JP2007523655A - 多分岐多糖画分の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、2000〜29000ダルトンの範囲の平均分子量及び10%より大きくかつ20%未満の平均枝分れ度を有する多分岐アミロペクチンを製造するための方法に関する。該枝分れ度は、分枝点を有するアンヒドログルコース単位のmol%で表される。本発明の方法によれば、第1の加水分解工程において、植物のアミロペクチン又はアミロペクチン中に豊富なデンプンの分子量をα-アミラーゼ又は酸による加水分解によって60000ダルトン以下の分子量に低下させ、かつ、第2の加水分解工程において、該第1の加水分解工程で得られた分解生成物の分子量をβ-アミラーゼ分解によってさらに減少させる。本発明はさらに該多分岐アミロペクチンと薬剤との結合生成物の製造に関する。
Description
本発明は、多分岐アミロペクチンの製造方法に関し、また、多分岐アミロペクチンと活性薬理成分との結合生成物の製造方法に関する。
非経口投与される活性薬理成分に親水性ポリマーを結合することによってその副作用を減らすことが可能であることが分かってきた。特に、そのような活性成分の分子量を増加させることにより、結合生成物の分子サイズが腎臓(フィルターのように作用する)の排除限界を超える場合、腎臓への副作用を減らすか、さらには防止することも可能である。これに関し、結合生成物の分子サイズは、適当に選択されるポリマーの分子量によって調節される。
親水性ポリマーと活性薬理成分との結合生成物のさらなる利点は、治療タンパク質の抗原性が低下されること、従って、それに関連する副作用を低下又は回避できることである。
同様に、そのような結合生成物により、薬物動態学半減期をかなり引き延ばすことができ、従って、患者の血清中での活性薬理成分の滞留時間をかなり引き延ばすことができる。これにより、非経口投与において、治療間隔をかなり長くすることが可能になる。
上述した活性薬理成分への結合に適したポリマー類は、特に、ポリエチレングリコール類[Herman, S. et al., Poly(Ethylene Glycol) with Reactive Endgroups: I.Modification of Proteins, Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 10. (1995)145-187]、あるいは、多糖類であり、例えばデンプン誘導体及びデキストラン類である。適当な活性化は、活性成分との結合によるものである。
この場合、それ自体が公知であり、固相にリガンドを固定化する手法や蛋白質結合若しくは架橋反応から既に知られている、化学的方法により、活性成分と担体分子が結合する。適当な方法は、G. T. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press Inc. (1992)に記載され、さらに、S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press LLC (1993)及びC. P. Stowell et al., Neoglycoproteins, the preparation and application of synthetic Glycoprotein, In: Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 37 (1980), 225-281に記載されている。
これに関し、デンプン誘導体と比較して、ポリエチレングリコール類の欠点は、それが体内で直接代謝され得ないということである。一方、デンプン誘導体は、内因性の血清α-アミラーゼによって分解され得る。体内でのデンプン誘導体の分解は、適当な置換(例えば、ヒドロキシエチル基による置換)によって意図的に遅らせることができ、そして、非経口投与することができる活性成分抱合体の反応速度(動力学)を調整することが可能になる[K. Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, volume 8, no.8, (1987)]。
しかし、ヒドロキシ基によるデンプンの誘導体化には欠点があり、それは、調製によってヒドロキシエチル基の鎖に沿った分布が不均一となり、その結果、炭水化物鎖の特定の位置で置換度が局所的に高くなることにより、内因性酵素によってさらに分解することができない断片が生体内での分解中に形成されることである。これらの画分は、いわゆる蓄積画分(storage fraction)を形成する[P. Lawin, et al., Hydroxyethylstarke, Eine aktuelle Ubersicht, Georg Thieme Cerlag (1989)]。
DE10217994は、活性薬理成分への結合のための多分岐多糖類を記載する。その開示された多分岐アミロペクチンは、内因性グリコーゲンに類似する構造を有し、従って、非常によく許容され、体内で完全に分解され得る。枝分れ度(分枝度)を調節することにより、誘導体化をさらに行うことなく血清において必要な滞留時間が得られるよう、多分岐アミロペクチン分解の反応速度を調節することが可能である。
その多分岐アミロペクチンの製造に関し、DE10217994は、EP1369432を引用している。EP1369432は、α-1,6-グリコシド結合の割合が10%を超え、好ましくは12〜30%であり、分子量が35000〜200000ダルトンである可溶性の多分岐グルコースポリマーを開示する。EP1369432によれば、枝分れ度を高めるため、デンプンの水性懸濁物又はデンプンの溶液を分枝酵素(枝作り酵素)で処理し、次いで、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、アンヒドログリコシダーゼ、及びα-トランスグルコシダーゼからなる群より選ばれる酵素で加水分解することにより、これらのポリマーが生成される。この目的に必要な分枝酵素は、生物及び/又は微生物から抽出されるものであり、グリコーゲン分枝酵素、デンプン分枝酵素、及びそれらの酵素の混合物からなる群より選択されるものである。
EP1369432に記載される方法の欠点は、複雑で、高価なことである。特に、分枝酵素(目下、市販されていない)を使用することは、生物及び/又は微生物からのいずれも場合でも、それを余分に分離することが必要なことを意味する。
従って、本発明の目的は、活性薬理成分の担体分子として用いることができる多分岐多糖類を製造するための簡単で費用効果が高い方法を提供することである。
驚くべきことに、請求項1に記載の方法によって、この目的が達成されることを見出した。これに必要なことは、第1の加水分解工程において、植物のアミロペクチン又はアミロペクチンに富むデンプンをα-アミラーゼ又は酸による加水分解によって60000ダルトン以下の分子量に分解すること、及び、第2の加水分解工程において、該第1の工程からの分解生成物の分子量をβ-アミラーゼ分解によってさらに低下させることである。
さらに見出されたことは、アミロペクチン又はアミロペクチンに富むデンプンを60000以下の重量平均分子量に酸加水分解することにより、枝分れ度の顕著な増加をもたらすことが可能であったことである。
本発明に対応するそのような多分岐アミロペクチンは、2000ダルトン以上の重量平均分子量と10%以上の枝分れ度を有することが好ましい。2000ダルトン以上でかつ29000ダルトン以下の重量平均分子量、及び10%以上でかつ20%以下の枝分れ度が特に好ましい。
これに関し、アミロペクチンは、第一に、アンヒドログルコース単位間にα-(1-4)結合及びα-(1-6)結合を有する非常に広く枝分れしたデンプン類またはデンプン生成物を意味する。この場合、鎖における枝は、α-(1-6)結合を介して生じる。天然のアミロペクチン類において、その分枝点は、約15〜30のグルコース単位ごとに不規則に存在する。天然のアミロペクチンの分子量は、非常に高く、107〜2×108ダルトンの範囲にある。また、アミロペクチンは、所定の範囲内でらせんを形成すると考えられる。
枝分れ度をアミロペクチン類に対して規定することができる。枝分れの尺度は、アミロペクチンにおけるアンヒドログルコース単位の総数に対する、分枝点(α-(1-6)結合)を有するアンヒドログルコース単位の数の比である。この比はmol%で表される。天然に存在するアミロペクチンは、約4mol%の枝分れ度を有する。多分岐アミロペクチンは、天然に存在する枝分れ度に比べて、顕著に高い枝分れ度を有する。これに関し、枝分れ度は、いずれの場合も、平均値(平均枝分れ度)である。というのも、アミロペクチンは多分散物質であるからである。
本発明に関し、多分岐アミロペクチンは、10mol%以上の平均枝分れ度を有するアミロペクチンを意味することを意図している。
植物のアミロペクチン又はアミロペクチンに富むデンプンをα-アミラーゼ又は酸加水分解によって分解することにより、それぞれの加水分解生成物の加水分解度に応じて、それぞれの場合に、同様の枝分れ度を有するアミロペクチンが得られる。これに関し、酸加水分解による分解は、α-アミラーゼによる酵素的分解よりも、実施しやすく、安価である。さらに、酸加水分解によれば、インプロセスHPGPCにより加水分解工程中の加水分解度を追跡することが可能であり、意図的に加水分解度を調整することも可能である。酸加水分解による分解は、従って、α-アミラーゼによる分解よりも、特に好ましい。
第1の加水分解工程で得られた生成物のβ-アミラーゼ処理により、選択的に、α-1,4-グリコシドアンヒドログルコース単位に該生成物が分解される。この分解では、外側の非還元鎖末端におけるマルトース単位の排除があり、α-1,6-グリコシド枝自体は切断されない。この場合、分解は、外側鎖末端から、最初に出てくる分枝点の前の約2グルコース単位まで、起こる。この結果、アミロペクチンの1,6-グリコシド結合に富み、従って枝分れ度が高くなっている、いわゆるβ-限界デキストリン(β-genzdextrin)が生じる。
本発明に関し、あらゆるアミロペクチン含有デンプン類を出発原料として用いることができる。これに関し、ワキシー(waxy)トウモロコシデンプン及びキャッサバデンプンが特に好ましい。
高い枝分れ度のため、該β-限界デキストリンは、血清において、その分、ゆっくり分解される。というのも、そこでは、多糖類の分解について、α-アミラーゼが支配的であるからである。本発明の方法による生成物は、従って、活性薬理成分への結合に適している。
アミロペクチンの枝分れ度及び分子量のパラメータにより、目標とする作用、例えば所望の薬物動態学の調整、特に、所望のα-アミラーゼ分解の達成を可能にする。アミロペクチンの枝分れ度は、これに関し、重要な役割を有し、共に、分子量もまた上述した反応速度に影響を及ぼす。さらに、分枝生成物の分布を通して、望ましい方向であるアミロペクチン分解の反応速度に影響を与えることが可能となる。
本発明の方法において、5000ダルトン未満、さらには1000ダルトン未満の絶対分子量を有する低分子量の不純物を、第1の加水分解工程の後、及び/又は、第2の加水分解工程の後、除去することが好ましい。この除去は、5000ダルトン又は1000ダルトンのカットオフ値を有する膜を用いた限外ろ過により行うことが好ましい。除去される不純物は、主に、アミロペクチン及びデンプンの低分子量分解生成物、並びに塩酸である。
本発明により分解された生成物は、凍結乾燥により分離することが好ましい。
α-アミラーゼ及びβ-アミラーゼは、市販され利用できる、費用効果の高い酵素である。従って、これらの分子を用いた加水分解は、簡単にかつ高い費用効果で行うことができる。同じことが、酸加水分解にあてはまる。限外ろ過及び凍結乾燥による精製もまた、簡単でありかつ高価なものではない。従って、本発明の製品は、簡単にかつ高い費用効果で製造することができる。
第2の加水分解工程の加水分解生成物は、活性薬理成分に結合させることが好ましい。該活性薬理成分は、タンパク質又はポリペプチドであることが好ましい。
本発明により製造される多分岐アミロペクチンの活性薬理成分への結合は、公知の態様で行うことができる。活性薬理成分の多糖へのそのような結合は、例えば、WO02/080979、PCT/EP02/06764、WO03/074088、WO03/074087、PCT/EP03/13622、DE10254754.9、及びPCT/EP04/00488に記載されている。
活性薬理成分は、多分岐アミロペクチンの還元鎖末端のアンヒドログルコース単位に、遊離アミノ官能基を介して結合させることが好ましい。この目的のため、多分岐アミロペクチンの還元末端を活性化することが特に好ましい。これに関し、多分岐アミロペクチンの還元末端を酸化して、アルドン酸にすることや、該アルドン酸基を活性化して、アルドン酸エステル基にすること、そして、該アルドン酸エステル基を介して、活性薬理成分を多分岐アミロペクチンに結合させることが好ましい。同様に、本発明により調製される生成物を、無水媒質中、炭酸ジエステルと反応させて多分岐アミロペクチンの炭酸ジエステルを生成させること、そして、多分岐アミロペクチンの炭酸ジエステルを活性成分と結合させることが好ましい。
本発明を実施例及び比較例によって以下により詳細に説明するが、本発明をそれらの実施例に限定することを意図するものではない。
測定方法
分子量及び重量平均分子量は、通常の方法によって測定した。それらには、例えば、水系GPC、HPGPC、HPLC、光散乱などがある。
分子量及び重量平均分子量は、通常の方法によって測定した。それらには、例えば、水系GPC、HPGPC、HPLC、光散乱などがある。
枝分れ度は、1HNMR法によって測定した。
[実施例1]
55gのシンボイリングワキシートウモロコシデンプン(thin-boiling waxy corn starch)を、1000mlの脱イオン水で懸濁し、その懸濁液を還流下で沸騰させた。それにより、ワキシートウモロコシデンプンを完全に溶解させた。溶解後、1NのHClでそのpHを2.0に調整し、そして、混合物を還流下で1時間加熱した。冷却後、脱イオン水に対し、公称カットオフ値が5000ダルトンの膜を用いて限外ろ過を行った。このようにして精製された物質を凍結乾燥によって分離した。その収率は60%であった。該物質の特性は、重量平均分子量が42000ダルトン(HPGPCにより測定)であり、枝分れ度は7mol%(1HNMRにより測定)であることが明らかとなった。
55gのシンボイリングワキシートウモロコシデンプン(thin-boiling waxy corn starch)を、1000mlの脱イオン水で懸濁し、その懸濁液を還流下で沸騰させた。それにより、ワキシートウモロコシデンプンを完全に溶解させた。溶解後、1NのHClでそのpHを2.0に調整し、そして、混合物を還流下で1時間加熱した。冷却後、脱イオン水に対し、公称カットオフ値が5000ダルトンの膜を用いて限外ろ過を行った。このようにして精製された物質を凍結乾燥によって分離した。その収率は60%であった。該物質の特性は、重量平均分子量が42000ダルトン(HPGPCにより測定)であり、枝分れ度は7mol%(1HNMRにより測定)であることが明らかとなった。
[実施例2]
実施例1のワキシートウモロコシデンプンの分解画分10gを、1000mlの0.15モル濃度の酢酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、そして、10単位/mlのβ-アミラーゼ(Sigmaから入手、サツマイモ由来のβ-アミラーゼ タイプI-B、Art. No. A7005)を添加した。その混合物を25℃で12時間反応させた。次いで、その混合物を100℃で10分間沸騰させることにより、該酵素を失活させた。冷却の後、約2重量%(基質に対して)の活性炭を反応混合物に添加し、そして、ろ過により除去した。その後、カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いた反応物の限外ろ過により、マルトース及び緩衝液を除去した。そして、β-限界デキストリンを凍結乾燥により分離した。その収率は60%であった。特性は、枝分れ度は14mol%(1HNMRにより測定)であり、重量平均分子量は28000ダルトンであることが明らかとなった。
実施例1のワキシートウモロコシデンプンの分解画分10gを、1000mlの0.15モル濃度の酢酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、そして、10単位/mlのβ-アミラーゼ(Sigmaから入手、サツマイモ由来のβ-アミラーゼ タイプI-B、Art. No. A7005)を添加した。その混合物を25℃で12時間反応させた。次いで、その混合物を100℃で10分間沸騰させることにより、該酵素を失活させた。冷却の後、約2重量%(基質に対して)の活性炭を反応混合物に添加し、そして、ろ過により除去した。その後、カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いた反応物の限外ろ過により、マルトース及び緩衝液を除去した。そして、β-限界デキストリンを凍結乾燥により分離した。その収率は60%であった。特性は、枝分れ度は14mol%(1HNMRにより測定)であり、重量平均分子量は28000ダルトンであることが明らかとなった。
[実施例3]
実施例1と同様に実施例3を行ったが、加水分解時間を4時間に引き延ばした。この場合、15000ダルトン未満の重量平均分子量を有する生成物を得るため、加水分解法をインプロセスHPGPCによって追跡した。実施例1に対して、公称カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いて、その後、限外ろ過による精製を行った。その収率は25%であった。物質の特性は、重量平均分子量は10000ダルトンであり、枝分れ度は10.3mol%であることが明らかとなった。
実施例1と同様に実施例3を行ったが、加水分解時間を4時間に引き延ばした。この場合、15000ダルトン未満の重量平均分子量を有する生成物を得るため、加水分解法をインプロセスHPGPCによって追跡した。実施例1に対して、公称カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いて、その後、限外ろ過による精製を行った。その収率は25%であった。物質の特性は、重量平均分子量は10000ダルトンであり、枝分れ度は10.3mol%であることが明らかとなった。
[実施例4]
実施例3からの加水分解生成物を用いて、実施例2と同様にしてβ-限界デキストリンを調製した。その収率は60%であった。物質の特性は、重量平均分子量は7000ダルトンであり、枝分れ度は15mol%であることが明らかとなった。
実施例3からの加水分解生成物を用いて、実施例2と同様にしてβ-限界デキストリンを調製した。その収率は60%であった。物質の特性は、重量平均分子量は7000ダルトンであり、枝分れ度は15mol%であることが明らかとなった。
[実施例5]
55gの国内産キャッサバデンプンを、1000mlの脱イオン水中、還流下で加熱してゼラチン化した。次いで、11mlの1N HClを添加してpHを約1.9に調整した。30分後、ゲルは低い粘度となり、そして混合物をさらに7時間還流下で加熱した。冷却後、沈殿及び濁りをろ過によって除去し、そして、脱イオン水に対し、公称カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いて限外ろ過を行った。その収率は24.4%であった。物質の特性は、重量平均分子量は10000ダルトンであり、枝分れ度は9.6mol%であることが明らかとなった。
55gの国内産キャッサバデンプンを、1000mlの脱イオン水中、還流下で加熱してゼラチン化した。次いで、11mlの1N HClを添加してpHを約1.9に調整した。30分後、ゲルは低い粘度となり、そして混合物をさらに7時間還流下で加熱した。冷却後、沈殿及び濁りをろ過によって除去し、そして、脱イオン水に対し、公称カットオフ値が1000ダルトンである膜を用いて限外ろ過を行った。その収率は24.4%であった。物質の特性は、重量平均分子量は10000ダルトンであり、枝分れ度は9.6mol%であることが明らかとなった。
[実施例6]
実施例5からの加水分解物質を用いたこと以外、実施例2と同様にしてβ-限界デキストリンを調製した。その収率は55%であった。物質の特性を明らかにした結果、重量平均分子量は5000ダルトンであり、枝分れ度は16mol%であった。
実施例5からの加水分解物質を用いたこと以外、実施例2と同様にしてβ-限界デキストリンを調製した。その収率は55%であった。物質の特性を明らかにした結果、重量平均分子量は5000ダルトンであり、枝分れ度は16mol%であった。
[実施例7]
実施例2からのワキシートウモロコシ分解画分をpH7.2の等張リン酸緩衝液中に溶解させて1重量%の溶液とした。該溶液を37.0℃に加熱し、そして、ブタ膵臓由来のα-アミラーゼ(Rocheから入手、AS, Art. No. 102814)0.5I.U./mlを添加した。1時間及び3時間後にサンプルを採取し、該酵素を熱により失活させた。そして、残存する高分子量画分の分子量をHPGPCにより測定した。この場合、最初の重量平均分子量は28000ダルトンであり、1時間の加水分解後の重量平均分子量は11000ダルトンであり、そして、3時間の加水分解後の重量平均分子量は7000ダルトンであった。
実施例2からのワキシートウモロコシ分解画分をpH7.2の等張リン酸緩衝液中に溶解させて1重量%の溶液とした。該溶液を37.0℃に加熱し、そして、ブタ膵臓由来のα-アミラーゼ(Rocheから入手、AS, Art. No. 102814)0.5I.U./mlを添加した。1時間及び3時間後にサンプルを採取し、該酵素を熱により失活させた。そして、残存する高分子量画分の分子量をHPGPCにより測定した。この場合、最初の重量平均分子量は28000ダルトンであり、1時間の加水分解後の重量平均分子量は11000ダルトンであり、そして、3時間の加水分解後の重量平均分子量は7000ダルトンであった。
[実施例8]
実施例4からの分解画分を用いて、実施例7の方法を繰り返し行った。この場合、最初の重量平均分子量は7000ダルトンであり、1時間の加水分解後の重量平均分子量は5500ダルトンであり、そして、3時間の加水分解後の重量平均分子量は4600ダルトンであった。
実施例4からの分解画分を用いて、実施例7の方法を繰り返し行った。この場合、最初の重量平均分子量は7000ダルトンであり、1時間の加水分解後の重量平均分子量は5500ダルトンであり、そして、3時間の加水分解後の重量平均分子量は4600ダルトンであった。
[比較実験1]
実施例2からの分解画分の代わりに市販のヒドロキシエチルデンプン(130/0.4、商標名「Voluven」)を用いて実施例7と同様に比較実験1を実施した。最初の重量平均分子量は140200ダルトンであり、1時間後の重量平均分子量は54700ダルトンであった。3時間の加水分解後の重量平均分子量は33700ダルトンであった。
実施例2からの分解画分の代わりに市販のヒドロキシエチルデンプン(130/0.4、商標名「Voluven」)を用いて実施例7と同様に比較実験1を実施した。最初の重量平均分子量は140200ダルトンであり、1時間後の重量平均分子量は54700ダルトンであった。3時間の加水分解後の重量平均分子量は33700ダルトンであった。
従って、比較実験1のα−アミラーゼを用いたヒドロキシエチルデンプンを素材とした市販の血清増量剤の分解速度は、実施例7の多分岐アミロペクチン画分の分解速度と同程度である。
[実施例9]
実施例4の多分岐アミロペクチン画分の還元末端基のアルドン酸への酸化
実施例4で得られた多分岐分解画分の脱イオン水中25重量%の溶液を調製した。この溶液に、還元末端基に対し3.5倍モル過剰の0.05モルヨウ素溶液を複数回に分けてゆっくり添加し、それぞれの場合において0.1NのNaOH(ヨウ素に対し3倍モル量)を用いて複数回に分けて除去した。添加後、室温で一晩反応を続け、得られた溶液を、公称カットオフ値が1000ダルトンの膜を用いて、pHを監視しながら透析した。透析物のpHが約6に達し、ヨウ素酸ナトリウムの添加及び酸性化によりヨウ素が無いことを確認した後、混合物を、0.1NのHClでpH2.5に調整し、限外ろ過液のpHが5になるまでさらに透析した。生成物を凍結乾燥によって分離した。その収率は、理論収率の80%であった。酸化度は、90%を超えており、還元末端基を介して測定した。
実施例4の多分岐アミロペクチン画分の還元末端基のアルドン酸への酸化
実施例4で得られた多分岐分解画分の脱イオン水中25重量%の溶液を調製した。この溶液に、還元末端基に対し3.5倍モル過剰の0.05モルヨウ素溶液を複数回に分けてゆっくり添加し、それぞれの場合において0.1NのNaOH(ヨウ素に対し3倍モル量)を用いて複数回に分けて除去した。添加後、室温で一晩反応を続け、得られた溶液を、公称カットオフ値が1000ダルトンの膜を用いて、pHを監視しながら透析した。透析物のpHが約6に達し、ヨウ素酸ナトリウムの添加及び酸性化によりヨウ素が無いことを確認した後、混合物を、0.1NのHClでpH2.5に調整し、限外ろ過液のpHが5になるまでさらに透析した。生成物を凍結乾燥によって分離した。その収率は、理論収率の80%であった。酸化度は、90%を超えており、還元末端基を介して測定した。
[実施例10]
実施例9のアルドン酸66mgを乾燥DMF0.5mlに溶解し、3.4mgのN,N'-ジスクシンイミジルカーボネートを添加して、室温で2時間、反応させた。ウシ血清アルブミン(BSA)の1重量%溶液0.5mlを、1モル重炭酸塩溶液180mlと混合した。次いで、活性化されたアルドン酸を2回(各回100μl)に分けて該BSA溶液に滴下し、それぞれの場合において半時間反応させた。次いで、混合物を塩酸で7.4のpHに調整した。HPGPCによる反応溶液の検査では、使用したBSAの95%超が生成物に結合していることが明らかになった。
実施例9のアルドン酸66mgを乾燥DMF0.5mlに溶解し、3.4mgのN,N'-ジスクシンイミジルカーボネートを添加して、室温で2時間、反応させた。ウシ血清アルブミン(BSA)の1重量%溶液0.5mlを、1モル重炭酸塩溶液180mlと混合した。次いで、活性化されたアルドン酸を2回(各回100μl)に分けて該BSA溶液に滴下し、それぞれの場合において半時間反応させた。次いで、混合物を塩酸で7.4のpHに調整した。HPGPCによる反応溶液の検査では、使用したBSAの95%超が生成物に結合していることが明らかになった。
Claims (8)
- 重量平均分子量が2000ダルトン以上30000ダルトン以下でありかつ分枝点を有するアンヒドログルコース単位のmol%で表される平均枝分れ度が10%より大きくかつ20%以下である多分岐アミロペクチンを製造方法であって、
第1の加水分解工程において、植物のアミロペクチン又はアミロペクチンに富むデンプンの分子量をα-アミラーゼ又は酸による加水分解によって60000ダルトン以下の分子量に低下させ、かつ、第2の加水分解工程において、該第1の加水分解工程からの分解生成物の分子量をβ-アミラーゼ分解によってさらに低下させる、方法。 - 5000ダルトン未満、好ましくは1000ダルトン未満の絶対分子量を有する低分子量の不純物を、該第1の加水分解工程の後、及び/又は、該第2の加水分解工程の後、除去する、請求項1に記載の方法。
- 植物のアミロペクチン又はアミロペクチンに富むデンプンの分子量を、該第1の加水分解工程において酸加水分解により低下させることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 該第2の加水分解工程の加水分解生成物は、活性薬理成分に結合されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 該活性薬理成分がタンパク質又はポリペプチドであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 該第2の加水分解工程の加水分解生成物の該活性薬理成分への結合が、該加水分解生成物の末端アンヒドログルコース単位において生じることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
- 該第2の加水分解工程の加水分解生成物の還元末端基(terminal reducting end group)をアルドン酸に酸化し、該アルドン酸基をアルドン酸エステル基に活性化して該活性薬理成分に結合させることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 該第2の加水分解工程の加水分解生成物の該活性薬理成分への結合が、炭酸エステル基を介して生じることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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