergistisk kombination av t-PA eller u-PA eller streptokinas som sidokomponent och en- fibrinolytiskt aktiv t-PA-variant som huvudkomponent, före- trädesvis i blandning med en farmaceutiskt acceptabel excipient.

Enligt en annan sida av uppfinningen åstadkommas ett för- farande för framställning av en trombolytiskt aktiv farmaceutisk komposition innefattande en kombination av t-PA eller u-PA eller streptokinas som mindre komponent och en fibrinolytiskt aktiv variant av t-PA som huvudkomponent i en farmaceutiskt acceptabel excipient eller excipienter. Den erhållna farmaceutiska komposi- tionen kan ha vilken som helst lämplig form men föreligger före- trädesvis i form av ett intravenöst infusions- eller injektions- fluid.

Den mindre komponenten som är t-PA, u-PA eller streptoki- nas kan vara av vilket som helst konventionellt slag erhållen från någon lämplig källa. Vid häri beskrivna experiment erhålles t-PA från det konditionerade mediet av en melanomcellinje och streptokinaset härrör från en naturlig stam av streptococcus, men t-PA, u-PA eller streptokinas härledda från naturliga källor eller fràn genetiskt processade eukaryota eller prokaryota cel- ler är lika användbart.

Huvudkomponenten i kombinationsbehandlingen är en plas- minogenaktivator, företrädesvis en modifierad t-PA-variant, som karakteriseras av längre halveringstid in vivo och av en för- dröjningsfas med avseende på trombolytisk aktivitet in vitro i 10 15 20 25 30 35 5 462 829 jämförelse med normal t-PA. t-PA-varianterna i de experiment som kommer att beskrivas produceras genom rekombinantteknik i mammalieceller, men vilken som helst plasminogenaktivator med ovan angivna karakteristika erhàllen från naturliga källor eller från genetiskt processade eukaryota eller prokaryota celler är även användbar. Beträffande detaljer avseende användbara t-PA- -varianter för användning i kompositionen enligt föreliggande uppfinning hänvisas till publicerade Europapatentansökningen nr.297066. aktiva plasminogenaktivatorer av vävnadstyp, vilka har längre I nämnda Europapatentansökan beskrives fibrinolytiskt halveringstid in vivo. Hela innehållet i nämnda patentansökan införlivas häri genom referensen därtill. Huvuddragen hos däri beskrivna varianter är sammanställda nedan.

De t-PA-varianter som avslöjas i publicerade Europapatent- -ansökningen 297066 är att förutom tillväxtfaktordomänen (G-domänen) även första kringeldomänen (Kl-domänen) avlägsnats.

Dessutom har plasminogenaktivatorn enligt uppfinningen modifi- erats i en eller flera av följande säten eller regioner: sätena för aminosyraresterna 177, 184, 277 och 448 och fingerdomänen (F-domänen) om den är modifierad är helt eller delvis utesluten.

Det är föredraget att F-domänen eventuellt avlägsnats, och att glykosyleringssätet vid resten 184 modifierats för att för- hindra glykosylering därstädes. Det är speciellt föredraget att båda sätena 184 och 448 modifierats så att glykosylering för- hindras vid nämnda säten.

I föreliggande framställning är med avseende pà modifika- tion av glykosyleringssätena 184 och 448 modifikationen sådan, att ingen glykosylering uppträder. Sätet ifråga modifieras så- lunda så att N-glykosylering förhindras genom modifiering av konsensussekvensen för N-glykosylering.

I en speciellt föredragen utföringsform har F-domänen helt avlägsnats och aminosyrorna vid sätena 184 och 448 modifierats så att glykosylering förhindras vid dessa säten.

I en sàdan plasminogen aktivator är det föredraget, att den ytterligare modifikationen gjorts vid sätet för aminosyra- resten 277, och sådan modifikation kan föreligga i en sådan form att förändringen leder till en aminosyrarest, som i sin sido- kedja ej uppvisar en positiv laddning. Ett exempel pà en sådan modifikation är utbyte av lysinresten vid 277-position mot en 462 829 6 10 15 20 25 30 35 valinrest.

Vid en annan föredragen utföringsform har den ytterligare modifikationen gjorts i Kl-domänen, endera som den enda modifi- kationen av moklekylen förutom modifikationen av tillväxtfaktor- domänen eller i kombination med modifikation av sätet för amino- syraresten 277.

Vid ytterligare en utföringsform har modifikationen av molekylen gjorts vid sätet för aminosyraresten 184, varigenom N- -glykosylering vid nämnda säte, som sker i normal t-PA, ej längre kan uppnås. I en sådan modifikation vid 184-sätet kan dess asparaginrest vara ersatt med en glutaminrest.

Förutom nämnda modifikationer vid aminosyrasätena 184 och 277 är det även föredraget att modifiera K1-domänen, eventuellt i kombination med en modifikation av F-domänen.

Samtliga dessa modifikationer av de olika domänerna kan bestå i uteslutning av en del av eller hela respektive domäner.

Ett flertal förfaranden för rening av t-DA, u-PA , str- eptokinas och t-PA-mutanter är tillgängliga. Vanligen användes ett antal kromatografiska steg.

Viktförhållandet mellan sekundärkomponenten och huvudkom- ponenten i kombinationsbehandlingen kan variera, men sidokompo- nenten är alltid mindre än 50 viktprocent av den totalt givna dosen. Det föredragna viktförhållandet för den mindre komponen- ten är ca 5 till ca 30 % av totaldosen, och ett speciellt före- draget intervall är ca 10 till ca 20 %.

Farmaceutiska kompositioner innehållande en blandning av komponenterna eller innehållande komponenterna separat kan vara vilken som helst form lämplig för administration på människa.

Den föredragna formen är en intravenös injektions- eller infu- sionsfluid eller en kombination av sådana fluida. Sådana fluida kan innehålla de aktiva substanserna i en koncentration av 0,1 till 10 mg/ml.

De totala doserna för kombinationsbehandlingen såsom be- skrivits vid föreliggande uppfinning för administration pà en trombotisk patient kan vara väsentligt lägre än vad som erford- ras för t-PA eller u-PA var för sig. Tack vare den reducerade fördröjningsfasen i aktivitet inducerar kombinationen snabbare och effektivare trombolys än om t-PA-varianten användes för sig.

Sammanfattningsvis avser sålunda uppfinningen en tromboly- 10 15 20 25 30 35 7 462 829 tiskt aktiv komposition innefattande i kombination en modifierad plasminogenaktivator av vävnadstyp (modifierad t-PA) som huvud- komponent och normal human t-PA, streptokinas eller humant uro- kinas som mindre komponent i en farmaceutiskt acceptabel exci- pient.

Det är föredraget att sekundärkomponenten utgör upp till ca 30 % av den kombinerade vikten av nämnda två komponenter. När i framställningen refereras till “huvudkomponent" och “sekundär komponent" är meningen den, att huvudkomponenten utgör mer än 50 viktprocent av den kombinerade vikten av nämnda komponenter, medan den sekundära komponenten utgör mindre än 50 viktprocent av nämnda kombinerade vikt.

I en sådan trombolytiskt aktiv komposition enligt uppfin- ningen är det speciellt föredraget att använda en kombination av modifierad t-PA och normal human t-PA.

Uppfinningen innefattar även ett förfarande för framställ- ning av en trombolytiskt aktiv komposition, och nämnda förfaran- de innebär åtgärden att kombinera en modifierad plasminogenakti- vator av vävnadstyp (modifierad t-PA) som en huvudkomponent och normal human t~PA, streptokinas eller humant urokinas som sekun- där komponent i en farmaceutiskt acceptabel excipient.

Uppfinningen innefattar vidare ett förfarande för behand- ling av trombotisk störning, vilket förfarande innefattar admi- nistration på en patient som lider av sådan störning en trombo- lytiskt effektiv mängd av den komposition som beskrives ovan.

Enligt ett alternativt förfarande för behandling av trom- botisk störning innefattas följande steg: a) administration på en patient som lider av sådan störning genom en ursprunglig injektion normal t-PA, streptokinas eller humant urokinas i en mängd av upp till ca 30 mg; och sedan b) administration på samma patient genom en andra injektion en trombolytiskt effektiv mängd av en modifierad t-PA.

Slutligen avser uppfinningen en medicinsk kit eller för- packning för användning vid behandling av trombotiska stör- ningar, vilken kit eller förpackning innehåller: a> normal human t-PA, streptokinas eller humant urokinas i en mindre mängd i en farmaceutiskt acceptabel excipient; b) en modifierad t-PA i en trombolytiskt effektiv mängd i en farmaceutiskt acceptabel excipient; och 462 829 ' B 10 15 20 25 30 35 lc) skrivna instruktioner för simultan eller konsekutiv admi- nistration av kompositionen under a) och b) i nämnda ordning på en patient som lider av sådan störning.

I en sådan medicinsk kit eller förpackning är det föredra- get, att komponenten a) innehåller upp till ca 10 mg, såsom ca 1 till ca 10 mg aktiv beståndsdel, och komponent b) innehåller upp till ca 50 mg, såsom ca 10 till ca 50 mg, aktiv beståndsdel.

Uppfinningen kommer att illustreras ytterligare i det föl- jande genom icke inskränkande konkreta exempel, vilka är helt exemplifierande och ej bör tolkas inskränkande på omfattningen av föreliggande uppfinning såsom den definieras i bilagda patentkrav. Denna illustration göres i anslutning till bilagda ritningar, där: Fig. 1 visar upplösningen av en human plasmapropp in vitro som en funktion av tiden. Reaktionen igångsättes genom tillsats av 500 ng/ml normal human (melanom) t-PA (t-PA) eller 500 ng/ml av t-PA-varianten K2(Gln)P.

Fig. 2 visar den trombolytiska effekten in vitro av t-PA (50 ng/ml), t-PA-varianten K2(Gln)P (450 ng/ml), den beräknade summan av aktiviteten av de två föreningarna och den experimen- tellt funna aktiviteten av de två föreningarna i blandning.

Fig. 3 visar den trombolytiska aktiviteten in vitro av 500 ng/ml streptokinas (SK), 500 ng/ml av t-PA-varianten K2(Gln)P och en blandning av de två innehållande 100 ng/ml SK och 400 ng/ml K2(Gln)P.

Fig. 4 visar den trombolytiska aktiviteten in vitro av t- PA-varianten K2(Gln)P verkande på en human blodpropp, som först inkuberats med normal t-PA (50 ng/ml) i 30 minuter ("primad“), sedan tvättats och överförts till den andra lösningen innehål- lande 500 ng/ml av t-PA-varianten. Den trombolytiska aktiviteten bestämdes även efter det att proppen förinkuberats i frånvaro av t-PA (“ej primad").

Fig. 5 visar den trombolytiska aktiviteten in viga i ka- niner av 2 mg t-PA, t-PA-varianten K2(G1n)P och en 1:4-blandning av t-PA och K2(Gln)P. De experimentella betingelserna anges i detalj i Exempel 4. 10 15 20 25 30 35 462 829 Exempel 1 Detta experiment visar effekten av en låg koncentration av t-PA på den trombolytiska aktiviteten in vitro av en t-PA-mutant.

Använd t-PA erhålles från humana melanomceller. t-PA-variantmolekylen, kallad “K2(Gln)P", är en deletionsmutant, som skiljer sig från den normala humana t-PA-molekylen på föl- jande sätt. Resterna nr 6-173 är avlägsnade och Asn177 och Asn184 är utbytta mot Ser respektive Gln. Denna mutant uppvisar en halveringstid in vivo i plasma av ca 50 minuter vid test i kaniner. Motsvarande värde för normalt t-PA är ca 3 minuter.

Konstruktionen av expressionsvektorer och expressionen av t-PA- mutanter, såsom "K2(Gln)P" i mammalieceller har beskrivits i patentansökningen EP 297066.

Chandlers loopcirkulationssystem användes för att bestämma de trombolytiska egenskaperna in vitro av t-PA, "K2(Gln)P" och kombination. Med avseende på detaljer beträffande procedurerna hänvisas till C. Mattsson et al., Thrombosis Research 21, (1981) 535-545. rades, blandades med 1251-fibrinogen och fylldes pà ett Tygon I korthet uttogs humanblod i natriumcitrat, centrifuge- plaströr. Plasmat rekalcifierades med CaCl2 och rörändarna an- slöts till bildning av en cirkel. Det cirkulära röret roterades på ett lutande roterbord i 24 timmar så att proppen bildades före tillsatsen av de olika plasminogenaktivatorerna. Prover uttogs från röret och undersöktes med avseende på radioaktivitet med jämna mellanrum, och den från proppen utgående radioaktivi- teten uttrycktes som % propplys.

Resultaten av sådana experiment utförda med t-PA och "K2(Gln)P" visas i Fig. 1 resp. 2. Det framgår att t-PA induce~ rat trombolys omedelbart efter injektion, medan i fallet "K2(Gln)P“ aktiviteten uppvisar en markerad fördröjningsfas och i huvudsak ingen aktivitet kan iakttas inom en timme. Genom kom- bination av en låg dos av t-PA (50 ng/ml) med 450 ng/ml K2(Gln)P elimineras emellertid en stor del av fördröjningsfasen hos t-PA-varianten (Fig. 3). Den aktivitet som erhålles för bland- ningen (expr. t-PA + K2(Gln)P) är signifikant högre än som kan beräknas från aktiviteten av de två föreningarna var för sig, vilket framgår av kurvan “calc. t-Pa + K2(Gln>P“. l 10 462 829 10 15 20 25 30 35 Exempel 2 Detta experiment visar, att fördröjningsfasen av tromboly- tisk aktivitet in gitgg beträffande t-PA-varianten kan elimine- ras om blodproppen först underkastas små mängder t-PA. Tromben kan sålunda "primas" medelst t-PA och därefter effektivt lyseras med en t-PA-variant, som har utsträckt halveringstid gg ligg.

Experimentet utföres på samma sätt som enligt Exempel 1 med föl- jande undantag. Plasmapropparna inkuberades först i 1 timme i en t-PA-haltig (50 ng/ml) lösning innan de tvättades och överfördes till en loop innehållande (K2(Gln)P vid en koncentration av 500 ng/ml (Fig. 3). Ingen propplys uppträdde när den "primade“ och tvättade kroppen inkuberades i 6 timmar utan tillsatt t-PA-variant.

Exempel 3 Detta experiment visar att en synergistisk trombolytisk effekt in vitro erhålles när streptokinas och t-PA-varianten K2(Gln)P blandas i rätt förhållande och även att fördröjnings- fasen av aktivitet för K2(Gln)P elimineras när streptokinas innefattas.

Blandningar av K2(Gln)P och streptokinas 400+100 ng/ml jämföras med 500 ng/ml av de två föreningarna var för sig (Fig. 4). En markerad synergistisk effekt kan iakttas i detta system, eftersom 400+100 ng/ml-blandningen av K2(Gln)P och streptokinas är 40 till 65 X effektivare än någon av föreningarna var för sig.

Exempel 4 Detta experiment visar den synergistiska trombolytiska effekten av en blandning av t-PA-varianten K2(Gln)P och normal t-PA i kaniner.

Den trombolytiska effekten in vivo utvärderades i en trom- bosmodell under användning av jugularven hos kanin. Jugularvenen av en med pentobarbiton anestiserad kanin frilades och alla tributarier legerades. Ett 2 cm långt segment av jugularvenen legerades och det inneslutna blodet avlägsnades och utbyttes mot samma volym av färskt uppsamlat humant helblod blandat med små mängder av 1251-humanfibrinogen och trombin. En bomullstråd, Jr f) 10 15 20 25 11 462 829 kring vilken den radioaktivt märkta proppen bildas, infördes sedan genom kärlet för att undvika enbolisering. Efter propp- bildning (ca 15 minuter) avlägsnades kirurgklämmorna och kok- saltlösning spolades över proppen för att àterställa en viss grad av flöde över proppen och för att avlägsna icke koagulerat 1251-fibrinogen frán proppens omgivning.

Graden av trombolys moniterades kontinuerligt med en gammadetektorprob med plan yta (Alnor Instruments, Studsvik.

Sverige) som fastsatts ca 1 cm över proppen. Plasminogenaktiva- torerna injicerades som en bolusdos i den kontralaterala margi- nala öronvenen och gammaaktiviteten uppmättes i 30 sekunder var femte minut under tre timmar.

Resultaten av detta in vivo-experiment visas i Fig. 5, där en totalmängd om 2 mg plasminogenaktivator injicerades i kaniner med en vikt av 3 kg. De trombolytiska ämnena var: a) normal t- PA, b) t-PA-variant K2 varianten. En dramatisk synergistisk effekt erhålles när normal t-PA och t-PA-varianten injiceras som en blandning. Den procen- tuella medelpropplysen efter 3 timmar är 12, 45 och 83 för nor- mal t-PA, K2(G1n)P respektive blandningen.

Av ovanstående experiment kan man dra den slutsatsen, att en kombinerad administration, endera som en blandning eller i följd, och t-PA och t-PA-varianter med en utsträckt halverings- tid i plasma pà humanpatienter effektivt inducerar trombolys vid doser som är väsentligt lägre än som normalt användes för var- dera av ämnena använda var för sig.

Claims (11)

462 829 ” 10 15 20 25 30 35 PATENTKRAV

1. Trombolytiskt aktiv komposition innefattande i kombi- nation som huvudkomponent en modifierad plasminogenaktivator av vävnadstyp (modifierad t-PA), vilken förutom i tillväxtfaktor- domänen (G) modifierats även i en eller flera av följande säten eller domäner: sätena för aminosyraresterna 117, 184, 277 och 448, F-domänen, K1-domänen och P-domänen, och som sekundärkompo- nent en normal human t-PA, streptokinas eller humant urokinas i en farmaceutiskt acceptabel excipient.

2. Trombolytiskt aktiv komposition enligt patentkravet 1, vari nämnda huvudkomponent är t-PA som modifierats så att den uppvisar utsträckt biologisk halveringstid.

3. Trombolytiskt aktiv komposition enligt patentkravet 1 eller 2, vari sekundärkomponenten utgör upp till ca 30 % av den kombinerade vikten av nämnda tva komponenter.

4. Trombolytiskt aktiv komposition enligt patentkravet 1, 2 eller 3, vari den modifierade t-PA användes i kombination med normal human t-PA.

5. Trombolytiskt aktiv komposition enligt nàgot av de föregående patentkraven, vilken föreligger i flytande form läm- pad för infusion eller injektion.

6. Trombolytiskt aktiv komposition enligt patentkravet 5, vari nämnda komponenter är närvarande vid en koncentration av ca 0,1 till ca 10 mg/ml.

7. Förfarande för framställning av en trombolytiskt ak- tiv komposition, kännetecknat därav att, man kombinerar som huvudkomponent en modifierad plasminogen aktivator av vävnadstyp (modifierad t-PA), vilken förutom i tillväxtfaktordomänen (G) modifierats även i en eller flera av följande säten eller domä- ner: sätena för aminosyraresterna 117, 184, 277 och 448, F-domä- nen, K1-domänen och P-domänen och som sekundär komponent normal human t-PA, streptokinas eller humant urokinas i en farmaceu- tiskt acceptabel excipient.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, vari nämnda sekun- därkomponent kombineras med t-PA, som modifierats sa att den uppvisar utsträckt biologisk halveringstid.

9. Förfarande enligt patentkravet 7 eller 8, vari nämnda modifierade t-PA kombineras med normal human t-PA. k? 4% 10 15 18 462 829

10. Medicinsk kit eller förpackning för användning vid behandling av trombotiska störningar, innehållande: a) normal human t-PA, streptokinas eller humant urokinas i en mindre mängd i en farmaceutiskt acceptabel excipient; och b) en modifierad plasminogenaktivator av vävnadstyp (modifi- erad t-PA), vilken förutom i tillväxtfaktordomänen (G) modifie- rats även i en eller flera av följande säten eller domäner: sä- tena för aminosyraresterna 117, 184, 277 och 448, Fdomänen, K1- -domänen och P-domänen i en trombolytiskt effektiv mängd i en farmaceutiskt acceptabel excipient; och c) skrivna instruktioner för samtidig eller konsekutiv admi- nistration av kompositionerna under a) och b) i nämnda ordning pà en patient behäftad med sådan störning.

11. Medicinsk kit eller förpackning enligt patentkravet 10, vari komponenten a) innehåller upp till ca 10 mg, såsom ca 1 till ca 10 mg, aktiv beståndsdel, och vari komponent b)-innehàl- ler upp till ca 50 mg, såsom ca 10 till ca 50 mg, aktiv be- stàndsdel.