FI91764C - Analogiamenetelmä asyylideoksiribonukleosidijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

91764

ANALOGIAMENETELMA AS Y YLIDEOKS IR IBONUKLEOSIDIJOHDANNAISTEN VAL-MISTAMISEKSI

Tama hakemus on continuation-in-part samaan aikaan vireillå olevalle US-hakemukselle sarjanumeroltaan 115.923, jåtetty 28.10.1987.

Keksinnon alue

Tama keksinto koskee yleisesti deoksiribonukleosidien asyyli-johdannaisia ja naiden johdannaisten kayttoa eksogeenisten deoksiribonukleosidien toimittamiseen elåinkudokseen. Tarkem-min tama keksinto koskee 21-deoksiadenosiinin, 2'-deoksigua-nosiinin, 21-deoksisytidiinin ja 2'-deoksitymidiinin asyyli-johdannaisia ja naiden uusien johdannaisten kayttamista deoksiribonukleosidien toimittamiseen elainkudokseen ja siten tukemaan solujen aineenvaihduntatoimintoja. Viela tarkemmin tåma keksinto koskee uusien asyylijohdannaisten kayttoa esta-måån erilaisia fysiologisia ja patologisia tiloja solukudok-sessa, joita ovat såteilyn, auringonvalon, mutageenien, haa-vojen ja muiden olosuhteiden aiheuttama vaurio.

Keksinnon tausta

Periaatteessa on olemassa kaksi mahdollista kemiallista tai biokemiallista låhestymistapaa ionoivan sateilyn organismei-hin suuntautuvien haitallisten vaikutusten våhentåmiseksi: • (1) vahentaa ensimmaista vauriota biologisiin rakenteisiin, ja (2) parantaa tai kiihdyttaa elpymista.

Tunnetaan joukko yhdisteita, jotka antava jonkin verran suo-jaa ionoivalta sateilylta, kun niita on lasna kehossa sateilyn aikana. Nåmå yhdisteet ovat tyypillisesti antioksidantti-en tai vapaiden radikaalien poistajia, jotka inaktivoivat så-teilyn aikana muodostuneita reaktiivisia kemiallisia aineita ennen kuin ne voivat vahingoittaa tårkeitå biologisia raken-teita. Erinomaisia esimerkkejå såteilyltå suojaavista 2 91764 yhdisteistå ovat kysteamiini, 2-beeta-aminoetyyli-isotiouro-nium-Br-HBr (AET) ja S-2-(3-aminopropyyliamino)etyylifosforo-tiohappo (WR-2721). Koska nåmå yhdisteet tåytyy viedå orga-nismiin ennen såteilyå tai sen aikana, ne eivåt ilmeisesti-kåån ole hyodyllisiå tilanteissa, jolloin tapahtuu odottama-ton tai satunnainen altistus. Lisåksi nåmå yhdisteet ovat myrkyllisiå ihmisille.

Pååasialliset mahdollisuudet tehokkaaseen kemialliseen tera-piaan organismeissa, jotka ovat joutuneet såteilylle alttiik-si, ovat: (1) organismissa olevien yksittåisten solujen korjautumisen ja elpymisen ediståminen, tai (2) eloon jååneiden runkosolujen lisååntymisen kiihdyttåminen tai nopeuttaminen.

Luuydin ja suoliepiteeli ovat kudosten joukossa kaikkein her-kimpiå såteilyvauriolle; pyrittåesså ediståmåån elpymistå så-teilystå on keskityttåvå runkosoluihin nåisså kudoksissa.

On olemassa useita aineita, jotka voivat parantaa såteilytet-tyjen nisåkkåiden eloonjååmistå, annettaessa såteilytyksen . jålkeen. Nåitå ovat hiivapohjainen polysakkaridi Glucan, ja polypeptidisytokiinit kuten Interleukin-1, Granulocyte-Colony Stimulating Factor ja Granulocyte/Macrophage-Colony Stimulating Factor; kaikki nåistå aineista parantavat luuytimen runkosolujen 1isååntymistå tai jakautumista. Niiden tehokkuus on kuitenkin kohtalainen, ne tuottavat annosvåhennysfaktoreiksi alle 1,1, kun niitå annetaan sen jålkeen, kun såteilytys on jo tapahtunut, ja niiden kåyttoå vaikeuttavat sivuvaikutuk-set. Lisåksi ne ovat kaikki makromolekyyleja, joita voidaan antaa vain parenteraalisesti.

Tarvetta esiintyy yhdisteista, jotka tehokkaasti ediståvåt toipumista annettaessa ionoivalle såteilylle altistumisen i 3 91764 jalkeen ja joilla on tarkeitå farmaseuttisia ominaisuuksia, kuten myrkyttomyys ja aktiivisuus oraalisen antamisen jalkeen. Mama aineet olisivat hyodyllisia silloin, kun altistu-taan satunnaisesti ionoivalle sateilylle, ja myos syovan sa-dehoidon yhteydesså, jolloin edistetåån normaalikudoksen toi-pumista sateilystå. Nåma aineet voivat myos parantaa toipu-mista tiettyjen kemiallisen vaurion muodoista, esim. luuyti-men vahentyminen joko satunnaisesti tai terapeuttisesti al-tistuttaessa yhdisteille, kuten syklofosfamidi tai busulfaa-ni, joita molempia kaytetaan syovan kemoterapiassa.

On osoitettu, etta eksogeenisen deoksiribonukleiinihapon (DNA) antaminen koe-elaimiIle ionoivalle sateilylle altistu-misen jalkeen voi johtaa parantuneeseen eloonjåamiseen ja toiminnan toipumiseen. Kanazir et al., Bull. Inst. Nuc. Sci. "Boris Kidrich" 9:145-153 (1959); Wilczok, T., et al., Int.

J. Rad. Biol. 9:201-211 (1965); Golba, S-, et al., Int. Rad. Biol. 13:261-268 (1967); US-patentti nro 3 803 116.

Tutkimukset soluviljelmisså in vitro antavat olettaa, etta varsinaisia parantavia aineita ovat deoksiribonukleosidit, DNA:n entsymaattisen hajoamisen tulokset. Petrovic, D., et al., Int. J. Rad. Biol. 18:243-258 (1970). Depolymeroitu DNA tai deoksiribonukleosidit olivat kuitenkin elaimille annettu- • na tehottomia estamaan eloonjaamista tai toipumista sateilyn jalkeen. Kanazir et al., Bull. Inst. Nuc. Sci. "Boris Kid-rich" 9:145-153 (1959). On syyta uskoa, etta tama ilmeinen ristiriita johtuu deoksiribonukleosidien nopeasta katabolias-ta in vivo plasmassa ja eri elimisså olevien entsyymien vai-kutuksesta. Niinpa kun deoksiribonukleosideja on annettu jyr-sijoille, kudokset altistuvat tehokkaille annoksille alle viidessa minuutissa. Beltz et al·., Bioch. Biophys. Acta. 297:258-267 (1973). Soluviljelmissa havaittiin optimaalinen eloonjaåminen sateilytyksen jalkeen, kun deoksiribonukleosi-deja oli viljelman kasvatusalustassa lasna ainakin kolme tun-tia. Kun DNA:ta annetaan oarenteraalisesti, se luultavasti • · asteittain depolymeroituu, jolloin vapaatdeoksiribonukleosi-dit saadaan paremmin vapautumaan verenkiertoon.

4 91764

Nisakkaan kudoksessa saattaa olla muita fysiologisia tai pa-tologisia tiloja, jolloin eksogeenisten deoksiribonukleosi-dien toimittamisella voi olla terapeuttista kayttoå. Newman et al., Am. J. Physiol. 164:251-253 (1951) esittavat tutki-muksen, jossa rotille on suoritettu osittainen maksanpoisto. Maksan regeneroitumista seurattiin 11 paivaa. DNA:lla hoidet-tujen rottien maksat regeneroituivat merkittåvåsti nopeammin kuin hoitamattomien elainten maksat. On todennakoista, etta deoksiribonukleosidit olivat varsinaiset vaikuttavat aineet tassa tutkimuksessa, koska DNA on suuri molekyyli, jota nisa-kassolut eivat tehokkaasti ota vastaan. Ihon haavoihin levi-tetyn DNA:n on samoin todettu kiihdyttåvan joitakin tekijoita paranemisprosessissa, esim. jyvåiskudoksen muodostumista. Dumont, Ann. Surg. 150:799-807 (1959); Marshak et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 58:62-63 (1945); Nicolau et al., Der Hautartzt 17:512-515 (1966). Yane and Kitano, US-patentti 4 656 896, esittavat parenteraalisesti annetun DNA:n hyodyllis-ten vaikutusten ilmenemisen hoidettaessa mahahaavoja rotissa.

On todennakoista, etta naissa esimerkeissa DNA:n vaikutus johtui sen asteittaisesta hajoamisesta, joka johti deoksi-ribonukleosidien vapautumiseen pitempana ajanjaksona. DNA ei kuitenkaan ole sopiva farmaseuttinen aine annettavaksi ihmi-sille, ei oraalisesti eika parenteraalisesti. Oraalisesti an-nettaessa DNA:sta vapautuneet nukleosidit paaasiallisesti hajoaisivat entsyymien vaikutuksesta suoliontelossa, suolen seinamissa, plasmassa ja maksassa, ennemmin kuin olisivat kudosten saatavissa. Ongelmia parenteraalisesti annetun DNA:n tapauksessa ovat mahdollinen antigeenisyys (tilan pahentumi-nen kiinnittyvien proteiinien vaikutuksesta, joita on vaikea poistaa uuton aikana), epayhtenaisyys annosten valilla, ja mahdolliset ei-toivotut vaikutukset, jotka eivat johdu nuk-leosidien vapautumisesta, esim. lymfosyyteista vapautuvan in-terferonin lisaantyminen, joka on kaksisaikeisen nukleiini-hapon tunnettu vaikutus.

Deoksiribonukleosidien antamisen on tahan mennessa paatelty kumoavan deoksiribonukleotidien ilrrieisia puutteita 5 91764 (esim. tymidiinin antaminen metotreksaatin, antineoplastisen, tymidiinin nukleotidin biosynteesia inhiboivan aineen, ai-heuttaman myrkyllisyyden kumoamiseksi; deoksisytidiinin antaminen arabinosyylisytosiinin myrkyllisyyden kumoamiseksi, tai ihmisissa, joilla on puutteita tietyistå entsyymeista (esim. puriininukleosidifosforylaasi), jotka johtavat lopulta huo-nontuneeseen deoksiribonukleotidisynteesiin). Tymidiinin an-tamista on myos pidetty antineoplastisena hoitona, koska suu-rilla konsentraatioilla tymidiinilla on sytostaattisia tai sytotoksisia ominaisuuksia.

Tasså esitetty keksinto liittyy kuitenkin sen asian kasitta-miseen, etta odottamattomia hyodyllisia vaikutuksia voi esiintyå, kun annetaan deoksiribonukleosidiseosten supra-fysiologisia maaria silla tavalla, etta ne ovat kudosten saa-tavilla pitkitetyn ajan; tama paamaara voidaan parhaiten saa-vuttaa kayttamalla keksinnon mukaisia deoksiribonukleosidi-johdannaisia.

Keksinnon paamaarat

Samalla kun DNA:n ja/tai deoksiribonukleosidien toimittamisen strategia fysiologisesti tai patologisesti vahingoittuneeseen kudokseen on kasitetty, on alalia tahan mennessa epaonnistut-tu tarjoamaan tyydyttavia menetelmia toimittaa deoksiribonuk-leosideja riittavan korkeita ja luotettavia maaria in vivo, jotta saadaan menestyksellisesti hoidettua patologisia ja fysiologisia tiloja ja edistamaan elainsolujen paranemista ja eloonjaamista. Lisaksi vaikka on kehitetty erilaisia yhdis-teita, jotka suojaavat elaimia joiltakin ionoivan sateilyn tai kemiallisten mutageenien vaikutuksilta, on kudoksiin riittavan pitkana aikana annetuilla deoksiribonukleosidei11a suurin kliininen teho tallaisen vaurion altistuksen jalkei-sessa hoidossa. Taman strategian kliininen toteuttaminen kuitenkin odottaa tyydyttavien ja mukavien menetelmien kehitta-... mistå deoksiribonukleosidien sopivien maårien toimittamiseksi kudoksiin in vivo. Deoksiribonukleosidien kapasiteetin tay-dellinen hyvaksyminer. ja kliininen toteuttaminen edistamaan 6 91764 haavojen paranemista tai kudoksen korjautumista odottaa sa-moin tyydyttåvien menetelraien kehittåmista niiden toimitta-miseksi kudoksiin in vivo.

Niinpa tåmån keksinnon ensisijainen tarkoitus on identifioida farmaseuttisesti hyvåksyttaviå yhdisteita, joita voidaan kayttaa toimittamaan farmakologisesti tehokkaita mååriå deoksiribonukleosideja tai niiden vastaavia johdannaisia elainkudokseen.

Taman keksinnon tarkoituksena on lisaksi tarjota kayttoon deoksiribonukleosidijohdannaisten ryhma, joita voidaan tehok-kaasti antaa oraalisesti tai parenteraalisesti, joilla on minimaalinen myrkyllisyys, ja joita voidaan antaa elaimille ja ihmisille tehokkaasti edistamaan solujen korjautumista lukuisissa fysiologisissa ja patologisissa tiloissa, ja edistamaan elåimen eloonjaamista annettaessa sen jalkeen kun al-tistus sateilylle on tapahtunut.

Taman keksinnon viela eras ja asiaankuuluva tarkoitus on tarjota kayttoon 2'-deoksiadenosiinin, 21-deoksiguanosiinin, 21-deoksisytidiinin ja 2'-deoksitymidiinin tietyt johdannai-set, jotka elaimille annettuna toimittavat kyseiset deoksi-ribonukleosidit elainkudokseen.

Tåman keksinnon asiaankuuluva tarkoitus on olennaisesti pa-rantaa 2'-deoksiadenosiinin, 21-deoksiguanosiinin, 2'-deoksisytidiinin ja 21-deoksitymidiinin biologista saatavuutta li-saamallå naiden deoksiribonukleosidien kulkeutumista maha-suolistoalueen ja muiden biologisten membraanien poikki.

Taman keksinnon viela eras ja spesifisempi tarkoitus on tarjota kayttoon deoksiribonukleosidijohdannaisten ryhma eri-laisten maksan, luiden, ihon, veriopillisten ja muiden patologisten ja fysiologisten tilojen hoitoon.

Taman keksinnon viela eras tarkoitus on tarjota kayttoon deoksiribonukleosidijohdannaisia ja menetelmiå kayttaa naita 7 91764 johdannaisia, jotka ovat turvallisia, halpoja, ja jotka kiih-dyttavat normaaleja solun regeneroitumis- ja paranemisproses-se ja .

Keksinnolle on tunnusomaista se, mitå on esitetty patenttivaati-muksissa.

Nåmå ja keksinnon muut paaraaarat saavutetaan antaraalla 2'-deoksiadenosiinin, 21-deoksiguanosiinin, 2'-deoksisytidiinin ja 21-deoksitymidiinin tiettyja asyylijohdannaisia. Nåitå asyylijohdannaisia voidaan kåyttåå ehkaisemaan tai hoitamaan sateilyn, auringonvalon ja mutageenien aiheuttamia soluvau-rioita, lisaamaan haavojen paranemista, tai korjaamaan vauri-oituneita kudoksia, ja hoidettaessa muita fysiologisia ja patologisia kudosten tiloja.

Vaikka tekniikan tasossa esitetaan joitakin asyloituja deok-siribonukleosidien johdannaisia, niiden substituentit (esim. pivaloaatti, isobutyraatti, bentsoaatti tai adamantoaatti) valittiin niiden ominaisuuksien takia, joiden vuoksi niita voidaan hyodyntaa suojaryhmina kemiallisessa synteesissa (esim. oligonukleotidien synteesissa), eivatka ne ole yleen-sa sopivia elaimille annettaviksi. Tasså esitetyt uudet yh-disteet ovat edullisia, koska niiden substituentit ovat myr-kyttomia. Niilla on minimaalinen haittavaikutus organismiin, .· johon niita annetaan ja ne voidaan valita siten, etta saadaan halutut farmaseuttiset ja farmakologiset ominaisuudet ilman yletonta tutkimista.

Joidenkin antineoplastisten ja virusvastaisten nukleosidi-analogien asyloituja johdannaisia on kaytetty naiden sytotok-. sisten aineiden esilåakkeina. Hyvin erilaisia biokemiallisia ja fysiologisia kysymyksia liittyy kuitenkin myrkyllisten nukleosidianalogien terapeuttisen indeksin parantamiseen ver-rattaessa myrkyttomien deoksiribonukleosidien toimittamiseen sopivina maarina ja yhdistelmina parantamaan kudosten paran-tumista tai regeneroitumista, kuten tassa keksinnossa.

8 91764

Keksinnon pååasiallinen nåkokohta on sen kåsittåminen, etta de-oksiribonukleosidien asyylijohdannaisilla, erityisesti kun kah-den tai useamman deoksiribonukleosidin johdannaiset on yhdis-tetty, on odottamattomia terapeuttisia ominaisuuksia. Tama il-menee tiedoista, jotka koskevat sateilytettyjen hiirten eloon-jåSmistå. Keksinto kåsittåå myos johdannaisten uudet luokat, jotka ovat erityisen haluttuja sekå tehokkuuden etta turvalli-suuden suhteen.

Laajasti esitettynå ovat 2'-deoksiadenosiinin asyylijohdannaiset seuraavan kaavan (I) mukaisia.

NHR

I II CH

HC C / (I)

NjLJj/»

)R H

jossa R on vety tai muun aineenvaihduntatuotteen kuin asetyylin asyyliradikaali, sillå edellytyksellå, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai sen farmaseuttisesti sopiva suola.

2'-Deoksiadenosiinin edullisia asyylijohdannaisia ovat ne, joilla on kaava (I) nh2 i N C ^

I II CH

HC /

RjOCHj o (I) H_$

ORj H

jossa Ri ja R2 on H tai asyyliryhma, joka johtuu karboksyyliha-posta/ joka on valittu yhdestå tai useammasta seuraavan ryhman aineesta: pyruviinihappo, niaitohappo, enolipyruviinihappo, ami-nohappo, rasvahappo, joka on muu kuin etikkahappo, lipoiinihap-po, nikotiinihappo, pantoteenihappo, meripihkahappo, fumaari-happo/ p-aminobentsoehappo, beetahydroks ivoihappo, li 9 91764 orotiinihappo ja karnitiini, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai sen farmaseuttisesti sopiva suola. Kek-sinnon piiriin ei kuitenkaan kuulu kaavan (I) mukaiset yhdisteet, joissa R2 on johdettu leusiinista.

Laajasti esitettynå ovat 2'-deoksiguanosiinin asyylijohdannai-sia ne kaavan (II) mukaiset yhdisteet, o ll

HN C I II CH

RHN-c C / ΪΓ ROCHj 0 ( 11 ) h\[ ]/h

)R H

joissa R on vety tai muun aineenvaihduntatuotteen' kuin asetyy-lin asyyliradikaali, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai sen farmaseuttisesti sopiva suola.

Edullisia 2'-deoksiguanosiinin asyylijohdannaisia ovat kaavan (II) mukaiset yhdisteet, o ll

/C./N

HN C v

I II CH

h2n-c c / r1och^ o (11)

OR, H

joissa Rx ja R2 ovat H tai asyyliryhma, joka on johdettu karbok-syylihaposta, joka valitaan yhdesta tai useammasta seuraavan ryhman aineesta: pyruviinihappo, maitohappo, enolipyruviinihap-po, aminohappo, muu rasvahappo kuin etikkahappo, lipoiinihappo, nikotiinihappo, pantoteenihappo, meripihkahappo, fumaarihappo, p-aminobentsoehappo, beetahydroksivoihappo, orotiinihappo ja karnitiini, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai sen farmaseuttisesti sopiva suola. Keksinnon piiriin ei kuitenkaan kuulu kaavan (II) mukaiset yhdisteet, joissa Rx ja R2 ovat molemmat johdettuja butyryylista.

10 91 764

Laa jasti esitettyna ovat 21-deoksisytidiinin asyy1ijohdannai-sia ne kaavan (III) mukaiset yhdisteet

NHR

N^C ''CH

i n

0=C CH

VH fy

w\l 1/ H

{ Γ (in)

OR H

joissa R on vety tai muun aineenvaihduntatuotteen kuin ase-tyylin asyyliradikaali, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

EduIIisia 2 *-deoksisytidiinin asyylijohdannaisia ovat ne kaavan (III) yhdisteet,

NHR

N^C ^CH

I π

0=C CH

ROCHj \H h/

H

OR H (III) joissa R on H tai asyyliryhma, joka on johdettu karboksyyli-haposta, joka on valittu yhdesta tai useammasta seuraavan ryhman aineesta: pyruviinihappo, maitohappo, enolipyruviini-happo, aminohappo, muu rasvahappo kuin etikkahappo, lipoiini-happo, nikotiinihappo, pantoteenihappo, meripihkahappo, fu-maarihappo, p-aminobentsoehappo, beetahydroksibutyyrihappo, orotiinihappo ja karnitiini, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

Laajasti esitettyna ovat 2‘-deoksitymidiinin asyylijohdannai-set niita kaavan (IV) yhdisteita, “ 91764 o n hn^C"c-ch, 1 "

0=C CH

\n/ roch2 / o \_____ ¢-f (IV»

OR H

joissa R on vety tai muun aineenvaihduntatuotteen kuin rasva-hapon, jossa on vahemman kuin viisi hiiliatomia, asyyliradi-kaali, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

2'-deoksitymidiinin edullisia asyylijohdannaisia ovat ne kaa-van (IV) yhdisteet, o HN C-CHj

I II

0=C CH

H

OR Η (IV) joissa R on H tai asyyliryhmå, joka on johdettu karboksyyli-haposta, joka on valittu yhdesta tai useanunasta seuraavan ryhman mukaisesta aineesta: pyruviinihappo, maitohappo, eno-lipyruviinihappo, aminohappo, rasvahappo, joka sisaltaa 5 hiiliatomia tai enemmån, lipoiinihappo, nikotiinihappo, pan-toteenihappo, meripihkahappo, fumaarihappo, p-aminobentsoe-happo, beetahydroksivoihappo, orotiinihaopo ja karnitiini, silla edellytyksella, etta ainakin yksi R-substituentti ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

12 91 764 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaisia voivat olla myos ne kaavan (V) yhdisteet, o R"N^ VC"CHi

I II

0=C CH

R"OCHj a V1 (V1 • joissa R” on vety tai aineenvaihduntatuotteen asyyliradikaa- li, silla edellytyksellå, ettå R" typesså ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

Edullisia 21-deoksitymidiinin asyylijohdannaisia ovat ne kaavan (V) yhdisteet, o R'-n'" "c-ch,

I II

0=C CH R'

\H V

or" η (V) joissa R" on H tai asyyliryhmå, joka on johdettu karboksyyli-haposta, joka on valittu yhdestå tai useammasta seuraavan ryhmån aineesta: pyruviinihappo, maitohappo, enolipyruviini-happo, aminohappo, rasvahappo, lipoiinihappo, nikotiiriihappo, pantoteenihappo, meripihkahappo, fumaarihappo, p-aminobent-soehappo, beetahydroksivoihappo, orotiinihappo ja karnitiini, silla edellytyksella, ettå R" typesså ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

Il 13 91 764

Keksinto koskee myos kaavojen I-IV yhdisteitå, joissa riboo-siosa on monoasyloitu 3'- tax 5'-asemassa rasvahappojohdan-naisella ja kasittaa yhdisteiden I-IV 3',5'-diasyloidut johdannaiset, joissa ainakin yksi tållainen substituentti on johdettu rasvahaposta, jossa on 5 hiiliatomia tai enemraan.

21-deoksiadenosiinin, 21-deoksiguanosiinin, 2'-deoksisytidii-nin ja 21-deoksitymidiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaa-vat I, II, III ja V, ovat mielellaan substituoituja 3-22 hii-liatomia sisaltavan karboksyylihapon asyylijohdannaisella .

Silloin kun minkå tahansa kaavan I-V mukaisten yhdisteiden • asyylijohdannaiset ovat substituoituja aminohaposta johtuval- la asyyliryhmallå, on aminohappo mielellaan valittu ryhmåsta, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleusiinista, fenyylialaniinista, tyrosiinis-ta, proliinista, hydroksiproliinista, seriinista, treoniinis-ta, kysteiinistå, kystiinistå, metioniinista, tryptofaanista, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysii-nistå, histidiinistå, ornitiinista ja hydroksilysiinista.

Keksinnon edullisissa toteutusmuodoissa kaytetaan seosta ainakin kahdesta 2'-deoksiadenosiinin, 21-deoksiguanosiinin, 2'-deoksisytidiinin ja 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannai-sesta. Mainitut koostumukset sisaltavat vaikuttavan maaran kumpaakin ainakin kahdesta yhdisteesta, jotka on valittu ainakin kahdesta yhdisteryhmåsta, joilla on kaavat 9 nhk4 hk^C-c-\\

I I II CH

<ic\ RjHN-C. C /

I II CH

H%n/C\n/ R.OCH^/O^^ ROCH^ 0 v_j/i or2 h (I) <«) 14 91 764 NHRj ? 'c R3N^C"c-ch3 CH ' Uh

1 II 0=C ^CH

0-C ,CB ^ X.M/

RjOCHj o \r γί H—r '1 T 0R» “

OR, H

(III) (^) joissa R^, R2 ja R3 ovat samoja tai erilaisia ja kukin on H tai asyyliryhma, joka onjohdettu karboksyylihaposta, silla • edellytyksella, ettå ainakin yksi mainituista substituenteis- ta R^, R2-ja R3 kussakin mainitussa yhdisteryhmassa ei ole vety, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suolat. Edullisessa toteutusmuodossa R]_, R2 ja R3 ovat samoja tai erilaisia ja kukin on H tai asyyliryhma, joka on johdettu karboksyylihaposta, joka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat aminohappo, haarautumaton rasvahappo,joka sisaltaa 2-22 hiiliatomia, dikarboksyylihappo, joka sisaltaa 3-22 hiilatomia ja mahdol-lisesti substituoitu bentsoyyli- tai heterosyklinen aromaat-tinan karboksyylihappo, joka on olennaisesti myrkyton. Edul-lisia valinnaisesti substituoituja bentsoyyli- tai heterosyk-lisia karboksyylihappoja ovat nikotiinihappo ja p-aminobent-soehappo.

Toisessa keksinnon edullisessa toteutusmuodossa kaytetåån koostumusta, joka kasittaa seoksen vaikuttavasta maaråsta ainakin kolmea yhdistetta, jotka on valittu ainakin kolmesta yhdisteryhmasta, joilla on kaavat I-IV, kuten edella on esi-tetty. Viela eraassa muussa edullisessa toteutusmuodossa kay-tetaan koostumusta, joka kasittaa seoksen vaikuttavasta maarasta ainakin neljaa yhdistetta valittuna ainakin neljasta yhdisteryhmasta, joilla on kaavat I-IV, kuten edella on esi-tetty.

Oleellisia lisaetuja voidaan saada, erityisesti silloin, kun keksinnon koostumuksia kaytetaan parantamaan sateilyn vaiku-tuksia, jos sateilylta suojaava yhdiste on yhdessa yhden tai 1 15 91 764 useamman asyylideoksiribonukleosidin kanssa. Sateilylta suo-jaavia yhdisteita voidaan valita ryhmasta, johon kuuluvat WR-2721, NAC, DDC, kysteamiini, 2-merkaptoetanoli, merkapto-etyyliamiiniditiotreitoli, glutationi, 2-merkaptoetaanisul-fonihappo, WR-1065, nikotiiniamidi, 5-hydroksitryptamiini, 2-beeta-aminoetyyli-isotiouronium-Br-HBr, glukaanit, GLP/B04, GLP/B05, OK-432, Biostim, PSK, Lentinan, Schizophyllan, Rhodexman, Levan, Mannozym, MVE-2, MNR, MMZ, IL-1, TNF, kateenkorvafaktori TF-5, glutationiperoksidaasi, superoksidi-dismutaasi, katalaasi, glutationireduktaasi, glutationitrans-·· feraasi, seleeni, CdCl2» MnCl2# Zn-asetaatti, A-vitamiini, beetakaroteeni, prostaglandiinit, tokoferoli, metyleenisini-nen ja PABA.

Keksinto koskee myos farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisaltavat yhden tai useamman uuden deoksiribonukleosidin yhdessa farmaseuttisesti sopivan kantajan kanssa. Lisaksi tunnettuja 21-deoksiadenosiinin, 2'-deoksiguanosiinin, 2'-deoksisytidiinin ja 2'-deoksitymidiinin asetyylijohdannaisia seka tymidiinin rasvahappojohdannaisia, joissa asyyliryhma sisaltaa 3 tai 4 hiiliatomia, voidaan kayttaa keksinnon far-maseuttisissa koostumuksissa yksinaan, yhdessa toistensa kanssa tai yhdessa yhden tai useamman uuden koostumuksen kanssa. Koostumus voi edelleen sisaltaa kuvatun kaltaisen * sateilylta suojaavan yhdisteen. Koosturaukset voivat olla nesteen, suspension, tabletin, rakeiden, injektoitavan liuok-sen, paikallisesti kåytettavan liuoksen tai perapuikkojen muodossa.

Ihovoide voidaan edullisesti valmistaa yhdistama 11a vaikutta-va maara yhta tai useampaa keksinnon asyylideoksiribonukleo-sidia yhdessa sopivan kantajan kanssa. Tallåinen ihovoide sisaltaa edullisesti 0,1-5 painoprosenttia deoksiribonukleosi-deja ja haluttaessa sateilylta suojaavan yhdisteen.

Keksinnon farmaseuttiset koostumukset voivat kasittaa myos biologisesti erodoituvat mikrokapselit, jolloin mikrokapselit on edullisesti valittu ryhmasta, johon kuuluvat polylaktaatti 16 91 764 tai laktaatti-glykolaatti-kopolymeerit.

Uskotaan, ettå eksogeenisten deoksiribonukleosidien toimit-taminen elåinkudokseen voidaan tehokkaasti saada aikaan anta-malla elaimelle vaikuttava måara kaavojen I-V mukaista de-oksiribonukleosidin asyylijohdannaista. Lisaåmallå eksogeenisten deoksiribonukleosidien toimitusta ja siten lisaamållå niiden biologista saatavuutta, saattaa olla mahdollista hoi-taa elainkudoksen fysiologisia tai patologisia tiloja tuke-malla olennaisesti niiden aineenvaihduntatoimintoja. Olematta sidottuna teoriaan voi keksinto toimia myos lisååmålla nuk-leosidianaboliittien, esim. nukleotidien tai nukleotideista johtuvien kofaktorien biologista saatavuutta. Nukleosidien antaminen sinanså nostaa niiden biologista saatavuutta, mutta johtuen nopeasta solujen ulkopuolisesta aineenvaihdunnasta, tama ei ehka johda solujen nukleotiditasojen pitempiaikaiseen koholla pysymiseen. Alemmilla nukleosiditasoilla solut otta-vat ja kayttavåt ne nopeasti hyvåkseen, kun taas korkeanunilla tasoilla tapahtuu kyllastyminen ja ylimaara hajoaa. Keksinnon uskotaan toimivan tarjottaessa nukleosideja jatkuvasti pie-nempina maarina.

Spesifiset olosuhteet, jolloin etuja voidaan saavuttaa keksinnon yhdisteita, koostumuksia ja menetelmia kayttamalla, ’ ovat tilanteet, jolloin on hyodyllista parantaa DNA:n kuntoa tai parantaa runkosolujen jakautumista ja lisakasvua. Tallai-sia olosuhteita ovat erityisesti: (l) ionoivasta tai ultra- violettisateilysta johtuvan vaurion hoitaminen tai ehkaisy; (2) punasolujen muodostumisen parantaminen silloin kun luu-ytimen toiminta on alentunut ionoivan sateilyn, kemiallisen vaurion (esim. syovan- tai virustenvastaisten hoitojen sivu-vaikutukset), tai sairauden johdosta; ja (3) erilaisten vau-rioituneiden kudosten uudistumisen ja korjautumisen kiihdyt-tåminen, esim. haavojen ja palovammojen parantumisessa, tai vaurioituneen maksakudoksen uudistumisen ediståmisesså. Hoi-dettaessa kaikkia naita tiloja keksinnonmukaista yhdistetta, lisakantajien, sateilylta suojaavien yhdisteiden ja muiden apuaineiden kanssa tai ilman niita, annetaan elaimelle, » 91764 erityisesti ihmiselle.

Asyloitujen johdannaisten antarainen tarjoaa tiettyjå etuja verrattuna ei-johdettuihin yhdisteisiin. Asyylisubstituentit voidaan valita nostaraaan nukleosidin lipofiilisyyttå, jolloin parannetaan sen kulkeutumista maha-suolialueesta verenkier-toon. Asyloidut johdannaiset ovat tehokkaita oraalisesti an-nettaessa ja voidaan kåyttåa paikallisesti joissakin tilan-teissa. Asyloidut johdannaiset ovat resistentteja nukleosidi-deaminaasien ja nukleosidifosforylaasien katabolismille suo-listossa, maksassa, muissa elimissa ja verenkierrossa. Niinpå keksinnon asyloitujen johdannaisten antarainen, joko oraalisesti, parenteraalisesti tai paikallisesti, mahdollistaa toi-vottujen yhdistelmien ja deoksiribonukleosidien jatkuvan toi-mittamisen elaimen kudoksiin, koska asyylisubstituentit siir-tyvat asteittain entsyymien (esteraasit ja peptidaasit) vai-kutuksesta plasmaan ja kudoksiin luovuttaen vapaita deoksi-ribonukleosideja kaiken aikaa.

Piirrosten kuvaus

Kuva 1 on graafinen esitys, joka kuvaa deoksiribonukleosidien hajoamisnopeutta plasmassa. Seuraavia lyhennyksia on kaytet-ty: 9 dT = 2'-deoksitymidiini dC = 2'-deoksisytidiini dG = 2'-deoksiguanosiini dA = 21-deoksiadenosiini

Kuva 2 on graafinen esitys, joka kuvaa deoksiadenosiinin no-peata aineenvaihduntaa ja adenosiinijohdannaisten asteittais-ta deasyloitumista (deoksiadenosiinin saamiseksi) plasmassa.

Kuva 3 on graafinen esitys, joka kuvaa deoksiadenosiinijohdannaisten nopeaa aineenvaihduntaa (deoksiadenosiinin saamiseksi) maksauutteessa.

18 91 764

Kuva 4 on graafinen esitys, joka kuvaa plasman tymidiinikon-sentraatioita tymidiinin tai di-O-asetyylitymidiinin antami-sen jålkeen rotille.

Edullisten toteutusmuotojen kuvaus "Aineenvaihduntatuote" on kemiallinen yhdiste, joka on muo-dostunut aineenvaihduntareaktion vaikutuksesta tai osallistuu sellaiseen. Taman hakemuksen yhteydesså aineenvaihduntatuot-teita eivat ole vain karboksyylihapot, joiden tiedetåan syn-tetisoituvan ihmisen kehossa, vaan myos luonnossa esiintyvåt (mutta ehka syntetisoidut pikemmin kuin uutetut) karboksyylihapot, jotka saattaisivat olla johdettuja muista elain- tai kasvilåhteistå. Rajoittavia kriteereita ovat, ettå yhdisteen tulisi olla olennaisesti myrkyton ja biologisesti yhteensopi-va, ja sen tulisi helposti paastå aineenvaihduntateihin in vivo, niin ettei ehdotetuilla annoksilla pitkåaikaisenkaan kulutuksen aikana esiinny olennaisesti yhtåån myrkyllisyyt-tå. On edullista, ettå yhdisteet muuttuvat aineenvaihdunnassa pikemmin kuin ettå erittyvåt sellaisenaan (tai konjugoituvat myrkynpoistoreaktioissa), koska karboksyylihappojen pitoisuus munuaisissa voi johtaa ei-toivottuun liialliseen happamuu-teen. Siksi sellaiset karboksyylihapot, jotka normaalisti tai helposti osallistuvat vålittåvåån, kataboliseen tai anaboli-. seen aineenvaihduntaan, ovat edullisia substituentteja.

Termi "farmaseuttisesti sopivat suolat" tarkoittaa suoloja deosiribonukleosidijohdannaisten farmaseuttisesti sopivien happoadditiosuolojamuodostavien happojen kanssa, joita ovat, mutta ei nåihin rajoittuen, rikki-, vetykloridi- tai fosfori- hapot.

Termi "annetaan yhdesså" merkitsee, ettå ainakin kahta kek-sinndn asyloitua johdannaista annetaan sinå aikana, jolloin farmakologisen aktiivisuuden vastaavat ajat ovat limittåin.

"Asyyli johdannaiset11 tarkoittaa 2 ' -deoksiribonukleosidin johdannaisia, joissa karboksyy1ihaposta johtuva olennaisesti 19 91 764 myrkyton orgaaninen asyylisubstituentti on liittynyt yhteen tai useampaan deoksiribonukleosidin riboosiosan vapaaseen hydroksyyliryhmåån esterisidoksella ja/tai jossa tallainen substituentti on liittynyt primåariseen tai sekundååriseen amiiniin deoksisytidiinin tai deoksitymidiinin pyrimidiini-renkaassa, tai deoksiadenosiinin tai deoksiguanosiinin purii-nirenkaassa, amidisidoksella. Tallaiset asyylisubstituentit johtuvat karboksyylihapoista, joita ovat, mutta ei niihin rajoittuen, yhdisteet ryhmåstå, johon kuuluvat maitohappo, aminohappo, rasvahappo, nikotiinihappo, dikarboksyylihapot, jD-aminobentsoehappo ja orotiinihappo. Edullisia asyylisubs-tituentteja ovat yhdisteet, joita normaalisti on lasna kehos-sa, joko ruokavaliosta saatuina aineina tai våliaineenvaih-duntatuotteina, jotka ovat olennaisesti myrkyttomia, kun ne lohkaistaan deoksiribonukleosidista in vivo.

"Aminohapot" kåsittåvåt, mutta ei nåihin rajoittuen, glysii-nin, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleu-siinista, fenyylialaniinista, tyrosiinista, proliinista, hyd-roksiproliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinista, kystiinista, metioniinista, tryptofaanista, asparagiinihapos-ta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinistå, histidiinis-ta, ornitiinista, hydroksilysiinista, karnitiinista ja muista luonnossa esiintyvista aminohapoista.

"Rasvahapot" ovat alifaattisia karboksyylihappoja, joissa on 2-22 hiiliatomia. Tallaiset rasvahapot voivat olla tyydytty-neita, osittain tyydyttyneita tai monityydyttymattomia.

"Dikarboksyylihapot" ovat rasvahappoja, joissa on toinen kar-boksyylihapposubstituentti.

Edullisia 2'-deoksiribonukleosidien asyylijohdannaisia kulje-tuksen lisaamiseksi biologisten membraanien poikki ovat ne, jotka ovat lipofii1isempia kuin emonukleosidit. Yleensa lipo-fiilisilla asyylinukleosidijohdannaisilla on asyylisubsti-’* tuentteja, jotka ovat polaarittomia (paitsi karboksylaatti- ryhma). Lipofiilisia asyylisubstituentteja ovat erityisesti 20 91 764 ryhmåt, jotka johtuvat 2-22 hiiliatomia sisåltavistå rasva-hapoista. Alan ammattimies voi standarditekniikkaa kayttaen måårittåå, onko tietty asyylisubstituoitu nukleosidijohdan-nainen lipofiilisempi kuin ei-johdannaisnukleosidi, s.o. ver-taamalla vesi-oktanoliseoksissa maaritettyja jakautumisker-toimia.

Kun asyloitu nukleosidijohdannainen on kulkeutunut maha-suoli-alueelta verenkiertoon, tai muiden biologisten membraa-nien poikki, asyylisubstituentit lohkaistaan plasma- ja kudosesteraasien (tai amidaasien) avulla, jolloin syntyy vapaita nukleosideja. Edullisia keksinnon asyyliryhmia ovat luonnossa esiintyvat aineenvaihdunnan tuotteet, tai ovat yhdisteet, jotka helposti paasevat valillisen aineenvaihdunnan tiehyeisiin. Niinpa ne ovat vain vahan myrkyllisia vapau-tuessaan in vivo endogeenisten esteraasien tai amidaasien vaikutuksesta.

On myos mahdollista valmistaa asyylinukleosidijohdannaisia, jotka sisaltåvat seka polaarisia etta polaarittomia asyyli-substituentteja. Polaarinen asyyliryhma hidastaa nukleosidi-johdannaisen kulkua maha-suoli-alueelta, mahdollistaen nain yhdisteen pitempikestoisen toimituksen verenkiertoon yksit-taisen annoksen jalkeen. Polaarinen ryhma voidaan lohkaista • esteréaasien, amidaasien tai peptidaasien vaikutuksella, joi- ta on lasna suolialueella, jolloin saadaan nukleosidi, jolla on polaariton asyylisubstituentti, joka voi sitten tehokkaas-ti siirtya verenkiertoon. Polaariset asyylisubstituentit voi alan ammattimies valita ilman kohtuutonta kokeilua sellaisek-si, joka lohkeaa nopeammin kuin polaarittomat asyylisubstituentit. Edullisia tallaisia substituentteja ovat emaksiset aminohapot (lysiini tai arginiini), happamat aminohapot (glu-tamaatti tai aspartaatti), tai dikarboksyylihapot.

Parenteraaliseen injektioon voidaan edullisesti kåyttaa myos . asyylijohdannaisia, joissa on polaarisia substituentteja, ja > · · jotka sen vuoksi ovat vesiliukoisia ja silti resistentteja ennenaikaiselle hajoamiselle tai eliminaatiolle.

21 91764

Keksinnon edullisia yhdisteita Edullisia keksinnon yhdisteita ovat (1) 2'-deoksiadenosiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaava NHR, I II CH HC /

RiOCHj o C—r

H

ORj jossa Rj^, R2 ja R3 voivat olla samoja tai erilaisia ja kukin on vety tai asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliato-mia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmastå, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso- , leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksella, etta (i) kaikki ryhmistå R^, R2 ja R3 eivat ole H, ja (ii) silloin kun R3 ei ole H, voivat Ri ja/tai R2 myos olla ' ; asetyyli, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; 22 9 1 7 6 4 (2) 2'-deoksiguanosiinin asyy1ijohdannaiset, joilla on kaava o il

HN C I II CH

R^N-C C / r1och2 o \i_5/'

OR, H

jossa , R2 ja R3 voivat olla samoja tai erilaisia ja kukin on vety tai asyyliryhmå, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliato-mia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silLa edellytyksellå, etta (i) kaikki ryhmistå , R2 ja R3 eivat ole H, ja (ii) silloin kun R3 ei ole H, voivat Ri ja/tai R2 myos olla asetyyli, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; (3) 2‘-deoksisytidiinin asyylijohdannaisia, joiLLa on kaava NHR, i 3

N^^CH

I II

0=C CH

\h h/

H H

OR, H

li 23 9 1 7 6 4 jossa Ri, R2 ja R3 voivat olla samoja tai erilaisia ja kukin on vety tai asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliato-mia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinistå, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinistå, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksellå, etta (i) kaikki ryhmistå Rj_, R2 ja R3 eivat ole H, ja (ii) silloin kun R3 ei ole H, voivat Rj ja/tai R2 myos olla asetyyli, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; (4) 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaava 0 a

/C

RjN C-CH3

I II

0=C CH

R1°CHj

Xff.

ORj H

jossa Ri asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-15 tai 17-22 hiiliatomia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista.

24 9 1 7 6 4 seriinista, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, ja R2 ja R3 ovat H, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; (5) 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaava 0

RjN C-CHj

I II

0=C CH

\N/

RjOCH^^ q 3

OR, H

jossa R| on H, R2 on asyyliryhmå, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-13 tai 15-22 hiiliatomia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, ja R3 on H, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; (6) 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaava 0

RjN'' vc-ch3

I II

0=C CH

: “Κ'Ν _y«

OR, H

25 9 1 7 6 4 jossa ja R2 voivat olla samoja tai erilaisia ja kumpikin on asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 5-22 hiiliato-mia , (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinista, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, ja R3 on H, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola; ja (7) 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaiset, joilla on kaava 0

RjN^ C-CH3

I II

0=C CH

\H V

OR, H

jossa R^ ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on asyyliryhma, joka johtuu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 2-22 hiiliatomia , (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat glysiini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, iso-leusiinista, by rosiinista, proliinista, hydroksioroliinista, seriinista, treoniinista, kysteiinista, asparagiinihaposta, glutamiinihaposta, arginiinista, lysiinista, histidiinista, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaoosta, tai 26 91764 (d) dik.arbok.syylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, ja R3 on asyyliryhma, joka johtuu valinnaisesti substituoidusta bentsoyyli- tai heterosyklisestå karboksyylihaposta, joka on olennaisesti myrkyton, tai niiden farmaseuttisesti sopiva suola.

Edullisia 2'-deoksiadenosiinin asyylijohdannaisia ovat ne, joissa Ri on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia, R2 on H tai asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia, ja R3 on H tai asyyliryhma, joka johtuu aminohaposta, jossa on hapan tai emaksinen sivuketju.

Edullisia 2'-deoksiguanosiinin asyylijohdannaisia ovat ne, joissa Ri on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia, R2 on H tai asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia tai aminohaposta, jossa on hapan tai emaksinen sivuketju, ja R3 on H tai asyyliryhma, joka on johdettu aminohaposta, jossa on hapan tai emaksinen sivuketju.

Edullisia 21-deoksisytidiinin asyylijohdannaisia ovat ne, joissa Ri on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta . . rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia, R2 on H tai asyyli ryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia, ja R3 on H tai asyyliryhma, joka on johdettu aminohaposta, jossa on hapan tai emaksinen sivuket-ju.

Edullisia 2'-deoksitymidiinin (4) asyylijohdannaisia ovat ne, joissa Ri on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-15 hiiliatomia.

Edullisia 2'-deoks1tymidiin1n (5) asyy1 ijohdannaisia ovat ne, joissa R2 on asyyliryhma, joka ou johdettu haarautumattomas-**' ta rasvahaposta, jossa on 16 hiiliatomia.

Edullisia 2'-deoksitymidiinin (6) asyylijohdannaisia ovat ne, 27 9 1 7 6 4 joissa ja R2 samoja tai erilaisia ja kumpikin on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jos-sa on 6-16 hiiliatomia.

Edullisia 2'-deoksitymidiinin (7) asyylijohdannaisia ovat ne, joissa R^ ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on asyyliryhma, joka on johdettu haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 6-16 hiiliatomia ja R3 on asyyliryhma, joka johtuu nikotiinihaposta, bentsoehaposta tai para-aminobent-soehaposta.

Terapeuttiset kåytot

Keksinnon lipofiiliset asyylideoksiribonukleosidijohdannaiset ovat kayttokelpoisia lisaamaan deoksiribonukleosidien kulje-tusta biologisten membraanien, mukaanlukien mahasuolialue elaimisså, kautta, ja nain nostamaan deoksiribonukleosidien biologista saatavuutta. Ensisijaisia nåiden elainten joukossa ovat ihmiset; keksinnon ei kuitenkaan ole tarkoitettu olevan siten rajoitettu, ja keksinnon alueeseen kuuluu kaikkien elainten hoitaminen, jotka saattavat kokea hyodyllisen vaiku-tuksen keksinnon asyylideoksiribonukleosidien antamisesta.

Taman keksinnon koostumuksia voidaan antaa elaimelle joko . . ennen sateilylle, auringonvalolle tai mutageeneilie altistu- mista tai sen jalkeen. Deoksiribonukleosidien asyylijohdan-naismuoto antaa oraalisesti tehokkaan keinon tarjota deoksi-ribonukleosideja kudoksiin. Malta johdannaisia voidaan antaa myos parenteraalisesti tai paikallisesti. Johdannaisia anta-malla v-iltetaån mahasuoliston, maksan ja plasman entsyymien vaikutuksesta tapahtuva nopea aineenvaihdunta.

Kuten kuvassa 1 on esitetty, vapaa deoksiguanosiini (dG) ja deoksiadenos iini (dA.) hajoavat plasmassa aarettoman nopeasti .

Deoksiadenosiinin, 5'-O-asetyylidsoksiadenosiinin ja 5'-O-va- leryylideoksiadenosimin kohtalot plasmassa on esitetty kuvassa 2. Kutakin naista yhdisteistå lisattiin rotan 28 9 1 7 6 4 erillisiin plasmaeriin, jotka alkuperaiselta konsentraatiol-taan olivat 20-mikromolaarisia. Plasmasta otettiin naytteita eri ajankohtina, ja halatut yhdisteet tutkittiin nestekroma-tografiaila.

Deoksiadenosiini (dA) on hyvin nopeasti hajoavaa plasmassa, kadoten 10 minuutissa. Taman yhdisteen antaminen elåin- tai ihmiskohteelle tekisi deoksiadenosiinin kudosten saatavaksi hyvin lyhyeksi ajanjaksoksi.

5'-O-deoksiadenosiini ja 5'-O-valeryylideoksiadenosiini de-asyloituvat kuitenkin plasmassa (muodostaen deoksiadenosii-nia) useiden tuntien aikana. Siksi jommankumman naista yhdisteista antaminen johtaisi deoksiadenosiinin pidempaån saata— vuuteen kudoksissa.

Deoksiadenosiinin, 5'-O-asetyylideoksiadenosiinin ja 5'-0-va-leryylideoksiadenosiinin kohtalot maksauutteessa on esitetty kuvassa 3. Kutakin naista yhdisteista lisåttiin erillisiin eriin rotan maksan vesiuutetta, jotka alkuperaiselta konsent-raatioltaan olivat 20-mikromolaarisia. Uutteesta otettiin naytteita eri ajankohtina, ja halutut yhdisteet tutkittiin nestekromatogra fia 1la.

• Deoksiadenosiini (dA) hajoaa aarettoman nopeasti plasmassa, kadoten 1 minuutissa. Alkuperainen hajoamistuote on deoksi-inosiini, joka ei ole suoraan kudosten hyvaksikåytettavissa. Deoksiadenosiinin antaminen sinansa elain- tai Ihmiskohteelle saattaisi deoksiadenosiinin kudosten saataville vain hyvin lyhyeksi ajaksi.

5'-0-asetyy1ideoksiadenos i ini ja 5'-0-valeryylideoksladeno-siini kuitenkin deasyloituvat maksauutteessa (muodostaen deoksiadenosiinia) oitemmassa kuin 1 tunnin ajassa. Siksi naista yhdisteista jommankumman antaminen johtaisi deoksi- . adenosiinin pitempiaikaiseen saatavuuteen maksaan tai n.uihin • · elimi in.

li 91764 29

Niinpå voidaan valita seos useista erilaisista kunkin deoksi-ribonukleosidin asyylijohdannaisista annetuksi annokseksi, jotta saadaan optimaalinen biologinen saatavuus. Koostumus, joka sisaltaa 35'-diasetyyli-2'-deoksisytidiinia ja 5'-pal-mitoyyli-2'-deoksisytidiinia (ja muiden deoksiribonukleosidi-en vastaavia johdannaisia) antaa pitempiaikaisen nukleosidien biologisen saatavuuden yksittaisella annoksella kuin kunkin nukleosidin yksittåisen asyylijohdannaisen antaminen tekee. Niinpa ylla kuvatun seoksen antamisen jalkeen asetyloitu yh-diste deasetyloituu suhteellisen nopeasti, jolloin saadaan vapaa deoksisytidiini (tai muut halutut deoksiribonukleosi-dit) pian antamisen jalkeen. 5'-palmitoyylijohdannainen ase-tyloituu hitaammin, jolloin saadaan enemmån vapaata deoksisytidiinia sen jalkeen, kun 351-diasetyyli-21-deoksisytidiini on muuttunut kudoksien aineenvaihdunnassa.

Asyylideoksiribonukleosidikoostumus voidaan muodostaa osaksi aurinkovoidetta, joka voidaan levittaa ennen auringonvalolle altistumista tai sen jalkeen. Aurinkovoide voi myos sisaltaa yhden tai useamman aurinkosuoja-aineen, kuten PABA, PABA:n esterit, tai muut ei-PABA:a sisaltavat kemialliset aurinko-suodattimet. Asyylideoksinukleotidit absorboituvat ihoon ja siirtyvat soluihin. Sitten asyylideoksiribonukleosidit lohke-avat kudosten esteraasien vaikutuksesta, jolloin syntyy va-paita deoksiribonukleosideja maarina, jotka ovat tehokkaita korjaamaan auringonvalon aiheuttamia vahinkoja. Asyylideoksi-ribonukleosidikoostumusten ja auringonsuoja-aineiden, kuten PA3A:n, yhdistelmå tarjoaa maksimaalisen suojan iholle aurin-golta.

Keksinnon asyylideoksiribonukleosidikoostunuksia voidaan myos kavttaå oarantamaan joitakin ikaantymisen vaikutuksia anta-malla deoksiribonukleosidien korkea ja pitkitetty taso nosta-maan luonnollisen DNA:n korjautumisprosesseja soluissa, hoi-taen nain luonno11isesti ilmenevaa DXA:han kohdistuneen vau-. non progress i iv1 sta akkumuloitumista, joka ilmenee ian kart- tuessa. Koostumukset ikaantymisen vaikutusten hoitamiseen tai parantamiseen voidaan antaa paikallisesti, ihovoiteen muodos-sa, tai voidaan antaa oraalisesti tai parenteraalisesti.

30 91764

On muitakin olosuhteita kuin sateilyvauriot, joissa eksogee-nisilla deoksiribonukleosidei11a tai nilden johdannaisilla on kåyttokelpoisia terapeuttisia sovellutuksia.

Deoksiribonukleiinihappoa on kaytetty kiihdyttamaan haavojen arpeutumista tai parantumista, ja myos kiihdyttamaan maksan regeneroitumista koe-elaimissa. On todennakoista, etta naissa tilanteissa, seka sellaisissa tilanteissa, jolloin DNA:ta kaytetaan edistamaan elainten eloonjaamista sateilyn jalkeen, DNA toimii varastosåilona deoksiribonukleosideille, joka asteittain vapauttaa deoksiribonukleotidit ja deoksiribo-nukleosidit entsymaattisen hajoamisen aikana.

Asyloitujen deoksiribonukleosidien antaminen, kuten tassa on kuvattu, on menetelma toimittaa deoksiribonukleosideja kudok-siin, joka on edullista vieraan DNA:n antamiselle tarkoituk-siin nopeuttaa haavojen paranemista tai kudosten uusiutumis-ta. Paitsi DNA, myos asyloidut deoksiribonukleosidit ovat tehokkaita oraalisen antamisen jalkeen; ne ovat myos ei-anti-geenisia ja ovat paljon helpompia puhdistaa kuin DNA.

Taman keksinnon koostumusta voidaan antaa myos lisaamaån vau-rioituneen kudoksen paranemista. Tallaisia vaurioituneita kudoksia ovat ihohaavat (esim. pistohaavat, repeytymiset, hankautumiset, jne.), palanut kudos (iho jne.), sairas tai vaurioitunut maksa (maksan leikkaus- ja muut haavat, tai kirroosin tai diabeteksen vuoksi, jne.), vaurioitunut syd.in-lihas (esim. parempi arpimuodostus sydanlihasinfarktin jalkeen) ja vaurioitunut luuydin (esim. sadehoidon tai kemotera-peuttisen hoidon jalkeen).

Kun on tarkoituksena hoitaa ihon haavoja tai palamisia, voidaan koostumuksia kayttaa paika11isesti osana iholotionia tai -voidetta, tai osana biologisesti erodoituvaa polymeeria.

EdulLisia asyylisubstituenttirvhmia 2'-deoksiadenosiInin , 2'-deoksisytidiinin, 2‘-deoksiguanosiinin ja tymidiinin deoksiriboosirenkaan hydroksyy11ryhmille ovat rasvahapot, 3i 91764 joissa on 6-16 hiiliatomia, tai dikarboksyylihapot, joissa on 4-6 hiiliatomia, esira. meripihka-, glutaari- tai adipiini-hapot. Edullisia substituentteja deoksisytidiinin, deoksi-adenosiinin ja deoksiguanosiinin eksosyklisiin aminoryhmiin ovat aminohapot, joissa on emaksisia sivuketjuja, esira. ly-siini tai arginiini. Edullisia substituentteja tymidiinin tymiinirenkaan sekundaariseen amiiniin ovat nikotiinihappo tai para-aminobentsoehappo.

Edullisia deoksiadenosiinijohdannaisia ovat N6-lysyyli-5'-palmitoyylideoksiadenosiini, 5'-palmitoyyliadenosiini, N^- lysyyli-51-dodekanoyylideoksiadenosiini, 51-dodekanoyyliade-nosiini ja N^-lysyyli-3',5'-diasetyylideoksiadenosiini.

Edullisia deoksiguanosiinijohdannaisia ovat N2-lysyyli-51-palmitoyylideoksiguanosiini, 5'-dodekanoyylideoksiguanosiini ja N2-lysyyli-3',5‘-diasetyylideoksiguanosiini.

Edullisia deoksisytidiinijohdannaisia ovat N^-lysyyli-5'-palmitoyylideoksisytidiini, 5'-palmitoyylideoksisytidiini, N^-lysyyli-5'-dodekanoyylideoksisytidiini, 5'-dodekanoyyli-deoksisytidiini ja N^-lysyyli-31,5'-asetyylideoksisytidiini.

Edullisia tymidiinijohdannaisia ovat N3-nikotinoyyli-5'-pal-. mitoyylitymidiini, 5'-palmitoyylitymidiini, N^-nikotinoyyli- 51-dodekanoyylitymidiini, 5'-dodekanoyylitymidiini ja N3-ni-kotinoyyli-3',5'-asetyylitymidiini.

Keksinnon piiriin kuuluvia koostumuksia ovat ne, jotka sisal-tav.it deoksiribonukleosidien asyylijohdannaisten seoksia te-hokkaina maarina saavuttamaan haluttu tarkoitus. Narna koostu-mukset voivat sisaltaa 0-50 mooliprosenttia deoksisytidiinin asyy1ijohdannaista, 0-50 mooliprosenttia deoksiguanosiinin asyy1ijohdannaista, 0-50 mooliprosenttia deoksitymidiinin asyy 11johdannaista ja 0-50 mooliprosenttia deoksiadenosiinin asyy11johdannaista, silla edellytyksella, etta asyy1ideoksi-ribonukleosidien kokona ispitoisuus on korkeitaan 100 mooliprosenttia .

32 9 1 7 6 4

Edullinen koostumus sisaltaa 25 mooliprosenttia deoksisyti-diinin asyylijohdannaista, 25 mooliprosenttia deoksiguanosii-nin asyylijohdannaista, 25 mooliprosenttia deoksitymidiinin asyylijohdannaista ja 25 mooliprosenttia deoksiadenosiinin asyylijohdannaista.

Sateilyn aiheuttamisen soluvaurioiden tai auringonpolttamien hoitamiseksi tai haavojen parantumisen lisaamiseksi edullisia annostuksia ovat seuraavien måarien kanssa ekvivalentit asyyli johdannaisten maarat: 10-1000 mg 2'-deoksiadenosiinia, 10-1000 mg 21-deoksiguanosiinia, 10-1000 mg 21-deoksisytidiinia ja 10-1000 mg 2'-deoksitymidiinia. Koostumus voi esimerkiksi sisaltaa 13-1330 mg 3*,5 *-diasetyyli-2’-deoksiadenosiinia, 13-1310 mg 33'-diasetyyli-2'-deoksiguanosiinia, 14-1370 mg 31,51-diasetyyli-2'-deoksisytidiinia ja 14-1350 mg 3',5'-di-asetyyli-21-deoksitymidiinia. Kuten alalla ymmårretåån, naita annostuksia laskettaessa tarkoitetaan 21-deoksiribonukleosi-din ekvivalenttista maåråå yksin, s.o. asyylisubstituentti ja happoadditio-osa mistå hyvansa farmaseuttisesti sopivasta suolasta eivåt sisally tåhån laskuun.

Aurinkovoiteeseen voidaan lisata 0,1-5 paino-% yllåolevia koostumuksia. Yleensa tata tarkoitusta vårten on asyylijoh-dannainen vapaiden asyylideoksiribonukleosidien muodossa eika ‘ farmaseuttisesti sopivina suoloina.

On joitakin tilanteita, jolloin on hyodyllista toimittaa yk-sittainen deoksiribonukleosidi kudoksiin, esim. deoksisyti-diini hoidettaessa antineoplastisen laakkeen arabinosyyli-sytosiinin aiheuttamaa myrkyl1isyytta, tai tymidiini hoidettaessa metotreksaatin aiheuttamaa myrkyllisyytta. Naissa taoauksissa voidaan antaa yksittaisen deoksiribonukleosidin asyylijohdannais ia.

Va Lmistusmenetelmia

Kun halutun asyylijohdannaisen happolahteessa on ryhmia, jorka hairitsevat asyloitumisreaktioita, esim. hydroksyyli-ja aminoryhmia, nama ryhmat voidaan estaa suojaryhmilla, • · 33 9 1 7 6 4 esim. t-butyylidimetyylisilyylieetterit tai t-BOC-ryhmat, vastaavasti, ennen anhydridin valmistusta. Esimerkiksi maito-happo voidaan rauuttaa 2-t-butyylidimetyylisiloksipropioni-hapoksi t-butyylidimetyylikloorisilaanilla, jonka jalkeen suoritetaan saadun silyyliesterin hydrolyysi emaksen vesi-liuoksella. Anhydridi voidaan muodostaa antamalla suojatun hapon reagoida DCC:n kanssa. Aminohapoilla voidaan standardi-menetelmiå kayttaen valmistaa N-t-BOC-johdannainen, joka sit-ten muutetaan anhydridiksi DCC:lla. Hapoilla, jotka sisalta-vat useamman kuin yhden karboksylaattiryhman (esim. meripih-ka-, fumaari- tai adipiinihappo), halutun dikarboksyylihapon happoanhydridin annetaan reagoida 2'-deoksiribonukleosidin kanssa pyridiinissa.

3 ' ,51-diasyylideoksitymidiin voidaan valmistaa menetelmien mukaan, jotka on esitetty julkaisussa Nishizawa et al., Biochem. Pharmacol. 1_4:1605 (1965), kasittelemalla deoksi-tymidiinia 2,1 ekvivalentilla halutun asyyliyhdisteen happo-anhydridia pyridiinissa, jonka jalkeen lammitetaan 80-85°C:ssa ainakin yksi tunti. Vaihtoehtoisesti voidaan deoksitymidiinia kasitellå 2,1 ekvivalentilla happokloridia pyridiinissa huoneenlammossa. (Katso esimerkki 1.)

Deoksitymidiinin 51-hydroksyyliryhma voidaan selektiivisesti asyloida 1 ekvivalentilla halutun asyyliyhdisteen happoanhyd-ridia pyridiinissa, joka lammitetaan 80-85°C:een, Nishazawa et al.:n mukaan. Vaihtoehtoisesti happokloridin (1 ekviva-lentti) voidaan antaa reagoida deoksitymidiinin kanssa pyridiinissa ja DMF:ssa huoneenlammossa Baker et al.:n mukaan J. Med. Chem. 21:1218 (1978). (Katso esimerkki 2).

Deoksitymidiinin 31-hydroksyyliryhma voidaan selektiivisesti asyloida muodostama1 la selektiivisesti 51-0-t-butyylidimetyy-lisilyylijohdannainen 1,2 ekvivalentilla _t-butyylidimetyyli-kloorisilaania DMF:ssa, joka sisaltaa imidatsolia, jonka jalkeen 3'-hydroksyy1iryhma asyloidaan sopivalla happoanhydri-dilla, ja suoritetaan 5 '-t-butyy 1 idimetyylisilyylieet.r.erin lohkaiseminen Baker et al.:n mukaan. (Katso esimerkki 3.) 34 91 764 3 1 ,51-diasyylideoksisytidiini voidaan valmsitaa Gish et al.:n soveltaman menetelman mukaan, J. Med. Chem. 14:1159 (1971), kasittelemalla deoksisytidiinlhydrokloridia 2,1 ekvivalenti 1-la sopivaa happokloridia DMF:sså. (Katso esimerkki 5.)

Deoksisytidiinin 51-hydroksiryhmå voidaan selektiivisesti asyloida kasittelemalla deoksisytidiinlhydrokloridia 1,1 ekvivalentilla sopivaa happoanhydridia DMF:ssa. Gish et al. (Katso esimerkki 6.)

Deoksiadenosiinin 3',51-diasyylijohdannainen voidaan valmis-taa kasittelemalla 2,1 ekvivalentilla sopivaa happokloridia DMF:ssa. (Sovellettu Gish et al.rsta, katso esimerkki 7.)

Deoksiadenosiinin 51-hydroksyyliryhma voidaan selektiivisesti asyloida kasittelemalla deoksiaddenosiinihydrokloridia 1,1 ekvivalentilla haluttua happokloridia DMF:ssa. (Sovellettu Gish et al.csta, katso esimerkki 8.) 3',5'-diasyyli-2'-deoksiguanosiini voidaan valmistaa kasittelemalla deoksiguanosiinihydrokloridia 2,1 ekvivalentilla sopivaa happokloridia DMF:ssa. (Sovellettu Gish et al.:sta, katso esimerkki 9.)

Deoksiguanosiinin 5'-hydroksyyliryhma voidaan selektiivisesti asyloida kasittelemalla deoksiguanosiinihydrokloridia 1,1 ekvivalentilla sopivaa happokloridia DMFrssa. (Sovellettu Gish et al.rsta, katso esimerkki 10.)

Aminohapot voidaan liittåa deoksiadenosiinin, deoksisytidiinin ja deoksiguanosiinin (tai niiden 3‘- tai 51-asyylijohdan-naisten) eksosyklisiin aminoryhmiin standardimenetelmi1la kayttaen disvkloheksyylikarbodi-imidia· (Katso esimerkki 11.)

Maita esyyliyhdisteita voidaan antaa jatkuvasti elaimelle, ^olla jn riski altistua joko sateil.ylle, auringonvalol le tai kemia l L isille niutageenei 1 le . Keksinnon asyylikoostumuks ia voidaan myos antaa sateilylle, auringonvalolle tai i 33 91764 kemiallisille mutageenei1 Le altistuksen jalkeen tai haavan syntymisen jalkeen lisaåmaån DNA:n korjautumista ja nain parantamaan vauriota ja edistamaan elaimen eloonjaamista. Edullisesti voidaan keksinnon koostumuksia antaa ennen tai jalkeen sådehoidon tai kemoterapian parantamaan hoidon ei-toivottuja sivuvaikutuksia.

Keksinnon asyylikoostumuksia voidaan myos antaa yhdessa mulden såteilyltå suojaavien yhdisteiden kanssa, kuten ovat WR-2721, NAC, DDC, kysteamiini, 2-merkaptoetanoli, merkapto-etyyliamiini, ditiotreitoli, glutationi, 2-merkaptoetaanisul-fonihappo, WR-1065, nikotiiniamidi, 5-hydroksitryptamiini, 2-beeta-aminoetyyli-isotiouronium-Br-HBr, glukaanit, GLP/B04, GLP/B05, OK-432, Biostim, PSK, Lentinan, Schizophyllan, Rhodexman, Levan, Mannozym, MVE-2, MNR, MMZ, IL-2, TNF, kateenkorvafaktori TF-5, glutationiperoksidaasi, superoksidi-dismutaasi, katalaasi, glutationireduktaasi, glutationitrans-feraasi, seleeni, CdCl2# MnCl2» Zn-asetaatti, A-vitamiini, beeta-karoteeni, prostaglandiinit, tokoferoli ja metyleeni-sininen. Naiden suojayhdisteiden antaminen yhdessa keksinnon asyylijohdannaisten kanssa antaa suuremman suojan kuin jos asyylijohdannaisia tai muita aineita annettaisiin yksinaan.

Farmakologisesti aktiiviset asyylijohdannaiset voidaan yhdis-tåa sopivien farmaseuttisesti soveltuvien kantajien kanssa, jotka sisåltavat tayteaineita ja apuaineita, jotka helpotta-vat vaikuttavien yhdisteiden valmistusta. Nama voidaan antaa tabLetteina, rakeina, kapseleina ja perapuikkoina. Koostumuk-set voidaan antaa oraalisesti, rektaalisesti, vaginan kautta, tai vapauttaa suun limakalvon kautta, ja ni ita voidaan kayt-taa liuosmuodossa injektoimalla, oraalisesti tai paikallises-ti. Koostumukset voivat sisaltaa noin 0,1-99 %, edullisesti noin 50-90% vaikuttavaa yhdistetta tai yhdisteita, yhdessa tayteaine(id)en kanssa.

Taman keksinnon farmaseuttiset valmisteet valmistetaan taval- la, joka on sinansa tunnettu, esimerkiksi tavanomai sella sekoitus-, granulointi-, rakeistus-, liuotus- tai « 36 91 764 lyofilisointimenetelmilla. Niinpa farmaseuttiset valmisteet oraalisesti kåytettåvåksi voidaan saada yhdiståmalla vaikut-tava yhdiste tai yhdisteet kiinteiden tayteaineiden kanssa, mahdol1isesti jauhamalla saatu seos ja valmistamalla granu-laattiseos sen jålkeen, kun on lisatty sopivia apuaineita, jos halutaan tai jos on tarpeen, jolloin sadaan tablettien tai rakeiden ytimet.

Sopivia tåyteaineita ovat tayteaineet (fillers), kuten soke-rit, esim. laktoosi, sakkaroosi, mannitoli tai sorbitoli, selluloosavalmisteet ja/tai kalsiumfosfaatit, esimerkiksi trikalsiumfosfaatti tai kalsiumvetyfosfaatti, seka sideai-neet, kuten tårkkelyspasta, kayttaen esimerkiksi maissitark-kelysta, vehnatårkkelysta, riisitarkkelysta tai perunatarkke-lysta, gelatiinia, tragakanttia, metyyliselluloosaa, hydrok-sipropyylimetyyliselluloosaa, natriumkarboksimetyyliselluloosaa ja/tai polyvinyylipyrrolidonia.

Apuaineita ovat ennen kaikkea juoksevuutta saatelevat aineet ja liukastusaineet, esimerkiksi piidioksidi, talkki, stearii-nihappo tai sen suolat, kuten magnesiumstearaatti tai kal-siumstearaatti, ja/tai polyetyleeniglykoli. Rakeiden ytimet tarjotaan kayttoon varustettuna sopivilla paallyksilla, jotka haluttaessa ovat resistentteja mahanesteille. Tahan tarkoi-tukseen voidaan kayttaa konsentroituja sokeriliuoksia, jotka valinnaisesti voivat sisaltaa arabikumia, talkkia, polyvinyy-lipyrroLidonia, polyetyleeniglykolia ja/tai titaanidioksidia, kiillottavia liuoksia ja sopivia orgaanisia liuottimia tai Liuot inseoksia. Jos on tarkoitus valmistaa påallysteet resis-tenteiksi mahanesteiLle, kaytetaan sopivien se 1luloosavalmis-teiden, kuten asetyy1 isel1uloosaftalaatin tai hydroksipropyy-1imetyyI iselluloosaftalaatin liuoksia. Variaineita tai pig-mentteja voidaan lisata tablettien tai rakeiden oinnoittei-siin esimerkiksi identifiointiin tai yhdisteannostukslen erilaisten yhdistelrTiien karakterisointiin.

Muita farmaseuttisia valmisteita, joita voidaan kayttaa oraalisesti, ovat gelatiinista valmistetut • ' 37 9 1 7 6 4 ns. "push-fit"-kapsel it, sekå pehmeasti suljetut kapselit, jotka on valmistettu gelatiinista ja plastisoijasta; kuten glyserolista tai sorbitolista. "Push-fit"-kapselit sisaltavat vaikuttavan yhdisteen (yhdisteet) rakeiden muodossa, sekoi-tettuna mahdol1isesti tayteaineiden, kuten laktoosin, side-aineiden, kuten tarkkelysten ja/tai liukastusaineiden, kuten talkin tai magnesiumstearaatin, ja mahdollisesti stabiloijien kanssa. Pehmeissa kapseleissa vaikuttavat aineet on edulli-sesti liuotettu tai suspendoitu sopiviin nesteisiin, kuten rasvaoljyt, nestemainen parafiini tai polyetyleeniglykolit. Lisaksi voidaan lisata stabiloijia.

Mahdollisia farmaseuttisia valmisteita, joita voidaan kåyttaa rektaalisesti, ovat esimerkiksi peråpuikot, jotka koostuvat vaikuttavien aineiden yhdistelmasta perapuikkopohjassa. Sopi-via perapuikkopohjia ovat esimerkiksi luonnon tai synteetti-set triglyseridit, parafiinihiilivedyt, polyetyleeniglykolit tai korkemmat alkanolit. Lisaksi on myos mahdollista kayttaa gelatiinista olevia rektaalikapseleita, jotka koostuvat vaikuttavien yhdisteiden yhdistelmasta pohjan kanssa. Mahdollisia pohjamateriaaleja ovat esimerkiksi nestemaiset triglyse-ridit, polyetyleeniglykolit tai parafiinihiilivedyt.

Sopivia koostumuksia parenteraalisesti annettavaksi ovat vesiliukoisessa muodossa olevien vaikuttavien yhdisteiden, esimerkiksi vesiliukoisten suolojen, vesi 1iuokset. Lisaksi voidaan antaa vaikuttavien yhdisteiden suspensioita sopivina oljymaisina injektiosuspensioina. Sopivia lipofiilisia liuot-timia tai. kantoaineita ovat rasvaoljyt, esimerkiksi seesami-oljy, tai synteettiset rasvahappoesterit, esimerkiksi etyyli-* oleaatti tai triglyseridit. Vesipitoiset injektiosuspensiot voivat sisaltaa ameita, jotka nostavat suspension viskosi-teettia, kuten esimerkiksi natriumkarboksimetyyliselluloosa, sorbitoli ja/tai dekstraani. Valinnaisesti suspensio voi sisaltaa myos stabiloijia.

Asyylideoksiribonukleosidit voivat olla muodostettu osaksi ihovoidetta tai aurinkovoidetta paikallisesti annettavaksi.

3S 91764

Sooivia koostumuksia paikallisesti annettavaksi ovat sopivat 61jysuspensiot tai liuokset. Sopivia lipofiilisiå liuottimia tai kantoaineita ovat rasvaoljyt, esimerkiksi seesamioljy tai kookosoljy, tai synteettiset rasvahappoesterit, esimerkiksi etyylioleaatti tai triglyseridit. Naita paikallisesti kåytet-tavia valmisteita voidaan kåyttaa hoidettaessa vaurioitunutta kudosta, kuten ihon haavat tai palovammat, tai hoitamaan tai ehkaisemåån auringonvalon aiheuttamia soluvaurioita (aurin-gonpolttamat).

Kun on tarkoitus nopeuttaa haavojen paranemista, voidaan tå-mån keksinnon koostumukset muodostaa osaksi haavan peitteitå, tai lisata biologisesti erodoituviin mikrokapseleihin paikallisesti annettaviksi. Tallaiset mikrokapselit voivat sisåltaå esimerkiksi polylaktaattia tai laktaatti-glykolaatti-kopoly-meereja. Katso Weise, D.L. et al-, Drug Carriers in Biology and Medicine, Gregoriadis, G. et al., Academic Press, NY s. 237-270 (1979) .

Seuraavat esimerkit ovat taman keksinnon menetelmia ja koostumuksia valaisevia, mutta eivat sita rajoittavia. Muut sopivat muunnokset ja sove 1lutukset erilaisista tiloista ja para-raetreista, jotka normaalisti kuuluvat kliiniseen terapiaan ja jotka ovat alan ammattimiehelle ilmeisia, kuuluvat taman kek- • · sinnon henkeen ja piiriin.

Esimerkkeja raenetelmista valmistaa taman keksinnon yhdisteitå

Esimerkki 1: 3',51-diasyy1i-2'-deoksitymidiinin valmistus .. Happoanhydr ideis ta : 2‘-Deoksitymidiini Liuotetaan vedettomaan pyridiiniin huo-neenlammossa. 2,1 mooliekvivalenttia halutun asyyliyhdisteen happoanhydridiå (esira. etikkahappoanhydridi, laktaattianhyd-ridi, voihappoanhydridi, jne.) Lisataan sitten. Reaktioseos kuumennetaan sitten 30-85°C:een 1-4 tunniksi, jaahdytetaan, • · i kaadetaan jaaveteen ja esterit otetaan talteen uuttamalla kloroformilla tai samanlaisella 1iuottimella. Kloroformi 39 9 1 7 6 4 pestaan sitten jaakylmalla 0,01 N rikkihapolla, 1% natriumbi-karbonaatin vesiliuoksella ja lopuksi vedella. Natriumsulfaa-tilla kuivaamisen jalkeen kloroformi haihdutetaan ja jaånnos-oljylle tai kiteille suoritetaan kromatografia (sovellettu julkaisusta Nishizawa et al., Biochem. Pharmacol. 14;1605 (1965) ) .

Happoklorideista:

Vedettomaan pyridiiniin liuotettuun 2'-deoksitymidiiniin lisataan 5°C:ssa 2,1 mooliekvivalenttia halutun asyyliyhdis-teen happokloridia (esim. palmitoyylikloridi, asetyyliklori-di, jne.). Seosta pidetaan huoneenlåmmdsså yon yli, lisataan jaaveteen ja jatkokasitellåan kuten edella on esitetty (so-vellutus Nishizawasta).

Esimerkki 2: 51-Asyyli-21-deoksitymidiinin valmistus

Vedettomaan pyriidiinin liuotettuun 2'-deoksitymidiiniin lisataan huoneenlammossa 1,0 mooliekvivalenttia halutun asyyliyhdisteen happoanhydridia. Reaktio kuumennetaan sitten suunnilleen lampotilaan 80-85°C useiksi tunneiksi, jaahdy-tetaan, kaadetaan jaaveteen, ja esterit otetaan talteen uut-tamalla kloroformi1la tai samanlaisella liuottimella. Kloro-: formi pestaan sitten jaakylmalla 0,01 N rikkihapolla, 1% nat- riumbikarbonaatin vesiliuoksella ja lopuksi vedella. Natrium-sulfaatilla kuivaamisen jalkeen kloroformi haihdutetaan ja jaannosoljy1 le tai kiteille suoritetaan kromatografia. Paa-tuote, joka kromatografialla eristetaan, on 51-substituoitu .. esteri (sovellettu Nishizawa et al.:sta).

Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa selektiivisesti deoksitymidiinin 5'-asyLointi suspendoimalla 2'-deoksitymidiini pyridiinin ja N,N-dimetyyliformamidin seokseen, joka on jaah-dytetty 0°C:ksi j ial'iauteessa. 1,0 mooliekvivalenttia halutun asvyiiyhdisteen happokloridia Lisataan pisaroittain seokseen, jota sekoitetaan 9°G:ssa 12-24 tuntia. Vetta Lisataan sitten pysayttamåan reaktio, ja Liuottimet haihdutetaan in vacuo 40 91 764 50°C:ssa. Jaannos liuotetaan metanoliin ja puhdistetaan kro-matografialla silikageelilla (sovellettu julkaisusta Baker et al. J. Med. Chem. 21:1218 (1978)).

Esimerkki 3: 31-Asyyli-21-deoksitymidiinin valmistus

Sekoitettuun suspensioon, jossa on 2'-deoksitymidiinia kui-vassa Ν,Ν-dimetyyliformamidissa, lisataan 2,4 mooliekviva-lenttia imidatsolia ja sen jalkeen 1,2 mooliekvivalenttia t-butyylidimetyylikloorisilaania. Seosta sekoitetaan kosteu-delta suojaten huoneenlåmmossa 20 tuntia, jolloin liuotin poistetaan 50°C:ssa in vacuo. Jaannos liuotetaan 15 mlraan etyyliasetaattia, peståån ja haihdutetaan, jolloin saadaan siirappi, josta saadaan kiteyttåmålla kuumasta kloroformista ja lisaamalla heksaania, kunnes tulee opalisoivaksi, 5‘-(t-butyylidimetyylsilyyli)-21-deoksitymidiini.

5'-(t-Butyylimetyylisilyyli)-2'-deoksitymidiinin sekoitettuun suspensioon kuivassa pyridiinissa, joka on jååhdytetty 0°C:een, lisataan 1,1 mooliekvivalenttia halutun asyyliyhdis-teen sopivaa happoanhydridia, ja seosta sekoitetaan kosteu-delta suojaten 20 tuntia 0-5°C:ssa, jolloin reaktio paatetaan lisaamalla muutama ml vetta. Liuotin haihdutetaan ja jaannos uutetaan ja haihdutetaan, jolloin saadaan paksu, kirkas sii-: rappi, joka sitten kuivataan iri vacuo 25°C:ssa.

t.-Butyylimetyylisilyyliryhma poistetaan jaaetikalla ja tetra-butyyliammoniumfluondilla tetrahydrofuraanissa, jolloin saadaan haluttu 31-asyyli-2'-deoksitymidiinijohdannainen (sovellettu Baker et al.rsta).

Esimerkki 4: N-^-Asyyli-2 '-deoksitymidiinin valmistus

Pyrimidiinirenkaan 3-asemassa olevan sekundaarisen amiinin asylointi suoritetaan antamalla 3',5'-diasyylideoksitymidii-nin rt_-agoida 1,1 mool iekvi valent in kanssa halutun asyylisubs-tituencin happokloridia aproottisessa liuottimessa (kuten eetten, dioksaani, kloroformi, etvyliasetaatti, 41 91764 asetonitriili, pyridiini, dimetyyliformamidi, ja vastaavat) siten, etta lasna on 1-5 mooliekvivalenttia orgaanista emasta (erityisesti aromaattiset araiinit, kuten pyridiini, trialkyy-liamiinit tai Ν,Ν-dialkyylianiliinit) (sovellettu Fuji et al.:n US-patentista nro 4 425 335). Asyylisubstituentti se-kundaårisessa amiinissa voi olla sama tai erilainen kuin on riboosiosan hydroksyyliryhmisså.

Esimerkki 5: 31,51-Diasyyli-21-deoksisytidiinin valmistus 2-Deoksisytidiinihydrokloridi liuotetaan N,N-dimetyyliform-amidiin. 2,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubstituentin happokloridia lisataan ja seosta sekoitetaan yon yli huoneen-låmmosså. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo oljyksi ja tri-turoidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai samanlais-ten liuottimien seoksella. Oljy trituroidaan sitten IN nat-riumvetykarbonaatilla. Kiteinen kiintea aine kerataan, pes-tåan vedella, kuivataan ja uudelleenkiteytetaan (sovellettu Gish et al.rsta, J. Med. Chem. 14:1159 (1971)).

Esimerkki 6: 51-Asyyli-2*-deoksisytidiinin valmistus 2-Deoksisytidiinihydrokloridi liuotetaan N,N-dimetyyliform-amidiin. 1,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubstituentin ·: happokloridia lisataan, ja seosta sekoitetaan yon yli huo- neenlammossa. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo oljyksi ja trituroidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai saman-laisten liuottimien seoksella. Oljy trituroidaan sitten IN natriumvetykarbonaati1la. Kiteinen kiintea aine kerataan, pestaan vedella, kuivataan ja uudelleenkiteytetaan (sovellet-.· tu Gish et al.rsta).

Esimerkki 7; 31,51-Diasyyli-21-deoksiadenosiinin valmistus 2'-Deoksiadenosiini liuotetaan N,N-dimetyy1 iformamidiin ja pyridiir.iin (1:1). 2,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubstituentin happokloridia lisataan ja seosta sekoitetaan yon yli huoneenlammossa. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo oljyksi ja trituroidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai 42 9 1 7 6 4 samanlaisten liuottimien seoksella. 01jy trituroidaan sitten IN natriumvetykarbonaatilla. Kiteinen kiintea aine keråtåån, pestaan vedellå, kuivataan ja uudelleenkiteytetåån.

Esimerkki 8: 5'-Asyyli-21-deoksiadenosiinin valmistus 2'-Deoksiadenosiini liuotetaan N,N-dimetyyliformamidiin ja pyridiiniin (1:1). 1,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubs-tituentin happokloridia lisåtåån ja seosta sekoitetaan huo-neenlammossa yon yli. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo 51-jyksi ja trituroidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai samanlaisten liuottimien seoksella. Oljy trituroidaan sitten IN natriumvetykarbonaatilla. Kiteinen kiintea aine keratåan, pestaan vedella, kuivataan ja uudelleenkiteytetåån.

Esimerkki 9: 3 *,5'-Diasyyli-2'-deoksiguanosiinin valmistus 2'-Deoksiguanosiini liuotetaan N,N-dimetyyliformamidiin ja pyridiiniin (1:1). 2,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubs-tituentin happokloridia lisåtåån ja seosta sekoitetaan yon yli huoneenlåmmosså. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo 51-jyksi ja trituroidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai samanlaisten liuottimien seoksella. Oljy trituroidaan sitten IN natriumvetykarbonaatilla. Kiteinen kiintea aine keråtåån, * · pestaan vedella, kuivataan ja uudelleenkiteytetåån.

Esimerkki 10: 5'-Asyyli-21-deoksiguanosiinin valmistus 2'-Deoksiguanosiini liuotetaan N,N-dimetyyliformamidiin ja .. pyridiiniin (1:1). 1,1 mooliekvivalenttia halutun asyylisubs- tituentin happokloridia lisåtåån ja seosta sekoitetaan y5n yli huoneenlåmm5sså. Reaktioseos konsentroidaan in vacuo 51-jyksi ja trituroidaan etyyliasetaatin ja dietyylieetterin tai samanlaisten liuottimien seoksella. Oljy trituroidaan sitten IN natriumvetykarbonaatilla. Kiteinen kiintea aine keråtåån, pestaan vedellå, kuivataan ja uudelleenkiteytetåån (sovellet- • · · tu Gish et al. :sta).

43 91 764

Esimerkki 11; N-lysyyli-51-O-palmitoyylideoksisytidiinin synteesi 51-O-palmitoyylideoksisytidiini syntetisoidaan antamalla deoksisytidiinihydrokloridin reagoida 1,1 ekvivalentin kanssa palmitoyylikloridia kuivassa dimetyyliformamidissa.

14 g 51-O-palmitoyylideoksisytidiiniå liuotetaan 100ml:aan dimetyyliasetamidia, 1 mooliekvivalentti di-tert-butoksikar-bonyylilysiiniå lisataan, ja seos jaåhdytetåan jaahauteessa.

1,2 mooliekvivalenttia (7,4 g) disykloheksyylikarbodi-imidiå lisataan ja seosta sekoitetaan 4°C:ssa 90 tuntia. Sakka (di-sykloheksyyliurea) poistetaan suodattamalla. Suodokseen lisataan 100 ml vettå, ja sen jalkeen 1 litra etyyliasetaattia. N^-(di-N-tert-butoksikarbonyylilysyyli)-51-O-palmitoyylideoks isytidiini erotetaan reagoimattomista reagensseista kromato-grafialla silikageelilla. t-Butoksikarbonyylin suojaryhmat poistetaan standardimenetelmilla kasittelemallå hapolla, kuten trifluorietikkahapolla.

Samoin voidaan deoksisytidiinin, deoksiadenosiinin tai de-oksiguanosiinin 5'-0-asyyli- tai 3',5'-O-diasyylijohdannai-siin liittaa lysiini tai arginiini niiden eksosyklisiin pri-maarisiin aminoryhmiin disykloheksyylikarbodi-imidillå.

Esimerkkejå nukleosidien suojaamisesta

Entsymaattiselta hajoamiselta asyloimalla

Deoksiribonukleosidit hajoavat nopeasti sen jalkeen kun niita on annettu elaimille. Jos on tarkoitus menestyksellisesti hyodyntaa asyloitujen nukleosidien suorittama nukleosidien toimitus kudoksiin, on ehdottoman valttamatonta, etta asy-loinnin tulisi ehkaista nukleosidiosan hajoaminen entsyymien vaikutuksesta, jotka normaalisti hajottavat nukleoside ja . Jo-kaisella paadeoksiribonukleosidi11a on niiden hajoamison en-simmaiseen vaineeseen osallisena erilainen entsyvmi. Deoksiadenosiinin hajoamisen ensimraainen vaihe on deaminoituminen, «« 91764 jota katalysoi adenosiinideaminaasi. Tymidiinia katalysoi aluksi tymidiinifosforylaasi; deoksiguanosiinia puriininuk-leosidifosforylaasi ja deoksisytidiinia hajottaa deoksisyti-diinideaminaasi.

Esimerkki 17

Kunkin deoksiribonukleosidin tai niiden asyloitujen johdan-naisten liuoksia (100 mikromolaarisia fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa) inkuboitiin 37°C:ssa kunkin nel jan entsyymin kanssa: adenosiinideaminaasi (ADA), sytidiinideaminaasi (CDA), puriininukleosidifosforylaasi (PNP) ja tymidiinifosforylaasi (TP). Yhdisteiden entsymaattinen hajoaminen maaritet-tiin HPLC:11a.

Taulukko 1; Deoksiribonukleosidien suojaaminen 5'-0-asyloin-nilla hajoamisen alkuvaiheita katalysoivilta entsyymeilta _Entsyymi_

Yhdiste_ADA CDA PNP TP

deoksiadenosiini +--- 3',5'-di-O-asetyylideoksiadenosiini - 5’-O-palmitoyylideoksiadenosiini - • < deoksisytidiini 31,5'-di-O-asetyy1ideoksisytidiini - 5'-O-palmitoyylideoksisytidiini - deoksiguanosiini + • · 3',5'-di-O-asetyylideoksiguanosiLni - 5'-O-palmitoyylideoksiguanosiini - tymidiini - - - + 3',5‘-di-O-asetyylitymidiini - 51-O-valeryylitymidiini - 5'-O-oktanoyylitymidiini - - 5'-O-palmitoyylitymidiini - - - 5 ' -O-valeryyl i tymidiini__ -_-_-_^ 45 9 1 7 6 4 + osoittaa, etta yhdiste oli substraatti entsyymille.

- osoittaa, etta yhdiste ei ollut substraatti entsyymille.

Nåmå tiedot osoittavat, etta deoksiribonukleosidien 5'-O-asy-lointi suojaa niita entsyymeiltå, jotka katalysoivat niiden hajoamisen alkuvaiheita. Niinpa asyloitujen nukleosidien nuk-leosidiosa pysyy ehjana in vivo, kunnes deasyloituminen ta-pahtuu.

Esimerkkeja asyloitujen deoksiribonukleosidien deasyloitumi-sesta maksauutteessa

Asyloituja deoksiribonukleosideja inkuboitiin rotan maksauut-teiden kanssa tarkoituksena arvioida johdannaisten entsymaat-tisen deasyloitumisen suhteellisia nopeuksia erilaisten subs-tituenttien kanssa, ja maarittaa deasyloituvatko eri nukleo-sidit, joilla on samat substituentit, samoilla nopeuksilla. Keksinnon johdannaisten deasylointi in vivo johtaa emanukleo-sidien vapautumiseen, joita solut sitten voivat kayttåa hy-vakseen.

Esimerkki 12

Kokonaiset rotan maksat homogenoitiin fosfaattipuskuroituun :. suolaliuokseen (10 ml grammaa kohti maksaa) ja sentrifugoi- tiin. Supernatantti laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 50 ml puskuria grammaa kohti maksaa, ja asyloitujen deoksiribonukleosidien varastoliuoksia lisattiin niin, etta yhdisteet olivat konsentraatioltaan 100-mikromolaarisia. 100 mikrolit- ran erat poistettiin periodisesti ja niistå maaritettiin * HPLC:11a ajan funktiona muodostuneiden vapaiden nukleosidien maarat. 1 •l « 91764

Taulukko 2

Vapautuneet nukleosidit (nmol/ml) _tuntia_

Yhdiste_1 2 3 8 24 3',5'-di-O-asetyylideoksiadenosiini 26 39 57 31.51- di-O-asetyylideoksisytidiini 25 40 50 31.51- di-O-asetyylideoksiguanosiini 23 43 63 31,5'-di-O-asetyylitymidiini 19 40 63 51-O-valeryylitymidiini 47 95 98 51-O-oktanoyylitymidiini 74 84 96 51-O-asetyylideoksiadenosiini 48 51-0-valeryylideoksiadenosiini 65 N-asetyylideoksisytidiini 0000 N-valeryylideoksiguanosiini 0000 N-palmitoyylideoksiguanosiini 0000 5'-O-palmitoyylideoksiadenosiini 5 16 5'-O-palmitoyylideoksisytidiini 4 15 5'-O-palmitoyylideoksiguanosiini 3 14 ’1 5'-O-palmitoyylitymidiini 4 14

Namå tiedot osoittavat, etta maksauutteissa kunkin neljån deoksiribonukleosidin di-o-asetyylijohdannaiset deasyloituvat hyvin samanlaisilla nopeuksilla. Taraa pitåå paikkansa myos 5'-O-palmitoyylijohdannaisille , vaikka palmitoyylisubstituen-tit lohkeavat pal jon hitaammin kuin asetaattiryhmåt. Tama an-taa aiheen olettaa, etta O-substituoitujen deoksirtbonukleo— sidien deasyloitumisen nopeus on ensis1jaisesti asyylisubsti-tuentin luonteen funktlo, eika sen nukleosidin, johon se on 1 i ittynyt. Tama on tarkeata keksinnon toteutuksessa, koska • · jotkut terapeutt iset vaikutukset saadaan vain kun annetaan yhdessa useamman kuin yhden nukleosidin johdannaista. On edullista, jos erilaisten nukleosidien deasyloituminen 47 9 1 7 6 4 terapeuttisessa seoksessa tapahtuu samanlaisilla nopeuksilla in vivo, koska nukleosidien optimaaliset suhteet tulevat kudoksiin samanaikaisesti. Suuri vaihtelu deasyloitumisno-peuksissa lyhyilla ketjuilla (asyyli) substituoiduilla nuk-leosideilla verrattuna pitkaketjuisilla (palmitoyyli) rasva-hapoilla substituoituihin antaa mahdollisuuden valikoida asyylisubstituentit deasyloitumisen nopeuksien mukaan (tai nukleosidin toimituksen mukaan), joita vaaditaan eri tilan-teissa. Keskipitkat rasvahapposubstituentit (esim. valeryyli tai oktanoyyli) lohkeavat nopeammin kuin lyhyemmat (asetaat-ti) tai pitemmat (palmitaatti) substituentit.

Tassa samassa maksauutteessa deoksiribonukleosidit sinansa hajoavat nopeasti, esim. deoksiadenosiini 100-mikromolaarise-na konsentraationa on kokonaan hajonnut, aluksi deaminoitumi-sella inosiinin muodostamiseksi, 2 minuutin kuluessa. Niinpa voidaan ymmartaa, etta antamisen jålkeen taman keksinnon O-asyloidut deoksiribonukleosidit vapautuvat asteittain, ja tarjoavat kudoksille vapaita nukleosideja pitemman ajan verrattuna nukleosidien saatavuuden lyhytaikaisuuteen silloin, kun on annettu emanukleosideja itsessaan. Deoksisytidiinin pyrimidiinirenkaan tai deoksiguanosiinin puriinirenkaiden primaarisiin amiineihin liittyneita rasvahappoja eivat maksan entsyymit poista kohtuullisella nopeudella.

Esimerkkeja asyloitujen nukleosidien antamisesta oraalisesti

Tarkoituksena maarittaa deoksiribonukleosidien toimitus sen jalkeen, kun asyloituja nukleosideja on annettu oraalisesti, mitattiln plasman tymidiinitasot, kun oli annettu oraalisesti joko 3',5'-di-O-asetyylitymidiinia tai itse tymidiinia.

Esimerkki 13

Urospuolisiin F344-rottiin (350 g) istutettiin pysyvat kaula-suonikatetrit verinaytteiden ottamiseksi, ja niiden annettiin toipua kaksi paivaa. Perusverinayte otettiin, ja sitten annettiin 0,7 millimoolia tymidiinia tai 48 91 764 3',51-di-O-asetyylitymidiinia (DAT) letkun kautta. Verinåyt-teet otettiin 0,5, 1, 2 ja 4 tuntia antamisen jalkeen, sent-rifugoitiin ja supernatantti (plasma) deproteinisoitiin meta-nolilla. Tymidiinin konsentraatio plasmanaytteissa maaritet-tiin HPLC:lla maarittamalla UV-absorbanssi.

Plasma oli tymidiinin peruskonsentraatioltaan 1-mikromolaa-rista. Kun tymidiinia oli annettu oraalisesti, plasman tymi-diinitasot saavuttivat maksimiltaan 9-mikromolaarisen kon-sentraation tunnin antamisen jalkeen ja palautuivat peruskon-sentraatioihin 4 tunnissa. Sita vastoin, kun annetiin oraalisesti ekvimolaarinen annos 3',5'-di-O-asetyylitymidiinia, plasman tymidiinikonsentraatiot saavuttivat maksimissaan 80 mikromolaarisuuden 30 minuutissa ja olivat perusarvojen yla-puolella vielå nelja tuntia antamisen jalkeen. Niinpa di-O-asetyylitymidiinin oraalisella antamisella voidaan vieda pal-jon suuremmat maarat tymidiinia kudoksiin (pidempana kestoai-kana) kuin antamalla ei-johdettua nukleosidia, kuten kuvassa 4 on esitetty, jossa nakyy graafinen esitys vertailutiedois-ta .

Esimerkkeja kliinisesta antamisesta Altistus sateilylle

Kolme tilannetta, jolloin deoksiribonukleosidien asyylijoh-dannaiset voivat olla kliinisesti kayttokelpoisia hoidettaes-sa sateilyvaurioita, ovat 1) vahingossa tapahtunut altistus ionoivalle sateilylle, kuten ydinonnettomuudessa; 2) altistus rontgensateilylle rontgenkuvauksessa; ja 3) syovan sadehoito.

Ensimmaisessa tapauksessa asyylideoksiribonukleosidijohdan-naisia tulisi antaa koostumuksena, joka sopii parenteraali-sesti injektoitavaksi, jonka jalkeen annetaan oraalisesti useita kertoja paivassa annoksia, jotka ovat suuruudeltaan 0,5-2 grammaa kutakm nel]aa paadeoksiribonukleosidia. on *' oleellista, etta kaikkien nukleos idien johdannaisia annetaan yhdessa.

« 91764

Toisessa tapauksessa, rontgensadealtistuksessa diagnostisen rontgenkuvauksen aikana, asyylideoksiribonukleosidijohdannai-sia annetaan oraalisesti ennen ja jalkeen altistuksen.

Kolmannessa tapauksessa, syovan sadehoidon aikana, asyyliri-bonukleosidijohdannaiset ovat erityisen kayttokelpoisia sai-lytettaessa luuytimen toimintaa sen jalkeen, kun se on ei-toivotusti, mutta valttåmattomåsti vahentynyt sateilytyksen aikana. Lisaksi koostumuksissa, jotka on suunniteltu selek-tiivisesti toimittamaan nukleosidit normaaliin, mutta ei neo-plastisiin kudoksiin, asyylinukleosidijohdannaiset parantavat sadehoidon terapeuttista indeksia (tehokkuuden suhde myrkyl-lisyyteen). Samanlaisia deoksiribonukleosidijohdannaisten annoksia voidaan myos kayttaa hoitamaan luuytimen vahentymis-ta, jonka on aiheuttanut antineoplastinen tai virustenvastai-nen kemoterapia .

Seuraava esimerkki esittaa keksinnon etuja hoidettaessa sa-teilytettyja hiiria.

Menetelmat

Balb/c+ hiiret altistettiin gammasateilylle (koboltti 60) an-nosnopeudella 7,3 rad/min. Kentta mitattiin kahdesti Fricken .. annosmittarilla kentan yhdenmukaisuuden ja annoksen vakioi- suuden varmistamiseksi kullekin hiirelle. 15 hiiren ryhmat saivat kokonaisannokset gammasateilya 675, 700, 725 ja 750 R.

Hiiret jaettiin neljaan hoitoryhmaan (5 hiirta kullakin sa-teilyannoksella), joista kukin sai erilaisen sateilynjalkei-sen hoidon:

Ryhma 1: 0,9% suolaliuos (vertailuryhma);

Ryhma 2: Deoksiribonukleosidien seos (ekvimolaarinen seos deoksiadenosiinista, deoksiguanosiinista, deoksi-sytidiinista ja tymidiinista); '* Ryhma 3: Seos deoksiadenosiinin, decksiguanosiinin, deoksi- sytidiinin ja tymidiinin 3,51-di-O-palmitoyyli- 50 91 764 johdannaisista, ekvimolaarisena ei-johdettujen nukleosidien armosten kanssa.

Ryhrna 4: Seos tymidiinin 5'-O-asetyylijohdannaisista (tutkittu ainoastaan annoksella 750 R).

Nukleosidit tai di-O-asetyylijohdannaiset annettiin injektoi-malla vatsaontelon sisaan (8 mikromoolia/0,2 ml fysiologista suolaliuosta kolme kertaa paivittain (joka 8. tunti) 4 paivan ajan, aloittaen 30 minuuttia sateilytyksen jalkeen). Vertai-luryhman hiiret saivat injektiot, joissa oli 0,2 ml fysiologista suolaliuosta saman aikataulun mukaisesti. Hiirille, jotka saivat 5'-O-palmitoyylinukleosidijohdannaisia, annettiin 8 mikromoolia vain kerran paivassa 4 paivan ajan satei-lytyksen jalkeen; niinpa ne saivat vain kolmasosan siita nukleosidien molaarisesta maarasta, joka annettiin hiirille, jotka saivat joko ei-johdettuja tai asetyloituja nukleosi-de ja .

Kuolleisuutta seuratiin paivittain 30 paivan ajan.

Tulokset ja niiden tarkastelu LD 50/30 (sateilyannos, joka tuotti 50% kuolleisuuden 30 paivassa sateilytyksen jalkeen) tåssa hiirikannassa on suunnil-··. leen 650 R. Tutkituilla sateilyannoksilla kuolema tapahtui, jos ollenkaan, 12-20 paivåa sateilytyksen jalkeen, mika on luonteenomaista kuolettavalle sateilynjålkeiselle luuydinvau-riolle.

A.lhaisimmalla t'issa kokeessa tutkitulla sateilyannoksel La (675 R) vain 20% suolaliuoksella hoidetuista vertailuhiirista jai eloon; yksikaan vertailuelain ei jaanyt eloon millaan korkeammalla sateilyannoksella (taulukko 1). Deoksiribonuk-Leosidien antaminen sateilyn jalkeen ei merkittavasti paran-tanut eLoonjaamista verrattuna vertailuryhman hiiriin. Sita vastoin elaimet, jotka hoidettiin di-O-asetyylideoksiribonuk-LeosideiLla sateilyn jalkeen, selvisivat sateilyannoksista, jotka olivat kuolettavia eLaimille, joille oli annettu joko 5i 91764 deoksiribonukleosideja tai suolaliuosta (700 R - 750 R). Hii-ret, joita hoidettiin 51-O-palmitoyylideoksiribonukleosidei1-la, selvisivat myos såteilyannoksista, jotka olivat kuoletta-via hoitamattomille hiirille (750 R). On ilmeista, etta pal-mitoyylijohdannaiset (8 mikromoolia annettuna kerran påivås-sa) ovat ainakin yhtå tehokkaita parantamaan sateilytettyjen hiirten eloonjaamista kuin kolminkertainen annos di-O-asetyy-linukleosideja (8 mikromoolia annettuna kolmesti påivåsså).

Aineet, jotka parantavat eloonjaamista annettuna sateilyn jalkeen, tekevåt sen parantamalla eloonjaåvien punasoluja muodostavien runkosolujen lisåantymistå ja jakautumista. On sen vuoksi ilmeista, etta keksinnon nukleosidijohdannaiset ovat kayttokelpoisia luuytimen parantamisen muissa tilanteis-sa, kuten sellaisissa, jotka ilmenevat hoidon jalkeen tie-tyilla antineoplastisilla aineilla.

Taulukko 3 Hiirten prosenttinen maara, jotka olivat elossa 30 paivan kuluttua potentiaalisesti kuolettavan gammasateilyn jalkeen

Sateilyannos (R)_ 675 700 725 750

Hoito_Eloonjaamis-% 30 paivan jalkeen suolaliuos (vertailu) 20 0 0 0 deoksiribonukleosidit 40 0 0 0 di-O-asetyylideoksiribo- nukleosidit 100 100 100 80 51-O-palmitoyyli- deoks ir ibonukleos i dit_-_-_-_100__

Hiiret hoidettiin luetelluilla aineilla gammasateilyn jalkeen kuten tekstissa on kuvattu._

Haavojen parantaminen

Edistettaessa ihon haavojen parantumista (joko kirurgisten avaamisten tai tapaturmaisten haavojen), on parasta kayttaa asyylideoksiribonukleosidijohdannaisia paika!lisesti, joko » · 52 9 1 7 6 4 laakevoiteessa, biologisesti hajoavissa mikrokapseleissa tai lisåttynå haavapeitteisiin. Paikallisesti vaikuttavaa anti-bioottia voidaan antaa samalla. Mooliekvivalenttinen raåarå 2-20 mg sisaltavan kaikkia neljaa påådeoksiribonukleosidia sisaltavan seoksen kanssa tulisi kayttaå neliosentille haavan pinta-alaa, tai 1-10 mg cm:å kohti suoraa leikkaushaavaa. Haavan paranemisen aikaisimpien vaiheiden alkamista kiihdyte-taan erityisesti.

Maksan uudistuminen

Deoksiribonukleosidien asyylijohdannaiset ovat kayttokelpoi-sia edistettaessa vaurioituneen tai sairaan maksan uudistu-mista, erityisesti kiihdyttamaan uudelleenkasvua sen jalkeen kun osa maksasta on kirurgisesti poistettu. Tåssa tapauksessa johdannaisten antaminen oraalisesti on edullista, annoksina, jotka ovat molaarisesti ekvivalentteja 0,2-2 gramman kanssa kutakin nukleosidia. On tarkeata, etta kaikkien neljan paa-deoksiribonukleosidin johdannaisia annetaan yhdessa.

Claims (4)

53 91 764

1. Analogiamenetelma sellaisen ISakeaineena kayttokelpoisen 2'-deoksiadenosiinin asyylijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava NHj ,Ac-\\ I II CH HC / R,OCH2 o ORj H jossa R2 ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety tai asyyliryhmå, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat gly-siini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleusii-nista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinis-tH, treoniinista, kysteiinista, asparagiinihaposta, glutamiini-haposta, arginiinista, lysiinistS, histidiinistå, karnitiinista ja ornitiinista, silla edellytyksella, ettei R2 ole johdettu leusiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksella, etta eivat molemmat ryhmista Rx ja R2 ole H, tai sen farmaseuttisesti kayttokelpoisen suolan valmistami-seksi tunnettu siita, etta 2'-deoksiadenosiini saatetaan rea-goimaan asyloivan aineen kanssa.

2. Analogiamenetelma sellaisen laåkeaineena kayttokelpoisen 2'-deoksiguanosiinin asyylijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava 54 9 1 7 6 4

0 II HN^ ^ I II CH h2n-c c / ^N7 r,och2 o _ ORj H jossa Rx ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety tai asyyliryhmå, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksellå, etteivat Rx ja R2 moleiranat ole johdettuja butyryylistå, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat gly-siini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleusii-nista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinis-tå, treoniinista, kysteiinista, asparagiinihaposta, glutamiini-haposta, arginiinista, lysiinistå, histidiinistå, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksellå, etta eivat molemmat ryhmistå Rx ja R2 ole H, tai sen farmaseuttisesti kåyttokelpoisen suolan valmistami-seksi, tunnettu siitå, etta 2'-deoksiguanosiini saatetaan rea-goimaan asyloivan aineen kanssa.

3. Analogiamenetelma sellaisen laakeaineena kåyttokelpoisen 2'-deoksisytidiinin asyylijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava nh2 vf '"CH I II 0=C CH \N/ RjOCH, 0 \ H H/ H H or2 H 55 9 1 7 6 4 jossa Rx ja R2 ovat samoja tai erilaisia ja kumpikin on vety tai asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmåstå, johon kuuluvat gly-siini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleusii-nista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinis-tå, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiini-haposta, arginiinista, lysiinistå, histidiinistå, karnitiinista ja ornitiinista, (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, silla edellytyksellå, ettå eivåt molemmat ryhmistå Rx ja R2 ole H, tai sen farmaseuttisesti kayttokelpoisen suolan valmistami-seksi, tunnettu siita, etta. 2'-deoksisytidiini saatetaan rea-goimaan asyloivan aineen kanssa.

4. Analogiamenetelmå sellaisen lååkeaineena kayttokelpoisen 2'-deoksitymidiinin asyylijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava o R,N C-CHj I II ' 0=C CH R.OCH, o * ORj H . jossa Rj on asyyliryhma, joka on johdettu (a) haarautumattomasta rasvahaposta, jossa on 18-22 hiiliatomia, (b) aminohaposta, joka on valittu ryhmasta, johon kuuluvat gly-siini, L-muodot alaniinista, valiinista, leusiinista, isoleusii-nista, tyrosiinista, proliinista, hydroksiproliinista, seriinis-tå, treoniinista, kysteiinistå, asparagiinihaposta, glutamiini-haposta, arginiinista, lysiinistå, histidiinistå, karnitiinista ja ornitiinista, 91764 (c) nikotiinihaposta, tai (d) dikarboksyylihaposta, jossa on 3-22 hiiliatomia, ja R2 ja R3 ovat H, tai sen farmaseuttisesti kåyttokelpoisen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå 2'-deoksitymidiini saatetaan rea-goimaan asyloivan aineen kanssa.