JPH02225420A - 新規な血栓溶解組成物 - Google Patents
新規な血栓溶解組成物Info
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- JPH02225420A JPH02225420A JP2001149A JP114990A JPH02225420A JP H02225420 A JPH02225420 A JP H02225420A JP 2001149 A JP2001149 A JP 2001149A JP 114990 A JP114990 A JP 114990A JP H02225420 A JPH02225420 A JP H02225420A
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
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- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔童業上の利用分野〕
本発明は血栓溶解作用を有する成分の有用な組合せを含
む血栓溶解活性組成物に関する。本発明はまたこのよう
な血栓溶解活性組成物の調製方法、血栓症の治療方法、
並びにこの種の治療に用いるための医療用キットまたは
包装品に関する。 〔従来の技術〕 急性心筋梗塞、心臓発作、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症
、末梢動脈血栓症または他の血栓症のような血管障害は
血塊による血管の部分的または全体的閉塞が原因で起こ
る。血液の流れを回復させるために１崩塊は除去もしく
は崩壊されねばならない。血塊の崩壊はプラスミノーゲ
ン活性化因子の使用により達成できる。この種の活性化
因子は血漿プロ酵素のプラスミノーゲンをその活性形の
プラスミンに変換することができる。プラスミンは血塊
の主成分であるブイプリンを効果的に分解する。 現在、血栓溶解治療に用いられている化合物は３つのグ
ルー・プ：すなわち組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ”ＰＡ ） 、ウロキナーゼ型プラ、”２ノーゲン
活性化囚子（ｕ−ＰＡ ）およびストレプトキナーゼに
大別される。血栓症を治療する場合、それらにはいくつ
かの制限がある。ストレプトキナーゼは細菌タンパク質
であり、臨床上の問題を提起しうる免疫反応を誘発する
。ｕ−ＰＡおよびストレプトキナーゼは両方ともフィブ
リン選択性およびフィブリン親和性を欠いている。これ
らの活性化因子の静脈内投与は全身的にプラスミンを生
成させて、出血の可能性および出血合併症を引き起こす
ことがある。組織型プラスミノーゲン活性化因子はフィ
ブリンに対して高い親和性を有し、プラスミノーゲンが
フィブリンに結合したときだけプラスミノーゲンを効果
的に活性化する。従りて、ｔ−ＰＡは全身的なプラスミ
ン作用を引き起こ１； すことなくフィブリン凝塊を効果的近分解することがで
きる。 組換えＤＮＡ技術および通常のバイオテクノロジー手法
は血栓症治療用のｔ−ＰＡを生産するために用いられた
〔欧州特許公開第９３６１９号、同第４１７６６号およ
び同第１７８１０５号の各明細書を参照された匹〕。組
換えｔ−ＰＡを用いた臨床実験によれば、有効な血栓溶
解には（資）〜ｌＯＯ■の用量が必要であることが分か
った。このような高用量は、ｔ−ＰＡが肝臓によって循
環から速やかに除かれ、ヒトにおける天然ｔ−ＰＡの半
減期がほんの２．３分であるという事実に関係し°（＋
、ｑるかも知れない（Ｇａｒａｂｅｄｌａｎ ｅｔ ａ
ｌ、１９８６＊Ａｍ、、 Ｊ 、Ｃａｒｄｌｏｌ 、
５８ｓｐｐ ６７３−６７９３゜また、短い半減期のた
めに、活性化因子は速くて便利なポーラス注入としてで
はなく数時間にわたる連続輸液として投与する必要があ
るだろう。 従って、高いブイプリン親和性およびフィブリン選択性
をもつと共に塵中で長い半減期を有するプラスミノーゲ
ン活性化因子を生産する試みがなされている。このよう
なプラスミノーゲン活性化因子は現在ｔ−ＰＡとして用
いられているものよりも低用量で有効であり且つ輸液の
代わりにポーラス注入を使用できると予想される。 長い１ｎマ１マ０半減期を有するｔ−ＰＡの遺伝学的に
修飾された変異体を′ふ組換えＤＮＡ技術によりりくら
れた〔欧州特許公開第８８８５０２０７．７号および同
第２４２８３６号、並びに国際特許出願ＰＣＴ番号ＷＯ
３７１０４７２２を参照されたい〕。この種の修飾ｔ−
ＰＡ分子を用いた動物実験は、より遅いクリアランスが
より効果的な血栓溶解と関係していることを明らかにし
た（ Ｃｏ１１ｅｎ ｅｔ ａｌ、１９８８＊Ｂｌｏｏ
ｄ７：Ｌ、２１６−２１９）。 しかしながら、ヒト血塊を溶解する変異体の能力につい
てｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した場合、その活性は顕著な
遅滞側と関係がある（ Ｋａｌｙａｎ ｅｔ ａｌ、１
．９８８Ｊ 、 Ｂｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍ、２６３．３
９７？３９７８） ｏこの遅滞側は変異体の活性、を低
下させて溶解時間を増加させ、従って１ｎｖｉｖｏ で
のより長い半減期の効果を打ち消すことになる。
む血栓溶解活性組成物に関する。本発明はまたこのよう
な血栓溶解活性組成物の調製方法、血栓症の治療方法、
並びにこの種の治療に用いるための医療用キットまたは
包装品に関する。 〔従来の技術〕 急性心筋梗塞、心臓発作、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症
、末梢動脈血栓症または他の血栓症のような血管障害は
血塊による血管の部分的または全体的閉塞が原因で起こ
る。血液の流れを回復させるために１崩塊は除去もしく
は崩壊されねばならない。血塊の崩壊はプラスミノーゲ
ン活性化因子の使用により達成できる。この種の活性化
因子は血漿プロ酵素のプラスミノーゲンをその活性形の
プラスミンに変換することができる。プラスミンは血塊
の主成分であるブイプリンを効果的に分解する。 現在、血栓溶解治療に用いられている化合物は３つのグ
ルー・プ：すなわち組織型プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ”ＰＡ ） 、ウロキナーゼ型プラ、”２ノーゲン
活性化囚子（ｕ−ＰＡ ）およびストレプトキナーゼに
大別される。血栓症を治療する場合、それらにはいくつ
かの制限がある。ストレプトキナーゼは細菌タンパク質
であり、臨床上の問題を提起しうる免疫反応を誘発する
。ｕ−ＰＡおよびストレプトキナーゼは両方ともフィブ
リン選択性およびフィブリン親和性を欠いている。これ
らの活性化因子の静脈内投与は全身的にプラスミンを生
成させて、出血の可能性および出血合併症を引き起こす
ことがある。組織型プラスミノーゲン活性化因子はフィ
ブリンに対して高い親和性を有し、プラスミノーゲンが
フィブリンに結合したときだけプラスミノーゲンを効果
的に活性化する。従りて、ｔ−ＰＡは全身的なプラスミ
ン作用を引き起こ１； すことなくフィブリン凝塊を効果的近分解することがで
きる。 組換えＤＮＡ技術および通常のバイオテクノロジー手法
は血栓症治療用のｔ−ＰＡを生産するために用いられた
〔欧州特許公開第９３６１９号、同第４１７６６号およ
び同第１７８１０５号の各明細書を参照された匹〕。組
換えｔ−ＰＡを用いた臨床実験によれば、有効な血栓溶
解には（資）〜ｌＯＯ■の用量が必要であることが分か
った。このような高用量は、ｔ−ＰＡが肝臓によって循
環から速やかに除かれ、ヒトにおける天然ｔ−ＰＡの半
減期がほんの２．３分であるという事実に関係し°（＋
、ｑるかも知れない（Ｇａｒａｂｅｄｌａｎ ｅｔ ａ
ｌ、１９８６＊Ａｍ、、 Ｊ 、Ｃａｒｄｌｏｌ 、
５８ｓｐｐ ６７３−６７９３゜また、短い半減期のた
めに、活性化因子は速くて便利なポーラス注入としてで
はなく数時間にわたる連続輸液として投与する必要があ
るだろう。 従って、高いブイプリン親和性およびフィブリン選択性
をもつと共に塵中で長い半減期を有するプラスミノーゲ
ン活性化因子を生産する試みがなされている。このよう
なプラスミノーゲン活性化因子は現在ｔ−ＰＡとして用
いられているものよりも低用量で有効であり且つ輸液の
代わりにポーラス注入を使用できると予想される。 長い１ｎマ１マ０半減期を有するｔ−ＰＡの遺伝学的に
修飾された変異体を′ふ組換えＤＮＡ技術によりりくら
れた〔欧州特許公開第８８８５０２０７．７号および同
第２４２８３６号、並びに国際特許出願ＰＣＴ番号ＷＯ
３７１０４７２２を参照されたい〕。この種の修飾ｔ−
ＰＡ分子を用いた動物実験は、より遅いクリアランスが
より効果的な血栓溶解と関係していることを明らかにし
た（ Ｃｏ１１ｅｎ ｅｔ ａｌ、１９８８＊Ｂｌｏｏ
ｄ７：Ｌ、２１６−２１９）。 しかしながら、ヒト血塊を溶解する変異体の能力につい
てｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した場合、その活性は顕著な
遅滞側と関係がある（ Ｋａｌｙａｎ ｅｔ ａｌ、１
．９８８Ｊ 、 Ｂｉｏｌ 、 Ｃｈｅｍ、２６３．３
９７？３９７８） ｏこの遅滞側は変異体の活性、を低
下させて溶解時間を増加させ、従って１ｎｖｉｖｏ で
のより長い半減期の効果を打ち消すことになる。
定義
本明細書においては、１９８２年７月２７日にイタリア
のベルガモで開偏された１血栓症およびうつ面症に関す
る国際会議１の第Ｘ溜ミーティングにおいて提案された
プラスミノーゲン活性化因子命名法が採用される：すな
わち、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ
）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（
ｕ”ＰＡ ）。本明細書中で用いる１正常ｔ−ＰＡ ”
または＠ｔ−ＰＡなる用語はＰｅｎｎ１ｃａ ａｔ ａ
ｌ、１９８３．Ｎａｔｕｒｅ＊３０１＊２１４−２２１
によって示されたａＤＮＡから推定されるアミノ酸配列
を有する全長ヒ） ｔ−ＰＡを意味する。自然界に存在
するｔ−ＰＡの調農物は３種類の異なるＮ末端アミノ酸
残基をもつことが分かつている。最長の形態ｃＬ形）は
第一アミノ酸残基としてグリシン（Ｇｘ）ｒ ）を有し
、−刀短Ａ形態ｒＳ形）およびウテリン形態ｃＵ形）Ｉ
Ａ端端室ミノ酸残基してそれぞれセリンｃ Ｓ＠ｒ ）
およびバリン（Ｖａｌ ）を有する。これらの異なるｔ
−ＰＡ形態はすべて正常ｔ−ＰＡの特徴をもっている。 ｔ−ＰＡＡ異体”なる用語は、正常ｔ−ＰＡに特徴的な
速いクリア２ンス速度を減するように修飾された正常ｔ
−ＰＡの種々の形態を意味する。 発明の説明 今や、少量の正常Ｃ組換えまたは弁組換え）ｔ−ＰＡ
５ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼを修飾ｔ−ＦＡ調
製物に添加すると、これらの化合物の血栓溶解活性にお
ける遅滞側を除くことができ、しかも得られる活性が正
常ｔ−ＰＡのレベルにまぶ増強されることが見出されｔ
こ。１１ ｖｉｖｏでの修飾ｔ−ＰＡ分子の有意に長い
半減期を前原すると、この混合物の改良された活性は顕
著な相乗作用を発現し、これによりそれぞれの化合物を
単独で用いたときよりも一層速い効果的な血栓溶解作用
が得られるであろう。 本発明はｉｎ ｖｉｖｏ半減期を長引かせるように修飾
されたｔ−ＰＡＡ異体が血栓溶解活性の発現に関して遅
滞側を示すという観察に基づいている。対照的に、正常
ｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼはこ
のような遅滞側を示さない。この遅滞側は、変異体が少
量の正常ｔ−ＰＡ％ｒ７０キナーゼまたはストレプトキ
ナーゼと混合される場合に観察されない。これらの薬剤
が単独で有意な血栓溶解を引き起こさない量ｃ血栓溶解
濃度以下）で存在する場合、ｔ−ＰＡＡ異体の活性は顕
著な遅滞側と無関係になる。さらに、低濃度の正常ｔ−
ＰＡと共にイン中ユベートシ、洗浄し、その後ンＪ？ｓ
、ベートした場合と同様に速やかに溶解されることが分
かった。 このことは、血栓が正常ｔ−ＦＡの注入により１感作ｒ
ｐｒｌｍｅｄ ） ’され、その後長い血漿半減期を
もつｔ−ＰＡ変意休体２回目の注入により効果的に溶解
されることを示している。このような併用療法により、
血栓患者は入院前に予め安全な血栓溶解濃度以下のｔ−
ＰＡ ％ ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼの注入に
より１感作″され、その後病院で有効なｔ−ＦＡＡ異体
の輸液を受けて血栓溶解治療を完了することができる。 前記併用療法の利点は、治療の開始から血栓溶解までの
時間が比較的短いということである。特に、急往心筋梗
塞の場合は、迅速な血栓が解が心筋の救助にとって重要
である。併用療法の他の利点は、２徨の薬剤を混合物と
して用いても、あるいは別々に用いても、効果的な崩栓
溶解が現在用いられているｔ−ＰＡの周索よりも顕著に
少ない全用量で達成し得るということである。 本発明は前記発見に基づいている。１つの観点にお込て
、本発明は、副成分としてのｔ−ＰＡ ｚｕ−ＰＡまた
はストレブトギナーｌおよび主成分としての繊維素溶解
活性ｔ−ＰＡ変異体の相乗的組合せを、好ましくは製剤
学的に許容しうる賦形剤と共に、含有する血栓溶解活性
薬剤組成物を提供する。 別に観点において、本発明は、１種またはそれ以上の製
剤学的に許容１５うる賦形剤中で副成分としてのｔ−Ｐ
Ａ ％ ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼおよび主成
分としての繊維素溶解活性ｔ−ＰＡ変異体を混合するこ
とから成る、崩栓溶解活性薬削組成物の調製方法を提供
する。得られる薬剤組成物はどのような適当な形態のも
のであってもよいが、好ましくは静脈内注射液または輸
液の形態をしている。 ｔ−ＰＡ ５ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼから成
る副成分は適当な供給源から得られる通常の種類のもの
であってよい。ここに記載した実験では、ｔ−ＰＡはメ
ラノーマＣ黒色腫）細胞系列のならし培地から得られ、
そしてストレプトキナーゼは天然の連鎖法菌属（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）の菌株から得られるが、天然
源由来のまたは遺伝子工学的に操作された真核もしくは
原核細胞由来のｔ−ＰＡ ％ｕ−ＰＡまたはストレプト
キナーゼも同様に適しているであろう。 併用治療の主成分は、正常ｔ−ＰＡと比較したとき、よ
り長いｌｎ ｖｉｖｏ半減期およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血
塊溶解血性溶解活性により特徴づけられるプラスミノー
ゲン活性化因子、好ましくは修飾ｔ−ＰＡ変異体、であ
る。本実験で用いるｔ−ＰＡ変異体は組換え技術によっ
て哺乳動物細胞により生産されるが、天然源または遺伝
子工学的に操作された真核もしくは原核細胞から得られ
る前記特徴をもつプラスミノーゲン活性化因子はどれも
適しているであろう。本発明組成物中で用いるのに適し
たｔ−ＰＡ変異体の詳細については、欧州特許公開第８
８８５０２０７．７号明細書を参照されたい。前記の欧
州特許公開明細書には、比較的長いｉｎ ｖｉｖｏ生物
学的半減期を有する線維素溶解活性の組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子が記載されている。前記特許の開示内
容はすべて参照によりここに引用されるものとする。そ
こに記載の変異体の主な特徴を以下に要約する。 欧州特許公開第８８８５０２０７．７号に記載されるｔ
−ＰＡ変異体は、成長因子ドメインＣＧドメイン）のほ
かに第一クリンゲルドメイン（Ｋ１ドメイン）も欠失さ
れている点に特徴がある。さらに、本発明のプラスミノ
ーゲン活性化因子は次の部位または領域の１つ以上にお
いて修飾されているニアミノ酸残基１７７、１８４．２
７７および４４８の部位、およびフィンガードメインＣ
Ｆドメイン）。フィンガードメインは、修飾される場合
１、その一部または全部が欠失される。 Ｆドメインは場合により欠失され且つ残基１８４のグリ
コジル化部位はその部位でのグリコジル化を妨げるよう
に修飾されているのが好適である。 残基１８４および４４８の両刀の部位はこれらの部位で
のグリコジル化を妨げるように修飾されているのが特に
好適である。 本明細書中で、グリコジル化部位１８４および４４８の
修飾について言及する場合、その修飾はグリコジル化が
起こらないようなものである。従って、問題の部位はＮ
−グリコジル化コンセンサス配列を修飾することによっ
てＮ−グリコジル化が起こらないように修飾される。 特に好適な実施態様では、Ｆドメインが全部欠失され、
そして部位１８４および４４８のアミノ酸が前記部位で
グリコジル化が起こらないように修飾される。 この種のプラスミノーゲン活性化因子はアミノ酸残基２
７７の部位でさらに修飾されているのが好ましく、この
ような修飾は側鎖中に陽電荷を示す基をもたないアミノ
酸残基へ変更した形であり得る。この種の修飾の例は部
位２７７のリシン残基をバリン残基に置き換えることで
ある。 別の好適な実施態様では、Ｋ１ドメインが、成長因子ド
メインの修飾のほかにこの分子の唯一の修飾として、あ
るいはアミノ酸残基２７７０部位の修飾と組み合わせて
、追加的に修飾されている。 さらに別の実施態様において、この分子はアミノ酸残基
１８４の部位で修飾されており、その結果正常ｔ−ＰＡ
で起こる前記部位でのＮ−グリコジル化がもはや起こら
ない。部位１８４におけるこの種の修飾では、そのアス
パラギン残基がグルタミン残基によって置換される。 アミノ酸部位１８４および２７７の前記修飾に加えて、
Ｋ１ドメインを、場合によりＦドメインの修飾と組み合
わせて、修飾することが好適である。 異なるドメインのこのような修飾はすべて、それぞれの
ドメインの一部または全部を欠失させることにより構成
される。 ｔ−ＰＡ ｚ ｕ−ＰＡ Ｎストレプトキナーゼおよび
ｔ−ＰＡ変異体をｌ＃ｔｆＪＩするには、いくつかの方
法が利用でき、通常は数多くのクロマトグラフエ穆が用
いられる。 併用治療の副成分と主成分の重量比は変化しううるが、
副成分は常に全用量の間型′Ｊｌｃｓより少ない。副成
分の好適な重量比は全用量の約５〜約Ｉチであり、特に
好適な範囲は約１０〜約２０ｔｓである。 二成分の混合物を含む又は二成分を別々に含む薬剤組成
物はヒトへの投与に適した形態でありうる。好適な形態
は静脈内注射液または輸液もしくは注射液と輸液の組合
せである。この種の液体は０．１〜１０■／ｍｌの濃度
で活性物質を含有するであろう。 前記併用療法において血栓症患者に投与される食用１″
は、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ単独の場合に必要とされる
用量よりも有意に少ない。血栓溶解の遅滞期が短縮され
るために、併用療法はｔ−ＰＡ変異体のみを用いる場合
よりも速くて一層効果的な血栓溶解を誘発するであろう
。 従って、要約すると、本発明は、製剤学的に許容しうる
賦形剤中に主成分としての修飾組織型プラスミノーゲン
活性化因子「修飾ｔ−ＰＡ ）および副成分としての正
常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはヒトウロキ
ナーゼの組合せを含有する血栓溶解活性組成物に関する
。 Ａｌｌ成分は前記二成分の合計重量の約３０チ以下を占
めるのが好適である１主成分２および１副成分８につい
て言及するとき、主成分は前記二成分の合計１量の（資
）重ｆｔｋ％より多くを占め、−力副成分はｈＩＪ配合
計重量の５０重量％未満を占めることを意味する。 本発明によるこのような血栓溶解組成物では、修飾ｔ−
ＰＡと正常ヒト ｔ−ＰＡを併用するのが特に好適であ
る。 また、本発明は製剤学的に許容しうる賦形剤中で主成分
としての修飾組織型プラスミノーゲン活性化因子（修飾
ｔ−ＰＡ ）および副成分としての正常ヒトｔ−ＰＡ、
ストレプトキナーゼまたはヒトウロキナーゼを混合する
ことから成る、血栓溶解組成物の調製方法に関する。 さらに、本発明は血栓を溶解するのに効果的な量の前記
組成物を血栓症患者に投与することから成る血栓症の治
療方法を包含する。 血栓症の別の治療方法によれば、 ａ）血栓症患者に、初期注射によって約３０ｍｇまでの
童の正常ｅ ） ｔ−ＰＡ Ｎストレプトキナーゼまた
はヒトウロキナーゼを投与し；その後ｂ）同一患者に、
２回目の注射によって血栓を溶解するのに効果的な童の
修飾ｔ−ＰＡを投与することから成る段階が含まれる。 最後に、本発明は ａ）製剤学的に許容しうる賦形剤中のより少ない量の正
常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはヒトウロキ
ナーゼ； ｂ）製剤学的に許容しうる賦形剤中の血栓溶解に効果的
な童の修飾ｔ−ＰＡ ：およびＣ）血栓症患者に、ａ）
およびｂ）の組成物を同時に又は前記順序で連続的
に投与するための説明書を含む、血栓症の治療に用いる
ための医療用中ットまたは包装品に関する。 このような医療用キットまたは包装品において、組成物
＆）は約１０りまでＣ例えば約１〜約１０ｍｇ）の活性
成分を含み、そして組成分ｂ）は約５０ｍｇまで（例え
ば約１０〜約５０〜）の活性成分を含むのが好適である
。 本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに例示さ
れるであろう。これらの実施例は純粋に例示的であって
、特許請求の範囲で定義した本発明の範囲を制限するも
のとして解釈されるべきではない。この例示は添付図面
を参照しながらなされるであろう：ここで 第１図は時間の関数としてのヒト血性の１Ｊ１のｔ−Ｐ
Ａ変異体に２ＣＧＩｎ）Ｐ の添加により開始される。 第２図はｔ−ＰＡ （５０ｎ、９／１７ ）およびｔ−
ＰＡ変異体に２ （Ｇｉｎ ） Ｐ （４５０ｎ９／
ＩＬｔ ）のそれぞれの１ｎマ１ｔｒｏ血塊溶解活性、
前記２つの化合物の計算上の合計活性、並びに混合した
場合の前記２つの化合物の実験的に見出された活性を示
す。 第３図は５υ０ｎｆｉ／ＩＲ１のストレプトキナーゼ（
ＳＫ ） 、５００ ｎｇ／”のｔ−ＰＡ変異体に２（
Ｇｉｎ）Ｐ％および１００ ｎ９／ａｔのＳＫと４００
ｎ９／ＩＬｌのに２ＣＧＩｎ）Ｐｑを含む混合物のｊ
ｎ ｖｉｔｒｏ崩塊溶解崩性溶解活性第４図は初めに正
常ｔ−ＰＡ （５０ｎｔｉ／ＩＲＩ ）と（至）分間イ
ンキュベートされ（“感作＃）、洗浄され、その後５０
０ ｎ＆／廐のｔ−ＰＡ変異体を含む第２溶液に移され
たヒト血性に作用するｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ）Ｐ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性進境溶解活性
はまた血性をｔ−ＰＡの不在下でブレインキュベートし
たＣ＠不感作１）後にも測定した。 第５図は２１Ｒ２のｔ−ＰＡ、 ｔ−ＰＡ変異体に２ｒ
Ｇｌｎ）Ｐおよびｔ−ＰＡとに２ｒＧ１ｎ）Ｐの１：４
混合物のウサギにおけるｉｎマｉｖｏ血血性解活性を示
す。実験条件は実施例４に詳述する。 実施例１ 本実験は、ｔ−ＰＡ変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊渚解
血性に及ぼす低濃度のｔ−ＰＡの影響を示すものである
Ｏ 用いたｔ−ＰＡはヒトメラノーマ組胞から得られた・′
″に２（Ｇｉｎ）Ｐ’と呼ばれるｔ−ＰＡ変異体分子＆
言、正常ヒ） ｔ−ＰＡ分子と次の点で異なる欠損変異
体である。アミノ酸残基６−１７３が欠失され、そして
Ａｓｎ １７７およびＡｓｎ １８４がそれぞれＳｅｒ
およびＧｉｎに置換されている。この変異体は、ウサギ
で試験した場合、約望分のｉＨｖ１ｖｏ血漿半減期を示
す。正常ｔ−ＰＡの対応値は約３分である。発現ベクタ
ーの構築および哺乳動物細胞によろ“Ｋ２ｒＧｌｎ、）
Ｐ″のよりなｔ−ＰＡ変異体の発現は、欧州特許公開Ｅ
ＰＯ第８８８５０２０７．７号に開示されている。 ｔ−ＰＡ ｓ ＠に２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’ およびこれら
の組合せのｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解特性るた
めに、チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ）の環状回路
循環系が用いられた。この方法の詳細については、Ｃ，
Ｍａｔｔａｓｏｎｅｔ ａｌｏ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
Ｒａｓ＊ａｒｅｈ２１ｓｒ１９８Ｘ）５３５−５４５
を参照されたい。蘭学に述べると、ヒト血液をクエン酸
ナトリウム中に採取し、遠心分離し、１１Ｓ７．フィブ
リノーゲンと混合してＴ）’ｇｏｎプラスチックチュー
ブに充填した。崩漿はＣａＣ１ｓで再石灰化し、チュー
ブの両端を連結して円形にした。 この円形チューブは傾斜したターンテーブル上で冴時間
回転させて、種々のプラスミノーゲン活性化因子の添加
前に地塊を形成させた。サンプルをチューブから取り出
し、一定の間隔をおいて放射能を調べた。崩性から放出
された放射能は崩性溶解饅として表した。 ｔ−ＰＡおよび＠に２ｒＧｌｎ）Ｐ ’ を用いて実ｍ
ｕた前記実験の結果をそれぞれ第１図と第２図に示す。 図面から分かるように％ ｔ−ＰＡは注入後ただちに素
塊溶解を誘発するが、′″に２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’ の場
合はその活性が顕著な遅滞期を示し、本質的ＶＣ１時間
以内に活性が発現しない。しかしながら、低用量ｒ ５
０ｎ、！ｉ’／ａ／ ）のｔ−ＰＡと４５０ ｎ９／−
のに２ｒＧ１ｎ）Ｐとを併用することＫより、ｔ−ＰＡ
変異体の遅滞期は大部分が消失するＣ第２図参照）。こ
の混合物により得られた活性Ｃ実験上のｔ−ＰＡ ＋
Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐ）は、曲線１計算上のｔ−ＰＡ＋ Ｋ
２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’に示されるような各化合物単独の活
性から計算されたものよりも有意に高い。 実施例２ 本実験は、ｔ−ＰＡ変異体に見られる１ｎ ｖｉｔｒｏ
崩塊溶解崩性溶解活性が、血性を初めに少量のｔ−ＰＡ
にさらすことにより消失され得ることを示すものである
。 進境はｔ−ＰＡで１感作１し、その後長い１ｎｖｔｖ。 半減期をもつｔ−ＰＡ変異体を用いて効果的に溶解した
。本実験は以下の点を除いて実験１と同じように実施し
た。血性は初めにｔ−ＰＡ （５ｏｎ９／ｌｉｔ ）含
有溶液中で１時間インキュベートし、洗浄し、その後５
００ｎ、９／”の濃度のに２ｒＧ１ｎ）Ｐを含む環状回
路に移した（第４図参照）。′感作“後洗浄した進境を
ｔ−ＰＡ変異体の不在下で６時間インキユベートシた場
合には、血相溶解が全く起こらなかった。 実施例３ 本実験は、相乗的ｉｎ ｖｌｔｒｏ血塊溶解血相溶解作
用プトキナーゼとｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ）Ｐを適
当な比率で混合した場合に得られること、お上びに２ｒ
Ｇｌｎ）Ｐの活性遅滞期がストレプトキナーゼを用いた
場合に消失されること、を示すものである。 Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐとストレプトキナーゼの混合物（４０
０＋ １００ ｎｇ／耐）は５００ ｎ９／ｉｔずつの
前記化合物単独と比較したＣ第３図参照）。Ｋ２ｒＧ１
ｎ）Ｐとストレプトキナーゼの４００ ＋ １０Ｏｎ、
９／ａｌ混合物は各化合物単独よりも４０〜６５％効果
的であるので、この系では顕著な相乗作用が見られる。 実施例４ 本実験は、ウサギにおけるｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ
）Ｐと正常ｔ−ＰＡの混合物の相乗的血相溶解作用を示
すものである。 ｉｎ ｖｉマｏｌｆｆｉ塊溶解作用はウサギ頚靜脈崩栓
モデルにより評価した。ベンドパルビトンで麻酔したウ
サギの頚静脈を露出させ、すべての支流を結紮した。長
さが２副の頚静脈セグメントを結紮し、中に含まれる血
液を取り出し、そして微量の１１５５−ヒトフィブリノ
ーゲンおよびトロンビンと混合した採取したばかりのヒ
ト全血液の間食と交換した。その後木綿系にの回りに放
射性標識した血性が形成されるであろう）を血管に挿入
して塞栓形成を回避した。血性の形成後Ｃ約１５分）、
外科手術用クランプを除き、血性に食塩水を流して洗い
、これにより血性のまわりＶＣある程度の流れを回復さ
せ、進境の周囲から非凝固性ｕｓ １−フィブリノーゲ
ンを除去した。 面塊浴解速度は進境から約１ｃＩｎ上に固定した平面ガ
ンマ検出器プローブＣスウェーデン、スタツズビック５
Ａｌｎｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて連続
的に監視した。プラスミノーゲン活性化因子は対何の周
縁耳静脈にポーラス用量として注入し、ガンマカウント
数を３時間にわたって５分ごとに加秒間測定した。 このようなｉ！Ｉｖｉｖｏ実験の結果を第５図に示す。 全部で２■のプラスミノーゲン活性化因子を体重異体の
１＝４混合物でありた。−正常ｔ−ＰＡとｔ−ＰＡ変異
体を混合物として注入したとき、劇的な相乗効果が得ら
れた。３時間後の血相溶解の平均百分率は正常ｔ−ＰＡ
、 Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐおよび混合物についてそれぞれ
１２ 、４５および８３％で６った。 前記実験から、ｔ−ＰＡと血漿半減期の長いｔ−ＰＡ変
異体を混合物として又は連続的にヒト患者へ併用投与す
ると、前記薬剤をそれぞれ単独で用いるときの通常の用
量よりも有意に低い用量で効果的な血栓溶解が誘発され
ると結論づけることができる。
のベルガモで開偏された１血栓症およびうつ面症に関す
る国際会議１の第Ｘ溜ミーティングにおいて提案された
プラスミノーゲン活性化因子命名法が採用される：すな
わち、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ
）およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（
ｕ”ＰＡ ）。本明細書中で用いる１正常ｔ−ＰＡ ”
または＠ｔ−ＰＡなる用語はＰｅｎｎ１ｃａ ａｔ ａ
ｌ、１９８３．Ｎａｔｕｒｅ＊３０１＊２１４−２２１
によって示されたａＤＮＡから推定されるアミノ酸配列
を有する全長ヒ） ｔ−ＰＡを意味する。自然界に存在
するｔ−ＰＡの調農物は３種類の異なるＮ末端アミノ酸
残基をもつことが分かつている。最長の形態ｃＬ形）は
第一アミノ酸残基としてグリシン（Ｇｘ）ｒ ）を有し
、−刀短Ａ形態ｒＳ形）およびウテリン形態ｃＵ形）Ｉ
Ａ端端室ミノ酸残基してそれぞれセリンｃ Ｓ＠ｒ ）
およびバリン（Ｖａｌ ）を有する。これらの異なるｔ
−ＰＡ形態はすべて正常ｔ−ＰＡの特徴をもっている。 ｔ−ＰＡＡ異体”なる用語は、正常ｔ−ＰＡに特徴的な
速いクリア２ンス速度を減するように修飾された正常ｔ
−ＰＡの種々の形態を意味する。 発明の説明 今や、少量の正常Ｃ組換えまたは弁組換え）ｔ−ＰＡ
５ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼを修飾ｔ−ＦＡ調
製物に添加すると、これらの化合物の血栓溶解活性にお
ける遅滞側を除くことができ、しかも得られる活性が正
常ｔ−ＰＡのレベルにまぶ増強されることが見出されｔ
こ。１１ ｖｉｖｏでの修飾ｔ−ＰＡ分子の有意に長い
半減期を前原すると、この混合物の改良された活性は顕
著な相乗作用を発現し、これによりそれぞれの化合物を
単独で用いたときよりも一層速い効果的な血栓溶解作用
が得られるであろう。 本発明はｉｎ ｖｉｖｏ半減期を長引かせるように修飾
されたｔ−ＰＡＡ異体が血栓溶解活性の発現に関して遅
滞側を示すという観察に基づいている。対照的に、正常
ｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼはこ
のような遅滞側を示さない。この遅滞側は、変異体が少
量の正常ｔ−ＰＡ％ｒ７０キナーゼまたはストレプトキ
ナーゼと混合される場合に観察されない。これらの薬剤
が単独で有意な血栓溶解を引き起こさない量ｃ血栓溶解
濃度以下）で存在する場合、ｔ−ＰＡＡ異体の活性は顕
著な遅滞側と無関係になる。さらに、低濃度の正常ｔ−
ＰＡと共にイン中ユベートシ、洗浄し、その後ンＪ？ｓ
、ベートした場合と同様に速やかに溶解されることが分
かった。 このことは、血栓が正常ｔ−ＦＡの注入により１感作ｒ
ｐｒｌｍｅｄ ） ’され、その後長い血漿半減期を
もつｔ−ＰＡ変意休体２回目の注入により効果的に溶解
されることを示している。このような併用療法により、
血栓患者は入院前に予め安全な血栓溶解濃度以下のｔ−
ＰＡ ％ ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼの注入に
より１感作″され、その後病院で有効なｔ−ＦＡＡ異体
の輸液を受けて血栓溶解治療を完了することができる。 前記併用療法の利点は、治療の開始から血栓溶解までの
時間が比較的短いということである。特に、急往心筋梗
塞の場合は、迅速な血栓が解が心筋の救助にとって重要
である。併用療法の他の利点は、２徨の薬剤を混合物と
して用いても、あるいは別々に用いても、効果的な崩栓
溶解が現在用いられているｔ−ＰＡの周索よりも顕著に
少ない全用量で達成し得るということである。 本発明は前記発見に基づいている。１つの観点にお込て
、本発明は、副成分としてのｔ−ＰＡ ｚｕ−ＰＡまた
はストレブトギナーｌおよび主成分としての繊維素溶解
活性ｔ−ＰＡ変異体の相乗的組合せを、好ましくは製剤
学的に許容しうる賦形剤と共に、含有する血栓溶解活性
薬剤組成物を提供する。 別に観点において、本発明は、１種またはそれ以上の製
剤学的に許容１５うる賦形剤中で副成分としてのｔ−Ｐ
Ａ ％ ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼおよび主成
分としての繊維素溶解活性ｔ−ＰＡ変異体を混合するこ
とから成る、崩栓溶解活性薬削組成物の調製方法を提供
する。得られる薬剤組成物はどのような適当な形態のも
のであってもよいが、好ましくは静脈内注射液または輸
液の形態をしている。 ｔ−ＰＡ ５ｕ−ＰＡまたはストレプトキナーゼから成
る副成分は適当な供給源から得られる通常の種類のもの
であってよい。ここに記載した実験では、ｔ−ＰＡはメ
ラノーマＣ黒色腫）細胞系列のならし培地から得られ、
そしてストレプトキナーゼは天然の連鎖法菌属（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）の菌株から得られるが、天然
源由来のまたは遺伝子工学的に操作された真核もしくは
原核細胞由来のｔ−ＰＡ ％ｕ−ＰＡまたはストレプト
キナーゼも同様に適しているであろう。 併用治療の主成分は、正常ｔ−ＰＡと比較したとき、よ
り長いｌｎ ｖｉｖｏ半減期およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血
塊溶解血性溶解活性により特徴づけられるプラスミノー
ゲン活性化因子、好ましくは修飾ｔ−ＰＡ変異体、であ
る。本実験で用いるｔ−ＰＡ変異体は組換え技術によっ
て哺乳動物細胞により生産されるが、天然源または遺伝
子工学的に操作された真核もしくは原核細胞から得られ
る前記特徴をもつプラスミノーゲン活性化因子はどれも
適しているであろう。本発明組成物中で用いるのに適し
たｔ−ＰＡ変異体の詳細については、欧州特許公開第８
８８５０２０７．７号明細書を参照されたい。前記の欧
州特許公開明細書には、比較的長いｉｎ ｖｉｖｏ生物
学的半減期を有する線維素溶解活性の組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子が記載されている。前記特許の開示内
容はすべて参照によりここに引用されるものとする。そ
こに記載の変異体の主な特徴を以下に要約する。 欧州特許公開第８８８５０２０７．７号に記載されるｔ
−ＰＡ変異体は、成長因子ドメインＣＧドメイン）のほ
かに第一クリンゲルドメイン（Ｋ１ドメイン）も欠失さ
れている点に特徴がある。さらに、本発明のプラスミノ
ーゲン活性化因子は次の部位または領域の１つ以上にお
いて修飾されているニアミノ酸残基１７７、１８４．２
７７および４４８の部位、およびフィンガードメインＣ
Ｆドメイン）。フィンガードメインは、修飾される場合
１、その一部または全部が欠失される。 Ｆドメインは場合により欠失され且つ残基１８４のグリ
コジル化部位はその部位でのグリコジル化を妨げるよう
に修飾されているのが好適である。 残基１８４および４４８の両刀の部位はこれらの部位で
のグリコジル化を妨げるように修飾されているのが特に
好適である。 本明細書中で、グリコジル化部位１８４および４４８の
修飾について言及する場合、その修飾はグリコジル化が
起こらないようなものである。従って、問題の部位はＮ
−グリコジル化コンセンサス配列を修飾することによっ
てＮ−グリコジル化が起こらないように修飾される。 特に好適な実施態様では、Ｆドメインが全部欠失され、
そして部位１８４および４４８のアミノ酸が前記部位で
グリコジル化が起こらないように修飾される。 この種のプラスミノーゲン活性化因子はアミノ酸残基２
７７の部位でさらに修飾されているのが好ましく、この
ような修飾は側鎖中に陽電荷を示す基をもたないアミノ
酸残基へ変更した形であり得る。この種の修飾の例は部
位２７７のリシン残基をバリン残基に置き換えることで
ある。 別の好適な実施態様では、Ｋ１ドメインが、成長因子ド
メインの修飾のほかにこの分子の唯一の修飾として、あ
るいはアミノ酸残基２７７０部位の修飾と組み合わせて
、追加的に修飾されている。 さらに別の実施態様において、この分子はアミノ酸残基
１８４の部位で修飾されており、その結果正常ｔ−ＰＡ
で起こる前記部位でのＮ−グリコジル化がもはや起こら
ない。部位１８４におけるこの種の修飾では、そのアス
パラギン残基がグルタミン残基によって置換される。 アミノ酸部位１８４および２７７の前記修飾に加えて、
Ｋ１ドメインを、場合によりＦドメインの修飾と組み合
わせて、修飾することが好適である。 異なるドメインのこのような修飾はすべて、それぞれの
ドメインの一部または全部を欠失させることにより構成
される。 ｔ−ＰＡ ｚ ｕ−ＰＡ Ｎストレプトキナーゼおよび
ｔ−ＰＡ変異体をｌ＃ｔｆＪＩするには、いくつかの方
法が利用でき、通常は数多くのクロマトグラフエ穆が用
いられる。 併用治療の副成分と主成分の重量比は変化しううるが、
副成分は常に全用量の間型′Ｊｌｃｓより少ない。副成
分の好適な重量比は全用量の約５〜約Ｉチであり、特に
好適な範囲は約１０〜約２０ｔｓである。 二成分の混合物を含む又は二成分を別々に含む薬剤組成
物はヒトへの投与に適した形態でありうる。好適な形態
は静脈内注射液または輸液もしくは注射液と輸液の組合
せである。この種の液体は０．１〜１０■／ｍｌの濃度
で活性物質を含有するであろう。 前記併用療法において血栓症患者に投与される食用１″
は、ｔ−ＰＡまたはｕ−ＰＡ単独の場合に必要とされる
用量よりも有意に少ない。血栓溶解の遅滞期が短縮され
るために、併用療法はｔ−ＰＡ変異体のみを用いる場合
よりも速くて一層効果的な血栓溶解を誘発するであろう
。 従って、要約すると、本発明は、製剤学的に許容しうる
賦形剤中に主成分としての修飾組織型プラスミノーゲン
活性化因子「修飾ｔ−ＰＡ ）および副成分としての正
常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはヒトウロキ
ナーゼの組合せを含有する血栓溶解活性組成物に関する
。 Ａｌｌ成分は前記二成分の合計重量の約３０チ以下を占
めるのが好適である１主成分２および１副成分８につい
て言及するとき、主成分は前記二成分の合計１量の（資
）重ｆｔｋ％より多くを占め、−力副成分はｈＩＪ配合
計重量の５０重量％未満を占めることを意味する。 本発明によるこのような血栓溶解組成物では、修飾ｔ−
ＰＡと正常ヒト ｔ−ＰＡを併用するのが特に好適であ
る。 また、本発明は製剤学的に許容しうる賦形剤中で主成分
としての修飾組織型プラスミノーゲン活性化因子（修飾
ｔ−ＰＡ ）および副成分としての正常ヒトｔ−ＰＡ、
ストレプトキナーゼまたはヒトウロキナーゼを混合する
ことから成る、血栓溶解組成物の調製方法に関する。 さらに、本発明は血栓を溶解するのに効果的な量の前記
組成物を血栓症患者に投与することから成る血栓症の治
療方法を包含する。 血栓症の別の治療方法によれば、 ａ）血栓症患者に、初期注射によって約３０ｍｇまでの
童の正常ｅ ） ｔ−ＰＡ Ｎストレプトキナーゼまた
はヒトウロキナーゼを投与し；その後ｂ）同一患者に、
２回目の注射によって血栓を溶解するのに効果的な童の
修飾ｔ−ＰＡを投与することから成る段階が含まれる。 最後に、本発明は ａ）製剤学的に許容しうる賦形剤中のより少ない量の正
常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはヒトウロキ
ナーゼ； ｂ）製剤学的に許容しうる賦形剤中の血栓溶解に効果的
な童の修飾ｔ−ＰＡ ：およびＣ）血栓症患者に、ａ）
およびｂ）の組成物を同時に又は前記順序で連続的
に投与するための説明書を含む、血栓症の治療に用いる
ための医療用中ットまたは包装品に関する。 このような医療用キットまたは包装品において、組成物
＆）は約１０りまでＣ例えば約１〜約１０ｍｇ）の活性
成分を含み、そして組成分ｂ）は約５０ｍｇまで（例え
ば約１０〜約５０〜）の活性成分を含むのが好適である
。 本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに例示さ
れるであろう。これらの実施例は純粋に例示的であって
、特許請求の範囲で定義した本発明の範囲を制限するも
のとして解釈されるべきではない。この例示は添付図面
を参照しながらなされるであろう：ここで 第１図は時間の関数としてのヒト血性の１Ｊ１のｔ−Ｐ
Ａ変異体に２ＣＧＩｎ）Ｐ の添加により開始される。 第２図はｔ−ＰＡ （５０ｎ、９／１７ ）およびｔ−
ＰＡ変異体に２ （Ｇｉｎ ） Ｐ （４５０ｎ９／
ＩＬｔ ）のそれぞれの１ｎマ１ｔｒｏ血塊溶解活性、
前記２つの化合物の計算上の合計活性、並びに混合した
場合の前記２つの化合物の実験的に見出された活性を示
す。 第３図は５υ０ｎｆｉ／ＩＲ１のストレプトキナーゼ（
ＳＫ ） 、５００ ｎｇ／”のｔ−ＰＡ変異体に２（
Ｇｉｎ）Ｐ％および１００ ｎ９／ａｔのＳＫと４００
ｎ９／ＩＬｌのに２ＣＧＩｎ）Ｐｑを含む混合物のｊ
ｎ ｖｉｔｒｏ崩塊溶解崩性溶解活性第４図は初めに正
常ｔ−ＰＡ （５０ｎｔｉ／ＩＲＩ ）と（至）分間イ
ンキュベートされ（“感作＃）、洗浄され、その後５０
０ ｎ＆／廐のｔ−ＰＡ変異体を含む第２溶液に移され
たヒト血性に作用するｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ）Ｐ
のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性進境溶解活性
はまた血性をｔ−ＰＡの不在下でブレインキュベートし
たＣ＠不感作１）後にも測定した。 第５図は２１Ｒ２のｔ−ＰＡ、 ｔ−ＰＡ変異体に２ｒ
Ｇｌｎ）Ｐおよびｔ−ＰＡとに２ｒＧ１ｎ）Ｐの１：４
混合物のウサギにおけるｉｎマｉｖｏ血血性解活性を示
す。実験条件は実施例４に詳述する。 実施例１ 本実験は、ｔ−ＰＡ変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊渚解
血性に及ぼす低濃度のｔ−ＰＡの影響を示すものである
Ｏ 用いたｔ−ＰＡはヒトメラノーマ組胞から得られた・′
″に２（Ｇｉｎ）Ｐ’と呼ばれるｔ−ＰＡ変異体分子＆
言、正常ヒ） ｔ−ＰＡ分子と次の点で異なる欠損変異
体である。アミノ酸残基６−１７３が欠失され、そして
Ａｓｎ １７７およびＡｓｎ １８４がそれぞれＳｅｒ
およびＧｉｎに置換されている。この変異体は、ウサギ
で試験した場合、約望分のｉＨｖ１ｖｏ血漿半減期を示
す。正常ｔ−ＰＡの対応値は約３分である。発現ベクタ
ーの構築および哺乳動物細胞によろ“Ｋ２ｒＧｌｎ、）
Ｐ″のよりなｔ−ＰＡ変異体の発現は、欧州特許公開Ｅ
ＰＯ第８８８５０２０７．７号に開示されている。 ｔ−ＰＡ ｓ ＠に２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’ およびこれら
の組合せのｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解特性るた
めに、チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ）の環状回路
循環系が用いられた。この方法の詳細については、Ｃ，
Ｍａｔｔａｓｏｎｅｔ ａｌｏ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
Ｒａｓ＊ａｒｅｈ２１ｓｒ１９８Ｘ）５３５−５４５
を参照されたい。蘭学に述べると、ヒト血液をクエン酸
ナトリウム中に採取し、遠心分離し、１１Ｓ７．フィブ
リノーゲンと混合してＴ）’ｇｏｎプラスチックチュー
ブに充填した。崩漿はＣａＣ１ｓで再石灰化し、チュー
ブの両端を連結して円形にした。 この円形チューブは傾斜したターンテーブル上で冴時間
回転させて、種々のプラスミノーゲン活性化因子の添加
前に地塊を形成させた。サンプルをチューブから取り出
し、一定の間隔をおいて放射能を調べた。崩性から放出
された放射能は崩性溶解饅として表した。 ｔ−ＰＡおよび＠に２ｒＧｌｎ）Ｐ ’ を用いて実ｍ
ｕた前記実験の結果をそれぞれ第１図と第２図に示す。 図面から分かるように％ ｔ−ＰＡは注入後ただちに素
塊溶解を誘発するが、′″に２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’ の場
合はその活性が顕著な遅滞期を示し、本質的ＶＣ１時間
以内に活性が発現しない。しかしながら、低用量ｒ ５
０ｎ、！ｉ’／ａ／ ）のｔ−ＰＡと４５０ ｎ９／−
のに２ｒＧ１ｎ）Ｐとを併用することＫより、ｔ−ＰＡ
変異体の遅滞期は大部分が消失するＣ第２図参照）。こ
の混合物により得られた活性Ｃ実験上のｔ−ＰＡ ＋
Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐ）は、曲線１計算上のｔ−ＰＡ＋ Ｋ
２ｒＧ１ｎ）Ｐ ’に示されるような各化合物単独の活
性から計算されたものよりも有意に高い。 実施例２ 本実験は、ｔ−ＰＡ変異体に見られる１ｎ ｖｉｔｒｏ
崩塊溶解崩性溶解活性が、血性を初めに少量のｔ−ＰＡ
にさらすことにより消失され得ることを示すものである
。 進境はｔ−ＰＡで１感作１し、その後長い１ｎｖｔｖ。 半減期をもつｔ−ＰＡ変異体を用いて効果的に溶解した
。本実験は以下の点を除いて実験１と同じように実施し
た。血性は初めにｔ−ＰＡ （５ｏｎ９／ｌｉｔ ）含
有溶液中で１時間インキュベートし、洗浄し、その後５
００ｎ、９／”の濃度のに２ｒＧ１ｎ）Ｐを含む環状回
路に移した（第４図参照）。′感作“後洗浄した進境を
ｔ−ＰＡ変異体の不在下で６時間インキユベートシた場
合には、血相溶解が全く起こらなかった。 実施例３ 本実験は、相乗的ｉｎ ｖｌｔｒｏ血塊溶解血相溶解作
用プトキナーゼとｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ）Ｐを適
当な比率で混合した場合に得られること、お上びに２ｒ
Ｇｌｎ）Ｐの活性遅滞期がストレプトキナーゼを用いた
場合に消失されること、を示すものである。 Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐとストレプトキナーゼの混合物（４０
０＋ １００ ｎｇ／耐）は５００ ｎ９／ｉｔずつの
前記化合物単独と比較したＣ第３図参照）。Ｋ２ｒＧ１
ｎ）Ｐとストレプトキナーゼの４００ ＋ １０Ｏｎ、
９／ａｌ混合物は各化合物単独よりも４０〜６５％効果
的であるので、この系では顕著な相乗作用が見られる。 実施例４ 本実験は、ウサギにおけるｔ−ＰＡ変異体に２ｒＧ１ｎ
）Ｐと正常ｔ−ＰＡの混合物の相乗的血相溶解作用を示
すものである。 ｉｎ ｖｉマｏｌｆｆｉ塊溶解作用はウサギ頚靜脈崩栓
モデルにより評価した。ベンドパルビトンで麻酔したウ
サギの頚静脈を露出させ、すべての支流を結紮した。長
さが２副の頚静脈セグメントを結紮し、中に含まれる血
液を取り出し、そして微量の１１５５−ヒトフィブリノ
ーゲンおよびトロンビンと混合した採取したばかりのヒ
ト全血液の間食と交換した。その後木綿系にの回りに放
射性標識した血性が形成されるであろう）を血管に挿入
して塞栓形成を回避した。血性の形成後Ｃ約１５分）、
外科手術用クランプを除き、血性に食塩水を流して洗い
、これにより血性のまわりＶＣある程度の流れを回復さ
せ、進境の周囲から非凝固性ｕｓ １−フィブリノーゲ
ンを除去した。 面塊浴解速度は進境から約１ｃＩｎ上に固定した平面ガ
ンマ検出器プローブＣスウェーデン、スタツズビック５
Ａｌｎｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて連続
的に監視した。プラスミノーゲン活性化因子は対何の周
縁耳静脈にポーラス用量として注入し、ガンマカウント
数を３時間にわたって５分ごとに加秒間測定した。 このようなｉ！Ｉｖｉｖｏ実験の結果を第５図に示す。 全部で２■のプラスミノーゲン活性化因子を体重異体の
１＝４混合物でありた。−正常ｔ−ＰＡとｔ−ＰＡ変異
体を混合物として注入したとき、劇的な相乗効果が得ら
れた。３時間後の血相溶解の平均百分率は正常ｔ−ＰＡ
、 Ｋ２（Ｇｉｎ）Ｐおよび混合物についてそれぞれ
１２ 、４５および８３％で６った。 前記実験から、ｔ−ＰＡと血漿半減期の長いｔ−ＰＡ変
異体を混合物として又は連続的にヒト患者へ併用投与す
ると、前記薬剤をそれぞれ単独で用いるときの通常の用
量よりも有意に低い用量で効果的な血栓溶解が誘発され
ると結論づけることができる。
第１図は時間の関数としてのヒト血性のｌｎ ｖｉｔｒ
。 溶解を示す。 第２図はｔ−ＰＡおよびｔ＝ＰＡ変異体のそれぞれのｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ血塊浴解血性、前記２つの化合物の計算
上の合計活性、並びに前記２つの化合物の混合物の実験
的に観察された活性を示す。 第３図はストレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡ変異体、および
ストレプトキナーゼとｔ−ＰＡ変異体の混合物のｉｎ
ｖｌｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性第４図は初めに正常ｔ
−ＰＡで１感作”し、洗浄し、その後ｔ−ＰＡ変異体を
含む第２溶液に移したヒト血性に対するｔ−ＰＡ変異体
のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性 第５図はｔ−ＰＡＳｔ−ＰＡ変異体、およびｔ−ＰＡと
ｔ−ＰＡ変異体の１：４混合物のウサギにおける１ｎ ｖｉｖｏ崩栓溶解活性を示す。
。 溶解を示す。 第２図はｔ−ＰＡおよびｔ＝ＰＡ変異体のそれぞれのｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ血塊浴解血性、前記２つの化合物の計算
上の合計活性、並びに前記２つの化合物の混合物の実験
的に観察された活性を示す。 第３図はストレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡ変異体、および
ストレプトキナーゼとｔ−ＰＡ変異体の混合物のｉｎ
ｖｌｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性第４図は初めに正常ｔ
−ＰＡで１感作”し、洗浄し、その後ｔ−ＰＡ変異体を
含む第２溶液に移したヒト血性に対するｔ−ＰＡ変異体
のｉｎ ｖｉｔｒｏ血塊溶解血性溶解活性 第５図はｔ−ＰＡＳｔ−ＰＡ変異体、およびｔ−ＰＡと
ｔ−ＰＡ変異体の１：４混合物のウサギにおける１ｎ ｖｉｖｏ崩栓溶解活性を示す。
Claims (13)
- （１）製剤学的に許容しうる賦形剤中に主成分としての
修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子（修飾ｔ
−ｐＡ）と副成分としての正常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプ
トキナーゼまたはヒトウロキナーゼとの組合せを含有し
てなる血栓溶解組成物。 - （２）前記主成分は長い生物学的半減期を示すように修
飾されたｔ−ＰＡである、請求項１記載の血栓溶解組成
物。 - （３）副成分は前記二成分の合計重量の約３０％以下を
占める、請求項１または２記載の血栓溶解組成物。 - （４）修飾ｔ−ＰＡは正常ヒトｔ−ＰＡとの組合せで用
いられる、請求項１、２または３記載の血栓溶解組成物
。 - （５）輸血または注射に適した液状形態である、請求項
１〜４のいずれか１項記載の血栓溶解組成物。 - （６）前記二成分は約０．１〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度
で存在する、請求項５記載の血栓溶解組成物。 - （７）製剤学的に許容しうる賦形剤中で主成分としての
修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子（修飾ｔ
−ＰＡ）および副成分としての正常ヒトｔ−ＰＡ、スト
レプトキナーゼまたはヒトウロキナーゼを混合すること
から成る、血栓溶解組成物の調製方法。 - （８）前記副成分は長い生物学的半減期を示すように修
飾されたｔ−ＰＡと混合する、請求項７記載の方法。 - （９）前記修飾ｔ−ＰＡは正常ヒトｔ−ＰＡと混合する
、請求項７または８記載の方法。 - （１０）血栓溶解に効果的な量の請求項１〜６のいずれ
か１項記載の組成物を血栓症患者に投与することから成
る、血栓症の治療方法。 - （１１）ａ）血栓症患者に、初期注射によつて約３０ｍ
ｇまでの量の正常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼま
たはヒトウロキナーゼを投与し；その後ｂ）同一患者に
、２回目の注射によつてまたは輸液によつて血栓溶解に
効果的な量の修飾ｔ−ＰＡを投与する 各段階から成る、血栓症の治療方法。 - （１２）ａ）製剤学的に許容しうる賦形剤中のより少な
い量の正常ヒトｔ−ＰＡ、ストレプトキナーゼまたはヒ
トウロキナーゼ； ｂ）製剤学的に許容しうる賦形剤中の血栓溶解に効果的
な量の修飾された組織型プラスミノーゲン活性化因子（
修飾ｔ−ＰＡ）；およびｃ）血栓症患者に、ａ）および
ｂ）の組成物を同時にあるいは前記順序で連続的に投与
するための説明書 を含む、血栓症の治療に用いる医療用キットまたは包装
品。 - （１３）組成物ａ）は約１０ｍｇまで（例えば約１〜約
１０ｍｇ）の活性成分を含み、一方組成物ｂ）は約５０
ｍｇまで（例えば約１０〜約５０ｍｇ）の活性成分を含
む、請求項１２記載の医療用キットまたは包装品。
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| DE3741149A1 (de) * | 1987-12-04 | 1989-06-15 | Thomae Gmbh Dr K | Zubereitungsformen zur verhinderung von adhaesionen von organen und organteilen |
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