JPH0383583A

JPH0383583A - アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法

Info

Publication number: JPH0383583A
Application number: JP1218885A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Yamazaki; 信行山崎
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1989-08-25
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 1991-04-09
Anticipated expiration: 2014-05-31
Also published as: DE69020276D1; EP0418523B1; US5342770A; EP0418523A1; JP2896580B2; DE69020276T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［ａ業上の利用分野］本発明は還元末端を有しカルボキシル基を含まない糖を
ペプチドを介してリゾチームと結合してなるハイブリッ
ドとその合成法に関し、その目的はりゾチームの安定性
を増加させることである。

又、糖−リゾチームハイブリッドを合成するのに必要な
還元末端を有し、カルボキシル基を含まない糖とペプチ
ドを介してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを結合してい
る活性化糖を提供するものである。

これら糖−リゾチームハイブリッド、活性化糖の製造法
に関するものである。

［従来の技術］蛋白質は２０種のアミノ酸の結合による１次構造とそれ
によって規定される立体構造から成っている。蛋白質の
機能が種々あることはすでに知られていることであり、
生体内に於て安定な蛋白質も、生体外で利用すると不安
定となる。

蛋白質のすぐれた機能を種々の用途に応用しようとする
場合、次の様な欠点が蛋白質にはある。

すなわち、■熱、アルカリ、酸に不安定で変成しやすい
、■有機溶媒に不溶で活性を失いやすい、■抗原性があ
る、などである。

これらの欠点を解決するために、蛋白質を化学修飾する
ことがおこなわれてきた。蛋白質を化学修飾して蛋白質
ハイブリッドにすれば、これらの欠点を補うことは可能
となってきた。化学修飾の方法としては種々の方法が提
案されているが、最も良く使用されているのは非免疫性
合成高分子であるポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ
）を修飾剤とする方法である。

この方法は次の式に示す様にモノメトキシポリエチレン
グリコールと塩化シアヌル（２，４Ｊ−トリクロロ−５
−トリアジン）の合成物（活性化ＰＥＧ）をつくり、こ
の活性化ＰＥＧと蛋白質と反応させＰＢＧ−蛋白質ハイ
ブリッドを製造する。

この蛋白質−ハイブリッドを利用して次に示す様な数多
くの応用例が報告されているが、まだ実際に産業上に利
用されている例は少ない様である。

これは活性化ＰＥＧが不安定であり、又、均一な性質の
ものが得られていない、塩化シアヌルの毒性問題、活性
化ＰＥＧと蛋白質の反応が定量的にスムーズにいかない
などの欠点があるためである。

（活性化ＰＥＧ）蛋白質−ＮＨ２◆活性化ＰＥＧＨ（ＰＥＧ−蛋白質−ハイブリッド）ＰＥＧ−蛋白質−ハイブリッドの応用例を次に示す。

（ＩＩＰＥＧ−アスパラギナーゼ（Ｔ、Ｐｈａｒ＋ｌａ
ｃ。

Ｙ、にａｍｉｓａｋｉ　　ａｔ　ａｌ；Ｅｘｐ、Ｔｈｅ
ｒａｐ、２１６．４１０）抗Ｉｌ！瘍酵素であるアスパ
ラギナーゼを血中半減期の延長、抗原性の低下。

（２）ＰＥＧ−酵素−ハイブリッドを利用して酵素反応
を有機溶媒の中でも可能にした（Ｙ、Ｉ■ａｄａａｔ　
ａｌ；τｒｅｎｄｓ　！ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　４１９０（１９８６）Ｋ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｔ
ｔ　ａｌ；Ｊ、Ｏｒｇ　Ｃｈｅｗ　５０３４１４（１９
８５）に、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ；Ｅｎｘｙ
ｍｅ　３２２３５（１９８４）。

に、Ｔａｋａｈａｓｈｌ　ｅｔ　ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍ
　Ｂｌｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ。

Ｇｏ＋ｅｍｕｎ：１２５７６１（１９８４））　。

カタラーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、ペルオキシダ
ーゼなど。

（３ＪＰＥＧ−アデノシンデア衾ナーゼ（Ｍ、Ｓ。

Ｈａｒｓｈｆｉｅｌｄ　ａｔ　ａｌ；Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ
、Ｍｏ１．３１６，４９３（１９８５））遺伝的酵素欠損症の一つにアデノシンアよナーゼ（ＡＤ
Ａ）欠損症があるが、このＡＤＡを投与する場合ＰＥＧ
−ＰＤＡハイブリッドにすると血中半減期が著しく延長
するなどの効果が報告されている。

Ｔ４）ＰＥＧ−インターロイキン２（井木泰治；化字と
生物　ＶＯＬ２７．ｐａｇｅ４２６１９８９）リンホカ
インの一極であるインターロイキン２は遺伝子組換えの
技術によって大量に生産されるが１１鎖が欠けているた
め不安定であり、ＰＥＧ−インタロイキン２のハイブリ
ッドとすることで安定化でき抗腫瘍効果も向上できた。

蛋白質とのハイブリッドをつくるにはＰＥＧの他に糖類
も利用されている。これらの利用方法としては次の　（
イ）〜（ニ）の様な方法があるが得られたハイブリッド
の効果については前に記述したＰＥＧの場合とほぼ同様
である。

（イ）Ａヨウ素酸酸化法＋０１臭化シアン法（ハ）塩化シアヌル法（＝）エピクロルヒドリン法（イ）の方法は過ヨウ素酸による反応が過酷であるので糖が分
解することもあり、又、蛋白質との結合に還元剤を使う
必要があり、蛋白質の変性の可能性があるなどの欠点が
ある。（ロ）の方法は、毒性のある臭化シアンを使用す
る。又、蛋白質を結合させる時にｐＨの調製を厳密にす
る必要があるなどの欠点がある。（八）の方法は、塩化
シアヌルが毒性があり、塩化シアヌルと糖との反応がス
ムーズにいかないなどの欠点がある。（ニ）の方法はエ
ピクロルヒドリンによって糖同志が架橋する。

などの欠点を有する。　（イ）〜（ニ）の方法の共通の
欠点は構成糖の−ＯＨと反応するため、結合する位置が
一定とならないことであり、又、糖のどの−ＯＨとも反
応するため各々の糖が持つ特有の性質が失われることで
ある。

溶菌酵素であるリゾチームは医業などに広く利用されて
いるが、その安定性を増すためには遺伝子工学の技術に
より構成しているアよノ酸の組成を変更したり、目的の
アミノ酸の間を架橋するなどの高度な技術を要したり手
間がかかる操作を必要とする（参照：井木泰治；化学と
生物　ＶＯＬ２７゜ｐａｇｅ４２３１９８９）　　。

［発明が解決しようとする問題点］本発明は下記（１）〜（３）の主要目的を有する。

（１１ｉ１元末端を有しカルボキシル基を含まない糖と
蛋白質のアよ）基とを毒性がある試薬を使うこともなく
糖の還元末端のみと反応させて糖本来の性質を失うこと
なく、反応をスムースにおこなわせて結合させるための
活性化糖を提供することを目的とする。

（２）又、上の発明を利用してリゾチームの安定性を増
すためにリゾチームと糖のハイブリッドを提供すること
を目的とする。

（３）これらの活性化糖、糖−リゾチームの製造方法を
目的とする。

その他の目的は、以下の記述から明らかにされる。

［問題点を解決するための手段］本発明の構成と効果につき以下に詳述する。

（１１３元末端を有しカルボキシル基を含まない糖をペ
プチドを介してリゾチームと結合してなるハイブリッド
。

（２）前記第１項記載の糖がアミロースであるハイブリ
ッド。

（３）前記第１項記載のペプチドがグリシルグリシンで
あるハイブリッド。

（４）前記第１項記載の糖が単糖、オリゴ糖、ＳＩＮか
ら選ばれたいづれかであるハイブリッド。

（５ｊ　ｉｊ１元末端を有しカルボキシル基を含まない
糖とペプチドを介してＮ−ヒドロキシスクシンイミドと
結合してなる活性化糖。

（６）前記第５項記載のペプチドがグリシルグリシンで
ある活性化糖。

（７）前記第５項記載の糖が！＃糖、オリゴ糖、多糖か
ら選ばれたいづれかである活性化糖。

（８）還元末端を有し、カルボキシル基を含まない糖を
還元剤存在下、両末端にアくノ基とカルボキシ基を有す
るペプチドと反応させ、ついで縮合剤存在下Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドを結合させることを特徴とする活性
化糖の製造法。

（９）前記第８項記載のペプチドがグリシルグリンであ
る活性化糖の製造法。

（１０）前記第８項記載の糖がＪＬ糖、である活性化糖
の製造法。

オリゴ糖、多糖シＡ、活性化糖の合成：（１）第１工程：還元糖を有する糖を緩衝液中あるいはジメチルスルホキ
シドなどの有機溶媒中に溶解させ両端にアよノ基、カル
ボキシル基を持つペプチドと還元剤を加えて反応させて
後述の式［１］の様な化合物をつくる。

この場合のＮ荷液は特に限定しないがアミノ基を含まな
くてｐＨ５〜９であれば良い、該糖としては単糖、オリ
ゴ糖、多糖である。ペプチドは特に限定しないが、構成
するアミノ酸は２〜ｌＧ個が適当である。還元剤として
は、ソディウムボロハイドライド（以下５ＢＨ）、ソデ
ィウムシアノボロハイドライド（ＮａＢ）Ｉ、ｆ：Ｎ、
以下５ＣＢＨとする）や、ジメチルアミンボラン（（Ｃ
Ｈ３）　２ＨＮＢＨ３，以下ＤＭＡＢとする）が良い。

反応温度はＩＱ〜ａＯ℃が好ましい０反応終了後、未反
応のペプチド、還元剤はゲル濾過や限外濾ＡＦＩＡで分
離して除く。

［１１（２）第２工程：前記［夏］を緩衝液、有機溶媒中に溶解させＮ−ヒドロキシスクシンイミド（以下ＨｏＮ５ｕとする）と縮合剤を加え［Ｉ＋　］を合成する。縮合剤はジ
シクロへキシルカルボジイミド（以下ＤＣＣとする）、
１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒ
ドロキシキノリン（以下ＥＥＤＱ）、ジサクシイミドカ
ーボネイト（以下ＤＳＣとする）、ｌ−エチル−３−（
３−ジメチルア泉ノブロビル）−カルボジイミドハイド
ロクロライド（以下ＥＤＣとする〉などが適当である。

［Ｉ＋　］はペプチド糖と　ＨｏＮ５ｕと結合している
化合物で、今まで得られていない新しい化合物であり、
蛋白質のアミノ基と容易に反応できる様なかたちなって
おり活性北朝と以下称す。

Ｂ、リゾチーム−糖ハイブリッドの合成：活性北朝［１
１］とりゾチームをアミノ基を含まない１１衝液中で反
応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーあるいは限外
濾過膜で糖−リゾチームハイブリッドと活性化ｍ［Ｉ＋
］を分離する。

この反応はほぼ定量的に進むが、未反応のりゾチームの
存在する場合は、陽イオン交換体のＣＭ−イオン交換体
でリゾチームと糖−リゾチームハイブリドーマを分離し
てリゾチーム−糖ハイブリドーマを得ることができる。

この様に本発明によれば比較的簡単に糖の還元末端と結
合したりゾチームー糖ハイブリッドを得ることができ画
期的である。リゾチーム以外の蛋白質についても糖−蛋
白質ハイブリッドを調製することが可能である。

Ｃ，＠−リゾチームハイブリッドの安定性；糖−リゾチ
ームハイブリッドがリゾチームに比較してどの様に安定
性が増加したかを調べるために熱に対するリゾチーム活
性を検討した。リゾチーム活性はゲルコールキチンを基
質として測定した。

その結果未修飾リゾチームは８０を以上の高温になると
著しく活性が低下するのに対し、糖リゾチームハイブリ
ッドは９０〜１００ｔ：の高温でも８０％の活性が維持
できその安定性の高さは画期的であった。

糖としては、アミロースをはじめ、アミロペクチン、キ
トサン、デキストラン、アガロースなどが応用される。

たｙし、カルボキシル基を有する糖質は蛋白質同志の分
子間架橋が生じるため末法を適用するには望ましくない
。

［実施例コ以下、実施例について説明する。

実施例１　アミロース−グリシルグリシンの合成：アミロース（平均重量分子量２９，０００＞　１．０ｇ
を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）ｌ　８．５）　　１０■
Ａに溶解し、グリシル−グリシンをアミロースの５倍モ
ル比相当量、５ＣＢＨを５０倍モル比相当量を加えて８
０℃で２日間攪拌する。濃塩酸でｐＨ３に調整し、さら
に６０℃で５時間攪拌する。　Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７に
調整する。

この反応液をゲル濾過剤（商品名セルロファインＧＣＬ
−２５）でゲルクロマトグラフィーなおこない、未反応
のグリシル−グリシン５ＣＢＨを除去する０図１にゲル
濾過の結果を示すが、始めのピークの部分を分取する。

後のピークは、グリシル−グリシン５ＣＢＨである０分
取した液は凍結乾燥した。なお、ゲル濾過は（カラム　
１．２Ｘ６０ｃｍ、溶出液：水、流速：　　１０ｍｕ／
ｈｒ）で行った。

アミロース−グリシルグリシンは０．９ｇ得られた。

実施例２　活性化アミロースの合成：実施例１で得たアミロース−グリシルグリシン０．５８
をジメチルスルホキサイド２　閣文に溶解させて、　）
ｌｏＮｓｕ、　Ｄ　ＣＣをアミロース−グリシルグリシ
ンの１０倍モル比相当量を加え、室温で１夜攪拌する。

不溶解物を濾過しアセトン　２０ｍｊ２を加え、３．０
００回転で５分間攪拌し析出してくる沈殿を濾取する。

減圧下で乾燥して活性化アミロース０．４８を得た。

実施例３　アミロース−リゾチームハイブリッドの合成
：１１１１１ｇのりゾチームを０．１Ｍホウ酸Ｎｉ街荷液
ｐＨ８，５）に溶解させ、１７．２ｇの実施例２で得た
活性化アミロースを加え室温で１夜攪拌する。

０．１Ｍリン酸１１ｍ液（ｐＨ５，Ｑ）　＋０．１Ｍ　
ＮａＣ１に対し、透析する。不溶解物を濾別し、濾液を
ゲル濾過剤（セルロファインＧＣＬ−３００）にかけゲ
ルクロマトグラフィーをおこなう。この結果を図２に示
す、先のピークの部分を分取する。後のピークの部分は
未反応の活性化アミロースである。なお、ゲル濾過は（
カラム：　　１．５ｘ　［１４ｃｍ、　４１衝液：　０
．ＩＭリン酸緩衝液＋　０．１％　ＮａＣ１，流速：１
０．２１Ｉｆｔ／　ｈｒ）で行った。

分取した部分を凍結乾燥してアミロースリゾチームハイ
ブリッドを８ｍｇ得た。

実施例４　リゾチームの活性測定法１　　ｔａｉｌの０．１％グリコールキチン溶液に（１
，１−文のりゾチームア主ロースーリゾチームハイブリ
ッドを加え４０℃で３０分間放置後、２　ｗｒｎの０．
０５％に５Ｆｅ（ＣＮ）３を加える。　１５分間沸騰さ
せて４２０■の吸収を測定する。？１４度と吸光度の関
係を図３に示す。

実施例５　アミロースリゾチームハイブリッドの安定性
：５００μぶのアミロース−リゾチームハイブリッド、リ
ゾチーム溶液を２０℃、８０’Ｃ１９０℃、　１００’
Ｃに３０分間静置する。

さらに室温に２．５時間放置後、実施例４の方法にした
がってリゾチーム活性を測定する。

結果を図４に示す、アミロースリゾチームハイブリッド
はりゾチームの９０％の活性を維持していた。１００℃
３０分間の処理すると、未修飾リゾチームの活性の低下
は著しいのに対しアミロースリゾチームハイブリッドの
活性は９０％維持されて、鮎安定性が非常に増加された
ことがわかる。

【図面の簡単な説明】

図Ｉ　Ｎ４は、本発明の詳細な説明図である。以上特許出願人チッソ株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）還元末端を有しカルボキシル基を含まない糖をペ
プチドを介してリゾチームと結合してなるハイブリッド
。
（２）請求項第１項記載の糖がアミロースであるハイブ
リッド。
（３）請求項第１項記載のペプチドがグリシルグリシン
であるハイブリッド。
（４）請求項第１項記載の糖が単糖、オリゴ糖、多糖か
ら選ばれたいづれかであるハイブリッド。
（５）還元末端を有しカルボキシル基を含まない糖とペ
プチドを介してＮ−ヒドロキシスクシンイミドと結合し
てなる活性化糖。
（６）請求項第５項記載のペプチドがグリシルグリシン
である活性化糖。
（７）請求項第５項記載の糖が単糖、オリゴ糖、多糖か
ら選ばれたいづれかである活性化糖。
（８）還元末端を有し、カルボキシル基を含まない糖を
還元剤存在下、両末端にアミノ基とカルボキシル基を有
するペプチドと反応させ、ついで縮合剤存在下Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドを結合させることを特徴とする活
性化糖の製造法。
（９）請求項第８項記載のペプチドがグリシルグリシン
である活性化糖の製造法。
（１０）請求項第８項記載の糖が単糖、オリゴ糖、多糖
である活性化糖の製造法。